CN102204679A - 一种四联菌片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种四联菌片及其制备方法，属于保健食品领域，具体涉及四联菌片中长双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌等益生菌四联菌片及其制备方法；该四联菌片中，干酪乳杆菌菌粉1-3％、长双歧杆菌菌粉2-5％、嗜酸乳杆菌菌粉1-3％、嗜热链球菌菌粉1-3％、其它成份为辅料；由于双歧杆菌和乳酸菌被认为对人体有很多有益的影响，所以通过添加低聚半乳糖和低聚异麦芽糖等益生元物质促进益生菌在人体内的增殖。
Description
技术领域
本发明涉及一种菌片及其制备方法，尤其是一种四联菌片及其制备方法。属于保健食品领域，具体涉及四联菌片中长双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌等益生菌四联菌片及其制备方法。
背景技术
健康有益的益生菌如嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌等被越来越多地添加到保健食品中，通过其中活菌的作用可以改善胃功能、调整肠道菌群、抑制病原菌的生长、提高蛋白质和维生素的代谢、防止便秘、缓解乳糖不耐症、抗肿瘤、增强免疫系统、降低胆固醇等，从而促进身体健康。为了确保此类益生菌能在体内发挥正常的生理保健功能，一些世界性的食品组织已经提出标准，要求在食品中双歧杆菌等益生菌的最低值为106～107CFU/g。本品采用粉末直接压片工艺，解决了在传统的先制粒后压片技术中益生菌无法存活的问题，采用本技术生产出的产品具有调节肠道微生态环境，调节肠道功能，增强免疫力和预防便秘、腹泻的疗效。
技术方案
本发明的目的在于提供一种四联菌片及其制备方法。
本发明的一种四联菌片，其中，菌粉占产品重量百分比为：
干酪乳杆菌菌粉1-3％
长双歧杆菌菌粉2-5％
嗜酸乳杆菌菌粉1-3％
嗜热链球菌菌粉1-3％
其它成份为辅料。
上述的辅料为：矫味剂、粘合剂和助流剂。
上述的矫味剂为：甜味剂和/或酸味剂。
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)菌种保藏号为CGMCC No.4472，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为：2010年12月14日。
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)菌种保藏号为CGMCC No.1697，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为：2006年04月21日。
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌种保藏号为CGMCC No.4471，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为：2010年12月14日。
长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)菌种保藏号为CGMCC No.4470，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为：2010年12月14日。
以四联菌片为100份计。上述的辅料(重量份)优选为：葡萄糖25-30，低聚半乳糖7-15，麦芽糊精18-25，赤藓糖醇3-9，微晶纤维素5-10，羟丙基纤维素1-3，柠檬酸0.3-0.8，香精0.1-0.5，低聚异麦芽糖15-20，硬脂酸镁0.3-0.8。
上述四联菌片的制备方法，其中：
第一步：分别将原辅料进行过筛，规格为16-40目；第二步：将步骤1中的原辅料除硬脂酸镁外在混匀机上混匀10-15分钟，再加入硬脂酸镁混匀3-5分钟；第三部：将步骤2中混合物进行压片，包装。
上述四联菌片的制备方法，其中，本发明产品的片重为0.85g。；本发明产品的硬度约为40-100N，优选发明产品的硬度约为80N。每天服用4片。
本发明涉及菌种的分类学特征和其他形态学特征公开如下：
长双歧杆菌(BB20071001)，为分离自内蒙古地区健康人体肠道，筛选出适合人体之菌株，该长双歧杆菌已于2010年12月14日在国家知识产权局指定专利微生物保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.4470。
样品的采集与保存：内蒙古锡盟西乌珠穆沁旗12名健康儿童，男女各6名，年龄3～5岁，均无胃肠病史，采样前两周内未服用任何抗菌类药物。
用无菌玻璃棒挑取自然排出的新鲜粪便5～10g，置入无菌平皿中，迅速放入厌氧罐中，带回实验室进行分离。
菌株筛选
1、菌株的分离纯化与保存：
取厌氧冻存的样品3g加入有玻璃珠的三角瓶中，加入30mLPBS稀释液摇床振荡(250rpm)15min，然后吸取1mL便液加入一支装有9mLPBS稀释液的试管中，漩涡混匀，作为10-2稀释液，同样方法稀释至10-4。
取厌氧罐中充分预厌氧的TPY固体平板，将粪便原液、10-2稀释液、10-3稀释液、10-4稀释液各取0.1mL，均匀涂布平板，置厌氧罐中37℃厌氧培养24h。
在选择性TPY培养基上，双歧杆菌的菌落特征较为典型，易与其它菌落区分开来。双歧杆菌的菌落一般为光滑，凸圆，边缘完整，颜色呈乳褐色或乳白色，直径2-5mm，具有这些形态特征的菌落被认为是双歧杆菌可疑菌落，进一步分离纯化得到双岐杆菌纯菌株。
将双歧杆菌纯菌株扩培后用PBS溶液离心洗涤两遍后，悬于保护剂(12％脱脂乳+0.1％谷氨酸钠)中，真空冷冻干燥，-18℃保存。
2、双歧杆菌的人工胃液耐受性筛选试验结果：
将供试菌株接入pH2.0、pH2.5、pH 3.0人工胃液中，37℃厌氧培养3h对其进行活菌计数，并计算存活率。结果看出，不同菌株在不同pH的人工胃液中耐受性有显著差异(p＜0.01)。菌株对人工胃液耐受性随pH降低而降低，其中长双歧杆菌对人工胃液耐受性最强，在pH2.0人工胃液中37℃厌氧保温3h后存活率达到92.4％，而其它10株菌在此条件下的存活率均小于31.25％，说明这10株菌对模拟胃液特别敏感，没有进一步筛选的价值，所以仅选择具有良好耐酸特性的长双歧杆菌作为进一步试验的对象。
3、长双歧杆菌对pH8.0人工肠液的耐受结果：
将具有良好耐酸特性的长双歧杆菌在pH2.0的人工胃液中厌氧消化3h后，接入pH8.0的人工肠液中继续37℃厌氧保温消化，分别在不同时间取样计数 并计算其存活率，结果可以看出，长双歧杆菌在pH8.0的人工肠液中37℃厌氧保温8h后，活菌数与存活率均无明显差异(p＜0.05)，该菌株具有良好的耐受肠液特性。
分离至儿童粪便中的双歧杆菌的鉴定结果
1、形态及菌落特征
G+，菌体长而弯曲，棍棒状，膨胀或哑铃形的杆菌可分叉，菌落一般为光滑，凸圆，边缘完整，颜色呈乳褐色或乳白色，直径2-5mm。
2、生理生化学特性，见表1。
表1双歧杆菌的生理生化鉴定结果
注：+表示待测菌株阳性(+)表示待测菌株弱阳性-表示待测菌株阴性
根据上表试验结果，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》，上述得到的该菌株为长双歧杆菌。
长双歧杆菌的制备方法(以上为重量百分比)：
1、种子培养基：牛肉膏0.25％、乳糖0.8％、酪蛋白胨1％、大豆蛋白胨0.2％、酵母粉0.3％、磷酸氢二钠0.20％、磷酸二氢钾0.25％、硫酸镁0.01％、L-半胱氨酸盐酸盐0.025％、吐温-800.02％、溶解后用25％的氢氧化钠溶液调节pH7.2-7.4。(注：硫酸镁单独溶解后加入)。
2、发酵液培养基：牛肉膏0.5％、乳糖1％、酪蛋白胨1％、大豆蛋白胨0.5％、酵母粉0.5％、磷酸氢二钠0.25％、磷酸二氢钾0.25％、硫酸镁0.01％、L-半胱氨酸盐酸盐0.05％、吐温-800.025％、溶解后用25％的氢氧化钠溶液调节 pH7.2-7.4。(注：硫酸镁单独溶解后加入)。121℃15分钟灭菌。
3、发酵及真空冷冻干燥：
一级、二级、三级种子接种量为1-7％，37℃进行发酵，搅拌速度为60转/分，发酵液pH恒定在5.8，OD6002.0以上镜检长双歧杆菌形态正常，无杂菌，终止发酵。得到的发酵液进行离心，转速为10000转/分，要求上清液清澈，得到菌泥。再按照菌泥与保护剂为1∶10的比例进行混合为上机液。保护剂配方各组份重量百分比为谷氨酸钠1％、乳糖8％、海藻糖4％、脱脂奶粉10％、甘油0.1％，其余为水，115℃灭菌15分钟后冷却至10℃。
上机液真空冷冻干燥工艺为：干燥条件-60--40℃预冻1-5h后进行真空冷冻干燥，冷冻干燥温度为-60℃，真空度为1-8pa，真空冷冻干燥10-28h，再进行粉碎、混合：粉碎粒度为0.4mm，均可通过40目筛，混合均匀后包装。
嗜热链球菌(QH10-4-1)，一种传统酸奶中分离得到嗜热链球菌，该嗜热链球菌已于2010年12月14日，在国家知识产权局指定专利微生物保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.4471。
菌株的分离纯化：
1.样品的采集：2005年8月12日于内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗赛音胡都嘎苏木采集了3份酸奶样品，样品均来自3个不同家庭。采集样品时将做好的一桶酸奶，搅拌均匀，用无菌移液器吸取5mL于灭菌离心管中，并封口，每个样品取三份。将收集到的样品立即放入冰盒内，间隔一定时间更换冰袋，保持在较低的温度下将样品放入4℃冰箱保存，以进行菌株的筛选。
2.嗜热链球菌的筛选：将酸奶样品进行稀释(10-4，10-5，10-6)，在Elliker琼脂培养基上进行涂布，37℃培养24-48h。对于在Elliker琼脂培养基上生长的不同菌落进行革兰氏染色，镜检结果革兰氏阳性菌并且细胞为球形的菌落。
3.菌种分离纯化：用无菌接种针挑取单个菌落接种于Elliker液体培养基中，放入相应的恒温箱中37℃培养18h～24h。连续培养三代后，将菌液振荡混匀，离心洗涤菌体10min，弃上清液，在沉淀中加入5mL灭菌生理盐 水，振荡混匀，如此重复两次后即将菌液制成供试菌液。将供试菌液振荡混匀，涂片，固定，革兰氏染色，在显微镜下仔细观察并记录细胞形态和细菌排列方式。菌落形态一样、革兰氏阳性、球菌分离株进行保存。
4.乳酸菌分离株的保存：分离纯化得到的5株菌在Elliker液体培养基中，37℃、24h培养2代。4000rpm，离心10min(4℃)，弃上清液，菌体中加入等量的灭菌生理盐水，振荡混匀，4000rpm离心10min(4℃)离心洗涤菌体，反复3次，弃上清液，加菌体保护液(含8％乳糖、1％L-谷氨酰胺钠、10％脱脂乳、1％L-半胱氨酸)约2mL，充分混匀，分装于冻存管中，封口-40℃冷冻保存。
5.耐酸耐胆盐菌株的筛选：向Elliker培养基中加入质量分数为0.3％的胆盐，并调pH值至3.0，将活化好的菌种按5％接种量接于加胆盐的培养基中；同时，用不加胆盐、不调pH值的Elliker培养基作对照，培养24h后，涂于Elliker固体培养基上培养24h后，挑出单个菌落接于斜面上备用。
表2 耐酸耐胆盐菌株的筛选结果
注：+表示生长良好 ±表示生长情况一般 -表示未生长
将分离得到的耐酸耐胆盐的1株菌株St-3进行鉴定。得到鉴定结果如下：
1、形态及菌落特征：圆形菌体，直径0.7～0.9μm。镜检革兰氏阳性成长链状。
2、生理生化特征：
表3 生理生化鉴定结果表
嗜热链球菌菌粉的制备方法
1、种子培养基：大豆蛋白胨0.25％、牛肉蛋白胨0.15％、乳酪蛋白胨0.2％、酵母浸膏0.3％、牛肉浸膏0.35％、抗坏血酸0.4％、β-甘油磷酸钠1％、硫酸镁0.025％、pH7.2±0.2，再加2％左右琼脂，121℃15min。
2、发酵液培养基：大豆蛋白胨0.5％、牛肉蛋白胨0.25％、乳酪蛋白胨0.25％、酵母浸膏0.5％、牛肉浸膏0.5％、抗坏血酸0.5％、β-甘油磷酸钠1％、硫酸镁0.025％、pH7.2±0.2，再加2％左右琼脂，121℃15min。
3、发酵及真空冷冻干燥：
一级、二级、三级种子接种量为1-7％，37℃进行发酵，搅拌速度为60转/分，发酵液pH恒定在5.6，OD6002.0以上镜检嗜酸乳杆菌形态正常，无杂菌，终止发酵。得到的发酵液进行离心，转速为10000转/分，要求上清液清澈，得到菌泥。再按照菌泥与保护剂为1∶10的比例进行混合为上机液。保护剂配方各组份重量百分比为8％乳糖、1％L-谷氨酰胺钠、10％脱脂乳、1％L-半胱氨酸其余为水，115℃灭菌15分钟后冷却至10℃。
上机液真空冷冻干燥工艺为：干燥条件-60～-40℃预冻1-5h后进行真空冷冻干燥，冷冻干燥温度为-60℃，真空度为1-8pa，真空冷冻干燥10-28h，再进行粉碎、混合：粉碎粒度为0.4mm，即均可通过40目筛，混合均匀后包装。
嗜酸乳杆菌(NM)，从一种传统特色发酵食品-酸粥中分离得到嗜酸乳杆菌，该嗜酸乳杆菌已于2010年12月14日在国家知识产权局指定专利微生物保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.4472。
菌株的分离纯化：
样品的采集：2006年7月2日于内蒙古巴彦淖尔市乌拉特前旗三顶帐房村采集了5份酸粥样品，样品均来自采用传统工艺制作酸粥的5个不同家庭。采集样品时将做好的一盆酸粥，搅拌均匀，用无菌移液管吸取10mL酸粥酸粥于带有胶塞的灭菌试管中，及时将试管封口，每个样品取三份。将收集到的样品立即放入冰盒内，间隔一定时间更换冰袋，保持在较低的温度下将样品放入4℃冰箱保存，以进行乳酸菌的筛选。
乳酸菌的分离纯化：用无菌枪头吸取1mL酸粥上清液，接种于5mL的MRS液体培养基中，至30℃恒温培养箱中培养48h～72h后用灭菌接种环蘸取一环培养物，划线接种于MRS琼脂培养基上，放入BBL培养罐中，置15℃、30℃、45℃恒温培养箱中厌氧培养48h～72h，待菌落形成后，观察并详细记录菌落形态，用无菌接种针挑取单个菌落接种于MRS液体培养基中，放入相应的恒温箱(15℃、30℃、45℃)中培养18h～24h。连续培养三代后，将菌液振荡混匀，离心洗涤菌体10min，弃上清液，在沉淀中加入5mL灭菌生理盐水，振荡混匀，如此重复两次后即将菌液制成供试菌液。将供试菌液振荡混匀，涂片，固定，革兰氏染色，在光镜下仔细观察并记录细胞形态和细菌排列方式。在连续培养的同时将第2代的细菌培养物划线接种于MRS固体培养基中，在相应温度下厌氧培养，待菌落形成后，仔细观察菌落形态，将菌落形态一致的细菌进行过氧化氢酶试验。将形态一致、菌落形态一样、革兰氏阳性、过氧化氢酶试验阴性的杆菌分离株和球菌分离株，暂定为乳酸菌属，并进行保存。
乳酸菌分离株的保存：分离纯化得到的5株菌在MRS液体培养基中，37℃、24h培养2代。4000rpm，离心10min(4℃)，弃上清液，菌体中加入等 量的灭菌生理盐水，振荡混匀，再4000rpm离心10min(4℃)离心洗涤菌体，反复3次，弃上清液，加菌体保护液(含5％乳糖、1％L-谷氨酰胺钠、10％脱脂乳)约2mL，充分混匀，分装于冻存管中，封口-40℃冷冻保存。
耐酸耐胆盐菌株的筛选：向MRS培养基中加入质量分数为0.3％的胆盐，并调pH值至3.0，将活化好的菌种按5％接种量接于加胆盐的培养基中；同时，用不加胆盐、不调pH值的MRS培养基作对照，培养24h后，涂于MRS固体培养基上培养24h后，挑出单个菌落接于斜面上备用。
表4 耐酸耐胆盐菌株的筛选结果
注：+表示生长良好 ±表示生长情况一般 -表示未生长
乳酸菌的鉴定
将分离得到的耐酸耐胆盐的2株菌株进行鉴定。得到一株嗜酸乳杆菌，嗜酸乳杆菌鉴定结果如下：
1、形态及菌落特征：杆状，两端园，0.6-0.9×1.5-6μm，以单个链出现。不运动、无鞭毛，菌落粗糙。显微镜下显示缠绕或微毛丝状物，从好像暗影的菌堆中心放射出来。深层菌落呈放射或分枝形的不规则状。无特有色素。
2、分离纯化的乳杆菌，经生理生化学特性分析和16S rDNA序列分析的方法鉴定，其微生物学特性如下表所示：
表5 生理生化鉴定结果
嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法：
1、种子培养基：蛋白胨10g、葡萄糖6g、酵母粉10g、牛肉膏5g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.2g、氯化钠0.03g、硫酸亚铁0.015g、醋酸钠4g、柠檬酸二胺2g、磷酸二氢钾3.5g、吐温-800.1g、纯化水1000mL。1N HCl或NaOH调pH为6.5±0.05，121℃15分钟灭菌。
2、发酵液培养基：蛋白胨15g、葡萄糖6g、酵母粉8g、牛肉膏6g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、氯化钠0.04g、硫酸亚铁0.015g、醋酸钠4g、柠檬酸二胺2g、磷酸二氢钾3.5g、吐温-800.9g、纯化水1000mL。自然pH，121℃15分钟灭菌。
3、发酵及真空冷冻干燥：
一级、二级、三级种子接种量为1-7％，37℃进行发酵，搅拌速度为60转/分，发酵液Ph恒定在5.9，OD6002.0以上镜检嗜酸乳杆菌形态正常，无杂菌，终止发酵。得到的发酵液进行离心，转速为10000转/分，要求上清液清澈，得到菌泥。再按照菌泥与保护剂为1∶10的比例进行混合为上机液。保护剂配方各组份重量百分比为谷氨酸钠0.5％、乳糖5％海藻糖8％、脱脂奶粉10％、甘油0.1％，其余为水，115℃灭菌15分钟后冷却至10℃。
上机液真空冷冻干燥工艺为：干燥条件-60--40℃预冻1-5h后进行真空冷冻干燥，冷冻干燥温度为-60℃，真空度为1-8pa，真空冷冻干燥10-28h， 再进行粉碎、混合，粉碎粒度为0.4mm，即均可通过40目筛，混合均匀包装。
本发明涉及菌种的分类学特征和其他形态学特征也可参见如下文献：
长双歧杆菌，参见森永乳业株式会社2001.12.7的JP 374327/2001专利文本以及CN02822225.3公开的内容。
干酪乳杆菌，参见《中国乳品工业》2004，(11)“不同地区酸马奶中乳杆菌的分离及其生物学特性的研究”，孟和毕力格，乌日娜等；以及《中国乳品工业》，2005，(06)，乌日娜，张和平，孟和毕力格，“酸马奶中乳杆菌Lb.casei.Zhang和ZL12-1的16S rDNA基因序列及聚类分析”；以及内蒙古农业大学刘桂芳2004年硕士论文“嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌β-半乳糖苷酶和蛋白水解活性的研究”。
嗜酸乳杆菌，参见北京三元食品股份有限公司的CN200410000767.0，即“一种嗜酸乳杆菌及其应用”；以及内蒙古农业大学刘桂芳2004年的硕士论文“嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌β-半乳糖苷酶和蛋白水解活性的研究”所公开的内容。
嗜热链球菌，参见佟潇，《中国乳品工业》2004年03期，“酸奶中嗜热链球菌的分离和鉴定”；以及弥春霞等，《牡丹江师范学院学报》，2007年第3期“酸奶中嗜热链球菌的分离和鉴定”。
本发明的产品的优点
双歧杆菌和乳酸菌被认为对人体有很多有益影响，所以添加低聚半乳糖和低聚异麦芽糖等益生元物质能促进益生菌菌数在人体内的增殖。
采用粉末压片技术，将药物的粉末与适宜的辅料分别过筛并混合后，不经过制颗粒(湿颗粒或干颗粒)而直接压制成片。由于其工艺过程简单，不必制粒、干燥，节能省时，更好的保护了益生菌的活性。
在传统的湿法制粒中，要考虑颗粒干燥时间、醇制粒过筛时间等因素，生产需要的机器数量多、空间大，由于有些因素需要依赖经验判断，因此可能造成产品质量不稳定，批次间差异大等。直接压片技术最显著优势是其降低了设备和运作成本：其生产工艺简单，无需制粒、过筛、干燥、整粒等工序，减少了相应设备厂房投资以及检验成本和劳动强度，节约时间和能源， 且不因工人的经验决定产品质量，使最终产品质量稳定，批次间差异小，可操作性强，连续生产有保证，尤其适合GMP要求的生产管理。
每克四联益生菌片中含有干酪乳杆菌1.0×1010cfu/g，长双歧杆菌6.0×109cfu/g，嗜酸乳杆菌1.0×199cfu/g，嗜热链球菌1.0×108cfu/g。市场上的产品活菌数一般都在107个水平上。
矫味剂的选择：
四联益生菌片定位于大众喜爱的1：10的甜酸比，甜味剂与酸味剂以蔗糖、乳糖、葡萄糖、低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、赤藓糖醇、柠檬酸进行配伍实验。结果表明，以葡萄糖、柠檬酸作为填充剂、矫味剂，辅以苹果香精，产品酸甜适口。赤藓糖醇味甜，咀嚼时没有颗粒的感觉，溶解时呈吸热反应，咀嚼时口中有凉爽感。因此在配方中加入了一定量的赤藓糖醇。
粘合剂的选择：麦芽糊精可以作为填充剂，增加咀嚼性，但添加量过多会使片剂成形难、易发生松片。而低聚异麦芽糖和低聚半乳糖不仅对益生菌增殖有效，还能起到粘合剂的作用。同时又加上了可压性好、有助流、粘合作用的微晶纤维素，解决片剂成形与崩解的矛盾。
助流剂的选择：同时选择了硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉进行选择，结果表明硬脂酸镁不但助流效果最好，还提高了片剂的光洁度。
7.压片工艺
①配料、混合：预先将原辅料过16-40目筛，按照配料比，先将除硬脂酸镁外的其他物料在混匀机上混合10-15分钟，再加入硬脂酸镁混合3-5分钟。
②将混合好的物料进行压片即可。
片剂硬度的控制：发明人选取了片剂压力为40N，60N，80N，100N四种压力进行对比，从片剂的感官及活菌数综合比较，结果表明在80N压力条件下效果最优。故四联益生菌糖片的压力确定为80N。
片剂硬度的确定试验
1材料与方法
1.1菌种：干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、嗜热链球菌。
1.3益生菌四联菌片的制备
采用粉末直接压片法，将符合食品安全要求的辅料分别过16-40目筛，按配方添加干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、嗜热链球菌冻干菌粉和其它辅料，混匀机混合12min，上压片机压片，控制压片机压力，得到4种不同硬度的片剂。全过程均须在一定洁净条件下操作。
压片试验中益生菌添加量分别为干酪乳杆菌菌粉3％、长双歧杆菌菌粉4％，嗜酸乳杆菌菌粉2％、嗜热链球菌菌粉1％，片剂硬度为40N、60N、80N、100N。试验设定4个不同片剂硬度，代表压片机压片时4个不同的压力。
1.4检测指标
平板稀释法检测不同硬度片剂中的干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、嗜热链球菌活菌数并计算存活率，测定不同硬度片剂的长度、厚度。
1.5主要仪器设备
ZPW21A旋转式压片机，YD-1片剂硬度测试仪，混匀机，恒温培养箱，厌氧培养罐。
2结果与分析
2.1不同硬度片剂中干酪乳杆菌存活率
当四联益生菌片片剂硬度为0N、40N、60N、80N、100N时测得干酪乳杆菌活菌数分别为1.33×1010cfu/g、1.26×1010cfu/g、1.06×1010cfu/g、1.02×1010cfu/g、8.8×109cfu/g，存活率分别为95.0％、79.7％、77.7％、65.9％。
2.2不同硬度片剂中嗜热链球菌存活率
当四联益生菌片片剂硬度为0N、40N、60N、80N、100N时测得嗜热链球菌活菌数分别为1.1×108cfu/g、8.8×107cfu/g、8.1×107cfu/g、7.4×107cfu/g、2.1×107cfu/g：，存活率分别为82％、75.3％、69.6％、19.6％。
2.3不同硬度片剂中嗜酸乳杆菌存活率
当四联益生菌片片剂硬度为0N、40N、60N、80N、100N时测得嗜酸 乳杆菌活菌数分别为1.3×109cfu/g、1.0×109cfu/g、9.0×108cfu/g、6.1×108cfu/g、4.3×108cfu/g：，存活率分别为77.4％、71.8％、48.2％、34.1％。
2.4不同硬度片剂中长双歧杆菌存活率
四联益生菌片片剂硬度为0N、40N、60N、80N、100N时测得长双歧杆菌活菌数分别为6.0×109cfu/g、1.9×109cfu/g、1.6×109cfu/g、1.4×109cfu/g、9.0×108cfu/g：，存活率分别为32.3％、26.2％、23.4％、15.6％。从上述数据可知，每种菌粉的活菌数随压力的增加而逐渐降低，但从片剂的光滑度、颜色、形状等方面综合考虑，最适选择了四联益生菌片的优选硬度80N来压片。片剂硬度与片长和片厚的关系
由于片型为橄榄形，出于片剂包装的需要，对片剂的厚度和长度有一定要求。试验表明，片剂硬度和片厚、片长有一定关系。由表2的两次压片结果看出，片厚、片长均与片硬度呈负相关。而且同样的配方，片剂硬度越大，其表面越光洁。
表6 片剂硬度与厚度、长度的关系(X±SD n＝20)
具体实施方案
本发明实施例中涉及到的菌种，除上述披露的制备方法得到的菌种外，其余均可通过市售或者其他公开途径得到。
实施例1.
本发明的一种四联菌片，其中，菌粉占产品重量百分比为：
其它成份为辅料的重量份比例为(％)：
葡萄糖 25
低聚半乳糖 7
麦芽糊精 18
赤藓糖醇 3
微晶纤维素 5
羟丙基纤维素 1
柠檬酸 0.3
香精 0.1
低聚异麦芽糖 15
硬脂酸镁 0.3。
上述四联菌片的制备方法，其中：
第一步：分别将原辅料进行过筛，规格为16目；第二步：将步骤1中粉碎后的原辅料除硬脂酸镁外在混匀机上混匀10分钟，再加入硬脂酸镁混匀3分钟；第三部：将步骤2中混合物进行压片，包装。
上述四联菌片的制备方法，其中，本发明产品的片重为0.85g。
其中，本发明产品的硬度为80N。
每天服用4片。
实施例2.
本发明的一种四联菌片，其中，菌粉占产品重量百分比为：
干酪乳杆菌菌粉 3％
长双歧杆菌菌粉 5％
嗜酸乳杆菌菌粉 3％
嗜热链球菌菌粉 3％
其它成份为辅料的重量份比例为(％)：
葡萄糖 30
低聚半乳糖 15
麦芽糊精 25
赤藓糖醇 9
微晶纤维素 10
羟丙基纤维素 3
柠檬酸 0.8
香精 0.5
低聚异麦芽糖 20
硬脂酸镁 0.8。
上述四联菌片的制备方法，其中：
第一步：分别将原辅料进行过筛，规格为40目；第二步：将步骤1中粉碎后的原辅料除硬脂酸镁外在混匀机上混匀15分钟，再加入硬脂酸镁混匀5分钟；第三部：将步骤2中混合物进行压片，包装。
上述四联菌片的制备方法，其中，本发明产品的片重为0.85g。
其中，本发明产品的硬度为40N。
每天服用4片。
实施例3.
本发明的一种四联菌片，其中，菌粉占产品重量百分比为：
其它成份为辅料的重量份比例为(％)：
葡萄糖 25
低聚半乳糖 15
麦芽糊精 18
赤藓糖醇 9
微晶纤维素 5
羟丙基纤维素 3
柠檬酸 0.8
香精 0.5
低聚异麦芽糖 15
硬脂酸镁 0.8。
上述四联菌片的制备方法，其中：
第一步：分别将原辅料进行过筛，规格为40目；第二步：将步骤1中粉碎后的原辅料除硬脂酸镁外在混匀机上混匀10分钟，再加入硬脂酸镁混匀5分钟；第三部：将步骤2中混合物进行压片，包装。
上述四联菌片的制备方法，其中，本发明产品的片重为0.85g。
其中，本发明产品的硬度约为100N。
实施例4.
一种四联菌片，其中，菌粉占产品重量百分比为：
其它成份为辅料的重量份比例为(％)：
葡萄糖 28
低聚半乳糖 11
麦芽糊精 21
赤藓糖醇 6
微晶纤维素 7
羟丙基纤维素 2
柠檬酸 0.5
香精 0.3
低聚异麦芽糖 18
硬脂酸镁 0.5。
上述四联菌片的制备方法，其中：
第一步：分别将原辅料进行过筛，规格为25目；第二步：将步骤1中粉碎后的原辅料除硬脂酸镁外在混匀机上混匀12分钟，再加入硬脂酸镁混匀4分钟；第三部：将步骤2中混合物进行压片，包装。
上述四联菌片的制备方法，其中，本发明产品的片重为0.85g。
其中，本发明产品的硬度为60N。
每天服用4片。
实施例5.
一种四联菌片，其中，菌粉占产品重量百分比为：
干酪乳杆菌菌粉 3％
长双歧杆菌菌粉 2％
嗜酸乳杆菌菌粉 3％
嗜热链球菌菌粉 1％
其它成份为辅料的重量份比例为：
葡萄糖 30
低聚半乳糖 7
麦芽糊精 25
赤藓糖醇 3
微晶纤维素 10
羟丙基纤维素 1
柠檬酸 0.8
香精 0.1
低聚异麦芽糖 20
硬脂酸镁 0.3。
上述四联菌片的制备方法，其中：
第一步：分别将原辅料进行过筛，规格为40目；第二步：将步骤1中粉碎后的原辅料除硬脂酸镁外在混匀机上混匀10分钟，再加入硬脂酸镁混匀5分钟；第三部：将步骤2中混合物进行压片，包装。
上述四联菌片的制备方法，其中，本发明产品的片重为0.85g。
其中，本发明产品的硬度为100N。
实施例6.
一种四联菌片，其中，菌粉占产品重量百分比为：
干酪乳杆菌菌粉 2％
长双歧杆菌菌粉 4％
嗜酸乳杆菌菌粉 2％
嗜热链球菌菌粉 2％
其它成份为辅料的重量份比例为：
葡萄糖 26
低聚半乳糖 9
麦芽糊精 22
赤藓糖醇 5
微晶纤维素 7
羟丙基纤维素 2
柠檬酸 0.5
香精 0.4
低聚异麦芽糖 18
硬脂酸镁 0.4。
上述四联菌片的制备方法，其中：
第一步：分别将原辅料进行过筛，规格为30目；第二步：将步骤1中粉碎后的原辅料除硬脂酸镁外在混匀机上混匀11分钟，再加入硬脂酸镁混匀5分钟；第三部：将步骤2中混合物进行压片，包装。
上述四联菌片的制备方法，其中，本发明产品的片重为0.85g。
其中，本发明产品的硬度为80N。
每天服用4片。
Claims (10)
1.一种四联菌片，其特征在于：菌粉占产品重量百分比为：
干酪乳杆菌菌粉 1-3％，
长双歧杆菌菌粉 2-5％，
嗜酸乳杆菌菌粉 1-3％，
嗜热链球菌菌粉 1-3％，
其它成份为辅料。
2.如权利要求1所述的四联菌片，其特征在于：
干酪乳杆菌菌种保藏号为CGMCC No.1697，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为：2006年04月21日。
3.如权利要求1所述的四联菌片，其特征在于：
长双歧杆菌菌种保藏号为CGMCC No.4470，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为：2010年12月14日。
4.如权利要求1所述的四联菌片，其特征在于：
嗜酸乳杆菌菌种保藏号为CGMCC No.4472，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为：2010年12月14日。
5.如权利要求1所述的四联菌片，其特征在于：
嗜热链球菌菌菌种保藏号为CGMCC No.4471，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为：2010年12月14日。
6.如权利要求1所述的四联菌片，其特征在于：
所述的辅料为矫味剂、粘合剂和助流剂，其中，优选矫味剂为甜味剂和/或酸味剂。
7.如权利要求6所述的四联菌片，其特征在于：在100重量份的四联菌片中，所述辅料的重量份为：
葡萄糖 25-30，
低聚半乳糖 7-15，
麦芽糊精 18-25，
赤藓糖醇 3-9，
微晶纤维素 5-10，
羟丙基纤维素 1-3，
柠檬酸 0.3-0.8，
香精 0.1-0.5，
低聚异麦芽糖 15-20，
硬脂酸镁 0.3-0.8。
8.如权利要求1-7中任意一项所述四联菌片的制备方法，其特征在于：
第一步，分别将原辅料进行过筛，规格为16-40目；第二步，将步骤1中的原辅料除硬脂酸镁外在混匀机上混合10-15分钟，再加入硬脂酸镁混合3-5分钟；第三步，将步骤2中混合物进行压片，包装。
9.如权利要求8所述四联菌片的制备方法，其特征在于：所述的四联菌片的单位片重为0.85g。
10.如权利要求8所述四联菌片的制备方法，其特征在于：所述的四联菌片的硬度约为40-100N，优选硬度约为80N。
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