发明内容
本发明目的在于提供具有优异体外抑制α-葡萄糖苷酶活性能力的益生菌菌株及其应用。
本发明提供了1株植物乳杆菌Grx16(Lactobacillus plantarum.Grx16),该菌具有优秀体外抑制α-葡萄糖苷酶活性能力,保藏号是CGMCC NO.10921。
本发明经试验证明,该菌株耐人工胃液及胆盐,具有优秀的体外抑制α-葡萄糖苷酶活性能力,同时具有较强的还原能力、DPPH自由基清除能力优秀且耐药性较低;并通过生理生化、API试剂条和16S rDNA 序列比对分析将该菌株鉴定为植物乳杆菌。
本发明还提供了植物乳杆菌Grx16(Lactobacillus plantarum.Grx16)在制备具有抑制α-葡萄糖苷酶活性能力的发酵乳中的应用。
本发明还提供了植物乳杆菌Grx16(Lactobacillus plantarum.Grx16)在制备具有抑制α-葡萄糖苷酶活性能力的发酵骆驼乳中的应用。
本发明的植物乳杆菌Grx16(Lactobacillus plantarum.Grx16)具有优秀的体外抑制α-葡萄糖苷酶活性能力,并耐人工胃液及胆盐,同时具有较强的还原活性、DPPH自由基清除能力,对多种抗生素敏感,可用于制备发酵乳与功能食品研发,具有很好的市场前景。
实施例一:菌株的分离、筛选方法及鉴定。
1、样品采集
采集广西巴马长寿村中长寿人群及其家族人群样品,加入1mL灭菌液体石蜡油密封后,迅速置于冰盒内,分离样品中的乳酸菌。
2、乳酸菌的分离
将采集的样品经梯度稀释后,分别接种于MRS固体培养基、LBS固体培养基和PTYG固体培养基中, 37℃厌氧培养48h,挑取平板上的典型菌落,划线分离得到纯菌落。挑取各平板上的纯菌落于MRS液体培养基中,37℃厌氧培养24h后,4℃冰箱冷藏备用或冻干保藏。
3、乳酸菌的生理生化试验
对分离到的乳酸菌进行革兰氏染色,于显微镜下观察菌体形态,并进行接触酶、运动性、硝酸盐还原及吲哚等生理生化试验。
结果表明,从采集的样品中分离获得197株菌株,通过生理生化试验发现180株菌革兰氏染色为阳性,形状为杆状、短杆状或球状,在15℃及45℃环境下均能生长,接触酶、运动性、硝酸盐还原、吲哚、产 H2S及明胶液化试验均为阴性,所以将180株菌初步鉴定为乳酸菌。
4、乳酸菌凝乳性的筛选
将180株试验菌株活化后接种于脱脂乳中,37℃静置48h,并观察凝乳状况,所有菌株的凝乳情况见表 1。
表1试验乳酸菌发酵24h凝乳情况
注:++为凝固,且凝乳质地均匀细致,凝乳时间较短,凝块结实,无乳清析出;+为凝固,但凝块不结实,凝乳时间较长,乳清析出较多.
结果显示,180株乳酸菌中,有136株在48h内凝乳,并且各菌株的凝乳时间有较大的差异。因此将筛选出的136株乳酸菌用于进一步筛选试验。
5、乳酸菌耐酸耐胆盐能力的测定
将活化好的乳酸菌制成菌悬液,取1.0mL的菌悬液接种至9.0mL的pH3.0人工胃液中,37℃培养,分别在0h和3h用平板计数法测定活菌数,计算其存活率(%)。
存活率(%)=3h的活菌数/0h的活菌数×100%
将活化好的乳酸菌按3%的接种量分别接种至含0.00%(即空白)、0.10%、0.30%及0.50%胆盐的MRS 培养基中,37℃培养,分别在0h和3h用平板计数法测定活菌数,计算其存活率(%)。
存活率(%)=3h的活菌数/0h的活菌数×100%
乳酸菌的活菌浓度必须达到106cfu/mL才能在肠道中发挥生理功能,所以乳酸菌在进入人体消化道后,需要具有同时能够耐受较低的pH以及较高浓度的胆盐能力。而分离的乳酸菌需要在人体内存活,则需要测试在模拟人体肠液和胃液的人工肠液、胃液中的存活率,筛选出的136株凝乳性能较好的乳酸菌中25 株乳酸菌对人工胃液、人工胆盐和人工肠液的耐受率处于较高的水平,部分结果见表2。
表2乳酸菌的耐酸耐胆盐能力
结果表明,25株菌株在pH为3.0的人工胃液中均有一定的耐受性,且存活率均大于70%,其中菌株Y6、 R10、R4、M4存活率大于70.0%。菌株对胆盐均有一定的耐受性,存活率在36.0%-50.0%之间,而菌株Y1、 R4、G5、G6、S8存活率均大于47.0%。而对人工肠液耐受能力较好的菌株有R7、Y1、Y4、Y6、D12等,而在人工肠液中25株菌株存活率均大于45%。
6、乳酸菌体外抗氧化能力的测定
取发酵液上清2mL,加入2mLDPPH·无水乙醇溶液(0.2mmol/L),摇匀,避光反应30min,6000r/min 离心10min,取上清液于517nm处测定吸光度值Ai;以等体积无水乙醇代替DPPH·无水乙醇溶液为Aj,以等体积空白溶剂代替样品溶液为Ac,并以等体积蒸馏水和乙醇混合液调零,测定菌株的DPPH·自由基清除率。
取发酵液上清0.5mL与0.5mLPBS缓冲液(0.2mol/L,pH6.6)混合,再加入0.5mL铁氰化钾(1%) 混匀后于50℃水浴20min,迅速冷却后加入0.5mL三氯乙酸(10%),3000r/min离心10min,取上清液1mL,加入1mL蒸馏水和1mL FeCl3(0.1%),混匀,反应10min,在700nm处测吸光度。25株乳酸菌体外抗氧化能力见表3。
表3菌株抗氧化能力测定结果
结果表明,25株乳酸菌发酵液对DPPH自由基菌具有一定清除能力,清除率在25%~82%之间,且这 25株菌株发酵液均具有一定还原能力,还原能力在0.7~2.8之间,根据72株益生菌的自由基清除能力和还原能力范围,选择羟自由基清除率大于50%,DPPH自由基清除率大于60%,A700nm值大于1.7的菌株,共有12株,对其益生特性进行进一步研究。
7、乳酸菌抗生素敏感试验
使用药敏纸片法检测菌株对抗生素的敏感性,抗生素及纸片浓度见表4。
吸取1.0mL菌悬液加入到15.0mL灭菌并融化后的MRS固体培养基中(40-50℃),于漩涡振荡混合器上混和均匀后迅速倾注到100mm×H20mm无菌平皿中,摇匀,待平板凝固后贴放标准药物纸片,在37℃恒温培养箱中倒置培养,48h后测量并记录抑菌圈直径,根据CLSI制定的《抗菌药物敏感性试验执行标准》 (2010版)判定乳酸菌对抗生素的耐药性,结果见表4。
表4乳酸菌的耐药性
注:R为耐药,M为中度敏感,S为敏感。
结果显示,12株乳酸菌对阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素均有耐药性,对哌拉西林、庆大霉素、呋喃妥因、万古霉素、苯唑西林、头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻肟、头孢哌酮、新霉素、红霉素表现出不同的耐药性。由于实验菌株是从较少服用抗生素的长寿人群中获得,所以对抗生素的药敏性较强。因此筛选耐药性较低的M11、B3、G9、R9、grx16、D12、D11、G5、R10、M4进行下一步体外降血糖能力测定。
8、乳酸菌α-葡萄糖苷酶抑制能力筛选
从12株乳酸菌筛选药敏性较高的10株菌株,测定其对α-葡萄糖苷酶活性抑制能力,筛选出对α-葡萄糖苷酶活性抑制能力较高的6株乳酸菌,其抑制率分布如表5所示。
表5抑制率分布表
结果显示,菌种Grx16、G9、D12、M11、R9、R10对α-葡萄糖苷酶有较高的抑制活性,且菌株Grx16、 M11、G9的抑制率分别达到89.47%、84.21%、84.96%。获得一株对α-葡萄糖苷酶活性抑制能力最强的菌株Grx16,可利用其研制具有降血糖功效的发酵乳。
9、乳酸菌的鉴定
经过筛选获得具有度α-葡萄糖苷酶最强抑制能力,且具有耐酸耐胆盐能力、体外抗氧化能力以及对多种抗生素敏感,因此对该菌株进行鉴定。
(2)革兰氏染色试验
本发明菌株Grx16形状为短杆状,如图1。
(2)糖发酵试验
对照《伯杰氏细菌鉴定手册》,对筛选出的菌株进行糖发酵初步鉴定,结果如表6。
表6菌株糖发酵试验结果
注:“+”表示阳性;“-”表示阴性。
(3)API鉴定
筛选获得的乳酸菌利用API50CHL系列鉴定试验条进行鉴定,所有操作按照说明书中的操作方法进行,结果如表7所示。
表7 API50CHL系统鉴定结果
注:“+”表示阳性;“-”表示阴性
将API鉴定产生的生化图谱提交数据库进行在线比对,可以得出此株乳酸菌的菌种名称及鉴定率,结果见表8。
表8 API比对结果
(4)菌株16S rDNA测序鉴定
以菌株Grx16基因组DNA作为PCR扩增的模板,采用通用的16S rDNA引物进行PCR扩增,扩增结果见图2 。电泳检测扩增产物后,送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。将测序得到的序列与GenBank数据库中的序列进行比对分析,结果见表9。
表9 16S rDNA比对结果
结合生理生化试验、API试剂条鉴定及16S rDNA测序鉴定,将本发明菌株grx16定为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum.)。