CN116406795A - 一种合生元组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种合生元组合物及其应用,涉及微生物添加剂技术领域,其技术要点为:一种合生元组合物,所述合生元组合物包括益生菌和益生元,所述益生菌和益生元的剂量比例为1×108‑1×109CFU/kg:0.25‑1.0g/kg。经过研究发现,益生菌和益生元均具有较好的改善肾脏代谢作用,两者联合使用后,效果显著增加,具有明显的协同增效作用,具体表现在显著减轻肾脏和血清的炎症反应,降低血清中尿酸水平,促进肠道短链脂肪酸的生成,诱导上调肠道表皮紧密连接相关基因的高表达。
Description
技术领域
本发明涉及微生物添加剂技术领域,具体涉及一种合生元组合物及其应用。
背景技术
根据调查,慢性肾病与人们的生活方式之间关系密切,作息不规律、喜欢重口味、睡眠差、乱用药品保健品、长期吸烟酗酒都会影响肾脏健康,此类人群患慢性肾病的概率远超其他人。通常改善肾脏健康可以通过吃药进行调节和维护,但是药物或多或少都存在一定的副作用。因此,寻找新型高效的治疗方案已成为目前研究的热点。
合生元又称为合生素或共生元,定义为“一种由活微生物和宿主微生物选择性利用的底物组成的混合物,有益宿主健康”。“宿主”微生物既包括原生微生物:寄居或定居在宿主上,也包括外来微生物:如益生菌,这两种微生物中的任何一种都可以作为合生菌中所含底物的靶标。
全球功能食品产品研发中越来越重视益生菌和益生元的健康功能,但是目前市场上主要是添加单一或多种益生菌型产品以及单一多种益生元型产品,鲜有益生菌和其特异益生元的组合产品。目前国内外一些奶粉及乳品公司研发了目前国内外一些奶粉及乳品公司研发了在孕产妇或婴幼儿奶粉中添加了鼠李糖乳杆菌LGG、动物双歧杆菌Bb-12或模拟母乳低聚糖HMOs的益生元和益生菌组成的合生元,以缓解孕期肠道不适,促进婴幼儿肠道屏障发育等。而且这些益生菌和/或益生元产品主要功能是促进肠道健康或者提高机体免疫力,尚没有针对机体肾脏代谢健康功能的合生元产品。
鉴于此,申请此专利。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题,提供一种合生元组合物及其应用,合生元组合物可以有效的改善肾脏炎症和代谢功能;在上述的合生元组合上可以接受加入辅料和添加剂,制成固体饮料、液体饮料、半固体饮料;或者在上述的合生元组合上加入药学上可接受的医用无毒载体,制成散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂、冻干等制剂。
本发明的目的是提供一种合生元组合物。
本发明的另一目的是提供上述合生元组合的应用。
根据本发明具体实施方式的合生元组合物,所述合生元组合物包括益生菌和益生元,所述益生菌和益生元的剂量比例为1×108-1×109CFU/kg:0.25-1.0g/kg。
根据本发明具体实施方式的合生元组合物,所述益生菌为植物乳杆菌LLY-606,每天每千克的动物或人体所用的合生元组合物中植物乳杆菌LLY-606的总菌量为1×108-1×109CFU。
根据本发明具体实施方式的合生元组合物,所述益生元为低聚半乳糖,每天每千克的动物或人体所用的合生元中低聚半乳糖的总重量为0.25-2g。
根据本发明的具体实施方式的一种含有所述的合生元组合物的应用,所述合生元组合物在制备预防、辅助治疗、修复改善肾脏炎症和肾脏代谢的食品、特殊医学用途配方食品、营养补充剂、功能食品、保健食品中的应用。
优选的,将所述合生元用作食品的辅料或添加剂。
根据本发明的具体实施方式的一种含有所述的合生元组合物的应用,所述合生元组合物在制备预防、辅助治疗、修复改善肾脏炎症和肾脏代谢的药品中的应用。
优选的,将所述合生元与医用无毒载体结合用于药物制备。
更优选的,所述药物的剂型选自散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂、冻干中的一种。
与现有技术相比,本方案的有益效果:
(1)本发明的合生元组合物包括益生菌(植物乳杆菌LLY-606)和益生元(低聚半乳糖),属于发明人新发现的合生元组合,经过对其研究发现,两者均具有较好的改善肾脏代谢作用,两者联合使用后,效果显著增加,具有明显的协同增效作用,具体表现在显著减轻肾脏和血清的炎症反应,降低血清中尿酸水平,促进肠道短链脂肪酸的生成,诱导上调肠道表皮紧密连接相关基因的高表达。
(2)本发明的合生元组合物通过益生菌与益生元之间的合理配比,有效增强功效,益生元能够有效增加组合物中的益生菌数量,延长合生元的有效期,不仅使得其功效持久,而且促进益生菌在肠道中的存活率。
(3)本发明的服用方法剂量合理,功效显著,有效避免了现有益生菌制剂的剂量不明确导致的服用后无效果或服用过多有可能带来的不良效果。本发明还具有效果显著、见效快、安全性高的优点。
附图说明
图1是本发明试验例中提供的小鼠试验的方案图解;
图2是本发明试验例中各组小鼠的血清指标比较图(注,##表示合生元组与模型组相比p<0.05;**表示模型组与正常组相比标记p<0.05);
图3是本发明试验例中各实验组小鼠的肾脏切片比较图;
图4是本发明试验例中各实验组小鼠的纤维化基因表达的比较图;
图5是本发明试验例中各实验组小鼠的肝脏指标(尿酸合成酶、炎症因子和纤维化基因的表达水平)的比较图;
图6是本发明试验例中各实验组小鼠的肾脏指标(尿酸吸收转运基因与尿酸分泌转运基因的表达水平)的比较图;
图7是本发明试验例中各实验组小鼠的肾脏尿酸代谢基因与炎症因子相关基因表达水平的比较图;
图8是本发明试验例中各实验组小鼠的肠道紧密连接基因表达与粪便中短链脂肪酸水平的比较图;
图9是本发明试验例中各实验组小鼠的肠道微生物菌群结构和丰度水平的比较图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案,下面将结合本发明的实施例及附图,对本发明的技术方案进行进一步详细地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
本发明中的植物乳杆菌LLY-606,于2017年04月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.13984;下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,下述实施例中所用的材料、其他试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
植物乳杆菌LLY-606的分离和确认过程如下:
1、以内蒙古农家酸奶发酵食品为样品,用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释,将样品稀释至10-3,将其涂布于试验例1中相同的MRS培养基表面,置于37℃培养箱中培养24-48h,观察菌落形态特征。从中挑取疑似乳酸菌的菌落划线分离至新的MRS培养基上,37℃过夜培养后,再次进行划线分离纯化。采用无菌牙签从第二划线分离的培养基上挑取20个单菌落,将20个单菌落分别挑取至不同的离心管中,每个离心管加20μL无菌水,100℃加热10min,瞬时离心,作为菌液PCR模板,采用16sDNA扩增对挑取的单菌落进行分子生物学鉴定。
2、本例16sDNA扩增的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列。
SEQ ID NO.1:5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’
SEQ ID NO.2:5’-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’
3、对菌株的16SrDNA基因序列进行扩增和测序,PCR扩增产物送上海生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
测序结果显示,20个单菌落中,编号为LLY-606的菌株,其16srDNA测序结果为SEQID NO.3所示序列。
SEQ ID NO.3:
5’-GGCGGTGGTGGTTACTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTGAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGATGGTGCATGGTGTCGTCAGCTCGGTGTCTGAGATGTGGTAGTCTGCACTAGGCCACCCTTATTATCAGTGCCAGCATGAGTGAGACACTCTAGGTGAGACTGCG-3’
用BLAST工具在NCBI数据库中进行比对,比对结果显示,LLY-606菌株与植物乳杆菌Lactobacillusplantarum亲缘关系最近,相似性达到100%,因此,鉴定LLY-606菌株为植物乳杆菌,命名为植物乳杆菌LLY-606。
在一些较为具体的实施方案中,合生元组合物包括益生菌和益生元,益生菌为植物乳杆菌LLY-606,益生元为低聚半乳糖;合生元组合物中含有剂量为1×108-1×109CFU/kg的植物乳杆菌LLY-606,且含有剂量为0.25-1.0g/kg的低聚半乳糖。
上述合生元组合物的制备方法,包括以下步骤:
S1:植物乳杆菌LLY-606在MRS培养基38-42℃培养12-16h;
S2:取步骤S1得到的植物乳杆菌LLY-60640-60份,离心取菌泥,然后将其溶于1份无菌厌氧PBS中,得菌泥溶液;
S3:称取相应重量的低聚半乳糖,用5倍重量的无菌双蒸水溶解低聚半乳糖,形成低聚半乳糖溶液;
S4:取步骤S2得到的菌泥溶液1份与S2得到的低聚半乳糖溶液1份混合,搅拌均匀,即得合生元组合物。然后加入食品上或药学上可以接受的辅料与添加剂制成可接受的剂型。
以下通过实施例并结合附图进一步详细说明本发明的技术方案。然而,所选的实施例仅用于说明本发明,而不限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供了一种合生元组合物,包括益生菌和益生元,益生菌为植物乳杆菌LLY-606,益生元为低聚半乳糖;合生元组合物中含有剂量为1×108CFU/kg的植物乳杆菌LLY-606,且含有剂量为0.25g/kg的低聚半乳糖。
实施例2
本实施例提供了一种合生元组合物,包括益生菌和益生元,益生菌为植物乳杆菌LLY-606,益生元为低聚半乳糖;合生元组合物中含有剂量为1×109CFU/kg的植物乳杆菌LLY-606,且含有剂量为1g/kg的低聚半乳糖。
实施例3
本实施例提供了一种合生元组合物,包括益生菌和益生元,益生菌为植物乳杆菌LLY-606,益生元为低聚半乳糖;合生元组合物中含有剂量为1×108CFU/kg的植物乳杆菌LLY-606,且含有剂量为0.5g/kg的低聚半乳糖。
对比例1
本对比例提供了一种合生元组合物,包括益生菌和益生元,益生菌为植物乳杆菌LLY-606,益生元为低聚果糖;合生元组合物中含有剂量为1×108CFU/kg的植物乳杆菌LLY-606,且含有剂量为0.5g/kg的低聚果糖。
对比例2
本对比例提供了一种合生元组合物,包括益生菌和益生元,益生菌为植物乳杆菌LLY-606,益生元为低聚木糖;合生元组合物中含有剂量为1×108CFU/kg的植物乳杆菌LLY-606,且含有剂量为0.5g/kg的低聚木糖。
含有合生元组合物的应用,合生元组合物在预防、辅助治疗、修复改善肾脏炎症和肾脏代谢的食品、特殊医学用途配方食品、营养补充剂、功能食品、保健食品或药品中的应用。
在合生元组合物中加入食品上可接受辅料与添加剂,制成食品。
在合生元组合物中加入药学上可接受医用无毒载体,制成药物;所述药物的剂型选自散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂、冻干中的一种。
试验1合生元组合物制剂的制备
(一)材料与试剂
1、培养基:MRS培养基(蛋白胨5.0g,胰蛋白胨10.0g,乙酸钠5.0g,酵母提取物5.0g,葡萄糖20.0g,吐温80 1.0g,硫酸锰0.25g,柠檬酸氢二铵2.0g,硫酸镁0.58g,磷酸氢二钾2.0g,牛肉膏5.0g,用蒸馏水定容至1L,调节pH至5.8,121℃条件下灭菌15min)。
2、主要试剂:植物乳杆菌LLY-606,于2017年04月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.13984;GOS(CAS:No.87-999,S11137)购于上海源叶生物科技有限公司。
3、主要仪器:厌氧培养箱、酶标仪、高压蒸汽灭菌锅、智能高速冷冻离心机和电热恒温水浴锅。
(二)合生元组合物的制备
将冻存于-80℃条件下的植物乳杆菌LLY-606以2%的接种量接种在MRS培养基中,37℃培养24h,连续培养两代,37℃培养12-16h备用,进行梯度平板技术,取浓度为1×109CFU/mL的菌液,离心取菌泥,然后重置于灭菌厌氧PBS中,备用;
以体重35g的小鼠为例,取制备好的活菌数为1×109CFU/mL的植物乳杆菌LLY-606菌泥1mL,加入GOS(低聚半乳糖),得到植物乳杆菌LLY-606活菌数为1×109CFU、GOS(低聚半乳糖)含量为10mg的合生元组合物,用于下述动物试验研究。
对比例1-2合生元组合物制剂以上述同样方式制备而成。
试验2缓解肾脏损伤动物试验
本发明结合动物试验对本发明的合生元组合物做进一步的研究,以说明本发明的有效性。
(一)小鼠模型构建
实验动物分组及喂养方式如下:
C57BL/6系雄性7周龄小鼠45只,适应性喂养两周,随机分为3组,每组15只,分别为:正常组(CON)、模型组(HUA)和合生元组(UM)。其中,合生元组先进行2周的合生元组合物补充,以稳定菌群平衡。然后同时向模型组和合生元组的小鼠灌胃300mg/kg的氧嗪酸钾,并向合生元组小鼠灌胃合生元组合物。正常组小鼠全程灌胃给予0.5%CMC-Na溶液。所有小鼠均饲喂正常饮食(AIN-93M,购自江苏协通医药生物工程有限公司中国南京),小鼠试验的方案图解如图1所示。
氧嗪酸钾分散在生理盐水和0.5%CMC混合溶液中,合生元组合物分散在生理盐水中。每只小鼠的体重每周记录一次。在治疗结束时,我们收集每只小鼠的粪便。最后一次给药后1小时对小鼠实施安乐死。
以相同方式设置合生元2组(UM2)和合生元3组(UM3),UM2和UM3分别使用对比例1和对比例2所制得合生元组合物。
(二)合生元对血清指标的影响
小鼠安乐死后,收集血液,在20℃和3500rpm下离心15分钟获得血清。用检测试剂盒检测血清中的UA、CRE、BUN、黄嘌呤氧化酶、AST、ALT和肝脏XOD活性的水平。
图2和图5显示28天后,模型组小鼠血清中的UA、CRE、BUN、黄嘌呤氧化酶、AST和ALT的水平显著高于正常组,而合生元组小鼠血清中的UA、CRE、BUN、黄嘌呤氧化酶、AST和ALT的水平均显著低于模型组,表明合生元的干预可降低高尿酸血症小鼠血清中的黄嘌呤氧化酶活性,降低炎症因子的水平和尿酸的浓度,帮助缓解高尿酸症状,并且使用植物乳杆菌LLY-606+低聚半乳糖所得合生元组合物的效果明显优于植物乳杆菌LLY-606+低聚果糖和植物乳杆菌LLY-606+低聚木糖。
(三)合生元对小鼠肾脏形态的影响
利用H&E染色,PAS染色观察小鼠肾脏结构,利用马森染色观察小鼠肾脏纤维化情况。高尿酸的积累会损害肾脏,并影响其功能。
图3显示,合生元组小鼠肾脏切片的形态与正常组小鼠接近,而模型组小鼠的肾脏呈现明显的纤维化。图4显示,纤维化相关的基因SPP1、Col1a1和Timp1在合生元组小鼠肾脏中的表达水平略高于正常组,显著低于模型组。以上结果表明,合生元的干预可抑制肾脏中由高尿酸诱导的纤维化基因的表达,从而减轻肾脏的损伤。
(四)合生元对小鼠肾脏尿酸代谢基因与炎症因子水平的调节作用
采用RT-PCR检测小鼠肾脏尿酸代谢基因(GLUT9,URAT1,ABCG2等)与炎症相关基因(TNf-a,COX-2,IL-1B等)表达。肾脏是尿酸的主要代谢器官,肾脏吸收和分泌转运尿酸的功能下降都会导致尿酸在血液中的积累。同时肾脏中积累的高尿酸会导致肾脏的炎症反应。
图6的实验数据表明,合生元组和模型组小鼠肾脏中与尿酸吸收转运相关的基因GLUT9,URAT1和OAT3的表达均高于正常组,但这3个基因在合生元组中的表达均显著低于模型组;与尿酸分泌转运相关的基因OAT1、OCT1、ABCG2和OCTN2在模型组小鼠肾脏中的表达均显著低于正常组和合生元组。这表明经血清中的高尿酸诱导了肾脏对尿酸吸收的同时,又损害了肾脏排出尿酸的能力,而合生元的干预使得肾脏恢复了吸收和排出尿酸的平衡能力。
图7的实验数据表明,尿酸在模型组小鼠肾脏中的积累导致了炎症相关因子,如PNP、TNF-α、IL-1β、COX-2等的表达水平显著升高,而合生元组小鼠肾脏中的炎症因子的表达水平与正常组比较接近。以上结果表明,合生元可以通过维持肾脏的正常代谢尿酸功能来降低尿酸在肾脏中的积累,从而减轻高尿酸血症对肾脏的促炎症反应。
(五)合生元对肠道菌群平衡的调控作用和合生元对小鼠肠道紧密连接性与代谢物SCFAs的作用
利用16SrDNAsequencing高通量技术研究肠道微生物的构成及功能预测;采用RT-PCR检测小鼠肠道紧密连接基因表达,利用GC检测粪便中SCFAs水平。高尿酸血症往往伴随全身慢性低度性炎症,研究表明,这可能与肠道菌群失衡引起肠道内环境改变,肠道通透性增加继而导致血液循环中内毒素水平升高相关。
图8的实验数据表明,合生元组的小鼠粪便中短链脂肪酸的含量显著高于模型组,与正常组小鼠粪便的短链脂肪酸水平接近;并且,在合生元组中,小鼠肠道紧密连接相关基因如Ocdudin、claudin-1和ZO-1的表达水平显著高于模型组,与正常组相当。
图9的实验数据表明,在合生元组的小鼠肠道微生物菌群中,有益菌如乳杆菌和AKK菌的丰度均显著高于正常组和模型组,而梭菌的丰度则显著少于模型组,表明合生元具有调节肠道菌群的功能。以上结果表明,合生元能够通过调节肠道菌群,增加短链脂肪酸的生长,从而维持肠道表皮屏障的稳定,减少全身性的炎症反应。
试验3将合生元组合物制备成片剂
配方:植物乳杆菌LLY-606的乳酸菌冻干粉(采用冻干机将乳酸菌配制成的菌悬液在无菌环境下冷冻成固态,抽真空将水分升华干燥而成的粉状固体状态)6.5wt%、奶粉62wt%、低聚半乳糖30wt%、硬脂酸镁1.5wt%。将其混合均匀后,压片制成片剂。
试验4:将合生元组合物制备成功能性酸奶
生牛乳85wt%、白砂糖9wt%、乳清蛋白粉1wt%、复合稳定剂0.15wt%、无水奶油4wt%,加水搅拌充分溶解后,静止水合30分钟,定容至1L,60℃均质,95±1℃杀菌5分钟,冷却后接种发酵剂(接种量200U/t),厌氧发酵(时间5-7h)至发酵终点。破乳冷却,添加合生元组合物,无菌灌装后冷藏保存,即为功能型酸奶。
以上具体实施例仅仅是对本发明的解释,其并不是对本发明的限制,本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改,但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (8)
1.一种合生元组合物,其特征在于,所述合生元组合物包括益生菌和益生元,所述益生菌和益生元的剂量比例为1×108-1×109CFU/kg:0.25-1.0g/kg。
2.如权利要求1所述的一种合生元组合物,其特征在于,所述益生菌为植物乳杆菌LLY-606。
3.如权利要求1所述的一种合生元组合物,其特征在于,所述益生元为低聚半乳糖。
4.如权利要求1-3任一项所述的一种合生元组合物的应用,其特征在于,所述合生元组合物在制备预防、辅助治疗、修复改善肾脏炎症和肾脏代谢的食品、特殊医学用途配方食品、营养补充剂、功能食品、保健食品中的应用。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,将所述合生元用作食品的辅料或添加剂。
6.如权利要求1-3任一项所述的一种合生元组合物的应用,其特征在于,所述合生元组合物在制备预防、辅助治疗、修复改善肾脏炎症和肾脏代谢的药品中的应用。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,将所述合生元与医用无毒载体结合用于药物制备。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,所述药物的剂型选自散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂、冻干中的一种。
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