CN105053202B - 一种具有辅助降血糖功能的高品质发酵驼乳制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有辅助降血糖功能的高品质发酵驼乳制备方法，该方法是利用植物乳杆菌Grx16(Lactobacillus plantarum Grx16)并组合其他菌株作为发酵剂，制备具有辅助降血糖功能的发酵驼乳。特别是植物乳杆菌Grx16、干酪乳杆菌grx12、德氏乳杆菌保加利亚亚种grx33和发酵乳杆菌grx07以1:1:1:1(v/v)的比例混合作为发酵剂，发酵制备的发酵驼乳不仅风味良好，且后酸化较弱，同时具有降低糖尿病大鼠血糖的作用，还能够改善糖尿病大鼠的血脂水平，提高其抗氧化能力。

Description

一种具有辅助降血糖功能的高品质发酵驼乳制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高品质发酵驼乳制备方法。

背景技术

糖尿病是一种由遗传、生活、环境等因素相互作用而引起的胰岛素分泌绝对不足或相对不足的疾病，常见发病特征为机体内在糖、脂肪和蛋白代谢紊乱，外在表现为多饮、多食、多尿和体重下降。同时糖尿病还会诱发各种并发症，据统计，糖尿病的全球发病率均在飙升，预计到2030年全球患者人数将增至3.66亿，糖尿病已被列为世界第三大慢性非传染性疾病。

目前，糖尿病的治疗方法主要包括外科手术、药物和非药物治疗。糖尿病药物治疗又分为两大类，即胰岛素治疗和口服降糖药治疗。口服降糖西药包括双胍类药物、磺脲类药物、噻唑烷二酮药物、非磺脲类药物和α-葡萄糖苷酶抑制剂5大类。尽管近年来这些口服降糖西药有了迅速的发展，但它们基本上只起到了单一的促进降糖作用，不能改善机体的其它机能，对糖尿病的并发症基本上没有治疗的效果，而且这些药物都存在着不同程度的副作用，即使直接使用胰岛素注射也可引发注射部位肌肉萎缩、视力模糊等副作用，这使得药物和胰岛素治疗在临床应用中受到了很大程度的限制。

近年来，多种乳酸菌已被证实应用于动物模型和临床试验中对糖尿病具有预防或治疗的作用，乳酸菌通过调节机体内相关酶的活性，调节体内糖代谢，是一种安全有效的微生物调节剂，作用温和且几乎无毒副作用，开辟了有效防治糖尿病及并发症的研究新思路，成为该领域新的研究热点。本研究利用天然骆驼乳在调节血糖方面的优势，利用筛选出的具有优秀体外α-葡萄糖苷酶抑制能力的乳酸菌进行发酵，进而制备出具有调节血糖、促进身体健康功能的保健型发酵食品类，逐渐开创我国功能食品消费的新市场。

发明内容

本发明目的在于提供一种具有辅助降血糖功能的高品质发酵驼乳的制备方法，通过该方法制备的发酵驼乳酸甜适口，口感细腻，并具有辅助降血糖的功能。

本发明是通过以下技术方案进行的：纯驼乳中添加3％-6％(w/w)蜂蜜，添加2％-4％(w/w)低聚果糖，经均质，适当热处理后，接种混合菌种发酵剂，再经发酵制备而成。

本发明所述混合乳酸菌发酵剂菌株包括：植物乳杆菌Grx16(Lactobacillusplantarum Grx16)，保藏号是CGMCC NO.10921；干酪乳杆菌grx12(Lactobacillus caseigrx12)，保藏号是CGMCC NO.7696，专利申请号是CN201310312784.7；德氏乳杆菌保加利亚亚种grx33(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus grx33)，保藏号是CGMCCNO.7694，专利申请号是CN201310310725.6；发酵乳杆菌grx07(Lactobacillus fermentumgrx07)，保藏号是CGMCC NO.8874，专利申请号是CN201410156237.9。

本发明所述混合乳酸菌发酵剂的菌株由植物乳杆菌grx16、干酪乳杆菌grx12、德氏乳杆菌保加利亚亚种grx33和发酵乳杆菌grx07组成，其混合比例为1:1:1:1(v/v)。

本发明制备的发酵驼乳，通过对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠模型，以格列美脲为药物对照组，研究骆驼乳和发酵驼乳的体内的辅助降血糖效果。结果表明，相对于模型组，发酵驼乳能够显著改善糖尿病大鼠的饮水量、采食量和体重(P<0.05)；干预第4周后，大鼠血糖浓度下降了17.87％，且效果显著(P<0.05)，同时提高了糖尿病大鼠的葡萄糖耐受量，其血液的糖化血红蛋白(HbA1c)和果糖胺(FMN)水平显著低于模型组(P<0.05)，由此表明骆驼发酵乳在降低大鼠血糖的同时，还能够改善糖尿病大鼠的血脂水平，提高其抗氧化能力。

附图说明

图1为本发明菌株的形态图。

图2为本发明菌株16S rDNA PCR扩增产物电泳图；泳道M：100+2+3Kb DNA maker；泳道1为：grx16 16S rDNA扩增产物。

图3(a)为菌株组合A1、A2、A3、A4、A5、A6的生长曲线；

图3(b)为菌株组合A7、A8、A9、A10、B1、B2的生长曲线；

图3(c)为菌株组合B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9的生长曲线；

图3(d)为菌株组合B10、C1、C2、C3、C4、C5、D1的生长曲线。

图4为11种不同菌株组合的表观粘度随剪切时间变化曲线。

图5(a)为B1、B4、B5菌株组合的发酵驼乳表观粘度随剪切速率变化曲线；

图5(b)为B7、B8、B10菌株组合的发酵驼乳表观粘度随剪切速率变化曲线；

图5(c)为C1、C2、D1菌株组合的发酵驼乳表观粘度随剪切速率变化曲线；

图5(d)为C3、C5菌株组合的发酵驼乳表观粘度随剪切速率变化曲线。

图6(a)为B1、B4、B5菌株组合的发酵驼乳G'和G”的扫描图；

图6(b)为B7、B8、B10菌株组合的发酵驼乳G'和G”的扫描图；

图6(c)为C1、C2菌株组合的发酵驼乳G'和G”的扫描图；

图6(d)为C3、C5、D1菌株组合的发酵驼乳G'和G”的扫描图。

图7A为发酵驼乳对糖尿病大鼠采食量的影响。

图7B为发酵驼乳对糖尿病大鼠饮水量的影响。

图8发酵驼乳对糖尿病大鼠和平均体重的变化影响。

图9发酵驼乳对糖尿病大鼠葡萄糖耐受量的影响。

植物乳杆菌Grx16(Lactobacillus plantarum.Grx16)，于2015年8月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum.保藏号是CGMCC NO.10921。

具体实施方式

本研究采用传统涂布平板法从广西巴马长寿村采集的样品中分离乳酸菌，通过模拟人体胃肠道环境筛选出耐酸耐胆盐能力较强的菌株，并研究其还原活性、DPPH自由基清除能力以及耐药性，最后通过体外试验筛选出具有较高α-葡萄糖苷酶抑制能力的菌株，并组合其他菌株作为发酵剂，制备具有辅助降血糖功能的高品质发酵驼乳。

1.样品采集

采集广西巴马长寿村中长寿人群及其家族人群的粪便样品，加入1mL灭菌液体石蜡油密封后，迅速置于冰盒内，分离样品中的乳酸菌。

2.乳酸菌的分离

将采集的样品经梯度稀释后，分别接种于MRS固体培养基、LBS固体培养基和PTYG固体培养基中，37℃厌氧培养48h，挑取平板上的典型菌落，划线分离得到纯菌落。挑取各平板上的纯菌落于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h后，4℃冰箱冷藏备用或冻干保藏。

3.乳酸菌的生理生化试验

对分离到的乳酸菌进行革兰氏染色，于显微镜下观察菌体形态，并进行接触酶、运动性、硝酸盐还原及吲哚等生理生化试验。

结果表明，从采集的样品中分离获得197株菌株，通过生理生化试验发现180株菌革兰氏染色为阳性，形状为杆状、短杆状或球状，在15℃及45℃环境下均能生长，接触酶、运动性、硝酸盐还原、吲哚、产H₂S及明胶液化试验均为阴性，所以将180株菌初步鉴定为乳酸菌。

4.乳酸菌凝乳性的筛选

将180株试验菌株活化后接种于脱脂乳中，37℃培养48h，并观察凝乳状况，所有菌株的凝乳情况见表1。

表1试验乳酸菌发酵24h凝乳情况

注：++为凝固，且凝乳质地均匀细致，凝乳时间较短，凝块结实，无乳清析出；+为凝固，但凝块不结实，凝乳时间较长，乳清析出较多.

结果显示，180株乳酸菌中，有136株在48h内凝乳，并且各菌株的凝乳时间有较大的差异。因此将筛选出的136株乳酸菌用于进一步筛选试验。

5.乳酸菌耐酸耐胆盐能力的测定

乳酸菌的活菌浓度必须达到10⁶cfu/mL才能在肠道中发挥生理功能，所以乳酸菌在进入人体消化道后，需要具有同时能够耐受较低的pH以及较高浓度的胆盐能力。而分离的乳酸菌需要在人体内存活，则需要测试在模拟人体肠液和胃液的人工肠液、胃液中的存活率，对筛选出的136株凝乳性能较好的乳酸菌进行耐酸耐碱能力的测定，其中25株乳酸菌对人工胃液、人工胆盐和人工肠液的耐受率处于较高的水平，部分结果见表2。

表2乳酸菌的耐酸耐胆盐能力

结果表明，25株菌株在pH为3.0的人工胃液中均有一定的耐受性，且存活率均大于70％，其中菌株Y6、R10、R4、M4存活率大于70.0％。菌株对胆盐均有一定的耐受性，存活率在36.0％-50.0％之间，而菌株Y1、R4、G5、G6、S8存活率均大于47.0％。而对人工肠液耐受能力较好的菌株有R7、Y1、Y4、Y6、D12等，而在人工肠液中25株菌株存活率均大于45％。

6.乳酸菌体外抗氧化能力的测定

取发酵液上清2mL，加入2mLDPPH·无水乙醇溶液(0.2mmol/L)，摇匀，避光反应30min，6000r/min离心10min，取上清液于517nm处测定吸光度值Ai；以等体积无水乙醇代替DPPH·无水乙醇溶液为Aj，以等体积空白溶剂代替样品溶液为Ac，并以等体积蒸馏水和乙醇混合液调零，测定菌株的DPPH·自由基清除率。

取发酵液上清0.5mL与0.5mLPBS缓冲液(0.2mol/L，pH6.6)混合，再加入0.5mL铁氰化钾(1％)混匀后于50℃水浴20min，迅速冷却后加入0.5mL三氯乙酸(10％)，3000r/min离心10min，取上清液1mL，加入1mL蒸馏水和1mL FeCl₃(0.1％)，混匀，反应10min，在700nm处测吸光度。25株乳酸菌体外抗氧化能力见表3。

表3菌株抗氧化能力测定结果

结果表明，25株乳酸菌发酵液对DPPH自由基菌具有一定清除能力，清除率在25％～82％之间，且这25株菌株发酵液均具有一定还原能力，还原能力在0.7～2.8之间，选择DPPH自由基清除率大于60％，A700nm值大于1.7的菌株，共有12株，对其益生特性进行进一步研究。

7.乳酸菌抗生素敏感试验

使用药敏纸片法检测菌株对抗生素的敏感性，抗生素及纸片浓度见表4。

吸取1.0mL菌悬液加入到15.0mL灭菌并融化后的MRS固体培养基中(40-50℃)，于漩涡振荡混合器上混和均匀后迅速倾注到100mm×H20mm无菌平皿中，摇匀，待平板凝固后贴放标准药物纸片，在37℃恒温培养箱中倒置培养，48h后测量并记录抑菌圈直径，根据CLSI制定的《抗菌药物敏感性试验执行标准》(2010版)判定乳酸菌对抗生素的耐药性，结果见表4。

表4乳酸菌的耐药性

注:R为耐药，M为中度敏感，S为敏感。

结果显示，12株乳酸菌对阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素均有耐药性，对哌拉西林、庆大霉素、呋喃妥因、万古霉素、苯唑西林、头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻肟、头孢哌酮、新霉素、红霉素表现出不同的耐药性。由于实验菌株是从较少服用抗生素的长寿人群中获得，所以对抗生素的药敏性较强。因此筛选耐药性较低的M11、B3、G9、R9、grx16、D12、D11、G5、R10、M4进行下一步体外降血糖能力测定。

8.乳酸菌α-葡萄糖苷酶抑制能力筛选

从12株乳酸菌筛选药敏性较高的10株菌株，测定其对α-葡萄糖苷酶活性抑制能力，筛选出对α-葡萄糖苷酶活性抑制能力较高的6株乳酸菌，其抑制率如表5所示。

表5 6株乳酸菌对α-葡萄糖苷酶的抑制率

结果显示，菌种grx16、G9、D12、M11、R9、R10对α-葡萄糖苷酶有较高的抑制活性，且菌株grx16、M11、G9的抑制率分别达到89.47％、84.21％、84.96％。获得一株对α-葡萄糖苷酶活性抑制能力最强的菌株grx16，可利用其研制具有降血糖功效的发酵乳。

9.乳酸菌的鉴定

经过筛选获得具有度α-葡萄糖苷酶最强抑制能力，且具有耐酸耐胆盐能力、体外抗氧化能力以及对多种抗生素敏感，因此对该菌株进行鉴定。

(1)革兰氏染色试验

本发明菌株Grx16形状为短杆状，如图1。

(2)糖发酵试验

对照《伯杰氏细菌鉴定手册》，对筛选出的菌株进行糖发酵初步鉴定，结果如表6。

表6菌株糖发酵试验结果

注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。

(3)API鉴定

筛选获得的乳酸菌利用API50CHL系列鉴定试验条进行鉴定，所有操作按照说明书中的操作方法进行，结果如表7所示。

表7 API50CHL系统鉴定结果

注：“+”表示阳性；“-”表示阴性

将API鉴定产生的生化图谱提交数据库进行在线比对，可以得出此株乳酸菌的菌种名称及鉴定率，结果见表8。

表8 API比对结果

(4)菌株16S rDNA测序鉴定

以菌株grx16基因组DNA作为PCR扩增的模板，采用通用的16S rDNA引物进行PCR扩增，扩增结果见图2。电泳检测扩增产物后，送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。将测序得到的序列与GenBank数据库中的序列进行比对分析，结果见表9。

表9 16S rDNA比对结果

结合生理生化试验、API试剂条鉴定及16S rDNA测序鉴定，将本发明菌株grx16定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum.)。

10.不同菌株组合生长特性的测定

将上述筛选获得的具有较高α-葡萄糖苷酶的植物乳杆菌Grx16、M11与本实验室的专利菌株干酪乳杆菌grx12、德氏乳杆菌保加利亚亚种grx33和发酵乳杆菌grx07进行组合，具体组合方式如表10所示。利用微生物全自动生长曲线分析仪，总接种量为4％(v/v)，37℃培养24h，每隔60min读取一次数据，以OD_550nm为横坐标，绘制组合生长曲线，结果如图3所示。

由图3可以看出，试验的26组菌株组合生长良好，均在17-18h后进入稳定期；其中A3、A6、A8、B3和B6生长速度较快，但整体差异不显著，各菌株之间并无明显相互抑制作用，均可进行下一步试验。

表10菌株组合方式及混合比例

11.不同菌株组合发酵特性的测定

对5种单菌株以及26组不同菌株组合均按照总接种量为4％(v/v)接入骆驼乳中，37℃培养至发酵终点(pH为4.5)后取出，测定其终点所需时间、酸度、发酵终点时的活菌数并进行感官评价，结果如表11所示。

表11不同菌株及其组合在骆驼乳中的发酵特性

注： ^▲分别表示同一列数据中的最低值和最高值。

由表11可以看出，不同菌株组合发酵的发酵乳特性均有一定程度的差异，31种发酵驼乳的发酵时间在3.5h-18.1h不等，其中有16组菌株组合在5.0h内达到发酵终点，菌株grx12的发酵时间最长，B9组合发酵时间最短，其次是B8和B10组合；31种发酵驼乳的酸度在86-107°T之间不等，B10组合的酸度最高，菌株grx12的发酵酸度最低，其次是C2和B5组合；发酵驼乳发酵终点时活菌数发酵乳的活菌数须越高越好，其中，发酵至发酵终点时D1组合的活菌数最高，其次是C2和B4组合；31种发酵驼乳感官评价差别比较显著，分数在3.10-7.42之间不等，感官评价关系到这几种菌株组合制备的发酵乳的质地和口感，其中，C2组合感官评价最高，其次是C1和C5组合。综上，选择发酵时间在5h内、酸度在100°T以下、发酵终点时的活菌数在1.80×10⁸CFU.mL^-1以及感官评价在6.66分上的菌株组合即B1、B4、B5、B7、B8、B10、C1、C2、C3、C5和D1这11种菌株组合进行下一步研究。

12.不同菌株组合流变学特性的测定

人们在咀嚼食物时对食品的剪切速率约为30～50s^-1，因此试验选择16r/min的旋转速率，在25℃下对发酵驼乳进行剪切，研究了表观粘度随剪切时间的变化以及表观粘度随剪切速率的变化，结果如图4、图5所示。并研究不同菌株组合发酵的发酵驼乳在恒温、固定频率的条件下弹性模量G′和黏性模量G″的扫描结果，结果如图6所示。

由图4可以看出，11种不同菌株组合的发酵驼乳的表观黏度均随剪切时间的延长而降低，进一步体现出发酵驼乳具有时间触变性。对该11种酸乳的时间-表观黏度变化曲线均进行数学模型拟合，可发现其剪切稀释性基本均与对数方程基本吻合。B1组合发酵出来的骆驼乳初始黏度值最高，但B1组合的黏度变化量也最大，B4、B7次之，说明该三者稳定性较差，入口后有较严重的剪切变稀的现象，而C2组合黏度变化量最小，C1、D1次之，说明该三种菌株组合稳定性较好，产品浓稠稳定，利于食用。

由图5可以看出，11种不同菌株组合的发酵驼乳的触变环的形状和大小有较明显差别，通过计算触变环的滞后面积，该面积可体现在外剪切力作用下，整个体系的破坏程度或新结构的形成能力，其面积值与破坏体系结构所需能量成正比，故滞后环面积大则体系触变性大，即体系经外力的作用后黏度变化大，因此撤销外力后恢复至体系原状态所需要的时间则长。在11组样品中，C1组合的触变性最明显，其面积达到了1.91Pa.r/min，而C2和D1组次之，分别为1.84Pa.r/min和1.80Pa.r/min，其余组合的触变面积均低于1.7Pa.r/min，由此说明与其他菌株组合发酵的骆驼乳相比，C1、C2和D1组合制成的发酵驼乳的触变环面积较大，在感官上表现为具有更加爽滑柔和的口感。

由图6可以看出，在线性黏弹性的区域内11种菌株组合的所发酵的风味骆驼乳制品的弹性模量G′均大于黏性模量G″，这说明在这一应变范围内发酵乳制品的网络结构未受破坏，显示相对较强的弹性，表现为固体特性；随着应变幅度的进一步增大，当应变逐渐增大并超过体系的临界应变时，发酵乳的网络结构受到破坏，样品开始流动，体现出流体特性。组合C1、C2和D1的酸奶的线性黏弹区最广，临界应力处的复合黏度分别为2.45Pa·s、2.53Pa.s和2.68Pa·s，其余组合的临界应力处的复合黏度均低于2.40Pa·s，由此可见C1、C2和D1这3个组合制成的发酵驼乳网络结构较为坚固，能够承受较大剪切应力而不被破坏。因此选用这三种组合的混合菌株制成的发酵驼乳进行下一步试验。

13.驼乳组成及菌株发酵对功能特性的影响

将C1、C2和D1这3个组合制成的发酵驼乳与grx16组进行比较发现，C2组从对α-葡萄糖苷酶的抑制率、乳酸菌活菌数量以及感官特性，均优于grx16，且对α-葡萄糖苷酶的抑制率以及感官特性为最优。因此确定菌株组合为C2。

表12不同菌株及其组合发酵骆驼乳特性

以菌株组合为C2，即植物乳杆菌grx16、干酪乳杆菌grx12、德氏乳杆菌保加利亚亚种grx33和发酵乳杆菌grx07组成，其混合比例为1:1:1:1(v/v)，作为发酵剂接种到不同骆驼原料乳中，其中纯驼乳中添加3％-6％(w/w)蜂蜜，添加2％-4％(w/w)低聚果糖，分别测定对α-葡萄糖苷酶的抑制率、乳酸菌活菌数量以及感官特性，其平均值如表13所示。

表13不同原料驼乳组成对发酵驼乳特性的影响

从表中可以看出，当纯驼乳中添加3％-6％(w/w)蜂蜜，添加2％-4％(w/w)低聚果糖，发酵驼乳对α-葡萄糖苷酶的抑制率以及感官特性为最优。

14.发酵驼乳体内功能特性研究

将造模成功的41只大鼠，随机剔除匹配不均1只，其余分为模型组(10只)、药物组(10只)、骆驼乳组(10只)、发酵驼乳组(10只)共4组。各组均按照表14进行连续灌胃42d。在42d饲喂期间，大鼠的饮水量和采食量结果如图7所示，平均体重动态变化情况如图8所示。骆驼发酵乳(添加蜂蜜和低聚果糖)和骆驼乳(添加蜂蜜和低聚果糖)(下同)组进行干预4周后，通过脏器指数的测定，结果如表15所示。

表14实验大鼠分组及灌胃

注：格列美脲片成人每日：2mg/kg

表15发酵驼乳对糖尿病大鼠脏器指数的影响(x±sd，n＝10)

注：abcd同列比较，不同字母表示具有差异性(P<0.05)脏器指数＝脏器质量/体重

由表15发现，干预组的脏器指数显著低于模型组(P<0.05)，总体来看，总脏器指数从低到高分别是正常组、药物组、骆驼发酵乳组、骆驼乳组、模型组，说明发酵驼乳能够在一定程度上保护糖尿病大鼠的主要脏器，对辅助糖尿病的治疗具有积极的意义。

(1)发酵驼乳对糖尿病大鼠空腹血糖(FBG)的影响

设干预第1天为第0周，对大鼠空腹血糖(FPG)进行0-4周实时监控。结果如16所示。

表16发酵驼乳对糖尿病大鼠FPG的影响

注：abcd同列比较，不同字母表示具有差异性(P<0.05)

由表16可以看出，正常组大鼠整个试验期间的血糖浓度无明显差异，模型组的血糖浓度一直处于上升趋势，第4周结束时，其血糖浓度达到了26.72mmol/L，相比第0周增加了17.87％，说明造模成功。通过药物、骆驼乳和发酵驼乳对糖尿病大鼠进行一定的膳食干预，各干预组的血糖水平于1周后均有所降低，但差异不显著；药物组的血糖水平于第2周后较模型组有明显程度的降低，且差异显著(P<0.05)，而此时骆驼乳组和发酵驼乳组的血糖水平较模型组虽有所降低，但差异不显著；发酵驼乳组的血糖水平于第3周后较模型组均有明显程度的降低，且差异显著(P<0.05)，而此时骆驼乳组的血糖水平较模型组虽有所降低，但差异不显著；第4周结束时，药物组与第1周相比血糖浓度下降了21.76％，总体而言，发酵驼乳的血糖控制能力比骆驼乳强，与第1周相比血糖浓度下降了17.87％，而骆驼乳组与第1周相比血糖浓度下降了16.81％，且与模型组相比差异显著(P<0.05)，说明经过一定时间的干预后，骆驼乳和发酵驼乳均具有较强的辅助降血糖的能力，但骆驼乳所需的时间更长。

(2)发酵驼乳对糖尿病大鼠葡萄糖耐受量(OGTT)、血清指标和肾脏指标的影响

连续干预4周后对试验鼠血糖水平测定，结果如图9所示。从图9中可以看出，经过4周的干预，骆驼乳组和发酵驼乳组对大鼠的耐糖量均有一定改善作用，而发酵驼乳组的效果更佳，灌胃2h后血糖值已降低至17.82mmol/L，与模型组相比差异显著，说明发酵驼乳有提高大鼠OGTT的功效。

连续干预4周后，禁食12h，摘眼球取血，解剖取内脏测定各指标，血清指标包括糖化血红蛋白(HbA_1c)、果糖胺(FMN)、大鼠血清总胆固醇(TC)、总甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)和尿酸(UA)，肾脏的指标包括一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)，结果如表17，表18所示。

表17骆驼乳及其发酵乳对糖尿病大鼠血清指标的影响

注：abc同列比较，不同字母表示具有差异性(P<0.05)

表18发酵驼乳对糖尿病大鼠肾脏组织指标的影响

注：abc同列比较，不同字母表示具有差异性(P<0.05)

由表17可以看出，正常组大鼠的HbA_1c和FMN在正常范围内。与正常组相比，模型组大鼠血清中的HbA_1c和FMN水平相都显著升高(P<0.05)；与模型组相比，骆驼乳组和发酵驼乳组的HbA_1c水平分别降低了15.63％和20.02％；骆驼乳组和发酵驼乳组的FMN水平分别降低了和15.46％和10.63％，差异均显著(P<0.05)。所以骆驼乳和发酵驼乳在血糖水平上能够降低瞬时血糖并提高OGTT的基础上，同时能够很好的降低HbA_1c和FMN水平，尤其是发酵驼乳组的效果更佳。

与正常组相比，其余各组的在干预四周后大鼠血清TC、TG、HDL-C和LCL-C指标均有所升高。总血脂水平从低到高的顺序依次为正常组<药物组<发酵驼乳组<骆驼乳组<模型组。与模型组相比，骆驼乳组的TC和TG水平分别降低了17.70％和24.28％，发酵驼乳组的TC和TG水平分别降低了25.57％和33.52％，差异显著(P<0.05)说明发酵驼乳具有降低机体总血脂水平的功效；骆驼乳的HDL-C和LDL-C水平分别降低了11.22％和24.60％；发酵驼乳的HDL-C和LDL-C水平分别降低了15.31％和36.06％，差异显著(P<0.05)。表明发酵驼乳在降低糖尿病大鼠的血脂方面表现出良好的效果，能在一定程度上缓解糖尿病引发的诸如高血脂、动脉粥样硬化等并发症，而骆驼乳的能力次之，可能与纯鲜骆驼乳中较高的脂肪含量有关。

模型组大鼠血清中Cr、BUN和UA水平比正常组分别上升了45.31％、38.36％、27.43％，说明模型组大鼠的肾脏受到了一定强度的损伤。而与模型组相比骆驼乳组和发酵驼乳组大鼠血清中Cr、BUN、UA的含量均显著降低，骆驼乳组大鼠的血清中Cr、BUN和UA含量分别降低了21.10％、15.91％和7.19％，且发酵驼乳组大鼠的血清中Cr、BUN和UA含量分别降低了25.26％、20.06％和11.18％，差异显著(P<0.05)，表明发酵驼乳能够有效地降低糖尿病所引起的肾脏功能衰竭、肾炎等并发症的危险，具有明显的肾脏保护作用。

由表18可以看出，模型组肾脏中NO、NOS较正常组分别升高了44.08％和50.21％，说明模型组大鼠已经出现NO代谢异常现象。肾脏组织中NO和NOS水平由低到高的顺序依次为正常组<药物组<发酵驼乳组<骆驼乳组<模型组。与模型组相比，骆驼乳及其发酵乳能够很好的降低肾脏组织中NO含量，分别降低了12.67％和18.95％，差异显著(P<0.05)；发酵驼乳能够很好的抑制NOS的合成，降低了20.95％，且差异显著(P<0.05)；骆驼乳能够在一定程度上抑制NOS的合成，降低NOS的含量，但差异不显著(P>0.05)。由此表明骆驼乳尤其是发酵驼乳能够缓解肾脏中NO的过量产生，一定程度上抑制了NOS的合成，对肾脏起到了一定程度的保护作用。

模型组的SOD含量较正常组降低了47.96％，而MDA较正常组升高了46.57％，说明模型组大鼠肾脏组织中具有由糖代谢紊乱为主要因素导致了自由基生成增多，且具有自由基清除障碍的症状。骆驼乳组及发酵驼乳组的肾脏中SOD水平较模型组分别升高了14.96％和27.33％，骆驼乳组及发酵驼乳组的肾脏中MDA水平分别降低了22.38％和29.24％，差异显著(P<0.05)，由此表明，发酵驼乳能够降低氧化应激的发生，提高机体的抗氧化能力，降低机体受到自由基侵害的机率，达到一个对肾脏慢性保护的作用。

(3)发酵驼乳对糖尿病大鼠血清中空腹胰岛素和胰岛素分泌指数的影响

经STZ诱导后，在一定程度对大鼠的胰岛细胞进行了破坏，胰岛素(INS)分泌受阻，从而引发机糖、蛋白和脂肪代谢紊乱。INS作为机体唯一能降低能够促进血糖降低的激素，胰岛素指标对于糖尿病研究具有极其重要的意义。对试验大鼠空腹胰岛素和胰岛素分泌指数如表19所示。

表19骆驼乳及其发酵乳对空腹胰岛素和胰岛素分泌指数的影响

注：abcd同列比较，不同字母表示具有差异性(P<0.05)

由表19可以看出，正常组大鼠血清胰岛素含量显著高于其他干预组，而模型组则显著低于其它组。与正常组相比，模型组大鼠的血清胰岛素降低了53.15％，与模型组相比骆驼乳组和发酵驼乳组的血清胰岛素均有一定程度的升高，差异显著(P<0.05)，表明骆驼乳和发酵驼乳可对抗由STZ损伤胰岛细胞后所引起的胰岛素合成及分泌减少，特别是发酵驼乳，效果明显，由此说明发酵驼乳可改善由于胰岛细胞损伤引起的胰岛细胞功能降低的症状，并对胰岛素分泌的不足有辅助治疗的作用。

实施例1

1000kg新鲜纯驼乳经标准化处理后，预热至60℃，加入30kg蜂蜜和40kg低聚果糖，于65℃，20Mpa条件下均质2min，经65℃/30min热处理后，冷却至42℃，按3％(w/w)接种量接种发酵剂，发酵剂由植物乳杆菌grx16、干酪乳杆菌grx12、德氏乳杆菌保加利亚亚种grx33和发酵乳杆菌grx07组成，其比例为1:1:1:1(v/v)，42℃发酵至凝乳，然后置于4℃冷藏24h即制成发酵驼乳。

实施例2

1000kg新鲜纯驼乳经标准化处理后，预热至55℃，加入40kg蜂蜜和30kg低聚果糖，于65℃，20Mpa条件下均质2min，经65℃/30min热处理后，冷却至40℃，按4％(w/w)接种量接种发酵剂，发酵剂由植物乳杆菌grx16、干酪乳杆菌grx12、德氏乳杆菌保加利亚亚种grx33和发酵乳杆菌grx07组成，其比例为1:1:1:1(v/v)，40℃发酵至凝乳，然后置于4℃冷藏24h即制成发酵驼乳。

实施例3

1000kg新鲜纯驼乳经标准化处理后，预热至60℃，加入50kg蜂蜜和20kg低聚果糖，于65℃，20Mpa条件下均质2min，经65℃/30min热处理后，冷却至37℃，按6％(w/w)接种量接种发酵剂，发酵剂由植物乳杆菌grx16、干酪乳杆菌grx12、德氏乳杆菌保加利亚亚种grx33和发酵乳杆菌grx07组成，其比例为1:1:1:1(v/v)，37℃发酵至凝乳，然后置于4℃冷藏24h即制成发酵驼乳。

Claims (3)

1.一种具有辅助降血糖功能的高品质发酵驼乳制备方法，其特征在于利用植物乳杆菌Grx16(Lactobacillus plantarum Grx16)并组合其他菌株作为发酵剂，所述植物乳杆菌Grx16的保藏号为CGMCC NO.10921，制备具有辅助降血糖功能的发酵驼乳。

2.如权利要求1所述的具有辅助降血糖功能的高品质发酵驼乳制备方法，其特征在于，用于制备发酵驼乳的发酵剂菌株组合为植物乳杆菌Grx16(Lactobacillus plantarumGrx16)、干酪乳杆菌grx12(Lactobacillus casei grx12)、德氏乳杆菌保加利亚亚种grx33(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus grx33)和发酵乳杆菌grx07(Lactobacillus fermentum grx07)以1:1:1:1(v/v)的比例混合作为发酵剂组合；所述植物乳杆菌Grx16、干酪乳杆菌grx12、德氏乳杆菌保加利亚亚种grx33和发酵乳杆菌grx07的保藏号分别是：CGMCC NO.10921、CGMCC NO.7696、CGMCC NO.7694和CGMCC NO.8874。

3.如权利要求1所述的具有辅助降血糖功能的高品质发酵驼乳制备方法，其特征在于，发酵驼乳的制备条件为：纯驼乳中添加3％-6％(w/w)蜂蜜，添加2％-4％(w/w)低聚果糖，并接种2％-10％(w/w)的混合发酵剂，在25-45℃发酵10-40h。