CN102533618B

CN102533618B - 一种植物乳杆菌ccfm8724及其用途

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Publication number: CN102533618B
Application number: CN2012100464308A
Authority: CN
Inventors: 陈卫; 张灏; 赵建新; 田丰伟; 王刚; 张秋香; 赵煜; 宋元达; 郭敏
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2012-02-28
Filing date: 2012-02-28
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2032-02-28
Also published as: CN102533618A

Abstract

本发明涉及一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM8724及其用途。该植物乳杆菌CCFM8724具有体外抑制空肠弯曲杆菌生长的能力，耐酸性与耐胆盐性能良好，对肠道上皮细胞具有良好的粘附能力，能抑制空肠弯曲杆菌粘附于肠道上皮细胞，抑制空肠弯曲杆菌在鸡肉中生长。所述植物乳杆菌CCFM8724可以用于制备抑制空肠弯曲杆菌的药物组合物，可以使用含有植物乳杆菌CCFM8724菌种的发酵剂生产发酵乳制品、发酵豆制品、发酵果蔬制品以及青贮饲料，该发酵剂赋予这些产品具有一定的酸度和特定的香味，同时延长了产品保藏时间，改善了营养价值和消化性以及产品的安全性。

Description

一种植物乳杆菌CCFM8724及其用途

【技术领域】

本发明属于微生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM8724，还涉及所述植物乳杆菌CCFM8724的用途。

【背景技术】

空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)是弯曲杆菌属成员之一，属革兰氏阴性菌，是全球范围内感染性腹泻常见的病原菌，世界卫生组织(WHO)在1980年将空肠弯曲杆菌病列为常见的食源性疾病。C.jejuni是一种人兽共同感染的病原菌，广泛存在于环境中，C.jejuni能定植在各种野生禽类和家禽、家畜的肠道内，如鸡、鸭、鹅等家禽，猫、狗等宠物，牛、猪等家畜，鸽子、麻雀等鸟类以及野生动物等为常见的动物宿主。人类通过与这些动物的接触而可能受到感染，此外，生的、欠火候的或受污染的鸡肉、牛肉，未彻底杀菌的牛奶以及污染的水都可以引起人类感染空肠弯曲杆菌。

20世纪90年代以来，C.jejuni感染率呈逐年上升的趋势。在欧美等发达国家，C.jejuni是造成腹泻的主要病原体，有时甚至超过沙门氏菌和志贺氏菌而居首位。最近数十年，在发达国家中空肠弯曲杆菌病的发病数逐年增长，仅在美国每年的发病例数就高达250万人次，我国和其它发展中国家的患者多集中在儿童。急性自限性胃肠炎是C.jejuni感染的典型症状，免疫力极低下者还会进一步导致心内膜炎、关节炎、骨髓炎、脑炎、败血症等全身性疾病，最严重的并发症是某些血清型C.jejuni感染引起的周围神经自身免疫性疾病-格林-巴利综合症(Guillain-Barre syndrome，GBS)。

C.jejuni的致病机理是复杂的，主要是通过粘附、定植、侵入、产毒素等机制感染机体而导致疾病。鞭毛、外膜蛋白、脂多糖或脂寡糖、荚膜多糖等在C.jejuni附着和定植于宿主肠道上皮细胞的过程中起重要作用。所有C.jejuni都能产生细胞致死性膨胀毒素(Cytolethal distending toxin，CDT)， CDT有多方面致病性，能直接破坏宿主细胞DNA；能通过阻止细胞分裂关键调节因子CDC2蛋白的去磷酸化等作用，使宿主细胞周期不可逆地阻断在G2期而不再进入M期，细胞不能增殖分化，致宿主肠道细胞失去调节形态和容量的能力，使细胞进行性扩张，最终破裂死亡；能激发宿主产生细胞因子IL-8，导致局部炎症的发生。

C.jejuni的广泛分布、较高发病率以及相关疾病的危害已经引起了人们的广泛关注。近年来抗菌药物的使用已经使细菌耐药性日趋严重，反而推动了这类食源性病原菌的流行。加强对C.jejuni的预防是控制弯曲杆菌病的重要手段之一，而且在公共卫生、食品安全、畜牧兽医中都有重要的意义。

益生菌被定义为活的微生物，适量摄入益生菌对人体具有有益的功效，通过益生菌来预防和治疗肠道细菌性感染已经成为相关领域研究的一个重要课题。乳酸菌具有抑制各种革兰氏阳性和阴性病原菌的功能，其抑制机制可能是由于产生有机酸，如乳酸和乙酸、过氧化氢、细菌素及类似细菌素的物质，还包括竞争排斥作用、促进肠道微生态平衡以及增强宿主的防御能力。此外，某些益生菌能在胃肠道环境中存活并定植于肠道，这些微生物治疗可以作为治疗肠道菌群失调的一种方法。

目前国内外对乳酸菌干预病原菌感染进行了很多研究。CN1796540公开了一种具有抗肠道致病菌和抗氧化特性的双歧杆菌；CN1982437公开了一种抗肠道致病菌和抗氧化能力的鼠李糖乳杆菌，用于制备抑制幽门螺杆菌、大肠杆菌或其他致病菌的食品或药品。但鲜有针对空肠弯曲杆菌的乳酸菌和益生菌的报道。目前针对空肠弯曲杆菌的专利中多集中于空肠弯曲杆菌的培养、检测等方面，例如CN1011825688公开一种空肠弯曲杆菌的检测方法；CN101392228涉及空肠弯曲杆菌的微需氧分离培养方法。因此，筛选出一种具有抑制空肠弯曲杆菌功能的乳酸菌，并且证明在体外具有良好的抗空肠弯曲杆菌的效果，同时研制这些乳酸菌的实际用途就显得十分必要。

为此，本发明人在总结现有技术的基础上，经过大量实验研究，终于完成了本发明。

【发明内容】

[要解决的技术问题1

本发明的目的是提供一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM8724。

本发明的另一个目的是提供所述植物乳杆菌CCFM8724的用途。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM8724，该菌株已于2011年11月29日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.5492。

所述的植物乳杆菌CCFM8724具有下述性质：

(1)体外抑制空肠弯曲杆菌生长；

(2)具有耐酸性，在pH2.0时存活良好；

(3)具有耐胆盐能力，能耐受的胆盐水平达0.3％；

(4)对肠道上皮细胞具有较好的粘附能力；

(5)体外抑制空肠弯曲杆菌粘附肠道上皮细胞；

(6)抑制空肠弯曲杆菌在鸡肉中的生长。

本发明涉及所述的植物乳杆菌CCFM8724在制备抑制空肠弯曲杆菌的药物组合物或发酵食品中的用途。

根据本发明的一种优选实施方式，所述的药物组合物是由植物乳杆菌CCFM8724菌剂与在药学上可接受的载体组成的。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的植物乳杆菌CCFM8724菌剂是将含有所述植物乳杆菌CCFM8724的菌液通过常规冷冻干燥工艺或其它类似工艺制备所得到的粉剂，它含有10⁶CFU/g以上的活性植物乳杆菌CCFM8724。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的药物组合物是颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液剂型。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的发酵食品是使用含有植物乳杆菌CCFM8724的发酵剂生产的乳制品、豆制品与果蔬制品。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的发酵剂是采用下述方法制备得到的：

制备具有下述组成的培养基：以该培养基总重量计10％酶水解脱脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨、0.3％酵母浸膏和余量水，所制备培养基的pH是6.8。

制备具有下述组成的保护剂：100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸钠和余量水。

植物乳杆菌CCFM8724菌种按照以所述培养基的重量计2-4％接种量接种到在温度110-120℃下灭菌8-12min的所述的培养基中，然后在温度37℃下培养18h，用pH 7.2磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用所述的保护剂重悬使植物乳杆菌CCFM8724浓度达到10⁹CFU/ml；接着，让该悬浮液在温度37℃下预培养60min，再采用冷冻干燥方法制成所述的发酵剂。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的发酵剂含有10⁹CFU/g以上活性植物乳杆菌CCFM8724。

根据本发明的另一种优选实施方式，所述的发酵乳制品是酸牛奶、酸奶油或干酪；所述的发酵豆制品是酸豆乳、豆豉、豆酱或酱油；所述的发酵果蔬制品是发酵的黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜制品。

下面将更详细地描述本发明。

下面将详细地描述所述植物乳杆菌CCFM8724的筛选方法与它具有的性质。

首先，从传统发酵食品中筛选乳酸菌。

原始样品取自于内蒙、新疆等地牧民自制的发酵奶酒。将5ml发酵奶酒注入带玻璃珠的45ml灭菌生理盐水中，振荡30min，然后用灭菌生理盐水将其奶酒稀释至不同的浓度。采用本技术领域的技术人员熟知的涂布平板法，将这些稀释菌液涂布在添加了酸碱指示剂溴甲酚紫的MRS培养基(青岛海博生物技术有限公司产品)平板上，分别在温度37℃下进行普通培养和厌氧培养48h，观察菌落生长情况，挑取能使培养基中溴甲酚紫变黄的典型单菌落，并对单菌落进行革兰氏染色，挑取革兰氏阳性菌作为初步目的菌株，然后转接至MRS平板划线分离纯化，直至得到纯乳酸菌株，作为实验菌株并在温度4℃下保存。用接种环在平板上刮一环新鲜培养的菌苔，均匀涂抹在载玻片上，往其上滴加一滴3％H₂O₂溶液，观察是否有气泡产生。若无气泡产生则表明该菌株不产过氧化氢酶，为接触酶阴性菌。

然后，采用牛津杯法筛选具有抑制空肠弯曲杆菌生长功能的乳酸菌。

将上述步骤获得的纯乳酸菌按照以MRS液体培养基体积计2％接种于MRS液体培养基中，于温度37℃下培养18-20h，按照同样的方式连续培养三代，然后将乳酸菌菌悬液在8000r/min与温度4℃的条件下离心20min，吸取上清液，使用0.22μm滤膜进行过滤去除菌体，得到一种乳酸菌发酵上清液。

空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)NCTC11168菌株(购自美国典型培养物保藏中心ATCC)在哥伦比亚血琼脂平板(Oxoid公司培养基)上在温度37℃与以体积计5％O₂、10％CO₂和85％N₂的环境下培养48h，按照同样的方式传代培养三代后，往其平板中加入脑心浸液肉汤培养基(Oxoid公司培养基)，用无菌涂布棒刮下表面的细菌，在5000r/min条件下离心20min，使用磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.2)洗涤后，调整该菌浓度至10⁸CFU/mL。

然后，吸取250μl空肠弯曲杆菌菌液，均匀涂布于CCDA平板培养基(青岛海博生物技术有限公司)上，待菌液自然干后，在平板上放置牛津杯，然后向牛津杯中加入100μl上述的乳酸菌发酵上清液，以pH＝3.8MRS作为对照，在温度4℃下扩散2小时，再放入培养箱中在温度37℃与以体积计5％O₂、10％CO₂和85％N₂的环境下培养48h，接着采用常规方法测量抑菌圈的直径，从中筛选得到一株能有效抑制空肠弯曲杆菌生长的乳酸菌，即乳酸菌CCFM8724，其测量结果列于下表1中。

表1：抑菌圈直径的测量结果

表1的结果清楚地表明，乳酸菌CCFM8724的发酵上清液有效地抑制了空肠弯曲杆菌的生长。

乳酸菌CCFM8724的菌种鉴定。

采用本技术领域的技术人员熟知的16srDNA鉴定方法鉴定，乳酸菌CCFM8724与Lactobacillus plantarum具有99.9％的同源性，因此，将乳酸菌CCFM8724定名为Lactobacillus plantarum CCFM8724。

本发明的植物乳杆菌CCFM8724具有下述生物学特性：

在MRS培养基上能形成明显的菌落，其菌落形态见附图1，其菌落呈圆形，边缘整齐，乳白色，透明，表面湿润光滑，不产生色素。革兰氏染色为阳性，细胞杆状，菌体成单、成对或者成链，不形成芽孢，两端圆形，其菌体形态见附图2。

植物乳杆菌CCFM8724具有下述的生长特性：

该菌株在30-37℃生长最佳，最低生长温度和最高生长温度分别为20℃和40℃，最适生长初始pH为6.0，最低和最高初始生长pH为9.0和3.0；该菌株的延滞期相对较短，4h左右开始进入对数生长期，14h左右达到稳定期。

本发明人通过大量实验研究了本发明植物乳杆菌CCFM8724在发酵液中的抑菌物质，对肠道上皮细胞上的粘附性、抑制空肠弯曲杆菌粘附在肠道上皮细胞HT-29上、对人工胃液及人工肠液的耐受性、对鸡肉中空肠弯曲杆菌的抑制作用。

采用牛津杯法，通过植物乳杆菌CCFM8724发酵上清液热处理实验、pH实验、过氧化氢酶处理实验、蛋白酶K处理实验与胰蛋白酶处理实验(具体参见实施例)确定，植物乳杆菌CCFM8724酸性代谢产物、过氧化氢及细菌素类或抗生素类物质都具有抑菌活性。

通过肠上皮细胞株HT-29细胞培养、粘附实验(具体参见实施例)确定植物乳杆菌CCFM8724具有良好的粘附性，因此，可以有效地防止病原微生物接触和粘附肠道上皮细胞，从而预防肠致病菌引起的肠道疾病。

通过植物乳杆菌CCFM8724抑制空肠弯曲杆菌粘附肠道上皮细胞HT-29的实验(具体参见实施例)，可以认为植物乳杆菌CCFM8724在体外能够有效抑制空肠弯曲杆菌对HT-29细胞的粘附。

通过植物乳杆菌CCFM8724对人工胃液及人工肠液耐受性实验(具体参见实施例)，其实验结果表明，植物乳杆菌CCFM8724在经过人工胃液与人工肠液的处理后，存活菌数没有受到较大影响，植物乳杆菌CCFM8724对酸性的人工胃液及含有胆盐(0.3％)的人工肠液具有良好的耐受性。

通过对污染空肠弯曲杆菌的鸡肉实验(具体参见实施例)，经植物乳杆菌CCFM8724处理后的鸡肉中，空肠弯曲杆菌的数量较对照组明显减少，说明植物乳杆菌CCFM8724能抑制空肠弯曲杆菌在鸡肉中的生长。

总之，所述的植物乳杆菌CCFM8724具有下述性质：

(1)体外抑制空肠弯曲杆菌生长；

(2)具有耐酸性，在pH2.0时存活良好；

(3)具有耐胆盐能力，能耐受的胆盐水平达0.3％；

(4)在肠道上皮细胞上具有较好的粘附能力；

(5)体外抑制空肠弯曲杆菌粘附肠道上皮细胞；

(6)抑制空肠弯曲杆菌在鸡肉中的生长。

本发明植物乳杆菌CCFM8724的培养方法与培养条件：

所述植物乳杆菌CCFM8724原始菌种在温度-75℃下以30％甘油悬液形式保存，或者在温度4℃下以冷冻干燥菌粉的形式保存备用。培养时，本发明植物乳杆菌CCFM8724可以在MRS培养基中在兼性厌氧与温度37℃的条件下培养18-20h即可使用。

根据本发明，所述的药物组合物是由植物乳杆菌CCFM8724菌剂与在药学上可接受的载体或赋形剂组成的。

所述的植物乳杆菌CCFM8724菌剂是将含有所述植物乳杆菌CCFM8724的菌液通过常规冷冻干燥工艺或其它类似工艺制备所得到的粉剂，它含有10⁶CFU/g以上的活性植物乳杆菌CCFM8724。

所述的植物乳杆菌CCFM8724菌剂的量是所述药物组合物重量的15-35％，优选地是18-32％，更优选地20-30％。

根据本发明，在药学上可接受的载体应该是指在药学领域中的常规药物载体，例如是一种或多种选自在药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂或矫味剂的载体。

根据本发明，所述的填充剂应该理解是用来增加片剂重量和体积而便于压片的辅料稀释剂；或者应该理解是用以吸收原料中多余液体成分的辅料吸收剂。

所述的填充剂选自淀粉、蔗糖、乳糖、硫酸钙或微晶纤维素。

优选地，所述的填充剂选自淀粉、蔗糖或微晶纤维素。

更优选地，所述的填充剂选自淀粉或微晶纤维素。

本发明使用填充剂的量是以所述药物组合物总重量计0.2-4.0％。

根据本发明，所述的润湿剂应该理解是药物本身无粘性，但可润湿其药物原辅料并诱发其粘性而制成颗粒的液体。

所述的润湿剂选自水、乙醇、淀粉或糖浆。

优选地，所述的润湿剂选自水、乙醇或淀粉。

本发明使用润湿剂的量是以所述药物组合物总重量计0.1-3.0％。

根据本发明，所述的粘合剂应该理解是当原料药物本身无粘性或粘性不足时，需加入粘性物质以便于制粒，这种粘性物质称为粘合剂。

所述的粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮。

优选地，所述的粘合剂选自纤维素衍生物、明胶或聚乙烯吡咯烷酮。

更优选地，所述的粘合剂选自明胶或聚乙烯吡咯烷酮。

本发明使用粘合剂的量是以所述药物组合物总重量计0.5-5.0％。

根据本发明，所述的崩解剂应该理解是一种能够加入片剂中而促进其片剂在胃肠液中快速崩解成细小粒子的辅料。人们知道，片剂经过压缩后的硬度大，如果其中不含有可以促进崩解作用的辅料，它在胃肠道中崩解很慢，影响疗效。

所述的崩解剂选自羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠。

优选地，所述的崩解剂选自羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂或碳酸氢钠。

更优选地，所述的崩解剂选自羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素或碳酸氢钠。

本发明使用崩解剂的量是以所述药物组合物总重量计5.0-15.0％。

根据本发明，所述的润滑剂应该理解是一种有利于提高片剂在制粒过程中的流动性，防止片剂材料粘附在制片机模子上，有利于片剂脱模的化学物质。

所述的润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、微粉硅胶或聚乙二醇。

优选地，所述的润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁或聚乙二醇。

更优选地，所述的润滑剂选自滑石粉或硬脂酸钙。

本发明使用润滑剂的量是以所述药物组合物总重量计0.5-3.0％。

根据本发明，所述的矫味剂应该理解是在药品中用以改善或屏蔽药物不良气味和味道，使病人难以觉察药物强烈苦味或其它异味，例如辛辣、刺激等的药用辅料。

所述的矫味剂选自单糖浆、蔗糖、卵磷脂、橙皮糖浆、枸橼糖浆或樱桃糖浆的甜味剂；柠檬、茴香或薄荷油的芳香剂；海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素或羧甲基纤维素钠的胶浆剂；柠檬酸或酒石酸与碳酸氢钠混合物的泡腾剂。

优选地，所述的矫味剂选自单糖浆、蔗糖、橙皮糖浆或樱桃糖浆的甜味剂；柠檬或薄荷油的芳香剂；海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶或羧甲基纤维素钠的胶浆剂；酒石酸与碳酸氢钠混合物泡腾剂。

更优选地，所述的矫味剂选自蔗糖、橙皮糖浆或樱桃糖浆的甜味剂；柠檬芳香剂；海藻酸钠或阿拉伯胶胶浆剂；酒石酸与碳酸氢钠混合物泡腾剂。

本发明使用矫味剂的量是以所述药物组合物总重量计0.5-2.0％。

本发明的植物乳杆菌CCFM8724菌剂可以与在药学上可接受的载体组合制成各种剂型，例如颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液，其中在药学上可接受的载体可以根据不同剂型进行选择，这些载体及其用量对于制药技术领域的普通技术人员都是容易确定的，也是显而易见的。

在本发明中，采用制药技术领域的普通技术人员熟知的普遍使用的方法和设备制备本发明药物颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液剂型。

所述的“剂型”一般应该理解是适用于人的单剂量药物形式，单个剂型含有为达到所需药量的预定活性物质，例如本发明的植物乳杆菌CCFM8724菌剂。

根据本发明，所述的发酵食品是使用含有植物乳杆菌CCFM8724的发酵剂生产的乳制品、豆制品与果蔬制品。

当然，使用含有植物乳杆菌CCFM8724的发酵剂生产其它产品，例如家禽、牲畜或其它动物的饲料或饲料添加剂，也都在本发明的保护范围内。

优选地，所述发酵剂的植物乳杆菌CCFM8724浓度是10⁶CFU/mL以上。

所述的发酵剂是采用下述方法制备的。

所述的培养基在温度110-120℃下灭菌8-12min后，接种以所述培养基重量计2-4％植物乳杆菌CCFM8724菌种，然后在温度37℃下培养18h，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.2)清洗2-4次，用所述的保护剂重悬使植物乳杆菌CCFM8724浓度达到10⁹CFU/ml。接着，让该悬浮液在温度37℃下预培养60min，再采用冻干法制成所述的发酵剂。

根据本发明，所述的发酵乳制品是酸牛奶、酸奶油或干酪。

所述的酸牛奶、酸奶油或干酪是使用本发明的发酵剂，代替现有技术使用的发酵剂或作为现有技术使用的发酵剂的补充发酵剂，按照现有常规生产方法生产得到的酸牛奶、酸奶油或干酪。

所述的发酵豆制品是酸豆乳、豆豉、豆酱或酱油。

在本发明中，所述的酸豆乳、豆豉、豆酱或酱油是使用本发明的发酵剂，代替现有技术使用的发酵剂或作为现有技术使用的发酵剂的补充发酵剂，按照现有常规生产方法生产得到的酸豆乳、豆豉、豆酱或酱油。

所述的发酵果蔬制品是经过发酵的黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜制品。

所述的经过发酵的黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜是使用本发明的发酵剂，代替现有技术使用的发酵剂或作为现有技术使用的发酵剂的补充发酵剂，按照现有常规生产方法生产得到的黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜制品。

使用本发明发酵剂制备的发酵乳制品、发酵豆制品以及发酵果蔬制品具有一定的酸度、香味等优异特性，同时延长了产品保藏时间，改善了营养价值和消化性以及产品的安全性。

[有益效果]

本发明的植物乳杆菌CCFM8724具有耐酸、耐胆盐的能力，它对空肠弯曲杆菌的生长具有抑制作用，在肠道上皮细胞HT-29上具有良好的粘附性，它能够抑制空肠弯曲杆菌在HT-29细胞上的粘附。

所述植物乳杆菌CCFM8724可以用于制备抑制空肠弯曲杆菌的药物组合物；可以使用含有植物乳杆菌CCFM8724的发酵剂生产发酵乳制品、发酵豆制品以及发酵果蔬制品，该发酵剂赋予这些产品具有一定的酸度，具有特定的香味，同时延长了产品保藏时间，改善了营养价值和消化性以及产品的安全性。

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM8724菌株已于2011年11月29日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo.5492。

【附图说明】

图1表示植物乳杆菌CCFM8724的菌落形态；

图2表示植物乳杆菌CCFM8724革兰氏染色的菌体形态，放大倍数1000倍；

图3表示植物乳杆菌CCFM8724在HT-29细胞上的粘附状况图，放大倍数1000倍；

图4表示植物乳杆菌CCFM8724抑制空肠弯曲杆菌对HT-29细胞的粘附；

图5表示植物乳杆菌CCFM8724对空肠弯曲杆菌在鸡肉中生长的抑制作用。

【具体实施方式】

实施例1：本发明植物乳杆菌CCFM8724发酵上清液中抑菌物质的分析实验

采用牛津杯法通过下述实验确定植物乳杆菌CCFM8724发酵上清液发挥抑菌作用的主要物质：

(1)热处理：将采用本说明书所描述方法得到的植物乳杆菌CCFM8724上清液于温度100℃下加热20min，再进行抑菌实验。

(2)调节pH：将所述植物乳杆菌CCFM8724上清液的pH值调节至6.2，再进行抑菌实验。

(3)过氧化氢酶处理：将过氧化氢酶溶液(1mg/ml)经0.22微米膜过滤后，按照其与植物乳杆菌CCFM8724上清液的体积比1∶10加入到所述植物乳杆菌CCFM8724上清液中，于温度37℃下恒温反应1小时，再进行抑菌实验。

(4)蛋白酶K处理：将蛋白酶K溶液(200μg/ml)经0.22微米膜过滤后，按照其与植物乳杆菌CCFM8724上清液的体积比1∶50加入到所述植物乳杆菌CCFM8724上清液中，于温度37℃下恒温反应1小时，再进行抑菌实验。

(5)胰蛋白酶处理：将胰蛋白酶溶液(200μg/ml)经0.22微米膜过滤后，按照其与植物乳杆菌CCFM8724上清液的体积比1∶50加入到植物乳杆菌CCFM8724上清液中，于温度37℃下恒温反应1小时，再进行抑菌实验。

这些实验结果列于表2中。

表2：植物乳杆菌CCFM8724发酵上清液经不同处理后的抑菌圈直径测定结果

从表2的结果可以看出，当植物乳杆菌CCFM8724上清液调节pH至6.2时，抑菌圈明显减小，接近对照MRS的抑菌圈大小，说明产酸是主要的抑菌作用；该上清液在温度100℃下处理20min后，其抑菌圈大小略有减小；过氧化氢酶处理、蛋白酶K及胰蛋白酶的处理后，其抑菌圈大小皆略有减小。这些结果表明，植物乳杆菌CCFM8724的抑菌活性是多方面的，它的酸性代谢产物、过氧化氢、细菌素类或抗生素类物质对抑菌活性都有贡献。

实施例2：植物乳杆菌CCFM8724在肠道上皮细胞上的粘附性实验。

通过下述实验方法确定其粘附性：

(1)肠上皮细胞株HT-29细胞培养

使用RPMI1640培养液(Gibco公司)培养肠上皮细胞株HT-29细胞(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)。HT-29细胞在培养箱里于5％CO₂气氛与温度37℃的条件下进行培养，每培养48h就更换培养液1次，这样连续培养15d。将无菌盖玻片插在6孔细胞培养板中，向孔中加入2mL细胞浓度为2×10⁵个/mL的该细胞培养液，每天更换细胞培养基，直到在盖玻片上形成单层细胞。

(2)粘附实验

将植物乳杆菌CCFM8724在MRS液体培养基中于温度37℃下培养18-20h。取1mL该菌培养液(10⁸CFU/mL)并加入1mLRPMI1640培养液制成2mL细菌悬浮液。从上述6孔细胞培养板中吸出HT-29细胞培养液，用PBS缓冲液(pH＝7.2)清洗HT-29细胞3次。然后将上述2mL乳酸菌RPMI1640 悬液加入到这些培养孔中。该细胞培养板在5％CO₂和95％空气的环境中在温度37℃下培养2h，然后将其细菌悬液吸出，用PBS缓冲液(pH＝7.2)冲洗HT-29细胞5次，用甲醇固定20min，再用PBS缓冲液(pH＝7.2)清洗3次后进行革兰氏染色，于100倍油镜下镜检。随机选取20个视野，计数HT-29细胞上所粘附的植物乳杆菌CCFM8724的数量，计算每100个HT-29细胞所粘附的植物乳杆菌CCFM8724的数量作为粘附指数(AI)，同时以鼠李糖乳杆菌LGG菌株(Lactobacillus rhamnosus GG，ATCC 53103，来自美国典型培养物保藏中心ATCC)作为对照菌株进行对照实验。粘附实验结果列于表3，植物乳杆菌CCFM8724在HT-29细胞上的粘附状况见附图3。

表3：植物乳杆菌CCFM8724在HT-29细胞上的粘附结果

由表3结果可以看出，所述鼠李糖乳杆菌LGG对细胞具有较高的粘附性，植物乳杆菌CCFM8724在HT-29细胞上也有较好的粘附性。植物乳杆菌能够粘附在肠道上皮细胞上是其进一步发挥作用的前提，具有较强粘附能力的植物乳杆菌CCFM8724在肠道定植后，可以有效地防止病原微生物接触和粘附肠粘膜细胞，从而可以预防肠道致病菌引起肠道疾病。

实施例3：植物乳杆菌CCFM8724抑制空肠弯曲杆菌粘附在肠道上皮细胞HT-29上的实验。

实验方法如下：

使用0.2％胰蛋白酶溶液对培养HT-29细胞进行消化，调节细胞浓度至2×10⁵个/mL^-1，然后加到6孔细胞培养板中，每孔2ml，在RPMI1640培养液中于37℃，5％CO₂和95％空气下进行培养。每天更换其细胞培养液，直至形成单层细胞。该单层细胞用PBS缓冲液(pH＝7.2)清洗3次，接着往每个孔中加入植物乳杆菌CCFM8724菌悬液，MOI(感染复数)为200∶1，在温度37℃与5％CO₂和95％空气的条件下培养2h，然后用PBS缓冲液(pH＝7.2)清洗3次，再加入空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni NCTC11168)菌悬液， MOI(感染复数)为200∶1，在温度37℃与5％CO₂和95％的空气条件下继续培养4h。实验结束后，得到的单层细胞用PBS缓冲液(pH＝7.2)洗涤3次，加入0.5mL 0.5％TritonX-100溶液，培育处理8min，随后对经TritonX-100处理过的样品进行梯度稀释，使用哥伦比亚血平板培养基对实验组和对照组的空肠弯曲杆菌数进行标准平板计数，对照组只加空肠弯曲杆菌，每个实验进行3个平行实验，重复进行3次。实验结果列于附图4。

从附图4中可以看到，经过植物乳杆菌CCFM8724处理后，空肠弯曲杆菌粘附的数量比对照组减少近60％，因此，可以认为植物乳杆菌CCFM8724能够有效抑制空肠弯曲杆菌在HT-29细胞上的粘附。

实施例4：植物乳杆菌CCFM8724对人工胃液及人工肠液的耐受性实验

实验方法如下：

(1)人工胃液配制：

取浓度1mol/L稀盐酸16.4ml，加水稀释至50ml，用稀氢氧化钠水溶液将其pH调节至2.0，于是得到一种稀盐酸水溶液，然后按照每100ml稀盐酸水溶液为1g胃蛋白酶(常规市售产品)的比例，往这种稀盐酸水溶液中加入胃蛋白酶，充分溶解后再用0.22μm无菌微孔滤膜进行过滤除菌，即得到人工胃液。

实验方法：

取处于对数中期的植物乳杆菌CCFM8724培养物在6000r/min条件下离心5min，收集其菌体，用PBS缓冲液(pH＝7.2)洗涤两次，然后加入等体积的人工胃液，同时设置对照组，对照组中加入等体积的PBS，于温度37℃的水浴中进行培养2h，每隔30min颠倒摇匀1次，2h后进行标准平板计数。

(2)人工肠液配制：

称取6.8g KH₂PO₄，加蒸馏水500mL进行溶解，用稀氢氧化钠水溶液将其pH调节至6.8，加水至1000mL，于是得到一种稀磷酸钾水溶液，然后按照每100mL这种稀磷酸钾水溶液为0.3g牛胆盐和1g胰蛋白酶的比例，往这种这种稀磷酸钾水溶液中添加牛胆盐和胰蛋白酶(均为常规市售产品)，充分溶解后用0.22μm的无菌微孔滤膜进行过滤除菌，即得到人工肠液。

其实验方法与人工胃液耐受性实验方法相同。

这些实验结果列于表4。

表4：植物乳杆菌CCFM8724对人工胃液及人工肠液的耐受性实验结果(标准平板计数结果的对数值，Log₁₀CFU/mL，平均值±标准偏差)

人们知道，乳酸菌必须进入人的胃肠道才能发挥其功能。因此，研究乳酸菌在胃液中的耐受性是十分必要的。人空腹时，胃液的pH值是0.9-1.8，而进食后是1.8-5.0。食物在胃中的消化时间相对较短，一般为1-2h。本实验采用的人工胃液pH2.0，反应时间为2h。

这些实验结果表明，与对照组相比，植物乳杆菌CCFM8724在pH2.0的人工胃液中的存活菌数没有受到较大的影响，存活性能良好。

人们知道，在小肠中保持一定数量的乳酸菌活菌数是乳酸菌发挥作用的基本条件。小肠液的作用和小肠的蠕动是影响乳酸菌数量的主要因素，小肠液的pH约为7.6，它含有各种酶、胆汁等，其中最主要的是胰蛋白酶。食物通过小肠的时间约为1.5h。

本实验结果表明，植物乳杆菌CCFM8724在经过人工肠液处理2h后，植物乳杆菌CCFM8724的存活数基本没有什么变化，人工肠液对植物乳杆菌CCFM8724没有什么影响，对含胆盐(0.3％)和胰蛋白酶的人工肠液具有良好的耐受性。

由此可见，植物乳杆菌CCFM8724对人工胃液及人工肠液都具有良好的耐受性

实施例5：植物乳杆菌CCFM8724抑制鸡肉中空肠弯曲杆菌生长的实验

其实验方法描述如下：

将空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni NCTC11168)在哥伦比亚血琼脂平板上在温度37℃与5％O₂、10％CO₂和85％N₂的条件下培养48h，传代培养三代，然后吸取适量脑心浸液肉汤加入平板中，用无菌涂布棒刮下表面的细菌，在5000r/min的条件下离心20min，然后用PBS缓冲液(pH＝7.2)清洗后，调整空肠弯曲杆菌浓度至10⁶CFU/mL，备用。将植物乳杆菌CCFM8724在37℃条件下培养18-20h，在5000r/min的条件下离心5min，然后用PBS缓冲液(pH＝7.2)清洗，调整植物乳杆菌CCFM8724浓度至10⁷CFU/mL，备用。

将上述空肠弯曲杆菌菌液涂敷在新鲜鸡肉样品表面(共30个样品)，自然干燥10min，然后将鸡肉样品浸泡于上述植物乳杆菌CCFM8724菌液中10min，随后自然干燥10min。接着将处理的鸡肉样品分成5组，每组5个样品，于温度4℃下分别储存0天、2天、4天、7天、10天。在无菌操作下用刀切取10cm²样品，投入到100ml PBS缓冲液(pH＝7.2)中，经均质后进行梯度稀释，在哥伦比亚血琼脂平板上进行标准平板计数。实验结果列于附图5。

从附图5可以看出，经植物乳杆菌CCFM8724处理后的鸡肉中，空肠弯曲杆菌的数量较对照组明显减少，说明植物乳杆菌抑制了空肠弯曲杆菌在鸡肉中的生长。

应用实施例1：制备含有植物乳杆菌CCFM8724活菌的酸牛奶

将脱脂牛奶在95℃热杀菌20min，然后冷却至温度35℃，再按重量比1∶1∶1接入本发明的植物乳杆菌CCFM8724发酵剂、商业干粉发酵剂保加利亚乳杆菌和商业干粉发酵剂嗜热链球菌，总接种量为原料乳脱脂牛奶的0.03％(重量百分比)，混匀，在温度35℃下保温发酵，凝乳后，在温度4℃下冷藏24h，得到所述的含有植物乳杆菌CCFM8724活菌的酸牛奶。

应用实施例2：制备含有植物乳杆菌CCFM8724活菌的果蔬饮料

选用新鲜蔬菜清水洗净后使用常规榨汁设备进行榨汁，接着在温度140℃下进行高温热杀菌2s，然后立即降温到37℃，再接入本发明的植物乳杆菌CCFM8724发酵剂，使其浓度达到10⁶CFU/mL以上，在4℃冷藏保存，得到含植物乳杆菌CCFM8724活菌的果蔬饮料。

应用实施例3：制备含有植物乳杆菌CCFM8724的发酵青贮饲料

选取新鲜的作物秸秆为原料，原料经过切碎后，加入本发明的植物乳杆菌CCFM8724发酵剂，使其浓度达到10⁶CFU/g以上，打捆包装，于密封环境中进行发酵，发酵时间为3-5日，得到含植物乳杆菌CCFM8724的发酵青贮饲料。

应用实施例4：制备含有植物乳杆菌CCFM8724的发酵黄瓜

选用新鲜的黄瓜洗净晾干后切条，装入坛中，按照黄瓜与本发明的植物乳杆菌CCFM8724发酵剂的重量比100∶0.05，将植物乳杆菌CCFM8724发酵剂加入黄瓜中，再按照黄瓜与食盐水重量比1∶30加入浓度为5％(重量百分比)的食盐水，并加入适量的调味料，用竹条压住黄瓜避免上浮，密封，于温度30℃下发酵10天，得到含植物乳杆菌CCFM8724的腌制黄瓜制品。

应用实施例5：制备含有植物乳杆菌CCFM8724的片剂

分别称取本发明植物乳杆菌CCFM8724菌剂粉剂25.7重量份、淀粉55.0重量份、纤维素衍生物4.5重量份、羧甲基淀粉钠12.0重量份、滑石粉0.8重量份、蔗糖1.0重量份与水1.0重量份，混合，采用常规方法制成湿颗粒，然后使用中南制药机械厂生产的压片机进行压片，然后使用青州市益康中药机械有限公司生产的小型药物干燥机中进行干燥，再包装得到本发明的片剂。

应用实施例6：制备含有植物乳杆菌CCFM8661的丸剂

分别称取本发明植物乳杆菌CCFM8661菌剂粉剂32.2重量份、微晶纤维素48.0重量份、聚乙烯吡咯烷酮4.5重量份、碳酸钙10.0重量份、硬脂酸镁2.8重量份、卵磷脂1.3重量份与乙醇1.2重量份，混合均匀，再加入常规量炼蜜制成本发明的丸剂。

Claims

1.一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CCFM8724，该菌株已于2011年11月29日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo.5492，它具有下述性质：

（1）体外抑制空肠弯曲杆菌的生长；

（2）具有耐酸性，在pH2.0时存活良好;

（3）具有耐胆盐能力，能耐受的胆盐水平达0.3%;

（4）对肠道上皮细胞具有较好的粘附能力；

（5）体外抑制空肠弯曲杆菌粘附肠道上皮细胞；

（6）抑制空肠弯曲杆菌在鸡肉中的生长。

2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌CCFM8724在制备发酵食品中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述的发酵食品是使用含有植物乳杆菌CCFM8724的发酵剂生产的乳制品、豆制品与果蔬制品。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的发酵剂是采用下述方法制备得到的：

制备具有下述组成的培养基：以该培养基总重量计10%酶水解脱脂乳、0.5%葡萄糖、1.5%胰蛋白胨、0.3%酵母浸膏和余量水，所制备培养基的pH是6.8；

制备具有下述组成的保护剂：100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/LL-谷氨酸钠和余量水；

将植物乳杆菌CCFM8724菌种按照以所述培养基重量计2-4%接种量接种于在温度110-120℃下灭菌8-12min的所述的培养基中，然后在温度37℃下培养18h，用pH7.2磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用所述的保护剂重悬使植物乳杆菌CCFM8724浓度达到10⁹CFU/ml；接着，让该悬浮液在温度37℃下预培养60min，再采用冷冻干燥方法制成所述的发酵剂。

5.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于所述的发酵剂含有10⁹CFU/g以上活性植物乳杆菌CCFM8724。

6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的乳制品是酸牛奶、酸奶油或干酪；所述的豆制品是酸豆乳、豆豉、豆酱或酱油；所述的果蔬制品是发酵的黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜制品。