CN113812634A - 一种合生元组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种合生元组合物及其制备方法与应用，本发明的合生元组合物包括益生菌(植物乳杆菌LLY‑606)和益生元(低聚半乳糖)，本发明人经过对其研究发现，两者均具有较好的改善糖脂代谢作用，两者联合使用后，效果显著增加，具有明显的协同增效作用，具体表现在显著改善血脂四项、提高胰岛素敏感性、降低餐后血糖、减轻体重、改善认知功能、提高免疫力或调节肠道菌群等；通过益生菌与益生元之间的合理配比，有效增强功效，益生元能够有效增加组合物中的益生菌数量，延长合生元的有效期，不仅使得其功效持久，而且促进益生菌在肠道中的存活率。

Description

一种合生元组合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于微生物添加剂技术领域，具体涉及一种合生元组合物及其制备方法与应用。
背景技术
随着经济发展和生活方式的改变，肥胖已经成为一个严重的公共卫生问题。现代人摄入营养丰富的食物甚至过量摄入高脂高糖的“西方饮食”，这种高热量的膳食模式促使肥胖、胰岛素抵抗和II型糖尿病等慢性代谢紊乱高频发生，引发了一系列的健康问题。糖尿病会引起大脑的神经生理和结构变化，包括降低海马的突触可塑性、引起脑内氧化应激水平增加和线粒体功能障碍等，从而导致认知学习能力的下降以及患阿尔茨海默症的风险增加。研究发现，益生元和益生菌饮食能够预防肥胖发生，特定的益生元能够起到影响食欲的作用。合生元是为益生菌补充特定益生元，能够起单独补充益生菌或者益生元不可比拟的作用。
合生元又称为合生素或共生元，定义为“一种由活微生物和宿主微生物选择性利用的底物组成的混合物，有益宿主健康”。“宿主”微生物既包括原生微生物(寄居或定居在宿主上)，也包括外来微生物(如益生菌)，这两种微生物中的任何一种都可以作为合生菌中所含底物的靶标。
全球乳业产品研发中越来越重视益生菌和益生元的健康功能，但是目前国内外乳制品市场上主要是添加单一或多种益生菌型产品以及单一多种益生元型产品，鲜有益生菌和其特异益生元的组合产品。目前国内外一些奶粉及乳品公司研发了在孕产妇或婴幼儿奶粉中添加了鼠李糖乳杆菌LGG、动物双歧杆菌Bb-12或模拟母乳低聚糖(HMOs)的益生元和益生菌组成的合生元，以缓解孕期肠道不适，促进婴幼儿肠道屏障发育等。而且这些益生菌和/或益生元产品主要功能是促进机体建立健康微生态，提高机体免疫力，尚没有针对机体代谢健康功能的益生菌和/或益生元产品。
鉴于此，申请此专利。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种合生元组合物及其制备方法，合生元组合物可以有效的改善糖脂代谢及认知功能；在上述的合生元组合物中加入食品上可以接受的辅料与添加剂，制成固体饮料、液体饮料、半固体饮料；或者在上述的合生元组合物中加入药学上可以接受的医药用无毒载体制成散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂、冻干等制剂。
本发明的目的是提供一种合生元组合物。
本发明的另一目的是提供上述合生元组合物的制备方法。
本发明的再一目的是提供上述合生元组合物的应用。
根据本发明的具体实施方式的合生元组合物，所述合生元组合物包括益生菌与益生元，所述益生菌为植物乳杆菌LLY-606，所述益生元为低聚半乳糖。
根据本发明的具体实施方式的合生元组合物，进一步的，每天每千克的动物或人体所用的合生元中植物乳杆菌LLY-606的总菌量为1×105-1×1012CFU。
根据本发明的具体实施方式的合生元组合物，进一步的，每天每千克的动物或人体所用的合生元中低聚半乳糖的总重量为0.01-2g。
根据本发明的具体实施方式的合生元组合物，进一步的，所述植物乳杆菌LLY-606和低聚半乳糖的剂量比例为(1×105-1×1012)CFU/kg:(0.01-2)g/kg。优选的，所述植物乳杆菌LLY-606和低聚半乳糖的剂量比例为(1×108-1×1010)CFU/kg:(0.08-1.0)g/kg。
根据本发明的具体实施方式的合生元组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
S1：植物乳杆菌LLY-606在MRS培养基中培养12～16h；
S2：取步骤S1得到的植物乳杆菌LLY-606，离心取菌泥，然后将其溶于无菌厌氧PBS中，得菌泥溶液；
S3：按重量配比称取低聚半乳糖，用无菌双蒸水溶解低聚半乳糖，形成低聚半乳糖溶液；
S4：将步骤S2得到的菌泥溶液与S3得到的低聚半乳糖溶液进行混合，搅拌均匀，即得所述合生元组合物。
根据本发明的具体实施方式的合生元组合物的制备方法，进一步的，步骤中S1，培养温度为38-42℃。
根据本发明的具体实施方式的合生元组合物的制备方法，进一步的，步骤中S2，取步骤S1得到的植物乳杆菌LLY-606 40～60重量份，离心取菌泥，然后将其溶于1重量份无菌厌氧PBS中，得菌泥溶液。
根据本发明的具体实施方式的合生元组合物的制备方法，进一步的，步骤中S3，低聚半乳糖与无菌双蒸水的添加量之比为1:5；步骤中S4，将菌泥溶液与等重量的低聚半乳糖溶液进行混合。
根据本发明的具体实施方式的一种含有所述的合生元组合物的应用，所述合生元组合物在预防、辅助治疗、修复改善糖脂代谢、认知功能的食品、特殊医学用途配方食品、营养补充剂、功能食品、保健食品和药物中的应用。
根据本发明的具体实施方式的所述的合生元组合物的应用，进一步的，所述的合生元组合物中加入食品上可以接受的辅料与添加剂，制成食品；或者，在所述的合生元组合物中加入药学上可以接受的医药用无毒载体，制成药物；所述药物的剂型选自散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂的一种。
本发明的合生元组合物包括益生菌和益生元。通过全基因组分析预测益生菌的特定益生元，并对预测信息进行体外验证，确定益生元的效果，从而确定合生元的组成。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的合生元组合物包括益生菌(植物乳杆菌LLY-606)和益生元(低聚半乳糖)，本发明人经过对其研究发现，两者均具有较好的改善糖脂代谢作用，两者联合使用后，效果显著增加，具有明显的协同增效作用，具体表现在显著改善血脂四项、提高胰岛素敏感性、降低餐后血糖、减轻体重、改善认知功能、提高免疫力或调节肠道菌群；
(2)本发明的合生元组合物通过益生菌与益生元之间的合理配比，有效增强功效，益生元能够有效增加组合物中的益生菌数量，延长合生元的有效期，不仅使得其功效持久，而且促进益生菌在肠道中的存活率；
(3)推荐每天服用该合生元组合物制剂一次，按照每千克体重服用1×1010CFU植物乳杆菌LLY-606和0.5g低聚半乳糖，服用方法剂量合理，功效显著，有效避免了现有的益生菌制剂剂量不明确导致的服用后无效果或服用过多有可能带来的不良效果；本发明还具有效果显著、见效快、安全性高的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为试验1的利用全自动生长曲线测定仪分析植物乳杆菌LLY-606的生长情况；
图2为试验4的胰岛素抵抗指数；
图3为试验4的胰高血糖素样肽-1指数；
图4为试验7的肠道菌群数据α-多样性分析结果；
图5为试验7的主成分分析结果；
图6为试验7的短链脂肪酸结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
本发明中的植物乳杆菌LLY-606，于2017年04月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13984；下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、其他试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
在一些较为具体的实施方案中，所述合生元组合物包括益生菌与益生元，益生菌为植物乳杆菌LLY-606，益生元为低聚半乳糖，合生元组合物中含有剂量为1×105-1×1012CFU/g的植物乳杆菌LLY-606，且含有剂量为0.01-2g/g的低聚半乳糖。
其中，在一些更为具体的实施案例之中，所述合生元组合物的制备方法，方法包括以下步骤：
S1：植物乳杆菌LLY-606在MRS培养基中培养12～16h；
S2：取步骤S1得到的植物乳杆菌LLY-606，离心取菌泥，然后将其溶于无菌厌氧PBS中，得菌泥溶液；
S3：按重量配比称取低聚半乳糖，用无菌双蒸水溶解低聚半乳糖，形成低聚半乳糖溶液；
S4：将步骤S2得到的菌泥溶液与S3得到的低聚半乳糖溶液进行混合，搅拌均匀，即得合生元组合物。
以下通过实施例并结合附图进一步详细说明本发明的技术方案。然而，所选的实施例仅用于说明本发明，而不限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供了一种合生元组合物，包括益生菌与益生元，益生菌为植物乳杆菌LLY-606，益生元为低聚半乳糖，合生元组合物中含有剂量为1×105CFU的植物乳杆菌LLY-606，且含有剂量为0.01g的低聚半乳糖。
实施例2
本实施例提供了一种合生元组合物，包括益生菌与益生元，益生菌为植物乳杆菌LLY-606，益生元为低聚半乳糖，合生元组合物中含有剂量为1×1012CFU的植物乳杆菌LLY-606，且含有剂量为2g的低聚半乳糖。
合生元组合物的制备方法，方法包括以下步骤：
S1：植物乳杆菌LLY-606在MRS培养基中培养12h；
S2：取步骤S1得到的植物乳杆菌LLY-606，离心取菌泥，然后将其溶于无菌厌氧PBS中，得菌泥溶液；
S3：按重量配比称取低聚半乳糖，用无菌双蒸水溶解低聚半乳糖，形成低聚半乳糖溶液；
S4：将步骤S2得到的菌泥溶液与S3得到的低聚半乳糖溶液进行混合，搅拌均匀，即得合生元组合物。
实施例3
本实施例提供了一种合生元组合物，包括益生菌与益生元，益生菌为植物乳杆菌LLY-606，益生元为低聚半乳糖，合生元组合物中含有剂量为1×108CFU的植物乳杆菌LLY-606，且含有剂量为0.08g的低聚半乳糖。
合生元组合物的制备方法，方法包括以下步骤：
S1：植物乳杆菌LLY-606在MRS培养基中38-42℃培养16h；
S2：取步骤S1得到的植物乳杆菌LLY-606 40重量份，离心取菌泥，然后将其溶于1重量份无菌厌氧PBS中，得菌泥溶液；
S3：按重量配比称取低聚半乳糖，用5倍重量的无菌双蒸水溶解低聚半乳糖，形成低聚半乳糖溶液；
S4：将步骤S2得到的1重量份菌泥溶液与S3得到的1重量份低聚半乳糖溶液进行混合，搅拌均匀，即得合生元组合物。
实施例4
本实施例提供了一种合生元组合物，包括益生菌与益生元，益生菌为植物乳杆菌LLY-606，益生元为低聚半乳糖，合生元组合物中含有剂量为1×1010CFU的植物乳杆菌LLY-606，且含有剂量为1.0g的低聚半乳糖。
合生元组合物的制备方法，方法包括以下步骤：
S1：植物乳杆菌LLY-606在MRS培养基中38-42℃培养14h；
S2：取步骤S1得到的植物乳杆菌LLY-606 60重量份，离心取菌泥，然后将其溶于1重量份无菌厌氧PBS中，得菌泥溶液；
S3：按重量配比称取低聚半乳糖，用5倍重量的无菌双蒸水溶解低聚半乳糖，形成低聚半乳糖溶液；
S4：将步骤S2得到的1重量份菌泥溶液与S3得到的1重量份低聚半乳糖溶液进行混合，搅拌均匀，即得合生元组合物。
实施例5
本实施例提供了一种合生元组合物，包括益生菌与益生元，益生菌为植物乳杆菌LLY-606，益生元为低聚半乳糖，合生元组合物中含有剂量为5×108CFU的植物乳杆菌LLY-606，且含有剂量为0.75g的低聚半乳糖。
合生元组合物的制备方法，方法包括以下步骤：
S1：植物乳杆菌LLY-606在MRS培养基中38-42℃培养14h；
S2：取步骤S1得到的植物乳杆菌LLY-606 40～60重量份，离心取菌泥，然后将其溶于1重量份无菌厌氧PBS中，得菌泥溶液；
S3：按重量配比称取低聚半乳糖，用5倍重量的无菌双蒸水溶解低聚半乳糖，形成低聚半乳糖溶液；
S4：将步骤S2得到的1重量份菌泥溶液与S3得到的1重量份低聚半乳糖溶液进行混合，搅拌均匀，即得合生元组合物。
含有的合生元组合物的应用，合生元组合物在预防、辅助治疗、修复改善糖脂代谢、认知功能的食品、特殊医学用途配方食品、营养补充剂、功能食品、保健食品和药物中的应用。
在合生元组合物中加入食品上可以接受的辅料与添加剂，预防、辅助治疗、修复改善糖脂代谢、认知功能的食品。
在合生元组合物中加入药学上可以接受的医药用无毒载体，制成预防、辅助治疗、修复改善糖脂代谢、认知功能的药物；药物的剂型可以是散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂的一种。
试验1：合生元组合物的筛选
(一)试验方法
(1)通过全基因组功能分析预测LLY-606的特定益生元
依据植物乳杆菌LLY-606的全基因组信息，通过生物信息学手段对所有基因序列进行功能预测，筛选出所有碳水化合物利用相关基因，预测底物及碳水化合物转运子信息；根据底物及转运子信息及其在基因组上的定位构建相应的代谢途径，进而完碳水化合物利用的功能基因组分析，完成对菌株特定益生元的预测。
(2)对预测信息进行体外验证。以预测到的益生元为唯一碳源，以无碳源的半合成培养基为对照，利用BioScreen生产曲线测定仪测定菌株在以相应益生元为底物的生培养基中的生长曲线，进而确定益生元的效果，确定合生元的组成。
(二)试验结果
将LLY-606的基因组信息与碳水化合物活性酶数据库比对，结果如表1，发现该菌具有潜在代谢低聚半乳糖(下文简称GOS)、果糖、蔗糖、淀粉的能力。在这四种碳源中，只有GOS属于益生元。因此，通过构建GOS的代谢途径证实该菌是否能够分解GOS，并结合体外实验，利用GOS替换MRS培养基中的葡萄糖，利用全自动生长曲线测定仪分析该菌的生长情况，结果如图1所示，表明替换后显著提高了该菌的生长情况，表明GOS是LLY-606特异性利用的益生元。
表1.LLY-606基因组数据与碳水化合物活性酶数据库(CAZy)比对结果
Figure BDA0003273450360000081
Figure BDA0003273450360000091
Figure BDA0003273450360000101
试验2：合生元组合物制剂的制备
(一)材料与试剂
1、培养基：MRS培养基(蛋白胨5.0g，胰蛋白胨10.0g，乙酸钠5.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0g，硫酸锰0.25g，柠檬酸氢二铵2.0g，硫酸镁0.58g，磷酸氢二钾2.0g，牛肉膏5.0g，用蒸馏水定容至1L，调节pH至5.8，121℃条件下灭菌15min)。
2、主要试剂：植物乳杆菌LLY-606，于2017年04月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13984；GOS(CAS：No.87-999，S11137)购于上海源叶生物科技有限公司；葡聚糖硫酸钠(DSS，分子量36000-50000Da，CATNo.160110)购自美国MP Biomedicals公司。
3、主要仪器：厌氧培养箱、酶标仪、高压蒸汽灭菌锅、智能高速冷冻离心机和电热恒温水浴锅。
(二)合生元组合物的制备
将冻存于-80℃条件下的植物乳杆菌LLY-606以2％的接种量接种在MRS培养基中，37℃培养24h，连续培养两代，37℃培养12～16h备用，进行梯度平板技术，取浓度为1×109CFU/mL的菌液，离心取菌泥，然后重置于灭菌厌氧PBS中，备用；
以体重35g的小鼠为例，取制备好的活菌数为1×109CFU/mL的植物乳杆菌LLY-606菌泥1mL，加入GOS，得到植物乳杆菌LLY-606活菌数为1×109CFU、GOS(低聚半乳糖)含量为10mg的合生元组合物，用于下述动物试验研究。
试验3：降血脂动物试验
本发明结合动物试验对本发明的合生元组合物做进一步的研究，以说明本发明的有效性。
(一)灌胃试剂制备
H+M组灌胃试剂：将植物乳杆菌LLY-606冻干粉用适量的无菌水复溶至活菌数为109CFU/mL，现配现用。
H+G组灌胃试剂：将低聚半乳糖溶解于无菌水，调配至浓度为4.5g/L。
H+S组灌胃试剂：同试验2
(二)实验动物分组及饲养方式
C57BL/6系雄性7周龄小鼠45只，适应性喂养一周，随机分为5组，每组15只，对照组(Control)、高脂组(HFD)、高脂补充益生菌组(H+M)、高脂补充益生元组(H+G)高脂补充合生元组(H+S)。正常组饲喂AIN93M标准饲料，高脂组、H+M、H+G和H+S组饲喂60％高脂饲料。经两周高脂饲料诱导后检测每只小鼠的体重水平，剔除体重增长不符合标准的小鼠以确保高模型建立成功，此时记为给药第0周。
给药处理：H+M、H+G、H+S组组按0.1mL/10g给药，正常组和高脂组给予等体积无菌水，每日1次，连续灌胃八周。
(三)样品采集与分析测试：正式试验前、试验后第56天进行采血。采血方法为禁食不禁水过夜(14h)，小鼠眼球取血1.0mL，置于1.5mL离心管中静置1h，3000×g离心15min，转移血清至另一离心管中，-20℃冻存备用。采用ELISA法，按照试剂盒步骤操作建立标准曲线并测定小鼠血清中总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三脂(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(density lipid cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(highdensity lipid cholesterol，HDL-C)的含量。
(四)试验结果及分析：试验结果见表2。
表2血脂相关指标试验结果
Figure BDA0003273450360000121
由表2可知，灌胃8周后，补充合生元组和高脂组比，总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白均极显著降低(P＜0.01)，高密度脂蛋白极显著提高(P＜0.01)。另外，补充合生元组(H+S)和单独补充益生元组(H+G)、单独补充益生菌(H+M)组相比，高密度脂蛋白显著升高，总胆固醇和低密度脂蛋白显著降低，表明补充合生元组合物对高脂血症小鼠具有降血脂的作用，且效果优于单一益生菌或益生元补充。
试验4：降血糖动物试验
(一)灌胃试剂的制备、实验动物、分组情况、动物饲喂方式同试验3。
(二)样品采集与分析测试
小鼠喂养8周后，禁食不禁水过夜(14h)，小鼠尾部取血，测定空腹血糖(Fastingblood glucose，FBG)，之后小鼠体内注射一定量的胰岛素或葡萄糖，检测0、15、30、60、120min时的血糖，从而测定小鼠的葡萄糖耐受性(GTT)、胰岛素敏感性(ITT)。采用ELISA法，按照试剂盒步骤操作建立标准曲线并测定空腹胰岛素(FINS)和胰升糖素样肽(GLP-1)；计算胰岛素敏感指数(ISI)＝I/(FBG*FINS)、稳态胰岛抵抗指数(HOMA-IR)＝FBG*FINS/22.5(FBG：空腹血糖；FINS：空腹胰岛素)
(三)试验结果及分析
葡萄糖耐受性(GTT)和胰岛素敏感性(ITT)试验结果见表3：
表3 GTT和ITT曲线下面积
GTT AUC ITT AUC
CON 32274±2798 12998±1165
HFD 57774±4215 22331±1062
H+M 47732±3211 19190±1245
H+G 50294±3676 19454±2009
H+S 48140±2223 17604±856.5
由上表可知与高脂组相比，补充合生元组的小鼠其葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性显著改善。且餐后2小时血糖值显著低于高脂组。
胰岛素抵抗指数见图2，补充合生元组的胰岛素抵抗性显著低于高脂组。说明合生元组合物可以显著改善高脂小鼠的血糖水平。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是由肠道L细胞产生，具有食欲中枢神经系统的活性，向机体补充GLP-1能够减少能量的摄入，缓解肥胖的发生。胰高血糖素样肽-1指数见图3，在图3中可以看出，高脂饮食会引起体内GLP-1下降，而补充合生元组的GLP-1水平显著高于高脂组。
试验5：对肥胖小鼠体重改善试验
灌胃试剂的制备、实验动物、分组情况及动物饲喂方式同试验3，小鼠喂养8周内，每周对其体重、摄食量和能量消耗情况进行监测，计算每日的平均摄食量和能量消耗情况。试验结果如表4、5所示：
表4体重变化情况
Figure BDA0003273450360000141
表5摄食量及能量消耗情况
摄食量(g) 能量消耗(kcal)
CON 2.91±0.29 10.81±2.1
HFD 3.2±0.68 17.48±3.74
H+M 3.05±0.35 15.96±1.5
H+G 2.77±0.44 14.72±2.27
H+S 3.08±0.34 16.03±1.64
小鼠经过8周干预后，合生元干预组小鼠体重显著降低，但是摄食量和能量摄入均没有变化。利用代谢笼测定小鼠的呼吸熵与能量消耗情况，发现合生元干预组显著提高了小鼠的能量消耗情况。试验结果表明合生元组合物可以提高能量消耗，减轻体重。
试验6：对高脂小鼠认知改善试验
(一)灌胃试剂的制备、实验动物、分组情况及动物饲喂方式同试验3。
(二)试验方法
Y迷宫实验
为检测小鼠自主活动能力和学习记忆功能，受试小鼠被置于内壁黑暗，连有三叉臂通道(长20cm，宽4cm，高40cm)的Y迷宫装置中心，在视频监测装置正下方自由探索，录像装置与相关软件记录其行走路线、速度、总路程与进臂次数等数据。每只受试小鼠被置于设备中央后开始为期8min的计时活动，测试重复3次，间隔时间大于1h。
巴恩斯迷宫实验
1)实验开始前一天，将动物单个从目标洞置于目标箱里内适应4min.
2)将动物置于迷宫中央的塑料圆筒(直径20cm高27cm)内限制活动5s.
3)移开圆筒，启动软件。动物四肢均进入目标箱，则计为一次逃离，并让动物在箱里停留30s。每一只动物一次最多观察4min。在此期间如果动物仍然找不到目标箱，则将动物从迷宫移开，放入目标箱停留30s。利用这一间隙清洁迷宫。动物每天训练1次，连续4天。
4)从第二次训练开始，每次训练之前将迷宫转动一至数个洞的位置，但目标箱始终固定在同一方向。这样做的目的是防止动物依靠气味，而凭借记忆来确定目标箱的位置。记录到达目标箱的潜伏期和每只动物的错误次数等。
5)第五天撤去目标箱，让小鼠自由探索120s，记录下探究任何一个洞的次数，在目标箱附近停留时间，以及首次找到目标箱的时间。
(三)试验结果及分析
利用巴恩斯迷宫与Y迷宫评价小鼠的认知功能损伤情况，结果如表6、表7所示：
表6认知功能损伤
总进臂次数 交替成功百分比
CON 30.8±3.94 60.33±8.74
HFD 27.82±5.64 45.7±9.11
H+M 24.8±4.96 66.1±12.75
H+G 30.3±3.77 64.4±8.96
H+S 29.82±4.17 67.36±6.53
表7巴恩斯迷宫
目标箱停留时间 首次到达目标箱时间
CON 11.13±7.46 21.11±12.02
HFD 4.36±3.46 105.21±46.01
HM 17.99±7.32 32.71±26.39
HG 12.26±6.07 19.8±14.71
HS 17.93±3.73 9.64±5.39
在巴恩斯迷宫中，合生元干预组小鼠在训练第二天的潜伏期显著降低，在测试天中，合生元干预组小鼠在目标箱探究次数与目标箱停留时间显著提高，首次到达目标箱时间降低；在Y迷宫中，交替成功百分比上升。表明合生元缓解了HFD小鼠认知功能损伤。
试验7：对肠道菌群的影响
(一)灌胃试剂的制备、实验动物、分组情况、动物饲喂方式同试验3。
(二)样品采集与分析测试
给药结束(记为第8周)后收集各组小鼠的粪便样本，提取粪便中细菌基因组DNA，通过16s DNA测序分析，确定小鼠肠道菌群变化。利用高效气相色谱检测小鼠肠道菌群代谢产物SCFAs的含量。
(三)试验结果及分析
在给药结束后即第8周，将给药结束后各组小鼠的肠道菌群数据进行α-多样性分析，得到的结果见图4。高脂组的肠道菌群多样性显著降低，而H+M组、H+G组和H+S组相比于高脂组(HFD)菌群多样性有一定提升，其中补充合生元组(H+S)提升程度最为显著。主成分分析结果见图5，补充合生元组(H+S)的肠道菌群与高脂组相比显著不同。
短链脂肪酸(SCFAs)是由肠道菌群发酵抗消化的碳水化物产生的，乙酸、丙酸和丁酸盐三种主要的短链脂肪酸，占肠道中SCFAs含量的95％。多项研究表明SCFAs可以改善血糖、减轻体重，调节脂肪组织的代谢等作用。在本实验中，短链脂肪酸结果见图6，补充合生元组(H+S)的乙酸、丙酸、丁酸和异戊酸含量显著高于高脂组(HFD)；表明补充合生元可以调节肠道菌群，并可以促进短链脂肪酸的产生，从而发挥有益作用。
试验8：将此合生元组合物制备成片剂
配方：植物乳杆菌LLY-606的乳酸菌冻干粉(采用冻干机将乳酸菌配制成的菌悬液在无菌环境下冷冻成固态，抽真空将水分升华干燥而成的粉状固体状态)6.5wt％、奶粉62wt％、低聚半乳糖30wt％、硬脂酸镁1.5wt％。将其混合均匀后，压片制成片剂。
试验9：将此合生元组合物制备成功能性酸奶
生牛乳85wt％、白砂糖9wt％、乳清蛋白粉1wt％、复合稳定剂0.15wt％、无水奶油4wt％，加水搅拌充分溶解后，静止水合30分钟，定容至1L，60℃均质，95±1℃杀菌5分钟，冷却后接种发酵剂(接种量200U/t)，厌氧发酵(时间5-7h)至发酵终点。破乳冷却，添加合生元组合物，无菌灌装后冷藏保存，即为功能型酸奶。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种合生元组合物，其特征在于，所述合生元组合物包括益生菌与益生元，所述益生菌为植物乳杆菌LLY-606，所述益生元为低聚半乳糖。
2.根据权利要求1所述的合生元组合物，其特征在于，所述植物乳杆菌LLY-606和低聚半乳糖的剂量比例为(1×105-1×1012)CFU/kg:(0.01-2)g/kg。
3.根据权利要求2所述的合生元组合物，其特征在于，所述植物乳杆菌LLY-606和低聚半乳糖的剂量比例为(1×108-1×1010)CFU/kg:(0.08-1.0)g/kg。
4.制备权利要求1-3任一所述的合生元组合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1：植物乳杆菌LLY-606在MRS培养基中培养12～16h；
S2：取步骤S1得到的植物乳杆菌LLY-606，离心取菌泥，然后将其溶于无菌厌氧PBS中，得菌泥溶液；
S3：按重量配比称取低聚半乳糖，用无菌双蒸水溶解低聚半乳糖，形成低聚半乳糖溶液；
S4：将步骤S2得到的菌泥溶液与S3得到的低聚半乳糖溶液进行混合，搅拌均匀，即得所述合生元组合物。
5.根据权利要求4所述的合生元组合物的制备方法，其特征在于，步骤中S1，培养温度为38-42℃。
6.根据权利要求4所述的合生元组合物的制备方法，其特征在于，步骤中S2，取步骤S1得到的植物乳杆菌LLY-606 40～60重量份，离心取菌泥，然后将其溶于1重量份无菌厌氧PBS中，得菌泥溶液。
7.根据权利要求4所述的合生元组合物的制备方法，其特征在于，步骤中S3，低聚半乳糖与无菌双蒸水的添加量之比为1:5；步骤中S4，将菌泥溶液与等重量的低聚半乳糖溶液进行混合。
8.一种含有权利要求1-3任一项所述的合生元组合物的应用，其特征在于，所述合生元组合物在预防、辅助治疗、修复改善糖脂代谢、认知功能的食品、特殊医学用途配方食品、营养补充剂、功能食品、保健食品和药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的合生元组合物的应用，其特征在于，所述的合生元组合物中加入食品上可以接受的辅料与添加剂，制成食品；或者，在所述的合生元组合物中加入药学上可以接受的医药用无毒载体，制成药物；所述药物的剂型选自散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂的一种。
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