CN107287133A - 一株植物乳杆菌lly‑606及其应用 - Google Patents

一株植物乳杆菌lly‑606及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一株植物乳杆菌LLY‑606及其应用。本申请的植物乳杆菌LLY‑606，其保藏号为CGMCC No.13984。本申请的植物乳杆菌LLY‑606，能够调节血脂，降低胆固醇和甘油三酯，具有优异的益生作用，并且，具有很强的耐酸和耐胆盐能力，能够长期保存；可以用于制备各种调节血脂的食品、保健品、食品添加剂或药品，为调节血脂提供了一种新的高效原材料。

Description

一株植物乳杆菌LLY-606及其应用
技术领域
本申请涉及植物乳杆菌领域，特别是涉及一株植物乳杆菌LLY-606及其应用。
背景技术
高胆固醇血症也称高低密度脂蛋白胆固醇血症，是导致动脉粥样硬化性心血管病的首要危险因素。最新研究显示，各种心血管病风险人群低密度脂蛋白每降低1毫摩尔/升，主要血管事件可降低21％。
当前针对预防心血管疾病，提倡遵守低脂或低饱和脂肪食物的膳食原则。大量的实验证明，低脂食物能有效减少血清中胆固醇的含量，但低脂食物的口感和风味比较简单，这个膳食建议仍未被大众接受或长期坚持，由于低脂膳食主张的低接受性，人们愿望开发出其他可以降低血清胆固醇及血脂的膳食补充品。
最早发现乳酸菌能够降低机体内胆固醇含量，是源于上世纪七十年代Mann 的发现，他发现饮用发酵乳制品人的体内具有较低的胆固醇含量，在1985年，研究者Gilliland等开展了嗜酸乳杆菌进行体外降胆固醇的研究，结果发现该菌能够降低发酵液中的胆固醇含量。Grill等给血清总胆固醇水平偏高的患者服用嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌制剂，8个月后发现被测人群血清胆固醇含量均显著下降。
目前国内针对降胆固醇功能研究比较深入的两个菌株同属于植物乳杆菌，分别为L.plantarum P8和植物乳杆菌ST-III。L.plantarum P8来自内蒙古农业大学的张和平领导的团队，动物试验表明，L.plantarum P8具有显著的降血脂作用。植物乳杆菌ST-III在大量基础研究的基础上，成功通过动物实验和人群临床试验的证实其降胆固醇的效果，并已产业化，成为光明公司的一个具有自主知识产权的益生菌产品。这也充分表明了具有降胆固醇的乳酸菌在发酵食品领域具有广泛的应用前景。
发明内容
本申请的目的是提供一株新的植物乳杆菌LLY-606及其应用。
本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一株植物乳杆菌LLY-606，其保藏号为CGMCC No. 13984。
需要说明的是，本申请的保藏号为CGMCC No.13984的植物乳杆菌 LLY-606，是新发现的一株具有良好的调节血脂功能的菌株，分类学命名为：植物乳杆菌植物亚种，Lactobacillus plantarum subsp.plantarum。经本申请的研究证实，该菌株在体内、体外都具有很好的降胆固醇、降甘油三酯效果，并且对酸和胆汁都有良好的耐受性，这意味着，本申请的植物乳杆菌LLY-606可以被食用或口服药用，以调节血脂。因此，特意将本申请的植物乳杆菌LLY-606于2017 年4月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为 CGMCC No.13984。
本申请的另一面公开了本申请的植物乳杆菌LLY-606在制备调节血脂的食品、保健品、食品添加剂、药品或组合物中的应用。
本申请的组合物是指除食品、保健品、食品添加剂、药品以外的其它类型的含有本申请的植物乳杆菌LLY-606的食用或药用组合物，该组合物可以用于调节血脂。
优选的，调节血脂具体包括降低胆固醇和/或甘油三酯。
需要说明的是，由于本申请的植物乳杆菌LLY-606具有良好的调节血脂功能，并且可以食用，因此，完全可以将其制成各种食品、保健品、食品添加剂或药品，用于调节血脂或者起保健作用。
本申请的另一面公开了一种食品，该食品中含有本申请的植物乳杆菌LLY-606。
优选的，该食品中还含有食品学上可接受的添加剂或辅料。
更优选的，本申请的食品为乳酸饮品或豆乳饮品。
需要说明的是，本申请的植物乳杆菌LLY-606和现有的乳杆菌一样，可以制成各种食品，例如乳酸饮品、豆乳饮品等，所制备的食品主要起保健作用，因此，对食品中的植物乳杆菌LLY-606活性菌量或者摄取量不做具体限定，实际应用中，可以根据实际状况灵活选择。本申请的研究显示，每天摄入1.0×108 CFU单位的活性植物乳杆菌LLY-606，能够明显降低动物血中的胆固醇含量、甘油三酯含量，该活性菌剂量可以作为食品、保健品、食品添加剂或药品的参考用量或参考摄取量。
此外，还需要说明的是，本申请的食品，是广义上的以任何形态存在的可食用物品，并不仅限于乳酸饮品或豆乳饮品，例如还可以是发酵食品，发酵食品也包括动物饲料等。
本申请的另一面公开了一种保健品，该保健品中含有本申请的植物乳杆菌LLY-606。
需要说明的是，本申请的植物乳杆菌LLY-606具有良好的调节血脂功能，因此，可以添加到现有的各种保健品中，使其具备良好的调节血脂的保健功能，只要保健品的其它组分与植物乳杆菌LLY-606之间没有相互抑制或不良副作用即可。
本申请的另一面公开了一种食品添加剂，该食品添加剂中含有本申请的植物乳杆菌LLY-606。
需要说明的是，本申请的植物乳杆菌LLY-606可以与通常的食品材料配合食用。例如，谷类及薯类，谷类包括米、面、杂粮，薯类包括马铃薯、红薯等；动物性食物，包括肉、禽、鱼、奶、蛋等；豆类及其制品，包括大豆及其它干豆类；蔬菜水果类，包括鲜豆、根茎、叶菜、茄果等；纯热能食物，包括动植物油、淀粉、食用糖和酒类等；因此，本申请的植物乳杆菌LLY-606可以单独的作为食品添加剂或者调制剂加入各种食材中直接食用，起到调节血脂的保健作用。
本申请的另一面公开了一种药品，该药品中含有本申请的植物乳杆菌 LLY-606。
优选的，本申请的药品用于调节血脂，调节血脂具体包括降低胆固醇和/或甘油三酯，药品一天的剂量中，含有至少1.0×108CFU单位的活性植物乳杆菌 LLY-606。
优选的，药品中还含有医学上可接受的载体或辅料。
更优选的，药品为片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂和冻干制剂中的至少一种；
更优选的，药品为复合益生菌片。
需要说明的是，本申请的药品，由于含有本申请的植物乳杆菌LLY-606，因此，具有良好的调节血脂的功能；本申请的药品，可以是单独活性成份的植物乳杆菌LLY-606的各种制剂，也可以与其它活性成份配合使用，只要相互之间不影响活性即可。
本申请的植物乳杆菌LLY-606单独的作为活性成份使用时，其中可以添加各种医学上可接受的载体或辅料，只要能够使药品方便给药即可，例如本申请的一种实现方式中，根据不同的剂型，无毒载体可以采用葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羟乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、氨基酸、明胶、白蛋白、水和生理食盐水中的至少一种。
此外，可以理解，本申请的植物乳杆菌LLY-606作为活性菌药品，只要不影响其菌株活性，药品可以采用现有的各种剂型，例如片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂等。而本申请的药品中，进一步的还可以包括药品或剂型中常用的辅料，例如稳定剂、湿润剂、乳化剂、粘合剂、等渗剂等。
本申请的药品中植物乳杆菌LLY-606活性菌含量，或者药剂量不受特别限制，实际应用中，可以根据给药对象的健康状况灵活选择。但是，本申请的研究显示，每天摄入1.0×108CFU单位的活性植物乳杆菌LLY-606，能够明显降低动物血中的胆固醇含量、甘油三酯含量，此用量可以作为药品中植物乳杆菌 LLY-606活性菌含量或者给药剂量参考。
本申请的植物乳杆菌LLY-606与其它益生菌或者益生材料组合使用时，只要各组分之间没有抑制作用或者不良反应即可，可以理解，最好的情况是各组分之间能够具有功能互补或促进作用，例如可以将本申请的植物乳杆菌LLY-606 制成复合益生菌片，通过与其它益生菌组合，达到更好或更多的活性功能，例如除调节血脂以外，还可以起到调节肠胃功能、提高免疫力等功能，具体的，可以根据复合益生菌片的各组分而定，在此不做限定。
本申请的有益效果在于：
本申请的植物乳杆菌LLY-606，能够调节血脂，降低胆固醇和甘油三酯，具有优异的益生作用，并且，具有很强的耐酸和耐胆盐能力，能够长期保存；可以用于制备各种调节血脂的食品、保健品、食品添加剂或药品，为调节血脂提供了一种新的高效原材料。
附图说明
图1是本申请实施例二中植物乳杆菌LLY-606在体外降解胆固醇实验结果图，其中，横坐标代表组别，纵坐标代表降解率；
图2是本申请实施例三中植物乳杆菌LLY-606在体外抗胆盐实验的生长曲线图；
图3是本申请实施例四中植物乳杆菌LLY-606降解甘油三酯动物实验的结果图，其中，横坐标代表组别，纵坐标代表甘油三脂的浓度；
图4是本申请实施例四中植物乳杆菌LLY-606降解胆固醇动物实验的结果图，其中，横坐标代表组别，纵坐标代表胆固醇的浓度。
本申请的植物乳杆菌LLY-606，分类学命名为：植物乳杆菌植物亚种，Lactobacillus plantarum subsp.plantarum，于2017年4月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.13984。
具体实施方式
本申请的植物乳杆菌LLY-606，是一株新分离发现的具有良好调节血脂功能的活性菌。本申请的植物乳杆菌LLY-606，在MRS培养基中在光学显微镜下呈球状形态，直径约1μm，无芽孢，胞壁结构完整；不含质粒，代谢物不产生D- 乳酸、吲哚等有毒物质，不表达硝基还原酶，也不具备产生物胺的能力； Gentamicin、Kanamycin、Streptomycin、Tetracycline、Erythromycin、Clindamycin、 Chloramphenicol、Amplicilin、Vancomycin等9种抗生素的最小抑菌浓度也都符合欧洲食品药品监督局(缩写EFSA)的规定。
本申请的植物乳杆菌LLY-606菌株对模拟胃液和人工肠液环境的抗性良好，且体外、体内都可明显降低胆固醇和甘油三酯；可见，本申请新分离发现的植物乳杆菌LLY-606具备成为药用菌或食用菌的必备条件，能够用于开发新药、食品、保健品、食品添加剂或其它食用或药用组合物。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例一
本例采用优化的培养基从内蒙古农家酸奶发酵食品中分离获得本例的植物乳杆菌LLY-606，并对其进行鉴定和细菌安全性测试。详细如下：
(1)培养基配方
本例配制了优化的MRS固体培养基和MRS培养液。
MRS固体培养基，简称MRS培养基，1L的配方为：酪蛋白胨10.0g/L，牛肉浸膏10.0g/L，酵母浸膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，吐温80 1.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，醋酸钠5.0g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锰 0.05g/L，琼脂17.5g
MRS肉汤培养基，即MRS培养液的配方较MRS培养基仅仅是不添加琼脂，其余相同。
配置的培养基和培养液，调整pH至6.5，121℃灭菌20min，然后4℃冷藏备用。
(2)植物乳杆菌LLY-606菌株的来源及鉴定
以内蒙古农家酸奶发酵食品为样品，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，将样品稀释至10-3，将其涂布于本例配制的MRS培养基表面，置于37℃培养箱中培养24-48h，观察菌落形态特征。从中挑取疑似乳酸菌的但菌落划线分离至新的MRS培养基上，37℃过夜培养后，再次进行划线分离纯化。采用无菌牙签从第二划线分离的培养基上挑取20个单菌落，将20个单菌落分别挑取至不同的离心管中，每个离心管加20μL无菌水，100℃加热10min，瞬时离心，作为菌液PCR模板，采用16s DNA扩增对挑取的单菌落进行分子生物学鉴定。
本例16s DNA扩增的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列。
SEQ ID NO.1：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’
SEQ ID NO.2：5’-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’
引物由深圳华大基因研究院合成。
PCR反应体系为，50μL的反应液中包括：10mM dNTPs 1μL、10×buffer 5μL、 10mM的上下游引物各10μL、菌液PCR模板5μL、5U/μL的Taq酶1μL，补充 ddH2O补充至50μL。
PCR反应条件为：95℃预变性5min，然后进入35个循环：95℃45s、55℃ 45s、72℃30s，循环结束后，72℃延伸5min，4℃待机。
对PCR扩增产物进行切胶回收，并对回收的PCR产物进行测序。本例采用试剂盒TaKaRa MiniBEST agarose GeL DNA Extraction kit进行切胶回收，详细步骤参见试剂盒说明书。本例的PCR产物由深圳华大基因研究院测序。
测序结果显示，20个单菌落中，编号为LLY-606的菌株，其16s rDNA测序结果为SEQID NO.3所示序列。
SEQ ID NO.3：
5’-GGCGGTGGTGGTTACTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTGAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGATGGTGCATGGTGTCGTCAGCTCGGTGTCTGAGATGTGGTAGTCTGCACTAGGCCACCCTTATTATCAGTGCCAGCATGAGTGAGACACTCTAGGTGAGACTGCG-3’
用BLAST工具在NCBI数据库中进行比对，比对结果显示，LLY-606菌株与植物乳杆菌Lactobacillus plantarum亲缘关系最近，相似性达到100％，因此，鉴定LLY-606菌株为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌LLY-606，即本例筛选获得的植物乳杆菌。
将植物乳杆菌LLY-606的单菌落转接到MRS培养液中进行纯培养，37℃培养18h，以备后续使用。
此外，在MRS培养基中于光学显微镜下观察植物乳杆菌LLY-606，结果显示，植物乳杆菌LLY-606呈球状形态、直径约1μm、无芽孢、胞壁结构完整，符合植物乳杆菌的形态结构。
将本例筛选获得的植物乳杆菌LLY-606于2017年4月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.13984。
(3)细菌安全性
1)抗生素敏感性测试
本例按照欧洲食品药品监督局的要求，测试了植物乳杆菌LLY-606对Gentamicin、Kanamycin、Streptomycin、Tetracycline、Erythromycin、Clindamycin、Chloramphenicol和Amplicilin总计八种抗生素的抗性；同时，额外的测试了植物乳杆菌LLY-606对抗生素Vancomycin的抗性。具体测试方法如下：
先将9种抗生素分别作一系列的2倍比稀释，分别得到了浓度为64μg/mL、 16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL 的稀释药物。
将稀释的抗生素分别加入96孔板对应孔中，然后对应孔加入植物乳杆菌 LLY-606的MRS培养液，混匀后，37℃培养48h，观察培养结果。本例以每个孔的抗菌药物最小抑菌浓度(缩写MIC)，表征植物乳杆菌LLY-606的敏感度，测试结果如表1所示。
表1植物乳杆菌LLY-606对9种抗生素抗性测定结果
抗生素 MIC(μg/mL) EFSA规定安全值
Gentamicin 1 16
Kanamycin 8 64
Streptomycin 8 不做要求
Tetracycline 8 32
Erythromycin 0.25 1
Clindamycin 0.5 2
Chloramphenicol 4 8
Amplicilin 0.125 2
Vancomycin 2 不做要求
表1的结果显示，本例分离获得的植物乳杆菌LLY-606对Gentamicin、 Kanamycin、Tetracycline、Erythromycin、Clindamycin、Chloramphenicol、Amplicilin 的最小抑菌浓度都符合欧洲食品药品监督局(缩写EFSA)的规定，并且远小于其规定的安全值；并且，植物乳杆菌LLY-606对Streptomycin和Vancomycin的最小抑菌浓度分别为8μg/mL和2μg/mL，这两个抗生素虽然在EFSA中没有做要求，但是，本例测得的值也都基本符合预期，可见，本例的植物乳杆菌LLY-606 对抗生素具有较好的敏感性。
此外，采用TIANGEN质粒小提试剂盒DP103对本例的植物乳杆菌LLY-606 进行质粒抽提，结果显示，未发现植物乳杆菌LLY-606携带任何质粒，表明植物乳杆菌LLY-606无基因水平转移可能性。
2)代谢物毒性检测
乳酸旋光性检测：使用爱尔兰Megazyme公司的D-/L-乳酸检测试剂盒进行检测。结果显示，本例的植物乳杆菌LLY-606不产生D-乳酸。
硝酸盐还原酶活性检测：将本例的本例的植物乳杆菌LLY-606转接于MRS 液体培养基中，于37℃培养24h，在无菌条件下，将活化好的菌株按3％的接菌量接入硝酸盐培养基中37℃培养5d后，滴加碘化钾溶液和淀粉溶液各10滴，观察实验结果。同时做阳性对照试验。实验结果显示菌液没有变蓝，为阴性反应，而阳性对照有变蓝，说明本例的植物乳杆菌LLY-606不表达硝基还原酶。
吲哚实验：无菌条件下，将活化好的菌株按3％的接菌量接入到蛋白胨水培养基中，37℃培养72h，然后加入吲哚试剂8～10滴，观察实验结果。同时做阳性对照试验。实验结果显示，菌液没有出现红色圆环，而阳性对照显示红色，表明本例的植物乳杆菌LLY-606代谢不产生吲哚。
氨基脱羧酶活性检测：具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺和二氧化碳，使培养基变碱性，例如将赖氨酸分解为尸胺，鸟氨酸分解为腐胺，精氨酸分解为精胺；滴加指示剂，例如溴甲酚紫，呈黄色为阴性，呈紫色为阳性。因此，本例在无菌条件下，将活化好的菌株按3％的接菌量接入到蛋白胨水培养基中，37℃培养72h，然后加入溴甲酚紫8～10滴，观察实验结果。滴定结果呈黄色，为阴性，说明本例的植物乳杆菌LLY-606不具备产生物胺的能力。
3)细胞粘附能力的测定
本例采用人结肠癌细胞系HT-29作为被吸附细菌，测试植物乳杆菌LLY-606 的细胞粘附能力，同时，设置购置于CGMCC的标准菌株干酪乳杆菌334作为对照。具体如下：
将6孔板中的植物乳杆菌LLY-606和干酪乳杆菌334的细胞单层培养物用不完全DMEM液37℃恒温培养1h，不完全DMEM液即不添加血清和双抗的 DMEM培养液；培养完成后，将培养液吸出，用无菌PBS洗涤3次，将洗涤液吸干；取500μL 108CFU/mL的人结肠癌细胞系HT-29与500μL不完全DMEM 混匀后，加入到前述的6孔培养板中，同时设无植物乳杆菌LLY-606细胞仅有菌液的空白对照，37℃，恒温培养1.5h；取出培养板，将培养液吸干，用无菌PBS洗涤5次，吸干洗涤液；每孔加入10％甲醛，室温固定2h；吸干固定液，用无菌PBS洗涤3遍，吸干洗涤液，室温干燥；革兰氏染色后镜检，随机选取 20个视野进行计数，并计算粘附指数：
粘附指数＝细菌/细胞数
粘附指数实际上就是指平均每个细胞粘附的细菌个数。
随机选取20个视野，对视野中的细胞上粘附的细菌的总数和细胞数进行计数并测定粘附指数，结果显示，本例的植物乳杆菌LLY-606对人结肠癌细胞系 HT-29粘附指数为5.8，与对照干酪乳杆菌334菌株相当，说明本例的植物乳杆菌LLY-606具有一定的细胞粘附能力。
实施例二
本例对实施例一分离获得的植物乳杆菌LLY-606进行了降胆固醇体外功能验证试验，并采用购置于CGMCC的标准菌株植物乳杆菌299v作为对照。其中，植物乳杆菌299v是已经商业化的具有降胆固醇功能的菌株。具体试验如下：
首先配制含有胆固醇的MRS培养液(缩写MRSO-CHOL培养液)和不含胆固醇的MRS培养液。
MRSO-CHOL培养液：由MRS培养液、巯基乙酸钠、胆盐和胆固醇组成，其中，巯基乙酸钠在MRSO-CHOL培养液中的浓度为2g/L，胆盐在MRSO-CHOL 培养液中的浓度为重量份0.3％，胆固醇的浓度为120μg/mL。
将植物乳杆菌LLY-606和植物乳杆菌299v分别转接于不含胆固醇的MRS 培养液中，于37℃培养24h，以1％的接种量传代2次后，于37℃培养15h，待用。
实验组：活化的植物乳杆菌LLY-606菌液按1％接种量接种于10mL MRSO-CHOL培养液中。
对照组：10mL没有接种菌株的培养液MRSO-CHOL。
299v组：活化的植物乳杆菌299v菌液按1％接种量接种于10mL MRSO-CHOL培养液中。
将这三组样品放置于37℃恒温培养箱培养24h后，取出摇匀，4000r/m离心 15min，取上清液，用邻苯二甲醛显色剂测定上清中胆固醇含量，并计算胆固醇的去除率，其中，胆固醇去除率＝对照组胆固醇与实验组胆固醇的差值/对照组胆固醇含量，试验结果如图1所示。
图1的结果显示，实施例一的植物乳杆菌LLY-606降胆固醇降低率为 64.49％，优于阳性对照即299v组的63.70％，可见实施例一的植物乳杆菌 LLY-606有较强的体外降低胆固醇能力，并且其降胆固醇能力，略优于目前已经商业化应用的植物乳杆菌299v标准菌株。
实施例三
本例对实施例一分离获得的植物乳杆菌LLY-606的体外耐酸、耐胆汁能力进行了试验，具体如下：
配制模拟胃液SGF：2.0g NaCl,3.2g胃蛋白酶,7ml浓HCl,加水调整至 PH3.0，然后用0.2μm微孔滤膜过滤后，即获得本例的SGF液，待用。
挑取植物乳杆菌LLY-606斜面菌种于MRS培养液中，37℃培养16～18h。菌悬液4000r/min离心15min，去上清，称量菌体湿重，按照0.1g/mL的比例重新悬浮菌体于生理盐水中，再按照1:10的比例加入到SGF液中，充分混匀后置于37℃恒温培养箱中培养2h，分别对培养0h和2h进行细胞计数。细胞计数结果如表2所示。
表2植物乳杆菌LLY-606对人工胃液SGF的耐受性活菌计数结果
菌株 0h计数 2h计数 存活率
LLY-606 2.07×109 1.60×109 77.29％
表2的结果显示，实施例一的植物乳杆菌LLY-606，培养2h后活菌数保持在一个数量级，表明植物乳杆菌LLY-606体外有较强的耐酸能力。
进一步的，将活化两次的菌液按1％量分别接入灭菌的含有重量份0.3％胆盐的10mL MRS培养液、含有重量份0.5％胆盐的10mL MRS培养液和不含胆盐的 10mL MRS培养液中，进行培养，并测定植物乳杆菌LLY-606在三个培养液中的生长曲线，结果如图2所示。图2中，▲的曲线代表在含有0.5％胆盐的MRS 培养液中的生长曲线、■的曲线代表在含有0.3％胆盐的MRS培养液中的生长曲线、◆的曲线代表在不含胆盐的MRS培养液中的生长曲线，图2的结果显示，胆盐的存在对植物乳杆菌LLY-606生长曲线几乎没有影响，说明实施例一的植物乳杆菌LLY-606体外有较强的抗胆汁能力。
实施例四
本例对实施例一分离获得的植物乳杆菌LLY-606进行体内降低胆固醇和甘油三酯，本例采用Sprague-Dawley系5周龄雄性大鼠进行体内试验，具体如下：
1.实验菌株的制备
将活化两次的植物乳杆菌LLY-606接种于MRS液体培养基中，于37℃培养18h，6000r/m离心10min，用灭菌生理盐水洗涤后收集菌体。然后，加入0.85％生理盐水，调整菌体数至1.0×108CFU/mL，然后将活菌按每日使用量分装于 15mL离心管，服用剂量为每天2mL/只，每组10只，共4组，灌胃28天。
2.实验动物分组及饲养方式
本例采用Sprague-Dawley系5周龄雄性大鼠，自由饲喂至第28天，然后平均分为4组，每组10只，按照以下设置分别对四组进行灌胃28天。
第一组：植物乳杆菌LLY-606组，该组灌胃活菌悬液，饲喂高脂饲料；
第二组：即模型组，该组灌胃0.85％生理盐水，饲喂高脂饲料；
第三组：即正常组，灌胃0.85％生理盐水，饲喂标准饲料；
第四组，即血脂康组，该组灌胃标准剂量血脂康，饲喂高脂饲料。
每天每只2mL灌胃，持续28天。
其中，高脂饲料自行配制，是在购买的标准饲料的基础上添加脂肪或高脂肪物质，具体配方为：78.8％标准饲料、10％猪油、10％蛋黄粉、l％胆固醇、0.2％胆盐。标准饲料为购置于河南天驰实验动物饲料厂的鼠类专用饲料。
3.样品采集与分析测试
正式试验前及第28天时间段进行采血。采血方法为绝食一夜后，于大鼠股静脉采血，凝血后4000r/m离心10min分离血清，利用购自浙江东瓯诊断产品有限公司的总胆固醇测定试剂盒和变色酸显色法，分别检测胆固醇及甘油三酯。其中，酶标仪采用MolecularDevices公司的Spectra MAX190酶标仪。
4.实验结果
测试结果如图3和图4所示，其中图3为各组甘油三酯的测定结果，图4 为各组胆固醇的测定结果。图3和图4的结果显示，用含植物乳杆菌LLY-606 菌株菌悬液喂养高脂饲料的大鼠即第一组，与模型组对照即第二组，两者相比大鼠血液中甘油三酯及胆固醇分别下降33.3％和33.9％，表明植物乳杆菌 LLY-606在大鼠体内确有降低胆固醇和甘油三酯的功效。
实施例五
本例分别将实施例一分离获得的植物乳杆菌LLY-606制成常用的药品和食品，具体如下：
(1)植物乳杆菌片剂
配方：CFU109的植物乳杆菌LLY-606的冻干粉15％、膳食纤维60％、山梨糖醇15％、微晶纤维素5％、硬脂酸镁5％；以上组分均为重量份，将各组分混合均匀后，压片制成片剂。其中，植物乳杆菌LLY-606的冻干粉为采用冻干机将其菌悬液在无菌环境下冷冻抽真空干燥而成。
(2)植物乳杆菌发酵酸豆乳
将奶粉和水进行混合，均质，以121℃超高温灭菌300s杀菌，冷却到42℃，接入活化好的发酵剂：保加利亚乳杆菌和嗜热乳杆菌菌粉总共接入量为重量份 0.4％。在42℃下发酵10h，冷却后加入重量份1％CFU为108的植物乳杆菌 LLY-606，搅拌，灌装即可。
其中，奶粉为酸奶制备中常规使用的奶粉。
(3)以上药品和食品的药效试验
本例采用实施例四相同的方法对本例的植物乳杆菌片剂和植物乳杆菌发酵酸豆乳进行体内降低胆固醇和甘油三酯试验。
其中，植物乳杆菌片剂捣碎后加无菌水制成的悬液，调整菌数至1.0×108 CFU/mL。植物乳杆菌发酵酸豆乳同样加无菌水制成的悬液，调整菌数至1.0× 108CFU/mL。以此替换实施例四中的活菌悬液。
喂养方法和后续的采血、测量方法都与实施例四相同。
结果显示，用植物乳杆菌LLY-606的药品或食品喂养高脂饲料大鼠28天后股静脉抽血检测，发现与对照相比大鼠血液中甘油三酯及胆固醇都有明显下降的情况，植物乳杆菌LLY-606在大鼠体内定植并发挥了作用，表明灌胃活菌在大鼠体内确有降低胆固醇及甘油三酯功效；并且，功效与直接的活菌悬液效果相当；可见，本例制备的植物乳杆菌片剂和植物乳杆菌发酵酸豆乳同样具有降低胆固醇及甘油三酯的效果。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大三生园科技有限公司
<120> 一株植物乳杆菌LLY-606及其应用
<130> 17I24428
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat catggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tagggttacc ttgttacgac tt 22
<210> 3
<211> 1143
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌 LLY-606的16s rDNA测序结果
<400> 3
ggcggtggtg gttactaata catgcaagtc gaacgaactc tggtattgat tggtgcttgc 60
atcatgattt acatttgagt gagtggcgaa ctggtgagta acacgtggga aacctgccca 120
gaagcggggg ataacacctg gaaacagatg ctaataccgc ataacaactt ggaccgcatg 180
gtccgagctt gaaagatggc ttcggctatc acttttggat ggtcccgcgg cgtattagct 240
agatggtggg gtaacggctc accatggcaa tgatacgtag ccgacctgag agggtaatcg 300
gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc 360
cacaatggac gaaagtctga tggagcaacg ccgcgtgagt gaagaagggt ttcggctcgt 420
aaaactctgt tgttaaagaa gaacatatct gagagtaact gttcaggtat tgacggtatt 480
taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc 540
gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt tttttaagtc tgatgtgaaa 600
gccttcggct caaccgaaga agtgcatcgg aaactgggaa acttgagtgc agaagaggac 660
agtggaactc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat ggaagaacac cagtggcgaa 720
ggcggctgtc tggtctgtaa ctgacgctga ggctcgaaag tatgggtagc aaacaggatt 780
agataccctg gtagtccata ccgtaaacga tgaatgctaa gtgttggagg gtttccgccc 840
ttcagtgctg cagctaacgc attaagcatt ccgcctgggg agtacggccg caaggctgaa 900
actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagct 960
acgcgaagac cttaccaggt cttgacatac tatgcaaatc tgagagatta gacgttccct 1020
tcggggacat ggatacagat ggtgcatggt gtcgtcagct cggtgtctga gatgtggtag 1080
tctgcactag gccaccctta ttatcagtgc cagcatgagt gagacactct aggtgagact 1140
gcg 1143

Claims (10)

1.一株植物乳杆菌LLY-606，其保藏号为CGMCC No.13984。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌LLY-606在制备调节血脂的食品、保健品、食品添加剂、药品或组合物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述调节血脂具体包括降低胆固醇和/或甘油三酯。
4.一种食品，其特征在于：所述食品中含有权利要求1所述的植物乳杆菌LLY-606。
5.根据权利要求4所述的食品，其特征在于：所述食品中还含有食品学上可接受的添加剂或辅料；
优选的，所述食品为乳酸饮品或豆乳饮品。
6.一种保健品，其特征在于：所述保健品中含有权利要求1所述的植物乳杆菌LLY-606。
7.一种食品添加剂，其特征在于：所述食品添加剂中含有权利要求1所述的植物乳杆菌LLY-606。
8.一种药品，其特征在于：所述药品中含有权利要求1所述的植物乳杆菌LLY-606。
9.根据权利要求8所述的药品，其特征在于：所述药品用于调节血脂，具体的用于降低胆固醇和/或甘油三酯，所述药品一天的剂量中，含有至少1.0×108CFU单位的活性植物乳杆菌LLY-606。
10.根据权利要求8或9所述的药品，其特征在于：所述药品中还含有医学上可接受的载体或辅料；
优选的，所述药品为片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂和冻干制剂中的至少一种；
更优选的，所述药品为复合益生菌片。
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