CN110129220A - 一种保加利亚乳杆菌bsts6-4及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种德氏乳杆菌保加利亚亚种BSTS6‑4及其应用。所述德氏乳杆菌保加利亚亚种BSTS6‑4命名为Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus BSTS6‑4，于2019年3月26号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019203。该菌株产酸能力强，能够抑制肠道致病菌，并且肠胃耐受性好。以该菌株发酵制备的酸乳风味佳，质构特性好，后酸化能力弱，酸乳活菌含量达107CFU·g‑1，产乙醛含量高达25.45mg/L，产双乙酰含量高达3.07mg/L，表观粘度高达4.75pa.s，保水率为80.34％，并且以该菌株发酵制备的酸乳能够调节肠道菌群，有效缓解细菌性腹泻，具有较好的益生保健效果。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种德氏乳杆菌保加利亚亚种BSTS6-4及其应用。
技术背景
酸奶是以新鲜的乳或复原乳为原料，经过巴氏杀菌后向其中添加乳酸菌发酵剂，40℃左右发酵，制备而成的发酵牛奶制品。各类酸奶产品以其丰富的营养、舒适的口感、特有的风味以及良好的保健功能倍受广大消费者的喜爱。随着我国人民消费水平的提高和健康理念的流行，酸奶消费量持续增长，已经成为我国第一大发酵乳制品。
乳酸菌是决定发酵乳制品质量和风味的重要因素，乳酸菌的生产性能(产香性、产粘性、产酸性、蛋白分解活力及乳糖分解性能)及功能特性(降血脂、免疫活性、抑菌等)直接关系到最终发酵乳制品的性能。性能优良的乳酸菌是保证发酵乳品质的关键因素。
益生酸奶是在制备酸奶的过程中加入益生菌，益生菌具有提高免疫力,维持消化肠道微生态平衡，预防胃肠道感染，抗肿瘤等作用，制备的酸奶有利于调节人体肠道微生态的平衡，适应人群广泛。而人体内的益生菌主要包括乳酸菌属、双歧杆菌属、芽胞杆菌属以及丁酸梭菌属。国家卫生部规定可用于保健食品的两株益生菌分别为嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌，对大肠杆菌、沙门菌或金黄色葡萄球菌有抑制作用。
目前市售酸奶是由嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌以及其他辅助菌株组成的发酵剂发酵而成，具有迅速产酸、产黏和产香等特性，单一菌株难以具备产酸能力强、表观黏度高、产香好以及具有抑菌活性等综合特性。而添加益生菌制备的益生酸奶虽对肠道菌群具有一定的抑制作用，但是抗菌种类少，抑菌效果一般。因此，有待筛选出一种具备产酸能力强、表观黏度高、产香好，并且具有一定抗菌活性的单一菌株，并利用筛选出的菌株制备质构特性好，活菌含量高的益生型酸乳。
本发明的目的在于提供一株益生型乳酸菌，能够实现单一菌株在制备酸奶时具有较强的产酸和产香能力能力、表观黏度高，胃肠耐受能力强，对肠道菌群的抑菌效果好，并且利用该菌株制备的酸乳质构特性好，风味佳，酸乳的后酸化能力较弱，活菌含量高，能够调节肠道菌群，缓解细菌性腹泻，具有较好的益生保健效果。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种德氏乳杆菌保加利亚亚种，所述菌株为Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus BSTS6-4，于2019年3月26号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019203。
本发明提供了一种德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus BSTS6-4在制备抑制肠道致病菌药物中的应用，所述肠道致病菌包括致泻大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、出血性大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、血清型肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌。
本发明提供了一种德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus BSTS6-4在制备调节肠道菌群保健品中的应用。
本发明提供了一种德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus BSTS6-4在制备食品或食品添加剂的应用，食品为发酵乳制品，包括酸乳、奶酪、发酵乳饮料。
本发明还提供了一种应用德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus BSTS6-4(以下简称为菌株BSTS6-4)发酵制备酸乳的方法，具体步骤如下：
(1)菌种活化：取-80℃冷冻保藏的菌株BSTS6-4于MRS液体培养基中，37℃厌氧环境下培养，连续转接完成菌株活化；
(2)继代式发酵剂：取活化后的菌液离心，用无菌生理盐水洗涤菌体后重悬于生理盐水中，将菌种接种于灭菌脱脂乳中，培养至凝乳，取出放置于4℃冰箱作为继代式发酵剂使用；
(3)酸乳的制备：取新鲜牛乳，加入重量比为5％的食用蔗糖，混匀后预热，均质和杀菌；冷却至40-50℃后加入发酵罐中，并加入步骤(2)中所得的继代式发酵剂进行发酵；发酵至pH值为4.5时置于4℃冷藏24h后即得。
优选地，步骤(2)中，所述菌株BSTS6-4的接种量为3％v/v，所述灭菌脱脂乳含有0.5％ m/v的葡萄糖，所述培养条件为37℃；
优选地，步骤(3)中，所述均质方式为二级均质，其中一级均质压力为17MPa，二级均质压力为4MPa；
优选地，步骤(3)中，所述的杀菌方式为100℃恒温杀菌5min；
优选地，步骤(3)中，所述继代式发酵剂的接种量为5％m/v。
本发明的有益效果是：①本发明提供的菌株BSTS6-4不仅产酸能力强，而且具有较好的疏水性和自凝集能力，能够对胃肠道产生较好的粘附性；②本发明提供的菌株BSTS6-4的具有较好的胃肠耐受性，菌株BSTS6-4经模拟胃液处理3h后的存活率在90％左右，经模拟肠液处理6h后的存活率为43.8％；③本发明提供的菌株BSTS6-4对肠道致病菌具有较好的抑制效果，肠道致病菌包括致泻大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、出血性大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、血清型肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌；④利用本发明提供的菌株BSTS6-4制备的酸乳质构特性好，风味佳，酸乳的后酸化能力较弱，活菌含量高达107CFU·g-1，乙醛含量高达25.45mg/L，双乙酰含量高达3.07mg/L，表观粘度为4.75pa.s，保水率为80.34％；⑤利用本发明提供的菌株BSTS6-4制备的酸乳能够调节肠道菌群，有效缓解细菌性腹泻，具有较好的益生保健效果。
附图说明
图1菌株BSTS6-4生长曲线图。
图2菌株BSTS6-4的细菌形态以及菌落形态图，其中图2-a为细菌形态图，图2-b为菌落形态图。
图3菌株BSTS6-4的16S rRNA经同源性对比，利用MEGA软件分析的进化关系图。
图4用菌株BSTS6-4制备的酸乳图片。
图5酸乳20d内的活菌变化量。
图6菌株BSTS6-4酸化能力测定，其中图6-a为产酸性能测定；图6-b为后酸化能力测定。
图7丁二酮标准曲线。
图8双乙酰和乙醛含量。
图9菌株BSTS6-4的抑菌效果图。
图10菌株BSTS6-4的疏水率和自凝集率，其中图10-a为疏水率；图10-b为自凝集率。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细的阐述，但本发明的保护范围并不限于以下实施例，任何本领域的技术人员在本发明的基础上，结合本领域公知常识所能想到的技术方案，都属于本发明的保护范围。
在本发明的下述实施例中，所用的实验材料和试剂来源如下：
德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricusBSTS6-4，于2019年 3月26号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019203；
致泻大肠埃希氏菌(CICC 10411)，鼠伤寒沙门氏菌(CICC 10420)，产肠毒素大肠埃希氏菌(CICC 10421)，出血性大肠埃希氏菌(CICC 21530)，单核细胞增生李斯特氏菌(CGMCC 1.9136)，血清型肠炎沙门氏菌(CGMCC 1.10754)和金黄色葡萄球菌(CICC 21600)均购自中国工业微生物菌种保存管理中心。
实施例1菌株BSTS6-4的分离鉴定
1.1乳酸菌的分离纯化
以从新疆伊犁地区采集的乳制品为样品，用无菌生理盐水分别稀释至10-4、10-5、10-6，分别吸取100μL稀释后的样品均匀的涂布在MRS培养基上，在37℃恒温箱中培养18-24h，观察菌落颜色、大小、凸起程度和光泽度，挑选其中具有乳酸菌典型特征的单菌落进行富集。
取适量菌悬液进行镜检，若镜检中菌株细胞形态、排列方式不一致，则需继续划线纯化至一致。纯化后的菌株在37℃条件下培养18h后进行革兰氏染色以及接触酶实验，将其中革兰氏阳性、接触酶阴性的菌株富集后保藏至-80℃备用。
共分离出来71株纯培养物，经初步鉴定，得到52株疑似乳酸菌，将这52株疑似乳酸菌的发酵特性以及益生特性进行初步研究，筛选出了具有较好发酵特性和益生特性的德氏乳杆菌保加利亚亚种BSTS6-4，该菌株命名为Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus BSTS6-4，于2019年3月26号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019203。
1.2菌株BSTS6-4生长特性及形态特征
菌株BSTS6-4生长迅速，18h即可达到稳定期，生长曲线如图1。在MRS固体培养基上呈现为1mm左右的白色菌落，表面光滑，菌体为细长杆状；菌株呈现出革兰氏阳性、接触酶阴性、无鞭毛、不运动，具体的细菌性态以及菌落形态见图2。
1.3菌株BSTS6-4生理生化鉴定
参照“东秀珠”等《常见细菌系统鉴定手册》进行菌株生理生化鉴定，具体鉴定结果如表1。
表1菌株BSTS6-4生理生化实验
注：+阳性结果，-阴性结果
实施例2菌株BSTS6-4的16S rRNA的序列分析
提取菌株BSTS6-4的DNA，使用细菌16S rRNA通用引物进行PCR扩增：
上游引物为27F:5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，
下游引物为1492R:5’-TAC CTT GTT ACG ACT T-3’；
PCR扩增体系(25μL体系)：预混液2×Taq MasterMix 12.5μL，引物27F 0.5μL，引物1492R 0.5μL，DNA模板2μL，补充ddH2O至25μL；
PCR反应条件：94℃预变性5min；95℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min， 35个循环；72℃终延伸7min；4℃保存备用。
反应在Bio-Rad iCycler Thermal Cycler(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)仪器上进行。扩增产物送交上海生工生物科技有限公司进行测序。测序结果提交到GenBank数据库。
菌株BSTS6-4的16S rRNA基因序列提交到GenBank数据库，利用BLAST搜索同源性较高的序列，用CLUSTAL X 1.81和MEGA 6.0软件进行序列的比对分析并建立系统发育树(图3所示)，可知该菌株隶属于乳杆菌属(Lactobacillus)，与已知种Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus系统发育关系最接近，初步确定该菌为Lactobacillusdelbrueckii subsp. bulgaricus BSTS6-4。
实施例3酸乳的制备及其质构特性
3.1酸乳的制备
菌种活化：取100μL-80℃冷冻保藏的德氏乳杆菌保加利亚亚种BSTS6-4于10mLMRS 液体培养基中，37℃厌氧环境下培养30h，连续转接3次完成对菌株的活化。
继代式发酵剂：取活化后的菌液4000r/min离心10min，无菌生理盐水盐水洗涤菌体，重复洗涤三次后重悬于生理盐水中。依照3％v/v的接种量将菌种接种于含有0.5％w/v的葡萄糖的灭菌脱脂乳中，37℃条件下培养至凝乳后取出放置于4℃冰箱作为继代式发酵剂使用。
发酵乳的制备：取经过验收、脱气、杀菌和标准化的新鲜牛乳1kg，加入50g食用蔗糖，混匀后预热至50℃过滤(除去残渣)；继续预热到60℃时，采用二级均质的方式均质，其中一级均质压力为17MPa，二级均质压力为4MPa；均质后采用100℃恒温杀菌5min的方式进行灭菌；冷却到40-50℃后加入发酵罐中，加入5％w/v的继代式发酵剂(活菌含量为109CFU·g-1)，在42℃条件下发酵，发酵至PH值为4.5取出并置于4℃冷藏24h后即得酸乳成品。制备的酸乳见图4。
3.2TPA全质构
利用TA.XTPlus物性测试仪，探头为P/36R，测定条件为：测试前速度5.00mm/s，测试速度1.00mm/s，测试后速度5.00mm/s，测试距离30mm，感应力Auto(Force)-2g；分析得出质构状况的评价参数，包括硬度、黏附性、内聚性、胶黏性等。
3.3表观粘度的测定
表观粘度由RVDV-III流变仪在Flow Peak模式下测得，剪切速率为10s-1，测定条件为 25℃。
3.4酸乳保水性测定
称取15g酸乳样品于50mL离心管中，1000g离心20min，用离心后的剩余沉淀的质量与样品质量的比值表示酸乳的保水率。
由菌株BSTS6-4发酵制得酸乳的质构特征见表2，由表2可以看出，菌株BSTS6-4发酵制得的酸乳硬度适中，表观粘度高达4.75pa.s，保水率达80.34％，酸乳的质构特性较好。
表2酸乳质构特性
3.5保藏过程中活菌数测定
将发酵至终点的酸乳样品置于4℃保存，分别于第1、5、10、15、20d取出样品测其活菌含量。具体测定方法为：取4℃保存的酸乳样品1mL于含有9mL无菌生理盐水的试管中，依次稀释105、106、107、108、109倍，取各稀释梯度样品100μL均匀涂布于MRS培养基上，厌氧环境下培养30h后计数。
酸乳20d内的活菌量如图5所示，酸乳在储藏20d后的活菌含量大于107CFU·g-1，高于国家规定的活菌含量(106CFU·g-1)。
实施例4菌株BSTS6-4酸化能力测定
4.1产酸性能测定
取活化后的菌株BSTS6-4于4000r/min离心10min后重悬于生理盐水中，以3％v/v的接种量接种于脱脂乳中，37℃条件下培养2h后，每隔2h取出10g样品测其滴定酸度。以酸度为纵坐标，发酵时间为横坐标绘制菌株产酸曲线。酸度测定方法参照国标 GBT12456-2008。由图6-a可以看出，菌株BSTS6-4发酵20h后的酸度增加了77°T，说明菌株BSTS6-4的酸化能力较强。
4.2后酸化能力测定
将发酵至终点的酸乳样品在4℃条件下冷藏，分别于第1、5、10、15、20d取出样品测其滴定酸度，绘制酸乳酸度随时间变化的曲线。酸度测定方法具体国标GBT12456-2008。图6-b可以看出，在4℃冷藏20d后，酸乳的酸度只增加了12°T，且酸度仍处于规定的范围内(70-110°T)，说明酸乳的后酸化能力较弱。
实施例5乙醛、双乙酰含量的测定
将发酵完全的酸乳样品置于4℃冰箱冷藏后熟，分别于第12、24、36、48h取出测其乙醛和双乙酰含量。
5.1双乙酰含量测定
丁二酮标准曲线的绘制：取15μL丁二酮溶于蒸馏水中，定溶至500mL。分别准确量取丁二酮标准溶液0.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0m L于编号的12支双排放置的试管中并用蒸馏水补足至10mL。向前排6支试管中加1％的邻苯二胺溶液0.5mL，后排6支试管不加邻苯二胺溶液，充分混匀后于黑暗处反应30min。反应完全后加4.0mol/L 的盐酸进行终止反应(前排试管加2.0mL，后排试管加2.5mL)，摇匀后以后排试管为空白对照，用紫外分光光度计在335nm波长下测定吸光值。以丁二酮浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，见图7。
丁二酮含量的测定：取待测乳样品，用16％三氯乙酸溶液等体积与其混合，混匀后静置 10min，3500g离心10min后取上清液，用滤纸将上清液过滤一次，确保其澄清。然后取上清液20mL，等体积分别加入到2个试管中，向1号试管中加入1％的邻苯二胺溶液0.5m L，2号试管不加，充分混匀后于黑暗处使其反应30min，然后向2个试管中加入4.0mol/L 的盐酸进行终止反应(1号试管加2.0mL，2号试管加2.5mL)，混匀后以2号试管作为对照液，用紫外分光光度计在335nm波长测定吸光值。如果样品中丁二酮含量较高，测得的吸光值超过0.2-1.0的范围，可用8％三氯乙酸对样品进行适当的稀释处理。然后对照标准曲线计算出样品中丁二酮的含量，如果稀释了样品，再乘以稀释倍数得到丁二酮的含量。
5.2乙醛含量测定
试剂的配制：称取12.70g碘于500mL烧杯中，加入40g碘化钾，加适量的水溶解，移至1000mL棕色容量瓶，定容摇匀，配制成0.1mol/L碘标准溶液。然后准确量取10.00mL 的0.1mol/L碘标准溶液于100mL棕色容量瓶中，用蒸馏水稀释至标线，摇匀，两种溶液现用现配。
样品测定取1％NaHSO3溶液5mL置于250mL锥形瓶中，加入处理后试样上清液25mL，混匀后在室温下放置1h，然后加入1％淀粉溶液1mL，用0.1mol/L碘液滴定至接近淡蓝紫色，再用0.01mol/L碘液滴定至淡蓝紫色，并且在30s内淡蓝紫色不褪去，以上的滴定均不计数。然后加入1mol/L的NaHCO3 20mL，充分振荡混匀，使溶液蓝紫色消失，最后用0.01mol/L碘液滴定至蓝紫色终点，记录消耗标准碘液的体积，每个样品有两个平行，并同时做空白试验。
其中：M-乙醛含量(mg/L)；V2-滴定空白消耗碘标准溶液体积(mL)；V1-滴定样品消耗碘标准溶液体积(mL)；C-碘标准溶液的浓度(mol/L)；25-样品称样量(mL)；0.022-乙醛反应化学基本单位(g)。
一般认为乙醛与双乙酰含量之比大于3:1时，酸乳风味较好，利用菌株BSTS6-4制备的酸乳产双乙酰和乙醛的含量见图8，并且在酸乳贮藏过程中，乙醛含量最高可达25.45mg/L，远高于同类型发酵剂菌株的乙醛产量，双乙酰含量最高可达3.07mg/L，乙醛与双乙酰含量比远大于3:1。
实施例6菌株BSTS6-4益生特性研究
6.1菌株抑菌能力测定
取培养18h的病原指示菌(浓度为108CFU/mL)100μL，用牛津杯法测定菌株抑菌能力：取37℃培养36h的菌株BSTS6-4菌悬液，10000r/min离心10min后用1mol/L NaOH将pH 调至6.0，并用过氧化氢酶和胰蛋白酶处理上清液，然后用22μm滤膜过滤，灭菌后取200μL 加入牛津杯中，将平板置于4℃静置5h，直至上清液扩散到琼脂中。在37℃条件下培养24 h后，使用游标卡尺测定抑菌圈直径(mm)，具体的实验效果图见图9(从A-G的菌株编号依次为：21530、10411、10420、10421、1.10754、1.9136、21600)。由表3可以看出菌株 BSTS6-4对于7种常见肠道致病菌具有较好的抑制能力。
表3菌株BSTS6-4的抑菌结果(抑菌圈直径单位：mm)
注：表内数据为抑菌圈直径(牛津杯直径8mm)，数值为三次试验的平均值
6.2菌株转运过程中的耐受性
模拟胃、肠液的制备：将胃蛋白酶溶解于无菌磷酸盐缓冲溶液(0.2M，pH3.0)中，制备成终浓度为3g/L的模拟胃液。将胰蛋白酶溶解于含有0.3％牛胆盐的无菌磷酸盐缓冲盐溶液中(0.2M，pH8.0)中制成胰蛋白酶终浓度为1g/L的模拟肠液。
将菌株培养至对数期后4℃条件下4000r/min离心10min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤三次后重悬于模拟胃液中，调节菌悬液浓度为108CFU/mL。将菌株置于37℃条件下培养，分别于第0、1、2、3h取出进行平板计数。将胃液处理3h后的菌株离心后重悬至模拟肠液中，置于37℃条件下培养，分别于第2、4、6h取出进行计数活菌。实验结果如表4，结果表明菌株BSTS6-4经模拟胃液处理3h后，存活率在90％左右，经模拟肠液处理6h后存活率为43.8％，说明菌株BSTS6-4具有较好的胃液耐受性。
表4菌株BSTS6-4胃肠液耐受性
6.3疏水性
将菌株发酵液4000r/min离心20min，用生理盐水洗涤两遍后重悬于0.1mol/LKNO3(pH 值为6.2)溶液中，调节菌悬液浓度为107CFU/mL，600nm下测定样品吸光度A0；分别吸取 1mL二甲苯、乙酸乙酯、氯仿溶剂加到3mL菌液中混匀，室温下放置10min后涡旋振荡2min，室温下静置20min后取水相，测定其在600nm(A1)处的吸光度。菌株疏水率(％) 用以下公式表示：
实验结果详见图10-a，二甲苯为非极性溶剂，菌株BSTS6-4对二甲苯的疏水率达85％，说明菌株BSTS6-4具有疏水性的细胞表面；氯仿是酸性溶剂，属于电子受体，而乙酸乙酯是单碱性溶剂，属于电子供体。菌株BSTS6-4对氯仿的疏水性明显高于对乙酸乙酯的疏水性，说明菌株BSTS6-4是电子供体，也进一步证明了菌株BSTS6-4具有疏水性的细胞表面。疏水性较高的细菌对肠道粘附性较好，菌株BSTS6-4疏水性较好，表明菌株BSTS6-4具有较好的胃肠道粘附性。
6.4自凝集能力
将菌株发酵液4000r/min离心20min，用PBS缓冲液洗涤两遍后调节菌悬液浓度为107 CFU/mL。取5mL菌悬液于10mL试管中漩涡震荡10s，在室温条件下静置5h，每隔1h 取出菌悬液置于600nm测其吸光值。每组3个平行试验。菌株自凝集率(％)使用下列公式计算：
式中At表示菌悬液在1h、2h、3h、4h和5h的吸光值，A0表示时间为0h的吸光值。
益生菌通过自凝集作用相互凝集到一定的数量时才能牢固的粘附于人体肠道内，达到一定的数量才会发挥发挥益生功效，实验结果详见图10-b，菌株BSTS6-4的自凝集率随着时间的增加而增大，最大可达65％，表明菌株BSTS6-4对肠道具有较好的粘附能力。
6.5含菌株BSTS6-4的酸乳对小鼠细菌性腹泻的影响
选取健康的BALB/c小鼠80只，雌雄各40只，体重为20±2g。禁食12h后，根据小鼠体重按0.02mL/g的剂量对其实施致病性大肠杆菌悬液(108CFU/mL)腹腔注射，连续观察6 h，小鼠每隔1h排水样便1次以上者即为模型构建成功。
选取构建模型成功的小鼠60只，雌雄各30只，将实验小鼠分成三组，每组20只，单只单笼饲喂。三组小鼠分别喂含菌株BSTS6-4的酸乳、某品牌市售原味酸奶(发酵用原料乳为牛乳，发酵用菌株为德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌以及鼠李糖乳杆菌，酸奶中活菌含量大于106CFU/mL)以及无菌生理盐水，12h内每隔2h灌喂一次，每次灌胃0.4mL/只，期间小鼠自由饮食。记录各组小鼠12h内腹泻的次数。具体实验结果见表5。由表5可以看出，与灌喂生理盐水的小鼠相比，灌喂含菌株BSTS6-4的酸乳和市售酸奶的两组小鼠腹泻情况得到好转，与灌喂普通市售酸奶的小鼠相比，灌喂含菌株BSTS6-4的酸乳的小鼠腹泻次数明显较少，表明食用利用本发明提供的菌株BSTS6-4发酵制备的酸乳能够有效缓解小鼠由于细菌感染引起的急性腹泻，具有一定的保健效果。
表5酸乳对小鼠腹泻次数的影响
序列表
<110> 石河子大学
<120> 一种保加利亚乳杆菌BSTS6-4及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1162
<212> DNA
<213> 保加利亚乳杆菌BSTS6-4(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusBSTS6-4)
<400> 1
ggcagggggg cagctataca tgcaagtcga gcgagctgaa ttcaaagatt ccttcggggt 60
gatttgttgg acgctagcgg cggatgggtg agtaacacgt gggcaatctg ccctaaagac 120
tgggatacca cttggaaaca ggtgctaata ccggataaca acatgaatcg catgattcaa 180
gtttgaaagg cggcgcaagc tgtcacttta ggatgagccc gcggcgcatt agctagttgg 240
tggggtaaag gcctaccaag gcaatgatgc gtagccgagt tgagagactg atcggccaca 300
ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccacaat 360
ggacgcaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa ggttttcgga tcgtaaagct 420
ctgttgttgg tgaagaagga tagaggcagt aactggtctt tatttgacgg taatcaacca 480
gaaagtcacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc 540
cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggaatgata agtctgatgt gaaagcccac 600
ggctcaaccg tggaactgca tcggaaactg tcattcttga gtgcagaaga ggagagtgga 660
attccatgtg tagcggtgga atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc 720
tctctggtct gcaactgacg ctgaggctcg aaagcatggg tagcgaacag gattagatac 780
cctggtagtc catgccgtaa acgatgagcg ctaggtgttg gggactttcc ggtcctcagt 840
gccgcagcaa acgcattaag cgctccgcct ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa 900
aggaattgac ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcacgcgaag 960
aaccttacca ggtcttgaca tcctgcgcta cacctagaga taggtggttc ccttcgggga 1020
cgcagagaca ggtggtgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt ggtaggtccc 1080
gcaacgagcg caccttgtct ttagtgcatc attagttgca ctctaaagaa ctgcgtacaa 1140
cgagaggtgg ggatgacgtc ag 1162
Claims (10)
1.一种德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricusBSTS6-4，该菌株于2019年3月26号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019203。
2.如权利要求1所述的一种德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus BSTS6-4，其特征在于，所述菌株BSTS6-4的16S rRNA序列如SEQ ID NO：1所示。
3.如权利要求1所述的一种德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus BSTS6-4在制备抑制肠道致病菌药物中的应用。
4.如权利要求3所述的一种德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus BSTS6-4，其特征在于，所述肠道致病菌包括致泻大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、出血性大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、血清型肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌。
5.如权利要求1所述的一种德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus BSTS6-4在制备调节肠道菌群保健品中的应用。
6.如权利要求1所述的一种德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus BSTS6-4在制备食品或食品添加剂中的应用。
7.如权利要求6所述的一种德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus BSTS6-4在制备食品或食品添加剂中的应用，其特征在于，所述的食品为发酵乳制品。
8.如权利要求7所述的一种德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus BSTS6-4在制备食品或食品添加剂中的应用，其特征在于，所述的发酵乳制品为酸乳、奶酪、发酵乳饮料。
9.如权利要求8所述的一种德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus BSTS6-44在制备食品或食品添加剂中的应用，其特征在于，所述的酸乳的制备方法包括以下步骤：
(1)菌种活化：取-80℃冷冻保藏的德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus BSTS6-4于MRS液体培养基中，37℃厌氧环境下培养，连续转接完成菌株活化；
(2)继代式发酵剂：取活化后的菌液离心，用无菌生理盐水洗涤菌体后重悬于生理盐水中，将菌种接种于灭菌脱脂乳中，培养至凝乳，取出放置于4℃冰箱作为继代式发酵剂使用；
(3)酸乳的制备：取新鲜牛乳，加入重量比为5％的食用蔗糖，混匀后预热，均质和杀菌；冷却至40-50℃后加入发酵罐中，并加入步骤(2)中所得的继代式发酵剂进行发酵；发酵至pH值为4.5时置于4℃冷藏24h后即得。
10.如权利要求9所述的一种德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus BSTS6-4在制备食品或食品添加剂中的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus BSTS6-4的接种量为3％v/v，所述灭菌脱脂乳含有0.5％m/v的葡萄糖，所述培养条件为37℃；步骤(3)中，所述均质方式为二级均质，其中一级均质压力为17MPa，二级均质压力为4MPa，所述的杀菌方式为100℃恒温杀菌5min，所述继代式发酵剂的接种量为5％m/v。
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