CN101974429A - 一种用于抗枣裂腐烂的微生态制剂及其制备方法 - Google Patents

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倪永珍
李维炯
李翎
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Abstract

一种用于抗枣裂腐烂的复合微生物制剂，包括植物乳杆菌、圆褐固氮菌、枯草芽孢杆菌、白色链霉菌、沼泽红假单胞菌，并由上述菌组分通过厌氧和好氧相结合的发酵工艺复合培养而成，其中各菌组分的重量百分比为：植物乳杆菌为15～35％；圆褐固氮菌为15～30％；枯草芽孢杆菌为5～25％；白色链霉菌为5～25％；沼泽红假单胞菌15～35％。

Description

一种用于抗枣裂腐烂的微生态制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及复合微生物制剂技术领域，特别涉及一种用于抗枣裂腐烂的复合微生物制剂。
背景技术
大红枣和金丝小枣的生产过程中，无论是金丝小枣或大枣，在果实着色期遇阴雨天裂果腐烂是普遍存在的严重问题之一。一般年份普通品种裂果腐烂率达15％左右，成熟期如遇多雨年份，高达50％～80％；易裂果品种一般年份裂果率为50％～70％，严重年份达95％以上。
产生裂枣的原因：一是连年施用化肥和干旱造成的土壤中的钙离子被固定而造成的缺钙，果皮厚度和韧性差，易造成裂枣；二是因为近年来地下水位的异常开采，造成地下水位低，土壤干湿不均，造成枣裂。在70年代以前，甚至没有枣裂现象，主要是因为那时地下水位高，即使不下雨，不浇水，土壤也不会有严重的干湿不均。枣裂后遇到雨水或夜露水的长期侵入，裂口变大，病菌感染后，果肉腐烂，造成较大的经济损失。
裂枣问题是枣树生产中最难解决的问题之一。目前一般根据枣裂的成因采用以下解决方法：
一是选择抗裂果的品种，但目前多数抗裂果品种的综合品质较差；二是从幼果期开始喷钙，0.2％～0.3％的硝酸钙或氯化钙，每15天就要喷洒一次；三是在果实的成熟期以后喷洒20～40mg/kg的赤霉素；四是生长季干旱时及时浇水。
例如现有技术中采用的一种方案是从幼果期开始喷洒0.2％～0.3％的硝酸钙或氯化钙，每15天喷洒一次。但该现有技术的缺点在于叶面喷施，钙的吸收利用率差，喷洒间隔时间短，次数过于频繁，增产并不明显，效益差。
现有技术曾采用的另种方案是在果实的成熟期以后喷洒20～40mg/kg的赤霉素。该方案的缺点在于赤霉素虽然也是微生物生长过程的产物，但它是一种激素类的物质，不利于品质的改善，给食品的安全性带来一定的影响。
发明内容
为了解决上述枣裂问题以及现有技术中为解决枣裂问题所采取的技术方案中所存在的缺陷，在农业生态学、土壤学和作物营养学原理的指导下，本申请的研究人员采用微生态工程技术，从土壤和自然界本来就存在的有益(有效)微生物种群中，选择出多个共生性能好，抑制病原菌等有害微生物能力强，能有效调节土壤水分和养分有效性的微生物种群，主要是嗜酸乳杆菌、圆褐固氮菌、沼泽红假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色链霉菌，采用厌氧和好氧相结合的发酵工艺，生产出的稳定的微生态制剂——抗红枣开裂腐烂的微生态制剂。
本发明提供了一种用于抗枣裂腐烂的复合微生物制剂，其特征在于，所述复合微生物制剂包括植物乳杆菌、圆褐固氮菌、枯草芽孢杆菌、白色链霉菌、沼泽红假单胞菌，并由上述菌组分通过厌氧和好氧相结合的发酵工艺复合培养而成。其中所述各菌组分的重量百分比(本发明中所称“各菌组分的重量百分比”是指上述各个菌组分的重量占上述各菌组分重量之和的比例)为：植物乳杆菌为15～35％；圆褐固氮菌为15～30％；枯草芽孢杆菌为5～25％；白色链霉菌为5～25％；沼泽红假单胞菌15～35％。优选为：植物乳杆菌为20～30％；圆褐固氮菌为20～30％；枯草芽孢杆菌为10～20％；白色链霉菌为10～20％；沼泽红假单胞菌20～30％。
各菌组分的重理百分比优选方案之一为：植物乳杆菌为30％；圆褐固氮菌为20％；枯草芽孢杆菌为10％；白色链霉菌为10％；沼泽红假单胞菌30％。
各菌组分的重量百分比优选方案之二为：植物乳杆菌为25％；圆褐固氮菌为25％；枯草芽孢杆菌为15％；白色链霉菌为15％；沼泽红假单胞菌20％。
各菌株组分的重量百分比优选方案之三为：植物乳杆菌为20％；圆褐固氮菌为20％；枯草芽孢杆菌为20％；白色链霉菌为20％；沼泽红假单胞菌20％。
本发明的所述复合微生物制剂的总菌数≥2×108个/ml，PH值为3.5～4.0。
本发明还提供了种制造用于抗枣裂腐烂的复合微生物制剂的方法，包括如下步骤：(1)将植物乳杆菌、圆褐固氮菌、枯草芽孢杆菌、白色链霉菌、沼泽红假单胞菌在各自培养基中进行单菌种培养的步骤；(2)将植物乳杆菌、圆褐固氮菌、枯草芽孢杆菌、白色链霉菌在加有糖蜜的各自培养基中进行驯化培养的步骤，将沼泽红假单胞菌在其加有糖蜜的培养基中加入圆褐固氮菌进行复合驯化培养的步骤；(3)将驯化好的上述菌株液体种子混合，进行复合培养的步骤。
其中步骤(1)中植物乳杆菌的单菌株制备中所使用的培养基的组分比例为：酪蛋白肠10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖5g，乳糖5g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，Tween80 1g，K2HPO4·3H2O 2g，MnSO4·4H2O 0.05g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCO3·7H2O 20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL；PH值为6.8；圆褐固氮菌的单菌株制备中所使用的培养基的组分比例为：KH2PO4 0.2g，K2HPO4·3H2O 0.8g，MgSO4·7H2O 0.1g，CaSO3·2H2O 0.1g，FeCl3 0.25g，Na2MoO4·2H2O 0.5g，酵母膏0.5g，甘露醇20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL；PH值为7.2；枯草芽孢杆菌的单菌株制备中所使用的培养基的组分比例为：牛肉膏10g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15g，水1000mL；PH值为7.2～7.4；白色链霉菌的单菌株制备中所使用的培养基的组分比例为：NaCl 0.5g，KNO3 1.0g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 10mg，可溶性淀粉20g，琼脂20g，水1000mL，PH值为7.2～7.4；沼泽红假单胞菌的单菌株制备中所使用的培养基的组分比例为：蛋白胨3g，酵母膏3g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2 0.3g，琼脂15g，蒸馏水1000mL；PH值为6.8。
步骤(2)中植物乳杆菌的驯化培养中所使用的培养基的组分比例为：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖5g，乳糖5g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，Tween80 1g，K2HPO4·3H2O 2g，MnSO4·4H2O 0.05g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCO3·7H2O 20g，蒸馏水1000mL；在所述培养基中加入糖蜜调pH值至6.8；圆褐固氮菌的驯化培养中所使用的培养基的组分比例为：KH2PO4 0.2g，K2HPO4·3H2O0.8g，MgSO4·7H2O 0.1g，CaSO3·2H2O 0.1g，FeCl3 0.25g，Na2MoO4·2H2O 0.5g，酵母膏0.5g，甘露醇20g，蒸馏水1000mL；在所述培养基中加入糖蜜调pH值至7.2；枯草芽孢杆菌的驯化培养中所使用的培养基的组分比例为：牛肉膏10g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL；在所述培养基中加入糖蜜调pH值至7.2；白色链霉菌的驯化培养中所使用的培养基的组分比例为：NaCl 0.5g，KNO3 1.0g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 10mg，可溶性淀粉20g，水1000mL；在所述培养基中加入糖蜜调PH值至6.8；沼泽红假单胞菌的驯化培养中所使用的培养基的组分比例为：蛋白胨3g，酵母膏3g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl20.3g，蒸馏水1000mL；在所述培养基中加入糖蜜调PH值至6.8，水1000mL，再加入圆褐固氮菌进行复合驯化培养；
在步骤(3)的复合培养中，培养基的组分为经预处理的糖蜜和蛋白胨，其中糖蜜和蛋白胨的重量比例为20∶1，PH值调至6.8，100℃灭菌2小时；快速冷却至40℃后，取上述驯化好的液体种子混合，进行接种，上述驯化好的液体种子与上述糖蜜的比例为1∶1，其中在上述驯化好的液体种子中各菌组分重量比例为：植物乳杆菌为15～35％；圆褐固氮菌为15～30％；枯草芽孢杆菌为5～25％；白色链霉菌为5～25％；沼泽红假单胞菌15～35％；30～35℃，72～120个小时发酵，待PH值降至3.5～4.0时即可。
本发明用于抗枣裂腐烂的复合微生物制剂主要的功能作用如下：
1、和有机肥配合使用，可提高土壤的生物活性，降低土壤pH值，提高土壤有效养分的含量和枣树对铁、钙等元素的吸收和利用率，增加果皮的厚度和韧性。
2、抗裂枣微生态制剂中的微生物在生长繁殖过程中能分泌出大量的乳酸等有机酸、抗氧化物质、促生长物质等。直接喷洒到叶面或果实上，一方面会提高叶面的光合作用，刺激果皮生长，厚度和韧性增加，防止果裂；另一方面抑制有害微生物的入侵，防止腐烂。
3、和有机肥配合做底肥，结合叶面喷洒施肥，可以提高枣树的非特异性免疫功能。枣树的抗寒性、抗旱性、抗涝性、抗病性、抗干热风能力都有明显的提高，对枣裂的产生也有显著的抑制作用。
4、提高枣的品质，药残少，蛋白质、糖分、干物质含量明显提高，促进早熟，货架寿命长。
具体实施方式
本发明中所涉及的菌株均来源于“中国普通微生物菌种保藏管理中心”(CGMCC)，并从“中国普通微生物菌种保藏管理中心”直接购买获得。
植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)，商品编号为：CGMCC1.557
圆褐固氮菌(Azotobocter chroococcum)，商品编号为：CGMCC1.213
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，商品编号为：CGMCC1.15
白色链霉菌(Streptomyces albus)，商品编号为：CGMCC4.188
沼泽红假单胞菌(Rhodop seudanonas palustris)，商品编号为：CGMCC1.2352
各菌株作用：
植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)：是一种乳杆菌属益生菌，乳杆菌可以产生有机酸、细菌素、过氧化氢、双乙酰等多种天然抑菌物质.具有维持体内菌群平衡，提高机体免疫力，促进营养物质吸收等多种功能。尤其是乳杆菌产生的抑菌活性代谢产物细菌素，不仅可以改善肠道生态，还可以用于食品与饲料的防腐。植物乳杆菌素是植物乳杆菌产生的一类具有抑菌活性的肽类，可以抑制许多革兰氏阳性菌。植物乳杆菌通过微生物夺氧及在消化道内附着定植和对营养素的竞争，调节肠道内菌趋于正常化，抑制致病菌和有毒菌的生长；植物乳杆菌的代谢可产生有机酸，降低动物肠道pH值，杀死不耐酸的有害菌；产生溶菌酶、过氧化氢等物质，可杀害潜在的病原菌；产生的代谢产物可以抑制肠内胺和氨的产生；产生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等消化酶，有利于物质的分解；合成B族维生素，氨基酸。
圆褐固氮菌(Azotobocter chroococcum)：具有较强的固氮能力，并且能够分泌生长素，促进植株的生长和果实的发育，提高农作物的产量。固氮菌，还能直接从空气中吸收氮气，繁殖后代，死后将遗体“捐赠”给植物，使植物得到大量氮肥。固氮菌的本领在于它有一把“神刀”一固氮酶，可以轻易地切断束缚氮分子的化学键，把氮分子变为能被植物消化、吸收的氮原子。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)：枯草芽孢杆菌为细菌性杀真菌剂，它通过竞争性生长繁殖而占居生存空间的方式来阻止植物病原真菌的生长，能在植物表面迅速形成一层高密保护膜，使植物病原菌得不到生存空间，从而保护了农作物免受病原菌为害。枯草芽孢杆菌可分泌抑菌物质，抑制病菌孢子发芽和菌丝生长，从而达到预防与治疗的目的。枯草芽孢杆菌菌体在生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用；促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，间接抑制其它致病菌的生长；枯草芽孢杆菌菌体能自身合成消化性酶类，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶等，在消化道中与内源酶共同发挥作用，提高土壤中有机物的分解转化，能合成多种维生素，为作物生长提供均衡而有效的养分。
白色链霉菌(Streptomyces albus)：可产生大量抗生素及多种酶，抑制土壤病原微生物的繁殖。促进有氧微生物的生长，调节土壤酸碱度的平衡。可在高温下分解纤维素等复杂的有机质。在自然界分布很广，绝大多数为腐生，少数寄生。产生种类繁多的抗生素，能利用葡萄糖。有较强的淀粉和蛋白质水解能力。对土壤中复杂有机物的矿化发挥重要作用。
沼泽红假单胞菌(Rhodop seudanonas palustris)：B族维生素极为丰富，Vb2、叶酸、泛酸、生物素的含量也较高，同时还含有大量的类胡萝卜素、辅酶Q等生理活性物质。因此，光合细菌具有很高的营养价值。通过微生物酶的作用，分解和合成有机质。其中起主要作用的是细菌，空气中一些可溶性的有机物在胞内酶的作用下被菌体选择性地吸收；颗粒、胶体等难溶或不溶性的有机物先附着在菌体外，由菌细胞分泌的胞外酶分解成脂溶性和水溶性物质，再被菌体吸收。通过微生物体内的生化作用，将一部分有机物同化成自身，另一部分被异化成水分子有机物、二氧化碳、水等，从而使污染物质得到降解。例如光合细菌(荚膜红假单胞菌)可将致癌物亚硝胺转化为无毒的化合物，快速降解氨氮、亚硝酸盐和硫化氢等有害物质，调节PH值。分解有机物。促进有益菌类的生长繁殖，维持菌群平衡，防止有害菌类过度繁殖。
本发明的复合微生物制剂的制造方法包括以下步骤：(1)将植物乳杆菌、圆褐固氮菌、枯草芽孢杆菌、白色链霉菌、沼泽红假单胞菌在各自培养基中进行单菌种培养的步骤；(2)将植物乳杆菌、圆褐固氮菌、枯草芽孢杆菌、白色链霉菌在加有糖蜜的各自培养基中进行驯化培养的步骤，将沼泽红假单胞菌在其加有糖蜜的培养基中加入圆褐固氮菌进行复合驯化培养的步骤；(3)将驯化好的上述菌株液体种子混合，进行复合培养的步骤。各步骤具体描述如下：
①单菌株制备
植物乳杆菌的制备：培养基(MRS培养基)：酪蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖5g，乳糖5g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，Tween80 1g，K2HPO1·3H2O2g，MnSO4·4H2O 0.05g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCO3·7H2O 20g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH值为6.8。
将购买的植物乳杆菌安培管接种于培养基斜面中，厌氧37℃培养36～48小时活化，如有需要，可连续活化2次。用接种针取出在培养基平板上划线分离，厌氧37℃培养36～48小时。选取长势良好的单菌落经镜检确认无污染后，用接种针选取单菌落接种至液体培养基中，以密闭的玻璃瓶厌氧37℃培养24～36小时。
圆褐固氮菌的制备：培养基(固氮培养基)：KH2PO4 0.2g，K2HPO4·3H2O 0.8g，MgSO4·7H2O 0.1g，CaSO3·2H2O 0.1g，FeCl3 0.25g，Na2MoO4·2H2O 0.5g，酵母膏0.5g，甘露醇20g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH值为7.2。
将购买的圆褐固氮菌安培管接种于培养基斜面中，好氧25～30℃培养72～120小时活化，如有需要，可连续活化2次。用接种针取出于培养基平板上划线分离，好氧25～30℃培养72～120小时。选取长势良好的单菌落经镜检确认无污染后，用接种针选取单菌落接种至液体培养基中，以三角瓶25～30℃好氧振荡培养72～120小时。
枯草芽孢杆菌的制备：培养基(营养肉汁琼脂)：牛肉膏10g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15g，自来水1000ml，pH值为7.2～7.4。将购买的枯草芽孢杆菌安培管接种于培养基斜面中，好氧25～30℃培养18～24小时活化，如有需要，可连续活化2次。用接种针取出于培养基平板上划线分离，好氧25～30℃培养18～24小时。选取长势良好的单菌落经镜检确认无污染后，用接种针选取单菌落接种至液体培养基中，以三角瓶25～30℃好氧振荡培养18～24小时。
白色链霉菌的制备：培养基(高氏合成一号琼脂)：NaCl 0.5g，KNO3 1.0g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 10mg，可溶性淀粉20g，琼脂20g，冷开水1000ml，pH值为7.2～7.4。将购买的白色链霉菌安培管接种于培养基斜面中，好氧25～30℃培养72～144小时活化，如有需要，可连续活化2次。用接种针取出于培养基平板上划线分离，好氧25～30℃培养72～144小时。选取长势良好的单菌落经镜检确认无污染后，用接种针选取单菌落接种至液体培养基中，以三角瓶25～30℃好氧振荡培养72～144小时。
沼泽红假单胞菌的制备
培养基：蛋白肠3g，酵母膏3g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2 0.3g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH值为6.8。将购买的沼泽红假单胞菌安培管接种于培养基斜面中，光照厌氧37℃培养120～168小时活化，如有需要，可连续活化2次。经镜检确认无污染后，用无菌移液管接种至液体培养基中，以密闭的玻璃瓶光照厌氧37℃培养120～168小时。
②驯化培养
植物乳杆菌的驯化：在200升厌氧种子罐内加入培养基(组分比例为：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖5g，乳糖5g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，Tween80 1g，K2HPO4·3H2O 2g，MnSO4·4H2O 0.05g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCO3·7H2O 20g，蒸馏水1000mL)20升、5公斤糖蜜(糖蜜经预处理)调pH值至6.8，100℃灭菌2小时，快速冷却至40℃后，接入10升液体植物乳杆菌，在种子罐内进行驯化培养。培养条件为：厌氧，30～35℃，偶尔搅拌，搅拌速度为40rpm，36～48小时。
圆褐固氮菌的驯化：在200升好氧种子罐内加入培养基(组分比例为：培养基KH2PO4 0.2g，K2HPO4·3H2O 0.8g，MgSO4·7H2O 0.1g，CaSO3·2H2O 0.1g，FeCl30.25g，Na2MoO4·2H2O 0.5g，酵母膏0.5g，甘露醇20g，蒸馏水1000mL)20升、5公斤糖蜜(糖蜜经预处理)，调pH值至7.2，100℃灭菌2小时，快速冷却至35度后，接入5升液体圆褐固氮菌，在种子罐内进行驯化培养。培养条件为：好氧，25～28℃，持续搅拌，搅拌速度为40rpm，18～24小时。
枯草芽孢杆菌的驯化：在200升好氧种子罐内加入培养基(组分比例为：牛肉膏10g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL)20升、5公斤糖蜜(糖蜜经预处理)调pH值至7.2，100℃灭菌2小时，快速冷却至35度后，接入5升液体枯草芽孢杆菌，在种子罐内进行驯化培养。培养条件为：好氧，25～30℃，持续搅拌，搅拌速度为80rpm，18～24小时。
白色链霉菌的驯化：在200升好氧种子罐内加入培养基(组分比例为：NaCl0.5g，KNO3 1.0g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 10mg，可溶性淀粉20g，水1000mL)20升、5公斤糖蜜(糖蜜经预处理)调pH值至6.8，100℃灭菌2小时，快速冷却至35度后，接入10升液体白色链霉菌，在种子罐内进行驯化培养。培养条件为：好氧，25～30℃，持续搅拌，搅拌速度为40rpm，120～144小时。
沼泽红假单胞菌的驯化：在200升厌氧种子罐内加入培养基(组分比例为：蛋白胨3g，酵母膏3g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2 0.3g，蒸馏水1000mL)20升、5公斤糖蜜(糖蜜经预处理)调pH值至6.8，100℃灭菌2小时，快速冷却至40度后，接入20升液体沼泽红假单胞菌、5升液体圆褐固氮菌在种子罐内进行复合驯化培养。培养条件为：光照厌氧，30～35℃，120～168小时。
③复合培养：
经过在多个大枣主产区的反复试验，各菌株占全部菌株的重量百分比在如下范围内时，本发明的复合微生物制剂能达到最优效果：其中植物乳杆菌为15～35％，优选为20～30％；圆褐固氮菌为15～30％，优选为20～30％；枯草芽孢杆菌为5～25％，优选为10～20％；白色链霉菌为5～25％，优选为10～20％；沼泽红假单胞菌15～35％，优选为20～30％。
在2吨的发酵罐内加入糖蜜培养基中，组成为200公斤糖蜜(糖蜜经预处理)、10公斤蛋白胨，调pH值至6.8，100℃灭菌2小时。快速冷却至40度后，取驯化好的液体种子混合，进行接种，驯化好的液体种子各菌组分的质量之和与上述糖蜜的重量比例为1∶1，其中在上述驯化好的液体种子中每个菌组分的重量占各个菌组分的重量之和的比例为：植物乳杆菌30～70公斤，优选40～60公斤；圆褐固氮菌30～60公斤，优选40～60公斤；枯草芽孢杆菌10～50公斤，优选20～40公斤；白色链霉菌10～50公斤，优选20～40公斤；沼泽红假单胞菌30～70公斤，优选40～60公斤。厌氧，30～35℃，72～120小时。72小时开始检测pH，每4小时一次，待pH降至3.5～4.0之间时，即可出罐。其中所获得的抗裂枣微生态制剂产品：①颜色：液体呈半透明红棕色；②气味：发酵型酸味；③pH：3.5～4.0；菌数：≥2.0×108个/ml。
配方方案一：在2吨的发酵罐内加入培养基，培养基的组成为200公斤糖蜜(糖蜜经预处理)、10公斤蛋白胨，调pH值至6.8，100℃灭菌2小时。快速冷却至40度后，取驯化好的液体种子混合，进行接种，植物乳杆菌60公斤，圆褐固氮菌40公斤，枯草芽孢杆菌20公斤，白色链霉菌20公斤，沼泽红假单胞菌60公斤。厌氧，30～35℃，72～120小时。72小时开始检测pH，每4小时一次，待pH降至4.0以下时，即可出罐。①颜色：液体呈半透明红棕色；②气味：发酵型酸味；③pH：3.8；④总菌数：2.7×108个/ml。
配方方案二：在2吨的发酵罐内加入培养基，培养基的组成为200公斤糖蜜(糖蜜经预处理)、10公斤蛋白胨，调pH值至6.8，100℃灭菌2小时。快速冷却至40度后，取驯化好的液体种子混合，进行接种，植物乳杆菌50公斤，圆褐固氮菌50公斤，枯草芽孢杆菌30公斤，白色链霉菌30公斤，沼泽红假单胞菌10公斤。厌氧，30～35℃，72～120小时。72小时开始检测pH，每4小时一次，待pH降至3.8以下时，即可出罐。其中所获得的抗裂枣微生态制剂产品：①颜色：液体呈半透明红棕色；②气味：发酵型酸味；③pH：3.6；④总菌数：2.4×108个/ml。
配方方案三：在2吨的发酵罐内加入糖蜜培养基，培养基的组成为200公斤糖蜜(糖蜜经预处理)、10公斤蛋白胨，调pH值至6.8，100℃灭菌2小时。快速冷却至40度后，取驯化好的液体种子混合，进行接种，植物乳杆菌40公斤，圆褐固氮菌40公斤，枯草芽孢杆菌40公斤，白色链霉菌40公斤，沼泽红假单胞菌40公斤。厌氧，30～35℃，72～120小时。72小时开始检测pH，每4小时一次，待pH降至3.6以下时，即可出罐。其中所获得的抗裂枣微生态制剂产品：①颜色：液体呈半透明红棕色：②气味：发酵型酸味；③pH：3.5；④总菌数：2.2×108个/ml。
配方方案表：
Figure BSA00000290800000101
经在大枣主产区反复试验发现，在上述的可选范围内，本发明的复合微生物制剂发酵时间、产品pH值都比较稳定，产品抗枣裂和防枣腐烂效果较好。当本发明中的复合微生物制剂中植物乳杆菌占菌株总重量小于15％或大于35％时，圆褐固氮菌小于15％或大于30％，枯草芽孢杆菌小于5％或大于25％时，复合微生物制剂的抗枣裂率和防枣腐烂效果相比自然状态下无显著的改善，或者虽然防枣腐烂效果显著但抗枣裂率效果不佳，无法达到实用目的。因此本发明的复合微生物制剂中各菌株占菌株总重量的百分比含量优选在上述范围内。
本发明中抗裂枣微生态制剂产品重量标准：
(1)颜色：液体呈半透明红棕色；(2)气味：发酵型酸味；(3)pH：3.5～4.0；(4)总菌数：≥2×108个/ml。
本发明技术方案带来的有益效果：
由于本发明中菌种组成合理，生产工艺正确可靠，产品重量稳定，两年内产品的感官指标、pH值不会发生变化，总菌数≥2×108个/ml。
本发明生产的抗红枣开裂腐烂的微生态制剂，能有效的改善土壤养分的均衡供应，果皮相对较厚而韧性强，不易开裂。即使到后期产生裂果，由于本产品有很强的抑制霉菌等有害菌的作用，也不会腐烂。
在我国的大枣产地所进行的试验表明：只要采用了抗裂枣微生态制剂，不论是采取哪种使用方法和措施，如和有机肥、大枣专用复合肥配合使用，还是单独灌根、叶面喷洒，也不论是在什么天气条件下使用，都能明显地降低裂果率。
具体试验结果：
1、某地大枣在转色-成熟期(秋季前后)遇连续15天阴雨，降雨量197.5mm，60年不遇。这种情况下通常会使枣果开裂腐烂，造成严重经济损失。在该地使用本发明的复合微生物制剂，该制剂中各菌株的重量百分含量为：植物乳杆菌25％，圆褐固氮菌25％，枯草芽孢杆菌15％，白色链霉菌15％，沼泽红假单胞菌20％。使用该复合微生物制剂后起到了很好的控制红枣裂果腐烂的功效。13个实验点统计，试验组裂果率平均为44.89％，比CK裂果率61.8％减少27.4％；裂果率最高的试验组(0.2％菌剂生物堆肥+0.2％菌剂喷洒)为54.2％，比CK减少了12.3％；裂果率最低的试验组(0.1％菌剂生物堆肥+0.2％菌剂喷洒)为24。7％，比CK减少60％。
同样，在上述地区同时期使用同样包括上述菌株，但各菌株重量百分比不在本发明所述的重量百分比范围内的复合微生物制剂，该制剂各菌株的重量百分比含量为：植物乳杆菌12％，圆褐固氮菌35％，枯草芽孢杆菌28％，白色链霉菌15％，沼泽红假单胞菌10％。试验组裂果率平均为59.89％，比CK裂果率61.8％仅减少0.91％。
2、在连续降雨，雨量76.9mm的某大枣产地使用本发明的复合微生物制剂，其中所使用的复合微生物制剂中各菌株的重量百分含量为：植物乳杆菌25％，圆褐固氮菌25％，枯草芽孢杆菌15％，白色链霉菌15％，沼泽红假单胞菌20％。实验结果的表明，3个试用组的裂果率平均为34.6％，比CK裂果率93.3％减少62.9％；裂果率最高的试用组(亩试0.3％菌剂生物堆肥50公斤+0.1％菌剂喷洒)为58.3％，比CK减少37.5％；裂果率最低的试验组(0.2％菌剂灌根+0.2％菌剂喷洒)为6％，比CK减少93.6％。
同样，在上述地区同时期使用同样包括上述菌株，但各菌株重量百分比不在本发明所述的重量百分比范围内的复合微生物制剂进行对比，该制剂各菌株的重量百分比含量为：植物乳杆菌40％，圆褐固氮菌10％，枯草芽孢杆菌25％，白色链霉菌15％，沼泽红假单胞菌10％。试验组裂果率平均为87.2％，比CK裂果率93.4％仅减少6.1％，其抗裂果率的减少不甚明显，效果不佳。
3、在神木县大河岔林场50木水浇地木枣示范园，使用本发明的复合微生物制剂，其中所使用的复合微生物制剂中各菌组分的重量百分含量为：植物乳杆菌30％，圆褐固氮菌20％，枯草芽孢杆菌10％，白色链霉菌10％，沼泽红假单胞菌30％。用0.2％菌液灌根1次+0.4％菌液喷洒5次，在连续降雨11天后，裂果率仅为11.3％，并且无腐烂现象出现。
从各地应用的情况汇总分析，本发明的抗枣裂腐烂复合微生物制剂中各菌组分的重量百分比应该选择在植物乳杆菌为15～35％，优选为20～30％；圆褐固氮菌为15～30％，优选为20～30％；枯草芽孢杆菌为5～25％，优选为10～20％；白色链霉菌为5～25％，优选为10～20％；沼泽红假单胞菌15～35％，优选为20～30％的范围内。尤其是复合微生物制剂中植物乳杆菌占全部菌株总重量的百分比不能小于15％或大于35％，圆褐固氮菌不能小于15％或大于30％，枯草芽孢杆菌不能小于5％或大于25％，否则复合微生物制剂的抗枣裂率和防枣腐烂效果相比自然状态下无显著的改善，或者虽然防枣腐烂效果显著但抗枣裂率效果不佳，无法达到实用目的。
各菌株占全部菌株总重量的百分比在本发明所限定范围内的复合微生物制剂，能充分起到防大枣裂果腐烂的效果，主要技术性能为：防御10天以上秋霖，减少裂果率75％以上，增产28-55％，生产经济效益显著。本发明的抗裂枣微生物菌剂防治红枣裂果方面达到国内领先水平，被相关部门建议在枣区大面积推广应用。

Claims (10)

1.一种用于抗枣裂腐烂的复合微生物制剂，其特征在于，所述复合微生物制剂包括植物乳杆菌、圆褐固氮菌、枯草芽孢杆菌、白色链霉菌、沼泽红假单胞菌，并由上述菌组分通过厌氧和好氧相结合的发酵工艺复合培养而成。
2.如权利要求1所述的复合微生物制剂，其特征在于：所述各菌组分的重量百分比为：植物乳杆菌为15～35％；圆褐固氮菌为15～30％；枯草芽孢杆菌为5～25％；白色链霉菌为5～25％；沼泽红假单胞菌15～35％。
3.如权利要求2所述的复合微生物制剂，其特征在于：所述各菌组分的重量百分比为：植物乳杆菌为20～30％；圆褐固氮菌为20～30％；枯草芽孢杆菌为10～20％；白色链霉菌为10～20％；沼泽红假单胞菌20～30％。
4.如权利要求3所述的复合微生物制剂，其特征在于：所述各菌组分的重量百分比为：植物乳杆菌为30％；圆褐固氮菌为20％；枯草芽孢杆菌为10％；白色链霉菌为10％；沼泽红假单胞菌30％。
5.如权利要求3所述的复合微生物制剂，其特征在于：所述各菌组分的重量百分比为：植物乳杆菌为25％；圆褐固氮菌为25％；枯草芽孢杆菌为15％；白色链霉菌为15％；沼泽红假单胞菌20％。
6.如权利要求3所述的复合微生物制剂，其特征在于：所述各菌株组分的重量百分比为：植物乳杆菌为20％；圆褐固氮菌为20％；枯草芽孢杆菌为20％；白色链霉菌为20％；沼泽红假单胞菌20％。
7.如权利要求1至6之一所述的复合微生物制剂，其特征在于，所述复合微生物制剂的总菌数≥2×108个/ml，PH值为3.5～4.0。
8.一种制造如权利要求1至6之一所述的用于抗枣裂腐烂的复合微生物制剂的方法，包括如下步骤：
(1)将植物乳杆菌、圆褐固氮菌、枯草芽孢杆菌、白色链霉菌、沼泽红假单胞菌在各自培养基中进行单菌种培养的步骤；
(2)将植物乳杆菌、圆褐固氮菌、枯草芽孢杆菌、白色链霉菌在加有糖蜜的各自培养基中进行驯化培养的步骤，将沼泽红假单胞菌在其加有糖蜜的培养基中加入圆褐固氮菌进行复合驯化培养的步骤；
(3)将驯化好的上述菌株液体种子混合，进行复合培养的步骤。
9.如权利要求8所述的制造复合微生物制剂的方法，其特征在于：步骤(1)中植物乳杆菌的单菌株制备中所使用的培养基的组分比例为：酪蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖5g，乳糖5g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，Tween801g，K2HPO4·3H2O 2g，MnSO4·4H2O 0.05g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCO3·7H2O 20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL；PH值为6.8；
圆褐固氮菌的单菌株制备中所使用的培养基的组分比例为：KH2PO4 0.2g，K2HPO4·3H2O 0.8g，MgSO4·7H2O 0.1g，CaSO3·2H2O 0.1g，FeCl3 0.25g，Na2MoO4·2H2O 0.5g，酵母膏0.5g，甘露醇20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL；PH值为7.2；
枯草芽孢杆菌的单菌株制备中所使用的培养基的组分比例为：牛肉膏10g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15g，水1000mL；PH值为7.2～7.4；
白色链霉菌的单菌株制备中所使用的培养基的组分比例为：NaCl 0.5g，KNO31.0g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 10mg，可溶性淀粉20g，琼脂20g，水1000mL，PH值为7.2～7.4；
沼泽红假单胞菌的单菌株制备中所使用的培养基的组分比例为：蛋白胨3g，酵母膏3g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2 0.3g，琼脂15g，蒸馏水1000mL；PH值为6.8。
10.如权利要求9所述的制造复合微生物制剂的方法，其特征在于：步骤(2)中植物乳杆菌的驯化培养中所使用的培养基的组分比例为：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖5g，乳糖5g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，Tween80 1g，K2HPO4·3H2O 2g，MnSO4·4H2O 0.05g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCO3·7H2O 20g，蒸馏水1000mL；在所述培养基中加入糖蜜调pH值至6.8；
圆褐固氮菌的驯化培养中所使用的培养基的组分比例为：KH2PO4 0.2g，K2HPO4·3H2O 0.8g，MgSO4·7H2O 0.1g，CaSO3·2H2O 0.1g，FeCl3 0.25g，Na2MoO4·2H2O0.5g，酵母膏0.5g，甘露醇20g，蒸馏水1000mL；在所述培养基中加入糖蜜调pH值至7.2；
枯草芽孢杆菌的驯化培养中所使用的培养基的组分比例为：牛肉膏10g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL；在所述培养基中加入糖蜜调pH值至7.2；
白色链霉菌的驯化培养中所使用的培养基的组分比例为：NaCl 0.5g，KNO31.0g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 10mg，可溶性淀粉20g，水1000mL；在所述培养基中加入糖蜜调PH值至6.8；
沼泽红假单胞菌的驯化培养中所使用的培养基的组分比例为：蛋白胨3g，酵母膏3g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2 0.3g，蒸馏水1000mL；在所述培养基中加入糖蜜调PH值至6.8，水1000mL，再加入圆褐固氮菌进行复合驯化培养；
在步骤(3)的复合培养中，培养基的组分为经预处理的糖蜜和蛋白胨，其中糖蜜和蛋白胨的重量比例为20∶1，PH值调至6.8，100℃灭菌2小时；快速冷却至40℃后，取上述驯化好的液体种子混合，进行接种，上述驯化好的液体种子与上述糖蜜的比例为1∶1，其中上述驯化好的液体种子中各菌组分重量比例为：植物乳杆菌为15～35％，圆褐固氮菌为15～30％，枯草芽孢杆菌为5～25％，白色链霉菌为5～25％，沼泽红假单胞菌15～35％；30～35℃，72～120个小时发酵，待PH值降至3.5～4.0时即可。
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