CN105505814B

CN105505814B - 一株延缓衰老的植物乳杆菌

Info

Publication number: CN105505814B
Application number: CN201510866376.5A
Authority: CN
Inventors: 徐锋; 魏华; 蔚晓敏; 杨栋; 吴姚平; 裘梁; 王登远
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2015-11-30
Filing date: 2015-11-30
Publication date: 2020-01-17
Anticipated expiration: 2035-11-30
Also published as: CN105505814A

Abstract

本发明公开了一株新的，具有很强抗氧化活性的植物乳杆菌CCTCC NO:M 2015589，分离自健康长寿老人粪便，为革兰氏阳性菌，有强的清除自由基能力，可以增强生物体内抗氧化酶活性，增强衰老小鼠血清和肝脏中抗氧化酶的活性，延缓衰老，并且具有优秀的耐胆盐性能。可作微生物菌剂、食品添加剂，改善宿主胃肠道健康。

Description

一株延缓衰老的植物乳杆菌

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及新的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株及其益生功能，尤其是用于清除自由基和延缓衰老的功能。

背景技术

肠道菌群作为虚拟“器官”，影响着人体的发育生长、营养与健康，甚至其与代谢性疾病(肠易激综合症，炎症性肠病，心血管疾病，糖尿病，肥胖等)密切相关，肠道菌群与人体健康乃至长寿的关联性。

湖南省浏阳市高田村地理位置相对封闭，其村民不仅长寿，而且普遍没有慢性疾病。与此形成鲜明对比的是，周边地区既无长寿现象，而且心血管疾病，慢性肠胃炎和癌症等疾病时有发生。

乳酸菌可调节机体胃肠道菌群平衡，提高机体免疫力降低血清胆固醇，降血压，抗氧化抑制肿瘤发生等方面的特殊生理活性。长双歧杆菌BBMN68分离自广西巴马长寿老人粪便，其活菌液对便秘模型小鼠有润肠通便作用，提高免疫力。唾液乳杆菌FDB86可以缓解二甲肼对肠道菌群的不良影响，使肠道菌群趋近于正常状态，对结肠癌大鼠肠道菌群变化的调节作用。另外生物氧化是机体新陈代谢的重要生理过程，但此过程中会产生多种自由基，自由基的累积，会照成体内氧化损伤逐渐增多，导致老年慢性病发生，而清除过多的自由基可以延缓衰老。

目前为止，没有报道来源于长寿老人肠道的植物乳杆菌物种的菌株，具有对自由基的清除作用及延缓衰老的功能。

发明内容

现在，本发明人鉴定了一种新的植物乳杆菌ZDY03菌株，是一类厌氧，不产孢子的革兰氏阳性菌，菌体呈短杆状，在MRS琼脂平板培养基中呈乳白色，圆形，光滑的菌落。植物乳杆菌ZDY03可以在MRS肉汤培养基上生长，是革兰氏阳性菌。

植物乳杆菌ZDY03对0.4％H₂O₂有较高的耐受能力，在8h后，ΔOD>0.9，具有极强的耐受性，清除自由基(DPPH、羟基自由基、超氧阴离子等)的能力表现优秀。

ZDY03还可以提高衰老小鼠的血清和肝脏中抗氧化酶活性，降低血清和肝脏中有害代谢产物(如：丙二醛)的含量，延缓小鼠的衰老症状。

菌株对模拟胃液和模拟肠液有较好的耐受性。

本发明的植物乳杆菌ZDY03作为益生菌，不仅具有极强的清除自由基能力，且有良好的耐胆盐性，能缓解D-半乳糖诱导小鼠的不良症状，延长自然衰老小鼠寿命，促进宿主健康。是一株性能优良的菌种。因此具有很高的研究价值和应用价值。

本发明植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株ZDY03，于2015年9月30日保藏在中国典型培养物保藏中心(中国武汉武汉大学)，编号：CCTCC NO:M 2015589。

一种微生物菌剂，含有权利要求1所述植物乳杆菌菌株ZDY03。

包含所述的植物乳杆菌的乳制品、蔬菜制品及饮料制品。

一种组合物，包括所述的植物乳杆菌菌株，或通过所述的方法所获得的微生物菌剂，或通过所述的方法获得的乳制品、蔬菜制品及饮料制品。

所述的组合物是食品，保健品或护肤品。

本发明所述植物乳杆菌可用于制作治疗和预防肠道疾病的组合物成分，还可以用于食品和饲料的添加剂。

附图说明

图1植物乳杆菌ZDY03发酵上清液，菌株和酸奶对DPPH的清除能力

图2植物乳杆菌ZDY03发酵上清液，菌株和酸奶对羟基自由基的清除能力

图3植物乳杆菌ZDY03发酵上清液，菌株和酸奶对超氧阴离子的清除能力

图4植物乳杆菌ZDY03发酵上清液，菌株和酸奶的总还原力评价

图5植物乳杆菌ZDY03对模拟胃液的耐受性

图6植物乳杆菌ZDY03对模拟肠液的耐受性

图7植物乳杆菌ZDY03对肠上皮细胞HT-29的基因表达的影响

图8植物乳杆菌ZDY03对D-半乳糖小鼠血清中抗氧化酶和丙二醛(MDA)的影响

图9植物乳杆菌ZDY03对D-半乳糖小鼠肝脏中抗氧化酶和丙二醛(MDA)的影响

图10植物乳杆菌ZDY03对D-半乳糖小鼠小肠基因表达的影响

图11植物乳杆菌ZDY03对衰老小鼠寿命的影响

具体实施方式

以下结合实例来进一步解释本发明，但实施例仅用于说明本发明，而本发明的应用范围不能以任何方式由这些实施例所限制。

实施例1：植物乳杆菌ZDY03的分离与鉴定

植物乳杆菌ZDY03是从健康长寿老人的粪便(取样地：湖南省浏阳市高田村)中分离。取1g粪便溶于10mL10％蛋白胨溶液中，充分溶解，滤纸滤去残渣，滤液用5000rmp离心10min，弃去上清，收集沉淀，用1mL10％蛋白胨水重悬。按1％接种到MRS液体培养基中，过夜培养。培养液采用10倍梯度稀释，梯度稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8和10^-9，每个梯度取1mL分别均匀涂布于MRS肉汤的琼脂平板上，37℃厌氧培养48h。挑取单菌落，在平板上划线分离，反复进行纯化培养，用革兰氏染色法观察菌落形态选出革兰氏阳性菌。将分离得到的菌株液体培养后，平板培养，用接种环挑取单一的菌落作为模板，进行菌落PCR。将阳性PCR产物送至公司测序。

将所分离菌菌株的16S rRNA碱基序列分析测序碱基序列进行比对分析，发现与数据库里的植物乳杆菌序列一致(该碱基序列见序列表)，并保存于武汉市中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2015589。

本发明植物乳杆菌ZDY03菌株，是一类厌氧，不产孢子的革兰氏阳性菌，菌体呈短杆状，在MRS琼脂平板培养基中呈乳白色，圆形，光滑的菌落。植物乳杆菌ZDY03可以在MRS肉汤培养基上生长，是革兰氏阳性菌。

实施例2：菌株对氧胁迫的耐受性

将新鲜培养的菌株以1％的比例接种到含0.4mmol/L H₂O₂的MRS液体培养基中，37℃厌氧培养8h，分别测定0h与8h的OD₆₃₀，检测菌株对H₂O₂的耐受性。

结果表明：ΔOD>0.9，具有极强的耐受性。

实施例3：菌株和发酵上清液清除DPPH自由基能力

按照接种量为1％接入MRS培养基中，厌氧37℃培养18h，6000r/min离心10min，分别收集发酵上清液和菌体。菌体用PBS(pH7.2)溶液洗涤2次，再用PBS溶液重悬至乳酸菌数为10⁹cfu/mL。发酵上清和重悬的菌体作为清除自由基试验的样品。

2mL样品中加入2mL DPPH无水乙醇溶液(0.2mmol/L)混合均匀，室温避光反应30min，6000r/min离心10min，取上清液于517nm处测定吸光度值A_i；空白组以等体积无水乙醇代替DPPH无水乙醇溶液A_o，对照组以等体积空白溶剂代替样品溶液A_j，并以等体积蒸馏水和乙醇混合液空白调零。清除率(％)＝100-(A_i-A_o)/A_j×100

实验结果：

如图1所示植物乳杆菌ZDY03的发酵上清液，菌株和酸奶对DPPH自由基的清除率均达到60％，其中酸奶对DPPH自由基的清除能力的最强。

实施例4：菌株和发酵上清液清除羟基自由基的能力

0.5mL的邻二氮菲(6mmol/L)，0.5mL的FeSO₄溶液(6mmol/L)与1.0mL的PBS溶液(pH7.2)混匀。再向此体系中加入0.5mL样品和0.5mL 0.1％过氧化氢，用双蒸水将总体积定容至4.0mL。混匀后在37℃下孵育1h，于536nm下读取吸光度。羟自由基的清除率按下式计算：清除率(％)＝[(A_s-A_o)/(A-A_o)]×100

A_s：样品的吸光度值；A_o：用H₂O替代样品；A：用H₂O替代H₂O₂和样品

实验结果：

见图2，结果表明，植物乳杆菌ZDY03的发酵上清液，菌株和酸奶对羟基自由基的清除率中，发酵上清最高，其次为酸奶。

实施例5：菌株和发酵上清液清除超氧阴离子的能力

A₁₁组：2mL Tris-HCl缓冲液(150mM pH 8.0)中加入1mL邻苯三酚溶液，再加入0.5mL样品；A₁₀组：用1mL蒸馏水取代邻苯三酚溶液；A₀₁组：用0.5mL蒸馏水取代样品；A₀₀组：用1.5mL蒸馏水取代1mL邻苯三酚和0.5mL样品；混匀，室温反应30min后于325nm处测定吸光值；记录数据并计算清除率：

清除率(％)＝[1-(A₁₁-A₁₀)/(A₀₁-A₀₀)]×100

实验结果：

如图3所示，植物乳杆菌ZDY03的发酵上清液对超氧阴离子自由基的清除率超过90％，清除能力最强。

实施例5：菌株和发酵上清液总还原力测定

0.5mL 0.2M PBS溶液(pH 6.6)中加入0.5mL 0.1％的铁氰化钾溶液和0.5mL样品；充分混匀，50℃保温20min；加入等体积的10％三氯乙酸，3000g离心10min；取1mL上清，加入0.175mL 0.1％FeCl₃溶液，混合均匀，反应10min；700nm处测定吸光值。

实验结果：

如图4所示，植物乳杆菌ZDY03的发酵上清液的OD₇₀₀达到1.3，总还原能力最强，菌株和酸奶的总还原力能力相对较弱。

实施例6：菌株对模拟胃液的耐受性评价

模拟胃液：将磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 2.2)中添加胃蛋白酶使终浓度为3mg/mL，现用现配。将对H₂O₂耐受性高的菌株，5000rmp离心10min，菌体洗涤两次，菌体洗涤两次后重悬于模拟胃液中，保持菌浓度相同，37℃厌氧孵育30min。在0min和30min分别用MRS固体培养基活菌计数。

实验结果：

如图5所示，植物乳杆菌ZDY03在模拟胃液中30min，数量级降低一个水平，仍能对模拟胃液保持较高的耐受性。

实施例7：菌株对模拟肠液的耐受性的评价

模拟肠液：将PBS缓冲液pH调节为8.0，并添加0.45％胆盐，终浓度为1mg/mL的胰蛋白酶，现用现配。将耐H₂O₂的菌株，5000rmp离心10min，菌体洗涤两次后重悬于模拟肠液中，保持菌浓度相同，37℃共孵育2h。0h和2h分别用MRS固体培养基活菌计数。实验结果：

如图6所示，植物乳杆菌ZDY03在模拟肠液中2小时后，没有数量级的变化，能极好的耐受模拟肠液。

实施例8：菌株对肠上皮细胞的抗氧化基因的作用

将细胞培养瓶中培养好的HT-29细胞分别与植物乳杆菌ZDY03共孵育2h，提细胞的RNA，反转录后，用q-PCR检测基因的表达情况。

实验结果：

如图7所示，与植物乳杆菌ZDY03共孵育后，HT-29细胞中与抗氧化及细胞分化的相关基因均上调，表明，植物乳杆菌ZDY03对基体具有一定的抗氧化作用。

实施例9：菌株对D-半乳糖诱导小鼠的作用

5周大的BALB/c小鼠，饲养一周后，其中20只用50mg/kg的D-半乳糖腹腔注射30天，30天后，以10只为一组，实验组(ZDY308)：灌胃植物乳杆菌ZDY03共28d，并同时腹腔注射D-半乳糖；对照组(D-gal)：灌胃与菌株重悬液相同体积的PBS缓冲液。10只为空白组(NC)：腹腔注射与D-半乳糖同等剂量的生理盐水，30天后灌胃与菌株重悬液同体积的PBS缓冲液，同时持续腹腔注射，共28天。灌胃结束的第二天，眼眶采血后，劲椎脱臼法处死小鼠，分别取肝脏和小肠，用于后续实验。

实验结果：

如图8和9所示，血清和肝脏中抗氧化酶SOD和GSH-PX的含量均增加，丙二醛减少，说明，植物乳杆菌ZDY03能缓解D-半乳糖对小鼠的氧化损伤。

如图10所示，植物乳杆菌ZDY03提高了小鼠肠上皮细胞抗氧化基因的表达量，进一步从分子机制证明了植物乳杆菌ZDY03对小鼠氧化损伤的缓解作用。

实施例10：菌株对自然衰老小鼠衰老的延缓作用

8周大的BALB/c小鼠，随机分两组，每组10只，实验组(ZDY03)：灌胃植物乳杆菌ZDY03至小鼠衰老自然死亡；对照组：灌胃同等体积的生理盐水至小鼠自然死亡。分别统计两组小鼠的生长寿命，并做比较分析。

实验结果：

如图11所示，持续灌胃植物乳杆菌ZDY03的小鼠的寿命较对照组延长了125天，可见，该菌株对自然衰老也有延缓的效果。

Claims

1.一株保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC 的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum )菌株ZDY03，保藏编号：CCTCC M 2015589。

2.一种微生物菌剂，其特征在于含有权利要求1所述植物乳杆菌菌株ZDY03。

3.包含自权利要求1所述的植物乳杆菌的乳制品、蔬菜制品及饮料制品。

4.一种组合物，包括权利要求1所述的植物乳杆菌菌株，或权利要求2所述的微生物菌剂，或权利要求3所述的乳制品、蔬菜制品及饮料制品。

5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于其是食品，保健品。