CN115287240A

CN115287240A - 一株具有高尿酸血症及痛风防治作用的植物乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN115287240A
Application number: CN202211115589.0A
Authority: CN
Inventors: 罗学刚; 操俊; 王佳丽; 王雪芳; 李中媛; 宋亚囝; 周飒
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2022-09-14
Filing date: 2022-09-14
Publication date: 2022-11-04

Abstract

本发明属于微生物领域，涉及一株具有高尿酸血症及痛风防治作用的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，所述植物乳杆菌的名称为：LTJ48，分类名称为：植物乳杆菌，保藏编号为：CGMCCNo.25124，保藏日期：2022年6月20日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。细胞实验分析显示培养基经植物乳杆菌孵育12小时后可显著降低高尿酸模型HepG2细胞的尿酸水平。动物实验结果显示，长期灌胃高尿酸模型小鼠植物乳杆菌LTJ48可显著其血清尿酸水平，具有明显的降尿酸效果，并对高尿酸模型下小鼠具有护肾作用。

Description

一株具有高尿酸血症及痛风防治作用的植物乳杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其是一株具有高尿酸血症及痛风防治作用的植物乳杆菌及其应用。

背景技术

高尿酸血症是人体由嘌呤代谢紊乱、尿酸排泄障碍导致的代谢疾病，可引发多种并发症例如高血糖、高血脂、高血压。随着生活水平的提高，高尿酸也继三高后成为第四高，威胁社会大众健康。高尿酸血症病程长，病情易反复，中老年人为高发人群，但近来高尿酸血症发病趋势愈发年轻化，且无症状患者越来越多。

XOD(黄嘌呤氧化酶)为体内尿酸生成关键酶，其抑制剂可作为降尿酸药物例如别嘌呤醇、非布司他，通过抑制肝脏中黄嘌呤氧化酶从而减少尿酸生成。促尿酸排泄药物例如苯溴马隆、雷西纳德，作为第二类降尿酸药物通过增加尿酸排泄减少体内尿酸。但现有药物存在严重的副作用，包括肝肾毒性和心脏相关疾病风险，除此之外，成本和药物适用也成为高尿酸患者所需考虑的因素。

肠道作为人体内最大的免疫器官，同样是尿酸排泄的第二场所。各式各样的微生物种群定植于肠道，在参与宿主新陈代谢的同时也发挥着调节血清尿酸浓度和体内尿酸分布的重要作用。有研究表明，粪便菌群移植可通过回复受损肠道屏障功能，有效降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平，益生菌在改善肠道菌群的同时可抑制肠道对外源性嘌呤的吸收来降低尿酸浓度。

植物乳杆菌作为乳酸菌的一种，普遍存在于生活中各种发酵食品中，在预防和治疗代谢调控疾病中发挥着重要作用，如改善肠道功能、降血脂、降血糖、促进免疫调节等。具有降尿酸功能植物乳杆菌菌株的筛选及其降尿酸的研究仍较少，因此筛选能够降尿酸的植物乳杆菌，对高尿酸血症治疗和针对高尿酸血症药物研究具有重要意义。

通过检索，发现如下一篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

一株可缓解高尿酸血症的植物乳杆菌及其用途(CN112795500B)，该植物乳杆菌为植物乳杆菌grx03，从广西巴马长寿村人群肠道中分离所得，本发明菌株发酵传统药食同源中草药菊苣表现出良好的降尿酸能力，可以与其他益生乳酸菌复配开发降尿酸发酵乳产品或乳酸菌饮料。

上述专利公开文献表现出的植物乳杆菌降尿酸能力体现在菌株体外对核苷的降解能力以及体外对黄嘌呤氧化酶的抑制作用，与发酵菊苣协同体现出的降尿酸能力。本发明就植物乳杆菌自身的降尿酸能力在细胞水平以及动物水平对进行了更进一步的检测，体内降尿酸能力的测定与体外相比更加准确也更具说服力，此外，上述专利公开文献仅着重于植物乳杆菌作为益生菌在高尿酸血症方面的治疗与缓解作用。

因此，通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一株具有高尿酸血症及痛风防治作用的植物乳杆菌及其应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一株具有高尿酸血症及痛风防治作用的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，所述植物乳杆菌的名称为：LTJ48，分类名称为：植物乳杆菌，保藏编号为：CGMCCNo.25124，保藏日期：2022年6月20日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

进一步地，所述植物乳杆菌的代谢物在细胞层面可显著降低尿酸水平的特性。

进一步地，所述植物乳杆菌具有能在高尿酸模型动物体内降低血清尿酸、缓解高尿酸血症的能力。

进一步地，所述菌株分离自天津市芦台镇酒醅，是酒醅中的优势菌株。

进一步地，所述菌株的菌落及菌体特征为：在MRS培养基上培养24h，菌落呈白色，不透明，菌落突起，湿润，边缘平整，有光泽，菌落直径为0.8～1.0mm，光学显微镜下观察其细胞形态，革兰氏染色呈G⁺，菌体呈小短杆状。

进一步地，所述菌株代谢物在细胞层面能够以降低高尿酸模型下HepG2细胞尿酸。

进一步地，所述菌株能够降低高尿酸模型小鼠血清尿酸水平。

进一步地，所述菌株能够有效缓解高尿酸模型小鼠肾损伤，具有一定保护肾脏的作用。

如上所述的植物乳杆菌在降低血清尿酸方面中的应用。

如上所述的植物乳杆菌在制备缓解高尿酸血症的食品方面中的应用。

如上所述的植物乳杆菌在制备缓解高尿酸血症的保健方面中的应用。

如上所述的植物乳杆菌在制备缓解高尿酸血症的药品方面中的应用。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明植物乳杆菌LTJ48，植物乳杆菌，细胞实验分析显示培养基经植物乳杆菌孵育12小时后可显著降低高尿酸模型HepG2细胞的尿酸水平。动物实验结果显示，长期灌胃高尿酸模型小鼠植物乳杆菌LTJ48可显著其血清尿酸水平，具有明显的降尿酸效果，并对高尿酸模型下小鼠具有护肾作用。因此其可作为缓解高尿酸血症和治疗痛风的新型措施，在高尿酸血症辅助治疗方面具有广阔的应用前景。

2、本发明的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)来源于天津市芦台镇酒醅，属于公认安全的可食用菌种。

3、本发明植物乳杆菌LTJ48能够在细胞层面降低高尿酸模型下HepG2细胞尿酸水平，也能够降低高尿酸模型小鼠血清尿酸水平，是一株具有降尿酸作用、缓解高尿酸血症的植物乳杆菌，能够应用在缓解高尿酸血症药物中。

4、本发明植物乳杆菌LTJ48能够缓解高尿酸模型小鼠肾损伤，具有保护肾脏的作用。

附图说明

图1为本发明植物乳杆菌CGMCCNo.25124的菌落形态和细胞形态图；

图2为本发明中植物乳杆菌CGMCCNo.25124的16SrDNA系统发育树图；

图3为本发明中植物乳杆菌的细胞层面降尿酸图；其中，M为高尿酸模型组，48为高尿酸模型给植物乳杆菌LTJ48治疗组；

图4为本发明中植物乳杆菌在高尿酸动物模型中降低血清尿酸图的细胞层面降尿酸图；

图5为本发明中植物乳杆菌在高尿酸动物模型中缓解肾损伤图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。

较优地，所述植物乳杆菌的代谢物在细胞层面可显著降低尿酸水平的特性。

较优地，所述植物乳杆菌具有能在高尿酸模型动物体内降低血清尿酸、缓解高尿酸血症的能力。

较优地，所述菌株分离自天津市芦台镇酒醅，是酒醅中的优势菌株。

较优地，所述菌株的菌落及菌体特征为：在MRS培养基上培养24h，菌落呈白色，不透明，菌落突起，湿润，边缘平整，有光泽，菌落直径为0.8～1.0mm，光学显微镜下观察其细胞形态，革兰氏染色呈G⁺，菌体呈小短杆状。

较优地，所述菌株代谢物在细胞层面能够以降低高尿酸模型下HepG2细胞尿酸。

较优地，所述菌株能够降低高尿酸模型小鼠血清尿酸水平。

较优地，所述菌株能够有效缓解高尿酸模型小鼠肾损伤，具有一定保护肾脏的作用。

较优地，所述菌株经细胞实验分析显示培养基经植物乳杆菌孵育12小时后可显著降低高尿酸模型HepG2细胞的尿酸水平。动物实验结果显示，长期灌胃高尿酸模型小鼠植物乳杆菌LTJ48可显著其血清尿酸水平，具有明显的降尿酸效果，且对高尿酸血症模型小鼠具有良好的护肾作用。

如上所述的植物乳杆菌在降低血清尿酸方面中的应用。

具体地，以下实施例分别从细胞水平菌株降尿酸能力测定以及通过高尿酸模型小鼠体内降尿酸能力测定来说明本发明的技术方案，具体内容如下：

实施例1植物乳杆菌LTJ48的分离鉴定

以下实验均在无菌条件下操作。

1.菌株的富集

称取天津市芦台镇酿酒过程中的酒醅25g，加入225mL无菌生理盐水混匀，将得到的菌液稀释10³～10⁵倍后取100μL涂布于MRS平板上，于37℃条件下倒置培养24h，观察菌落生长状况。

所述的MRS固体培养基的制备方法为：蛋白胨10g，牛肉浸粉5g，吐温801mL，磷酸氢二钾2g，酵母浸粉4g，硫酸镁0.2g，柠檬酸三铵2g，葡萄糖20g，硫酸锰0.05g，乙酸钠5g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH6.2±0.2，121℃灭菌20min备用。

2.菌株的分离

挑取步骤1中得到的菌落，用革兰氏染色法进行镜检，观察菌体形态特征，选取革兰氏阳性菌作为目的菌株。

3.菌株的纯化

挑取步骤2中所得的菌落在MRS平板上进行划线，反复纯化直至无其他杂菌，记录不同菌落的状态。

4.菌株的鉴定

采用细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取乳酸菌菌株基因组，并以此为模板进行PCR扩增。将扩增成功的PCR产物测序后拼接得到DNA序列，使用NCBI的BLAST检索系统对序列同源性进行比对分析。选择与其相似性最高的已知菌株，对其相似性进行分析。使用MEGA5软件中的邻接法(Neighbor-Joining，NJ)建立系统发育树。

对步骤3中获得的纯菌进行生理生化实验研究，发现该菌株具有很强的酒精耐受能力，该菌株在MRS培养基上培养24h，菌落呈白色，不透明，菌落突起，湿润，边缘平整，有光泽，菌落直径为0.8～1.0mm，光学显微镜下观察其细胞形态，革兰氏染色呈G⁺，菌体呈小短杆状(如图1所示)。

用BLAST软件经同源性比较，结果见图2，结合菌落形态特征、细胞形态特征和16SrDNA基因序列结果，确定为乳杆菌属中的一株新的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，该菌株已于2022年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.25124，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例2植物乳杆菌LTJ48代谢物细胞水平降尿酸能力测定

将对数生长期的该菌株离心清洗，用细胞培养基DMEM重悬后孵育12h。离心并将上清过滤膜得到无菌培养基，将过膜的培养基以15％体积分数处理HepG2细胞24h后构建细胞高尿酸模型，通过加入0.25mmol/L腺苷培养24小时构建高尿酸细胞模型。模型组为不予上清处理，仅加入0.25mmol/L腺苷培养24小时.检测给予上清组与模型组的尿酸生成量并进行对比。

通过尿酸试剂盒检测结果显示，给予菌代谢上清尿酸水平较模型组显著降低(如图3所示)。

实施例3植物乳杆菌LTJ48干预对高尿酸血症小鼠血尿酸水平的影响

高尿酸血症小鼠模型采用给小鼠腹腔注射氧嗪酸钾并辅以高嘌呤饮食建立，实验动物采用雄性昆明小鼠40只，在室温下饲养，自由饮食采食，经1周适应性饲养后，随机分成正常对照组(NC)、高尿酸血症模型组(M)、别嘌呤醇(AP)、植物乳杆菌LTJ48治疗组(J48)，每组10只。除正常对照组外，其他三组小鼠按300mg/kg·d标准腹腔注射氧嗪酸钾-羧甲基纤维素钠混悬液，溶剂为质量分数0.5％的羧甲基纤维素钠，并按照10g/kg·d标准进行酵母膏灌胃，此外J48组小鼠按照0.2mL/d标准灌胃菌液，培养基通过离心获得菌体，再通过PBS重悬获得菌液，菌液活菌数为10⁸CFU/mL，AP组小鼠按照30mg/kg·d标准灌胃，持续28d。

实验数据表明，连续腹腔注射氧嗪酸钾并佐以高嘌呤饮食28d后，M组、植物乳杆菌组和AP组小鼠血尿酸含量较正常组小鼠均显著升高，而通过植物乳杆菌LTJ48干预小鼠的血清尿酸水平与M组小鼠相比显著降低并接近AP组小鼠血尿酸水平，说明植物乳杆菌LTJ48具有降低小鼠血尿酸作用(如图4所示)。

实施例4植物乳杆菌LTJ48干预对高尿酸血症小鼠肾的影响

高尿酸血症小鼠模型采用给小鼠腹腔注射氧嗪酸钾并辅以高嘌呤饮食建立，实验动物采用雄性昆明小鼠40只，在室温下饲养，自由饮食采食，经1周适应性饲养后，随机分成正常对照组(NC)、高尿酸血症模型组(M)、别嘌呤醇(AP)、植物乳杆菌LTJ48治疗组(J48)，每组10只。除正常对照组外，其他三组小鼠按300mg/kg·d标准腹腔注射氧嗪酸钾-羧甲基纤维素钠混悬液，溶剂为质量分数0.5％有羧甲基纤维素钠，并按照10g/kg·d标准进行酵母膏灌胃，此外J48组小鼠按照0.2mL/d标准灌胃菌液，培养基通过离心获得菌体，再通过PBS重悬获得菌液，菌液活菌数为10⁸CFU/mL，AP组小鼠按照30mg/kg·d标准灌胃，持续28d。

实验数据表明，连续腹腔注射氧嗪酸钾并佐以高嘌呤饮食28d后，M组、植物乳杆菌组和AP组小鼠血清肌酐、尿素氮含量较正常组小鼠均显著升高，而通过植物乳杆菌LTJ48干预小鼠的血清肌酐与M组和AP组小鼠相比显著降低，说明植物乳杆菌LTJ48具有能在高尿酸的前提下保护肾脏的作用(图5所示)。

与已有公开文献相比，本发明通过细胞层面与动物水平更进一步的检测了植物乳杆菌LTJ48的降尿酸能力，并发现其对高尿酸模型下肾脏的保护作用。

现有乳酸菌就高尿酸模型的降尿酸能力研究方式种类繁多，其造模方式各不相同，所以难以进行横向对比乳酸菌降尿酸能力。此处列举几个较为相似的研究作为对比，在江南大学倪彩新的研究中，对鼠李糖乳杆菌CCFM1130、鼠李糖乳杆菌CCFM1131、罗伊氏乳杆菌CCFM1132进行动物实验检测其降尿酸能力，其高尿酸造模方式为灌胃次黄嘌呤与氧嗪酸钾联用，造模28天，每日以5*10⁹CFU/mL灌胃。就降尿酸结果而言鼠李糖乳杆菌CCFM1130、鼠李糖乳杆菌CCFM1131、罗伊氏乳杆菌CCFM1132三株菌较模型组分别降低了22.77％、22.21％、23.03％。南京师范大学徐珏采用高嘌呤饲料和氧嗪酸钾联用造模，对短乳杆菌PDD-5检测降尿酸能力，其高剂量组以每日10¹⁰CFU/kg灌胃，造模14天后尿酸较模型组降低35.5％(出自有文章中的数据图，并非数字计算得来)。本发明动物模型造模采用高嘌呤食品酵母膏造模，造模28天，每日灌胃剂量为10⁸CFU/kg。最终灌胃LTJ48组血尿酸较模型组降低56.48％。虽然建模方式不尽相同，但就与同造模方式的模型组相比植物乳杆菌LTJ48的降尿酸效果更好。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims

1.一株具有高尿酸血症及痛风防治作用的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，其特征在于：所述植物乳杆菌的名称为：LTJ48，分类名称为：植物乳杆菌，保藏编号为：CGMCC No.25124，保藏日期：2022年6月20日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌，其特征在于：所述植物乳杆菌的代谢物在细胞层面可显著降低尿酸水平的特性。

3.根据权利要求1所述的植物乳杆菌，其特征在于：所述植物乳杆菌具有能在高尿酸模型动物体内降低血清尿酸、缓解高尿酸血症的能力。

4.根据权利要求1所述的植物乳杆菌，其特征在于：所述植物乳杆菌在体外能够高效转化肌苷、鸟苷和鸟嘌呤。

5.如权利要求1至4任一项所述的植物乳杆菌在降低血清尿酸方面中的应用。

6.如权利要求1至4任一项所述的植物乳杆菌在制备缓解高尿酸血症的食品方面中的应用。

7.如权利要求1至4任一项所述的植物乳杆菌在制备缓解高尿酸血症的保健方面中的应用。

8.如权利要求1至4任一项所述的植物乳杆菌在制备缓解高尿酸血症的药品方面中的应用。