用于提升葡萄品质的复合乳酸菌菌剂及制备方法
技术领域
本发明涉及微生物应用领域,尤其涉及一种用于提升葡萄品质的复合乳酸菌菌剂及制备方法。
背景技术
目前世界上近半数的国家包括日本、英国、美国、法国、瑞典等主要的发达国家及巴基斯坦、印度、中国等发展中国家,都在进行微生物肥料的开发与利用。姚国强通过前期试验筛选出抑制致病真菌的菌株,采用低温长时间混合发酵获得乳酸菌及其代谢产物。于向荣等筛选出抑菌效果好、抑菌谱较广的的三株乳酸菌的发酵液,对贵妃玫瑰霜霉病、美乐炭疽病、藤稔白腐病有较好的防治效果。日本的比嘉照夫研制成的EM菌(有效微生物菌群),包括光合细菌、乳酸菌、酵母菌、放线菌、醋酸杆菌5科10属共80多种,目前在农业种植、堆肥、污水处理等方面的应用都取得了一定的进展。
葡萄是世界上最古老、分布最广的水果之一,人类在很早以前就开始栽培这种果树,几乎占全世界水果产量的四分之一,被人们称为“水晶明珠”。葡萄圆润光滑、味道鲜美,且具有极高的营养价值,既可做水果生食,也可酿酒或制作葡萄干。除了能够帮助人们改善睡眠外,还有很多功效,如补虚健胃、改善过敏症状、防癌抗癌等,深受人们的喜爱。然而在目前的葡萄生产过程中仍存在一些问题,关于提高葡萄产量和品质的研究一直是近年来研究的热点。
目前关于提高葡萄产量的方法主要是选用适宜的品种、加强水肥管理、防治病虫害等种植技术,根据葡萄生长特性和商品性状需要,施用不同的肥料是达到葡萄高产优质的必要条件,不同施肥量研究结果表明,施肥量越高,葡萄产量也就越高,但其糖度不一定高,还增加了施肥成本,降低了投入产出比。且长期施用化肥不但会对环境造成污染和破坏,还会使土地板结、土壤肥力和质量下降、作物的收益率降低等。乳酸菌作为自然环境中普遍存在的一种安全的微生物,在农产品的种植及其质量安全中发挥着特有的优势。随着人们生活水平的提高,无农药和化学肥料施用的农产品越来越受到人们的欢迎,乳酸菌在农业种植和农产品品质安全领域的应用也越来越广泛。
发明内容
本发明的目的在于通过探究不同乳酸菌对葡萄的生长性状及品质的影响,确定适宜在葡萄中应用的乳酸菌制剂,提供了一种用于提升葡萄品质的复合乳酸菌菌剂及其制备方法。
为了实现本发明的目的,采用如下技术方案:
本发明是用于提升葡萄品质的复合乳酸菌菌剂,该复合乳酸菌菌剂由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)组成。
需要说明的是,本发明所采用的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8,分离自内蒙古传统自然发酵酸牛奶中,具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力,能够存活于动物肠道内;该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心,保藏号为CGMCC No.6312;本发明所采用的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang,是从酸马奶中分离的耐酸和耐胆汁酸的益生菌菌株;该菌株于2006年4月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心,保藏号CGMCC No.1697。德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)简称为保加利亚乳杆菌,具有发酵剂的能力,它是从甘肃省甘南藏族自治州传统发酵牦牛乳中筛选得到的;2011年4月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心,保藏号CGMCC No.4774。
优选地,如上所述的复合乳酸菌菌剂,该菌剂由植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)按(1.5-2):(1.5-2):(1-1.5)的比例组成,所述复合乳酸菌菌剂的活菌总数含量2.4-3.2×109cfu/ml。
优选的,植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang的比例为1:1;
更优选的,植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)按2:2:1的比例混合,所述符合菌剂的活菌总数为3×109cfu/ml。
本发明另一方面提供了上述复合乳酸菌菌剂的制备方法,具体方法步骤如下:
(1)首先将所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang接种于MRS培养液中,在37±1℃条件下培养26-28小时,用无菌生理盐水离心洗涤3次,得到的菌体沉淀中加入8%-12%灭菌脱脂乳液,并调整其菌数为1.8-2.0×109cfu/ml,混匀后在35-37℃条件下培养35-48小时;
(2)将步骤(1)得到的菌株培养物与德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus)按比例进行混合,接种于MRS培养液,在39±1℃条件下培养12-24小时,并加入50ml/l的椰汁,调整其菌数为2.4-3.2×109cfu/ml,pH值为5.5-6.5。
优选的,步骤(1)植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang的接种量各为4-10%(v/w)。
优选的,步骤(1)植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang的接种量为1:1。
优选的,步骤(1)得到的菌株培养物与德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus)按(3-4):(1-1.5)的比例进行混合,并以8-12%(v/w)的接种量接种于MRS培养基。
本发明还提供了该复合乳酸菌菌剂在葡萄上的应用,六年生的葡萄从春季开花期开始,按2L/亩,2次/月随水浇施于植物根部。
本发明的有益效果是,本发明涉及的复合菌剂由植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)组成,这三种菌的复配对葡萄的生长代谢有明显的促进作用,尤其可以协同促进葡萄的产量和品质性状,产量达到24.97kg/亩,较空白对照组提高了13.65%;可溶性总糖和可溶性固形物的含量,较对照组分别提高了25.84%和12.79%。起到了明显的提质增产的作用,进而增加种植效益。
附图说明
图1:不同乳酸菌对葡萄坐果率和单株穗数的影响;
图2:不同乳酸菌对葡萄单株产量和亩产量的影响;
图3:不同乳酸菌对葡萄可溶性总糖和可溶性固形物的影响;
图4:不同乳酸菌对葡萄单宁含量的影响。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明实施例一方面提供了一种用于提升葡萄品质的复合乳酸菌菌剂,该复合乳酸菌菌剂由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)Zhang和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)组成。
需要说明的是,所采用的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8,分离自内蒙古传统自然发酵酸牛奶中,具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力,能够存活于动物肠道内;该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心,保藏号为CGMCC No.6312;本发明所采用的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang,是从酸马奶中分离的耐酸和耐胆汁酸的益生菌菌株;该菌株于2006年4月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心,保藏号CGMCC No.1697。德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus),具有发酵剂的能力,它是从甘肃省甘南藏族自治州传统发酵牦牛乳中筛选得到的;2011年4月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心,保藏号CGMCC No.4774。
在本发明的一实施例中,该复合乳酸菌菌剂由植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)按(1.5-2):(1.5-2):(1-1.5)的比例组成,所述复合乳酸菌菌剂的活菌总数含量2.4-3.2×109cfu/ml。具体的,三种菌的比例可以为1.5:1.5:1,1.6:1.6:1.1,1.7:1.7:1.2,1.8:1.8:1.3,1.9:1.9:1.4,2:2:1.5。
在本发明的一优选的实施例中,植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang的比例为1:1。
在本发明的一更优选的实施例中,植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus)按2:2:1的比例混合,所述复合菌剂的活菌总数为3×109cfu/ml。
本发明又一实施例提供了上述复合乳酸菌菌剂的制备方法,具体方法步骤如下:
S1:首先将所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang各4-10%(v/w)的接种量接种于MRS培养基中,在37±1℃条件下培养26-28小时,用无菌生理盐水离心洗涤3次,得到的菌体沉淀中加入8%-12%灭菌脱脂乳液,并调整其菌数为1.8-2.0×109cfu/ml,混匀后培养在35-37℃条件下培养35-48小时。
在本步骤中,能够充分培养上述两种菌,避免拮抗。
S2:将上述步骤得到的菌种与德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus)按(3-4):(1-1.5)比例进行混合,并以8-12%(v/w)的接种量接种于MRS培养基,在39±1℃条件下培养12-24小时,并加入50ml/l的椰汁,调整其菌数为2.4-3.2×109cfu/ml,pH值为5.5-6.5。
在本步骤中,加入椰汁可以防褐化,增强营养,从而保证三种菌剂的快速有效培养,避免了菌种之间的拮抗作用,有效的提高了菌剂的活性。
本发明的又一实施例为该复合乳酸菌菌剂在葡萄上的应用,六年生的葡萄从春季开花期开始,按2L/亩,2次/月随水浇施于植物根部。
本发明实施例所提供的这三种乳酸菌复配的复合菌剂对葡萄的生长代谢有明显的促进作用,尤其可以协同促进葡萄可溶性总糖和可溶性固形物的含量,提升葡萄的品质,进而增加种植效益。
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的用于提升葡萄品质的复合乳酸菌菌剂及制备方法,以下将结合具体实施例进行说明。
实施例1:该复合乳酸菌菌剂由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus)按1.5:1.5:1的比例组成,所述复合乳酸菌菌剂的活菌总数含量2.4×109cfu/ml。
实施例2:该复合乳酸菌菌剂由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus)按1.8:1.8:1.3的比例组成,所述复合乳酸菌菌剂的活菌总数含量2.8×109cfu/ml。
实施例3:该复合乳酸菌菌剂由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P-8和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus)按2:2:1.5的比例组成,所述复合乳酸菌菌剂的活菌总数含量3.2×109cfu/ml。
不同乳酸菌对葡萄生长的影响试验
试验时间:2016年5月-7月;试验地点:青岛农业大学实习基地;试验材料:以巨峰葡萄(Vitis vinifera'Kyoho')为试验材料,巨峰葡萄是生产中的主栽品种之一,适应性强,抗病、抗寒性能好。
分组情况为:
(1)空白对照组:喷施清水;
(2)德氏乳杆菌保加利亚亚种:喷施德氏乳杆菌保加利亚亚种,活菌总数含量0.8-1.0×109cfu/ml;
(3)复合菌1:喷施植物乳杆菌+干酪乳杆菌菌液,活菌总数含量1.8-2.0×109cfu/ml,两种菌的数量比为1:1,使用时加MRS培养液稀释,使活菌总数为0.9-1.0×109cfu/ml
(4)复合菌2:喷施植物乳杆菌+干酪乳杆菌液+德氏乳杆菌保加利亚亚种,活菌总数含量2.4-3.2×109cfu/ml,三种菌的数量比为2:2:1,使用时加MRS培养液稀释,使活菌总数为0.8-1.05×109cfu/ml
六年生的葡萄从春季开花期开始,按2L/亩,2次/月随水浇施于植物根部。
分别测定各处理对葡萄的坐果率和单株穗数的影响,葡萄单株产量和亩产量,葡萄可溶性总糖的量和可溶性固形物的含量,葡萄单宁含量,具体数据参见下表1
表1乳酸菌对葡萄各项指标的影响(n=30)
如图1、表1所示,3种乳酸菌对葡萄坐果率和单株穗数较空白对照组均有不同程度的提高,其中复合菌2对坐果率的影响最明显,坐果率达到27.38%,较空白对照提高了24.40%。3种乳酸菌对葡萄单株穗数较空白对照组分别提高了5.81%、14.19%和25.47%,说明复合菌2对葡萄单株穗数的作用最大。
乳酸菌对葡萄产量的影响如图2、表1所示,施加3种乳酸菌的葡萄其单株产量分别达到4.98kg/株、5.63kg/株、6.02kg/株,较空白对照组(4.78kg/株)分别提高了4.18%、17.78%、25.94%;3种乳酸菌对葡萄亩产量的影响也较明显,其中复合菌2对其作用最大,达到24.97kg/亩,较空白对照组提高了13.65%。总体表现为复合菌2>复合菌1>保加利亚乳杆菌>空白对照。
如图3、表1所示,复合菌2对葡萄可溶性总糖和可溶性固形物的提升作用明显,较对照组分别提高了25.84%、12.79%。保加利亚乳杆菌、复合菌1对葡萄可溶性总糖的影响较空白对照组分别提高了6.70%、15.40%,对葡萄可溶性固形物的影响较空白对照组分别提高了1.57%和10.32%,因此3种乳酸菌对葡萄可溶性总糖和可溶性固形物的影响表现为复合菌2>复合菌1>保加利亚乳杆菌>空白对照。
3种乳酸菌对葡萄单宁含量的影响如图4、表1所示,不同乳酸菌对葡萄单宁含量的提升作用不同,3种乳酸菌处理过的葡萄,其葡萄皮中的单宁含量分别达到6.64mg·g-1、7.01mg·g-1、7.86mg·g-1,其中复合菌2对其影响最大,较空白对照组提高了21.86%;3种乳酸菌对葡萄籽中的单宁含量复合菌的效果明显,其中保加利亚乳杆菌、复合菌1和复合菌2分别较空白对照组提高了1.29%、7.40%和13.25%。
从上述图1-4和表1中可以看出不同乳酸菌对葡萄生长的影响不同,总体表现为复合菌2>复合菌1>保加利亚乳杆菌>空白对照组。结果表明,植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)可以协同促进葡萄中活性成分含量的提高,对葡萄提质增产能起到明显的促进作用。