CN113151525B - 实时荧光定量PCR检测乳酸菌luxS基因的引物组及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种实时荧光定量PCR检测乳酸菌LuxS基因的引物组，包括用于检测乳酸菌内参基因的引物对和用于检测乳酸菌LuxS基因的引物对，乳酸菌包括保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌，内参基因为dp3d。可以较为准确地反应AI‑2信号分子合成情况。本发明还涉及引物组在制备实时荧光定量PCR检测乳酸菌LuxS基因试剂盒中的应用，可以较为准确地反应三种菌共培养时AI‑2信号分子合成情况。

Description

实时荧光定量PCR检测乳酸菌luxS基因的引物组及其应用
技术领域
本发明涉及一种乳酸菌LuxS基因检测技术领域，具体涉及一种实时荧光定量PCR检测乳酸菌LuxS基因的引物组及其应用。
背景技术
乳酸菌是存在于人体肠道中的一种普遍的生理菌群，它可以在人体肠道内定居并形成保护膜，以防止恶劣的胃肠道(GIT)微环境对细菌的影响。同时，乳酸菌产生的短链脂肪酸和乳酸已被证明在维持肠道内环境平衡方面起着重要作用。此外，乳酸菌还可以提高发酵食品的营养价值，降低肠道感染和血清胆固醇水平。与其它益生菌相比，乳酸菌在胃肠道环境中对酸和胆盐的抵抗力更强。为此，包括双歧杆菌、乳酸杆菌在内的乳酸菌在发酵食品工业中较为流行，而与一些优秀益生菌共培养发酵的模式在目前的发酵乳制品中更为常见，例如保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜热链球菌 (Streptococcusthermophilus)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)常常共培养以制备发酵乳。然而，共培养时不同菌株之间如何相互作用仍存在许多问题。
长期以来，人们认识到细菌群体之间通过群体感应中细胞外信号分子的交换存在着一种特殊的相互作用模式，以此来调控许多重要的生理功能(如生物发光、运动性、次生代谢产物的产生和生物膜的形成)。其中最常见的信号分子是自身诱导物-2(AI-2)。AI-2是一种新的呋喃葡萄糖基硼酸双酯，被认为是种间交流的“通用”信号分子，它是由许多革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌基因组中的S-核糖基同型半胱氨酸裂解酶基因产物 (S-ribosylhomocysteinase,LuxS)扩增出来的。也就是LuxS基因是AI-2信号分子合成的标志性基因。
为了研究保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌共培养中的群体感应现象，需要检测AI-2信号分子。目前AI-2一般通过生物发光的方法检测，该方法需要利用哈氏弧菌BB170(其发成的荧光只受AI-2信号分子的调控)作为报告菌株。一般是将待测菌的培养上清液加入哈氏弧菌的稀释液，再接种到AB培养基，最后使用光度计测量发光情况，但是该方法对实验条件比较敏感，培养基的所有成分都会影响哈氏弧菌的生长和发光，使得对AI-2的检测不够准确，可能出现假阳性或假阴性的情况。而实时荧光定量PCR技术具有快速准确、特异性强、灵敏性高等特点，可用于检测AI-2信号分子合成的标志性基因LuxS基因的表达。引物是实时荧光定量PCR检测需要用到的材料之一，经查，关于保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌引物组的报道较少。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术的现状而提供一种实时荧光定量PCR检测乳酸菌LuxS基因的引物组，能用于荧光定量PCR，以便较为准确地反应保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌共培养时AI-2信号分子合成情况。
本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术的现状而提供上述的引物组在制备实时荧光定量PCR检测乳酸菌LuxS基因试剂盒中的应用。
本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种实时荧光定量PCR检测乳酸菌LuxS基因的引物组，其特征在于：包括用于检测乳酸菌内参基因的引物对和用于检测乳酸菌LuxS基因的引物对，所述乳酸菌包括保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌，内参基因为dp3d；
内参基因dp3d的上游引物：GAATGTGGGCGTTAAGCAAACC；
内参基因dp3d的下游引物：TGCACGTTCCTCATCACTATCG；
保加利亚乳杆菌LuxS基因的上游引物：CACACCATTGAACACCTCCTG；
保加利亚乳杆菌LuxS基因的下游引物：TGTCGTCTCTGATTGCCTTGA；
嗜热链球菌LuxS基因的上游引物：TTTGGTTGCCGTACAGGTTTCC；
嗜热链球菌LuxS基因的下游引物：GCTGAATGAAGGCTGTGATCCT；
嗜酸乳杆菌LuxS基因的上游引物：CCTACCGGCGGATTGCATACTA；
嗜酸乳杆菌LuxS基因的下游引物：ATCCTGTTCGGCAACCAAATGG。
本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：如上述的引物组在制备实时荧光定量PCR检测乳酸菌LuxS基因试剂盒中的应用。
优选地，所述试剂盒的反应体系为：所述上游引物0.4μL，与上游引物对应的下游引物0.4μL，荧光染料10μL，其余为如乳酸菌的cDNA模板和水，整个反应体系共20μL。
与现有技术相比，本发明的优点在于：通过设计内参基因dp3d的上游引物、下游引物，保加利亚乳杆菌LuxS基因的上游引物、下游引物，嗜热链球菌LuxS基因的上游引物、下游引物，嗜酸乳杆菌LuxS基因的上游引物、下游引物，引物特异性强，可以用于实时荧光定量检测乳酸菌LuxS基因的表达，较为准确地反应AI-2信号分子合成情况，为研究保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌共培养时的群体感应现象奠定基础。
上述的引物组在制备实时荧光定量PCR检测乳酸菌LuxS基因试剂盒中的应用，同样具有可以较为准确地反应AI-2信号分子合成情况的优点。
附图说明
图1为胃肠液培养前后内参基因的表达稳定性分析(图1的图A为dp3d基因的熔融峰，图B为ldhD基因的熔融峰，图C为gapdH基因的熔融峰，图D为gryA基因的熔融峰)；
图2为嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌应用自身引物荧光定量PCR后的结果图(图2的A、B、C分别为嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌应用自身引物荧光定量PCR)；
图3为嗜酸乳杆菌的LuxS基因引物、保加利亚乳杆菌的LuxS基因引物、嗜热链球菌的LuxS基因引物分别添加到其它两种菌后的荧光定量PCR结果图(图3的A为嗜热链球菌的LuxS基因引物加到保加利亚乳杆菌的cDNA，B为嗜热链球菌的LuxS基因引物加到嗜酸乳杆菌的cDNA，C为保加利亚乳杆菌的LuxS基因引物加到嗜酸乳杆菌的 cDNA，D为保加利亚乳杆菌的LuxS基因引物加到嗜热链球菌的cDNA，E为嗜酸乳杆菌的LuxS基因引物加到保加利亚乳杆菌的cDNA，F为嗜酸乳杆菌的LuxS基因引物加到嗜热链球菌的cDNA)。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
1、内参基因的选择
以胃肠液处理前后的嗜酸乳杆菌CICC6074为研究对象，应用荧光定量PCR技术对dp3D(DNA polymeraseⅢ,delta subunit)、ldhD(L-lactate dehydrogenase)、 gapdH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)和gryA(gryA CDS)的表达稳定性进行评估。
在NCBI数据库和Geneious软件中获得dp3d、ldhD、gapdH和gryA的基因序列，利用primer premier 6软件设计相应引物，并通过BLAST分析验证引物的特异性。设计引物时所遵循的选择标准是：引物长度为18-25bp，GC含量在50％左右，Tm在55℃左右。引物设计结果如表1所示。
表1
Figure BDA0003081453870000031
Figure BDA0003081453870000041
将嗜酸乳杆菌CICC6074活化后扩大培养，再经过胃肠液培养，将培养前后的菌液分别取样按现有技术中的方法提取RNA后合成cDNA。qPCR体系按照北京全式金生物技术有限公司的荧光定量试剂盒，操作步骤对应目录号AQ141。将各基因同时扩增，实验使用Roche
Figure BDA0003081453870000042
96仪器，采用20μL反应体系，体系各组份如表2所示。实验数据通过
Figure BDA0003081453870000043
96软件分析。
表2
Figure BDA0003081453870000044
2、内参基因的选择结果
4个候选内参基因的稳定性通过
Figure BDA0003081453870000045
96软件分析。参见图1，其中图A 为dp3d基因的熔融峰，图B为ldhD基因的熔融峰，图C为gapdH基因的熔融峰，图D为gryA基因的熔融峰，可见，在胃肠液处理前后，表达最稳定的基因是dp3d。
因此，dp3d可以作为实时荧光定量PCR检测的内参基因。
3、目的基因的引物的设计
在NCBI数据库和Geneious软件中分别获得保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌的目的基因LuxS的基因序列，参见序列表，利用primer premier 6 软件设计相应引物，引物设计结果如表3所示：
表3 qRT-PCR的引物设计
Figure BDA0003081453870000051
4、目的基因的引物特异性验证
为了验证目的基因引物的特异性，将嗜酸乳杆菌的LuxS基因引物加到嗜酸乳杆菌cDNA中，荧光定量PCR后的熔融峰为单峰，参见图2A。而将嗜酸乳杆菌的LuxS基因引物分别加到保加利亚乳杆菌的cDNA和嗜热链球菌的cDNA中，熔融峰均为双峰，参见图3E、图3F。由此可见，嗜酸乳杆菌的LuxS基因引物具有特异性，只能用于检测嗜酸乳杆菌的LuxS基因表达，而不能检测保加利亚乳杆菌的LuxS基因表达和嗜热链球菌的LuxS基因表达。
同样以此方法验证保加利亚乳杆菌的LuxS基因引物的特异性。具体地，参见图2B，保加利亚乳杆菌的LuxS基因引物加到保加利亚乳杆菌cDNA中，荧光定量PCR后的熔融峰为单峰。参见图3C、图3D，将保加利亚乳杆菌的LuxS基因引物分别加到嗜酸乳杆菌的cDNA和嗜热链球菌的cDNA中，熔融峰均为双峰。由此可见，保加利亚乳杆菌的LuxS基因引物具有特异性，只能用于检测保加利亚乳杆菌的LuxS基因表达，而不能用于检测嗜酸乳杆菌的LuxS基因表达和嗜热链球菌的LuxS基因表达。
参见图2C，嗜热链球菌的LuxS基因引物加到嗜热链球菌cDNA中，荧光定量PCR后的熔融峰为单峰。参见图3A、图3B，将嗜热链球菌的LuxS基因引物分别加到保加利亚乳杆菌的cDNA和嗜酸乳杆菌的cDNA中，熔融峰均为双峰。由此可见，嗜热链球菌的LuxS基因引物具有特异性，只能用于检测嗜热链球菌的LuxS 基因表达，而不能检测保加利亚乳杆菌的LuxS基因表达和嗜酸乳杆菌的LuxS基因表达。
本实施例还提供引物组在制备实时荧光定量PCR检测乳酸菌LuxS基因试剂盒中的应用，具体地，试剂盒的反应体系为：上游引物0.4μL，与上游引物对应的下游引物0.4μL，荧光染料10μL，其余为如乳酸菌的cDNA模板和水，整个反应体系共20μL。
序列表
<110> 宁波大学
<120> 实时荧光定量PCR检测乳酸菌luxS基因的引物组及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 480
<212> DNA
<213> Lactobacillus bulgaricus
<400> 1
atggctaaag tagaaagttt tgaattggac cacactaaag ttaaggcacc ttacgtccgc 60
ctgatcaccg ttgaagaagg ccctaagggc gacaagatct ccaacttcga cctccgcctg 120
gtgcagccta acgaaaacgc catcccaact ggcggcctgc acaccattga acacctcctg 180
gccagcctcc tgcgcgaccg cttagacggc gtcatcgact gctccccatt cggctgccgg 240
accggtttcc acttgattac ctggggtgaa cacagcacca ctgaagtagc caaggccctg 300
cgcgactccc tcaaggcaat cagagacgac atcacttggg aagacgtgcc tggtaccacc 360
atcgaaagct gcggcaacta ccgcgaccac tccctcttca gcgcccagga atggtgcaac 420
gatatcttga agaagggcat cagcgacgac ccatttgacc gccacgtggt tgaagactag 480
<210> 2
<211> 483
<212> DNA
<213> Streptococcus thermophiles
<400> 2
atgccaaaag acgttactgt tgaaagtttt gaacttgatc acaccattgt aaaagcacct 60
tatgtccgtc ttatttcaga ggaagttgga cctaaaggag atatcatcac aaactttgat 120
atccgtttga ttcaacctaa tgaaaatagt attgatacag gtggtcttca tactatcgaa 180
cacctactcg ctaaactgat ccgtcaacgt atcgatggcc ttattgattg ctcaccattt 240
ggttgccgta caggtttcca tatgatcatg tggggaaaac aagatcctac ggaaattgcc 300
aaagttatca aatctagtct tgaagctatt gcaaacgaaa ttacttggga agatgttcca 360
ggaactacta ttgaatcttg tggtaactat aaggatcaca gccttcattc agctaaggaa 420
tgggctaaac ttatccttga acaaggcatc tcagaccaag ccttcgaacg tcataccgtc 480
taa 483
<210> 3
<211> 474
<212> DNA
<213> Lactobacillus acidophilus
<400> 3
atggcaaaag ttgaaagttt tacattagac cacactaaag ttaaggcacc ttacgttcgt 60
ttaattactg ttgaagaagg tcctaaaggc gacaagattt ctaactatga cttacgttta 120
gttcaaccga acgaaaatgc aattcctacc ggcggattgc atactattga acacttactt 180
gccagcttac ttcgtgaccg tcttgatggt gtaatcgatt gttcaccatt tggttgccga 240
acaggattcc acctaatcgt ttggggtgaa cattcaacta ctgaagttgc taaagcattg 300
aagtcttcat tagaggaaat tcgtgacaca attacttggg aagatgtacc aggtacaact 360
attaagactt gtggtaacta ccgtgatcac tcattgttca ccgcaaaaga atggtgtcgt 420
gatattcttg aaaaaggaat tagtgatgac ccattcgaaa gaaatgtgat ttaa 474

Claims (3)

1.一种实时荧光定量PCR检测乳酸菌luxS基因的引物组，其特征在于：包括用于检测乳酸菌内参基因的引物对和用于检测乳酸菌LuxS基因的引物对，所述乳酸菌包括保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌，内参基因为dp3d；
内参基因dp3d的上游引物：GAATGTGGGCGTTAAGCAAACC；
内参基因dp3d的下游引物：TGCACGTTCCTCATCACTATCG；
保加利亚乳杆菌LuxS基因的上游引物：CACACCATTGAACACCTCCTG；
保加利亚乳杆菌LuxS基因的下游引物：TGTCGTCTCTGATTGCCTTGA；
嗜热链球菌LuxS基因的上游引物：TTTGGTTGCCGTACAGGTTTCC；
嗜热链球菌LuxS基因的下游引物：GCTGAATGAAGGCTGTGATCCT；
嗜酸乳杆菌LuxS基因的上游引物：CCTACCGGCGGATTGCATACTA；
嗜酸乳杆菌LuxS基因的下游引物：ATCCTGTTCGGCAACCAAATGG。
2.如权利要求1所述的引物组在制备实时荧光定量PCR检测乳酸菌LuxS基因试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述试剂盒的反应体系为：所述上游引物0.4μL，与上游引物对应的下游引物0.4μL，荧光染料10μL，其余为如乳酸菌的cDNA模板和水，整个反应体系共20μL。
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