CN114196581B - 缓解高尿酸血症的罗伊氏乳杆菌ccfm1132及应用 - Google Patents

缓解高尿酸血症的罗伊氏乳杆菌ccfm1132及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了缓解高尿酸血症的罗伊氏乳杆菌CCFM1132及应用，属于微生物技术领域。所述罗伊氏乳杆菌CCFM1132能够降低高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平、抑制血清及肝脏的黄嘌呤氧化酶(XOD)活性，减少高尿酸血症和痛风的发生；并能够下调血清肌酐水平、下调血清总甘油三酯(TG)及抑制血清碱性磷酸酶(ALP)活性；以及促进回肠尿酸转运蛋白ABCG2的表达。本发明的罗伊氏乳杆菌CCFM1132可用于制备缓解高尿酸血症及痛风的功能性菌剂和药物，具有广泛的应用前景。

Description

缓解高尿酸血症的罗伊氏乳杆菌CCFM1132及应用
技术领域
本发明涉及缓解高尿酸血症的罗伊氏乳杆菌CCFM1132及应用，属于微生物技术领域。
背景技术
高尿酸血症(Hyperuricemia，HUA)是指血液内尿酸水平超过正常值的一种疾病。近年来，随着生活水平的提高，高尿酸血症的发病率也越来越高，我国高尿酸血症患者占总人口约13.3％。长期的高尿酸血症造成的尿酸盐结石会进一步诱发痛风。同时，高尿酸血症被认为是心脑血管疾病、慢性肾病、动脉粥样硬化的危险因素，严重危害人类健康，因此高尿酸血症的治疗引起了人们的高度重视。目前治疗高尿酸血症的药物主要有别嘌呤醇(黄嘌呤氧化酶抑制剂)、苯溴马隆(促尿酸排泄药物)等，但是这些药物存在一些副作用，国际上针对无症状高尿酸血症的降尿酸药物治疗存在诸多争议。因此，在饮食及生活方式上进行改善是无症状高尿酸血症治疗的优选方法。某些乳杆菌，如格氏乳杆菌PA-3、短乳杆菌DM9218等的降尿酸功能已通过临床试验和/或动物实验证实。
近年来，随着对肠道菌群与人体健康关系的深入研究，大量研究证实了益生菌通过调节肠道菌群对人体健康的改善功能。高尿酸血症的发病与肠道菌群结构紊乱密切相关，而食入益生菌可通过增殖肠道中的乳杆菌和双歧杆菌调节肠道微生物群，改善肠道屏障功能，减少内毒素等代谢物随血液进入肝脏，有效降低血尿酸值。尿酸在人体内的排泄主要通过肾脏及肠道的排泄作用，ABCG2作为尿酸转运蛋白在尿酸的肠排泄中发挥着重要作用，肠道ABCG2的表达被认为是治疗高尿酸血症及痛风的新靶点，但目前针对肠道ABCG2的药物尚未有发现。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1132，已于2020年7月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61093。
罗伊氏乳杆菌CCFM1132具有以下生物学特性：
(1)菌体特征：呈革兰氏染色阳性，不形成孢子，非运动性的细菌。
(2)菌落特征：呈圆形凸起、光滑、边缘整齐。
(3)生长特性：在37℃恒温条件下，在MRS培养基培养约12h到达对数末期。
(4)对模拟胃肠液具有较强耐受能力。
本发明的第二个目的是提供所述罗伊氏乳杆菌CCFM1132在制备功能性菌剂或药物中的应用。
在一种实施方式中，所述药物具有如下至少一种作用：
(1)降低高尿酸血症哺乳动物血清尿酸水平；
(2)降低高尿酸血症哺乳动物血清及肝脏黄嘌呤氧化酶(XOD)活性；
(3)降低哺乳动物的血清肌酐水平；
(4)降低哺乳动物的血清总甘油三酯水平；
(5)降低哺乳动物的血清碱性磷酸酶的活性；
(6)提高哺乳动物回肠尿酸转运蛋白ABCG2的mRNA水平。
在一种实施方式中，所述药物是缓解高尿酸血症和痛风的药物。
在一种实施方式中，所述哺乳动物包括但不限于人类。
本发明的第三个目的是提供含有所述罗伊氏乳杆菌CCFM1132的组合物。
在一种实施方式中，所述罗伊氏乳杆菌CCFM1132的数量≥1×106CFU/mL或≥1×106CFU/g。
在一种实施方式中，所述罗伊氏乳杆菌CCFM1132的数量≥1×109CFU/mL或≥1×109CFU/g。
在一种实施方式中，所述组合物包括但不限于微生物制剂或药物。
在一种实施方式中，所述组合物中含有所述罗伊氏乳杆菌CCFM1132的活菌株、干菌株、菌株代谢物或灭活的菌株。
在一种实施方式中，所述组合物为药物组合物。
在一种实施方式中，所述药物组合物用于抑制黄嘌呤氧化酶活性。
在一种实施方式中，所述药物组合物用于抑制血清肌酐升高。
在一种实施方式中，所述药物组合物用于抑制血清总甘油三酯和/或血清碱性磷酸酶活性升高。
在一种实施方式中，所述药物组合物用于促进回肠尿酸转运蛋白ABCG2表达。
在一种实施方式中，所述药物还含有药学上可接受的载体。
在一种实施方式中，所述药学上可接受的载体包括但不限于：填充剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂或润滑剂中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述填充剂为微晶纤维素、乳糖、甘露醇、淀粉或糊精中的一种或多种；所述润湿剂为乙醇或甘油中的一种或多种；所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、交联羧甲基淀粉钠、交联聚维酮或低取代羟丙基纤维素中的一种或多种；所述粘合剂为淀粉糊、糖浆、饴糖、炼蜜或液状葡萄糖中的一种或多种；所述润滑剂为硬脂酸镁、硬脂酸富马酸钠、滑石粉或二氧化硅中的一种或多种。
本发明的有益效果：所述罗伊氏乳杆菌CCFM1132能够降低血清尿酸水平，降低血清及肝脏的黄嘌呤氧化酶(XOD)活性，减少高尿酸血症及痛风的发生；所述罗伊氏乳杆菌CCFM1132能够下调血清肌酐、下调血清总甘油三酯(TG)水平及抑制血清碱性磷酸酶(ALP)活性；所述罗伊氏乳杆菌CCFM1132能够促进回肠尿酸转运蛋白ABCG2的表达。所述罗伊氏乳杆菌CCFM1132可用于制备缓解高尿酸血症及痛风的功能性菌剂和药物，具有广泛的应用前景。
生物材料保藏
罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)CCFM1132，分类命名为Lactobacillusreuteri，已于2020年7月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61093。
附图说明
图1是罗伊氏乳杆菌CCFM1132的菌落形态；
图2是罗伊氏乳杆菌CCFM1132对高尿酸血症小鼠血清尿酸(UA)的影响；
图3是罗伊氏乳杆菌CCFM1132对高尿酸血症小鼠血清和肝脏黄嘌呤氧化酶(XOD)活力的影响；
图4是罗伊氏乳杆菌CCFM1132对高尿酸血症小鼠血清肌酐(CREA)的影响
图5是罗伊氏乳杆菌CCFM1132对高尿酸血症小鼠总甘油三酯(TG)的影响；
图6是罗伊氏乳杆菌CCFM1132对高尿酸血症小鼠血清碱性磷酸酶(ALP)的影响；
图7是罗伊氏乳杆菌CCFM1132对高尿酸血症小鼠回肠尿酸转运蛋白ABCG2 mRNA水平的影响。
其中，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001(与高尿酸血症模型组比较)。
具体实施方式
实施例1：罗伊氏乳杆菌CCFM1132的筛选
(一)乳杆菌的分离筛选
(1)取1g健康成年人的新鲜粪便。梯度稀释后涂于加有1％制霉菌素的LBS培养基，置于37℃恒温培养箱中培养48h。
(2)培养后根据菌落的颜色、大小、边缘形状等，用接种环挑取菌落划线纯化。
(3)所得菌落进行革兰氏染色和过氧化氢酶分析。
(4)保留革兰氏染色阳性杆菌和过氧化氢酶阴性菌。
(二)乳杆菌的分子生物学鉴定
(1)单菌基因组抽提
(A)将步骤(一)所筛选得到的乳杆菌培养过夜；
(B)取培养过夜的菌悬液lmL于1.5mL离心管，10000r/min离心2min，弃上清得菌体；
(C)用lmL无菌水吹洗菌体后，10000r/min离心2min，弃上清得菌体；
(D)加入200μL SDS裂解液，80℃水浴30min；
(E)加入酚-氯仿溶液200μL于菌体裂解液中，其中酚-氯仿溶液的组成成分及体积比为Tris饱和酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1，颠倒混匀后，12000rpm离心5-10min，取上清200μL；
(F)加入400μL冰乙醇或冰异丙醇于200μL上清中，-20℃静置1h，12000rpm离心5-10min，弃上清；
(G)加入500μL 70％(体积百分数)冰乙醇重悬沉淀，12000rpm离心1-3min，弃上清；60℃烘箱烘干，或者自然晾干；
(H)50μL ddH2O重溶沉淀以备PCR。
(2)16S rDNA PCR
(A)细菌16S rDNA 50μLPCR反应体系
10×Taq buffer，5μL；dNTP，5μL；引物27F，0.5μL；引物1492R，0.5μL；Taq酶，0.5μL；模板，0.5μL；ddH2O，38μL。
(B)PCR条件
95℃5min；95℃10s；55℃30s；72℃30s；step 2-4 30×；72℃5min；12℃2min。
(C)制备1％琼脂糖凝胶，之后将PCR产物与10000×loading buffer混合，上样量2μL，120V跑30min，然后进行凝胶成像；
(D)将得到PCR产物送专业测序公司，将得到的测序结果与使用BLAST在Genbank中进行搜索和相似性比对，将鉴定为罗伊氏乳杆菌的菌株-80℃保存。
(3)全基因组测序
将提取的全基因组送专业测序公司，利用二代测序仪对菌的全基因组进行测序，将得到的序列结果使用BLAST在Genbank中进行搜索和相似性比对，测序结果鉴定为属于罗伊氏乳杆菌的一种新发现的菌株，命名为CCFM1132，并于-80℃保藏备用。
实施例2：罗伊氏乳杆菌CCFM1132对KunMing小鼠无毒副作用
将罗伊氏乳杆菌CCFM1132在MRS培养基中于37℃培养，收集菌体，将菌体重悬于100g/L的脱脂乳溶液中，制成浓度为4.0×109CFU/mL的菌悬液。取体重24-32g左右的健康雄性KunMing小鼠12只，适应环境一周后，分为CCFM1132组和对照组，CCFM1132组每日给予该浓度菌悬液0.3mL灌胃一次，对照组灌胃相同体积的不含罗伊氏乳杆菌CCFM1132的100g/L的脱脂乳溶液，观察一周，记录死亡和体重情况。
这些试验结果列于表1中。这些结果表明，喂食浓度1×109CFU/只的罗伊氏乳杆菌CCFM1132未对小鼠造成明显影响，体重无显著变化，无死亡现象产生。小鼠外观无明显病理症状。
表1小鼠体重变化及死亡情况
Figure GDA0004059123060000051
实施例3：罗伊氏乳杆菌CCFM1132降低高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平
取体重24-32g的健康雄性KunMing小鼠24只，适应性培养1周后，随机分为4组，分别为对照组、高尿酸血症模型组、罗伊氏乳杆菌CCFM1132干预组和别嘌呤醇干预组(别嘌呤醇)。除对照组外，其余组每天灌胃500mg/kg BW次黄嘌呤，1h后腹腔注射200mg/kg BW氧嗪酸钾；在氧嗪酸钾处理前1h，对照组和高尿酸血症模型组给予100g/L脱脂乳，罗伊氏乳杆菌CCFM1132干预组给予1.0×109CFU/只的罗伊氏乳杆菌CCFM1132，别嘌呤醇组给予5mg/kgBW别嘌呤醇。实验分组及处理方法见表2：
表2实验动物分组情况
Figure GDA0004059123060000052
Figure GDA0004059123060000061
实验末期收集小鼠新鲜粪便冻存于-80℃。试验结束时，小鼠禁食不禁水12h，腹腔注射0.1mL/10g 0.1g/L的戊巴比妥钠溶液麻醉后，摘眼球取血并辅以颈椎脱臼法处死。血液样本3500r/min离心15分钟，取上清，-80℃冻存，用于血液指标分析。肝脏、回肠等组织取出后迅速于预冷的生理盐水中漂洗去血，于液氮中速冻并转移于-80℃冻存，后续制成肝匀浆测定相关指标。血清尿酸水平的测定按照试剂盒方法进行。
罗伊氏乳杆菌CCFM1132对小鼠血清尿酸水平的影响如图2，与高尿酸血症模型小鼠相比，罗伊氏乳杆菌CCFM1132使高尿酸血症小鼠的血清尿酸浓度降低了23.03％，并接近对照组，可预防和减少高尿酸血症和痛风的发生。
实施例4：罗伊氏乳杆菌CCFM1132降低高尿酸血症小鼠的黄嘌呤氧化酶活性
实验动物分组及处理方法同实施例3，黄嘌呤氧化酶(XOD)的检测按照试剂盒(北京索莱宝)的方法进行。
黄嘌呤氧化酶是嘌呤代谢合成尿酸的关键酶，降尿酸药物别嘌呤醇由于能够抑制黄嘌呤氧化酶的活性使得尿酸合成减少，从而发挥降尿酸作用。如图3所示，与高尿酸血症小鼠相比，罗伊氏乳杆菌CCFM1132能够使高尿酸血症小鼠的血清和肝脏黄嘌呤氧化酶活性分别降低61.64％、67.44％，使得高尿酸血症小鼠升高的血清和肝脏黄嘌呤氧化酶活力趋近正常，从而使小鼠体内尿酸合成减少，有利于高尿酸血症和痛风的预防和治疗。
实施例5：罗伊氏乳杆菌CCFM1132下调血清肌酐水平
实验动物分组及处理方法同实施例3，血清肌酐的检测使用迈瑞BS480生化分析仪按照试剂盒的方法进行。
血清肌酐结果显示(图4)，高尿酸血症小鼠具有较高的血清肌酐浓度，浓度达63.2±3.7μmol/L，说明高尿酸血症使得小鼠肾脏功能受损，而罗伊氏乳杆菌CCFM1132能够使得小鼠的血清肌酐降至55.9±8.6μmol/L，并趋近正常值，而别嘌呤醇没有该降低作用，这说明罗伊氏乳杆菌CCFM1132能够用于肾脏疾病的治疗及预防。
实施例6：罗伊氏乳杆菌CCFM1132下调血清总甘油三酯水平
实验动物分组及处理方法同实施例3，血清总甘油三酯(TG)的检测使用迈瑞BS480生化分析仪按照试剂盒的方法进行。
罗伊氏乳杆菌CCFM1132对高尿酸血症小鼠的血清总甘油三酯的影响如图5，与对照组相比，高尿酸血症小鼠的血清总甘油三酯浓度达1.41±0.27mmol/L，罗伊氏乳杆菌CCFM1132能够使其恢复至1.00±0.30mmol/L，达到正常水平。这说明罗伊氏乳杆菌CCFM1132具备调节脂质代谢，缓解肥胖等疾病的潜力。
实施例7：罗伊氏乳杆菌CCFM1132降低小鼠的血清碱性磷酸酶(ALP)的活性
实验动物分组及处理方法同实施例3，血清碱性磷酸酶(ALP)的检测使用迈瑞BS480生化分析仪按照试剂盒的方法进行。
结果显示(图6)，与对照组相比，高尿酸血症小鼠血清碱性磷酸酶活性升高至86.5±14.0U/L，而罗伊氏乳杆菌CCFM1132干预能够使得升高的碱性磷酸酶活性恢复至55.6±8.7U/L，处于正常水平。
实施例8：罗伊氏乳杆菌CCFM1132提高小鼠回肠尿酸转运蛋白ABCG2的mRNA水平
实验动物分组及处理方法同实施例3。
回肠ABCG2 mRNA测定：取约20mg回肠组织加入500μL Trizol，冰浴匀浆后采用常规方法提取回肠组织中的RNA。按照反转录试剂盒说明书进行cDNA合成。用荧光染料SYBRGreen super mix(Qiagen,Germany)混合样本，PCR体系为5μL mix、1μL cDNA、1μL正向和1μL反向引物，用ddH2O补至总体积为10μL。在实时荧光定量基因扩增仪器CFX96TMReal-TimeSystem(Bio-Rad，USA)上进行检测，每个样本设立3个平行孔，并以GAPDH为内参，所得结果用2-ΔΔCq的方法进行分析；所用的引物序列见表3。
表3qPCR引物序列
Figure GDA0004059123060000071
结果显示(图7)，罗伊氏乳杆菌CCFM1132能够显著提高高尿酸血症小鼠的回肠ABCG2的mRNA水平。回肠ABCG2在肠道尿酸排泄中发挥着重要作用，罗伊氏乳杆菌CCFM1132能够通过提高回肠ABCG2的表达从而促进尿酸排出体外。
实施例10：罗伊氏乳杆菌CCFM1132的应用
将罗伊氏乳杆菌CCFM1132用于制备片剂，片剂的具体制备过程如下：
挑取实施例1获得的罗伊氏乳杆菌CCFM1132的单菌落接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到活化液；将活化液按照1％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到一级种子液；将一级种子液按照1％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到二级种子液；将二级种子液按照1％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到菌液；将菌液于6000×g离心15min，收集沉淀；将沉淀用pH为7.4的PBS缓冲液洗涤两次后，于6000×g再次离心10min，得到菌体；用含有130g/L脱脂乳、20g/L海藻糖和20g/L蔗糖的保护剂溶液将罗伊氏乳杆菌菌体重悬至细胞浓度为1×1010CFU/mL，得到罗伊氏乳杆菌菌液；将罗伊氏乳杆菌菌液冷冻干燥，得到罗伊氏乳杆菌菌粉；在罗伊氏乳杆菌菌粉中加入占罗伊氏乳杆菌菌粉总重计2％的硬脂酸作润滑剂、3％的CMC Na作粘合剂后进行压片，得到片剂。
取1g上述片剂每天灌胃高尿酸血症模型小鼠(参照实施例3的方法构建)，连续五周，可有效降低小鼠血清尿酸水平。
实施例11：罗伊氏乳杆菌CCFM1132的应用
罗伊氏乳杆菌CCFM1132可用于制备菌粉，菌粉的具体制备过程如下：
挑取实施例1获得的罗伊氏乳杆菌CCFM1132的单菌落接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到活化液；将活化液按照1％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到一级种子液；将一级种子液按照1％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到二级种子液；将二级种子液按照1％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到菌液；将菌液6000g离心15min，收集沉淀；将沉淀用pH为7.4的PBS缓冲液洗涤两次后，6000g再次离心10min，得到菌体；用含有130g/L脱脂乳、20g/L海藻糖和20g/L蔗糖的保护剂溶液将罗伊氏乳杆菌菌体重悬至细胞浓度为1×1010CFU/mL，得到罗伊氏乳杆菌菌液；将罗伊氏乳杆菌菌液冷冻干燥，得到菌粉。
取1g上述菌粉每天灌胃高尿酸血症模型小鼠(参照实施例3的方法构建)，连续五周，可有效降低小鼠血清尿酸水平。
对比例1：
具体实施方式同实施例3，区别在于，将罗伊氏乳杆菌CCFM1132替换为罗伊氏乳杆菌138-1(公开于：食品与发酵工业,2018,44(08):57-64)，测定小鼠的血清尿酸指标，结果显示罗伊氏乳杆菌138-1组小鼠血清尿酸值为582.6±95.8μmol/L，相比于高尿酸血症模型组(623.0±76.7μmol/L)，高尿酸血症小鼠尿酸水平未发生明显变化。
对比例2：
具体实施方式同实施例4，区别在于将罗伊氏乳杆菌CCFM1132替换为罗伊氏乳杆菌138-1，测定小鼠的血清和肝脏黄嘌呤氧化酶的活性，结果显示罗伊氏乳杆菌138-1组小鼠血清和肝脏黄嘌呤氧化酶活性分别为5.234±0.880U/L、1.334±0.395U/g prot，相比于高尿酸血症模型组(7.531±1.440U/L、1.718±0.416U/g prot)，罗伊氏乳杆菌138-1将高尿酸血症小鼠的血清尿酸黄嘌呤氧化酶活性降低了30.50％，但促进了高尿酸血症小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶的活性升高。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一株罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）CCFM1132，已于2020年7月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61093。
2.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌CCFM1132在制备功能性菌剂或药物中的应用。
3.含有权利要求1所述罗伊氏乳杆菌CCFM1132的药物。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌CCFM1132的数量≥1×106CFU/mL或≥1×106CFU/g。
5.根据权利要求3或4所述的药物，其特征在于，所述药物中含有所述罗伊氏乳杆菌CCFM1132的活菌株。
6.根据权利要求3或4所述的药物，其特征在于，所述药物还含有药学上可接受的载体。
7.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物还含有药学上可接受的载体。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药学上可接受的载体为：填充剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂或润滑剂中的一种或多种。
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