CN110607257B - 一种用于预防溃疡性结肠炎的复合益生菌 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于预防溃疡性结肠炎的复合益生菌，所述复合益生菌由长双歧杆菌CICC6197、罗伊氏乳杆菌RAM0101、丁酸梭菌RAM0216和凝结芽孢杆菌RAM1202构成。所述罗伊氏乳杆菌RAM0101的保藏编号为CGMCC No.17853；所述丁酸梭菌RAM0216保藏编号为CGMCC No.17854；所述凝结芽孢杆菌保藏编号为CGMCC No.17852；本发明益生菌组合不仅具有良好抗炎的作用，而且能够修复溃疡性结肠炎造成的粘膜损伤，对溃疡性结肠炎具有良好的预防效果。

Description

一种用于预防溃疡性结肠炎的复合益生菌
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种用于预防溃疡性结肠炎的复合益生菌。
背景技术
疡性结肠炎(UC)，是一种特发性、慢性、反复性的炎症性肠道疾病，其特点为腹痛、腹泻和便血。溃疡性结肠炎发病机制十分复杂，涉及遗传因素、环境因素(包括饮食习惯)、肠道稳态和免疫调节等因素。由于炎症性肠病精确的病因仍然未知，所以近年来炎症性肠病的治疗主要依赖于使用非特异性药物进行缓解性治疗，例如皮质类固醇、抗生素、免疫抑制剂等。然而，现有的很多治疗策略并非对所有患者都有效，甚至伴随一些高风险副作用或并发症。另外，这些治疗策略如何影响肠道微生物的组成与功能很少被了解。考虑到肠道微生物在炎症性肠病中的关键作用，所以以肠道微生物为治疗靶点，通过调节肠道微生态，恢复肠道菌群失衡来进行溃疡性结肠炎的治疗。
益生菌通常是定植于动物肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效的活性有益微生物的总称。益生菌发挥功能的机制包括对免疫功能进行调节、对共生细菌和病原菌发挥直接干预作用而阻止机体感染、对肠道稳态的修复以及致病性毒素的降解。益生菌在人和动物肠道内，通过栖生、偏生、竞争或吞噬等复杂关系，改善宿主肠道微生物的平衡进而发挥促进食物有益代谢、提高免疫力、防止代谢性疾病等作用。
近年的研究表明，在UC患者和实验性结肠炎动物中，微生物多样性和有益细菌(如乳酸杆菌，梭菌簇IV和XIVa和双歧杆菌)减少，而促炎细菌(如大肠杆菌，梭杆菌和Ruminococcus gnavus)增加。曾有研究者尝试通过粪便微生物群移植(FMT)，靶向药物，益生菌或饮食来重建肠道微生物组与免疫系统之间的相互作用，从而缓解肠道炎症和损伤。也有人采用益生菌和中药提取物的复合物来治疗UC。采用广谱的抗炎药物或补充益生菌对治疗是否有益，特别是在环境和饮食缺乏安全管理的现在，如何有效地预防UC，防止病从口入，是当今最受关注的课题。“物极必反”是治病和防病过程中的大忌。肠道益生菌是有益的，但是，需要合理且科学地使用才会产生有益效果。如何合理地选择和使用益生菌是开发益生菌产品的关键。
作为益生菌，菌株的安全性和特异性需要引起高度重视。同时，益生菌菌株之间的功能特异和互补是开发复合益生菌剂的基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于预防溃疡性结肠炎的复合益生菌，可以有效的预防溃疡性结肠炎。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种用于预防溃疡性结肠炎的复合益生菌，所述复合益生菌包括长双歧杆菌CICC6197(Bifidobacterium longum CICC6197)、罗伊氏乳杆菌RAM0101(Lactobacillusreuteri RAM0101)、丁酸梭菌RAM0216(Clostridium butyricum RAM0216)和凝结芽孢杆菌RAM1202(Bacillus coagulans RAM1202)。
上述预防溃疡性结肠炎的复合益生菌中，所述长双歧杆菌CICC6197、罗伊氏乳杆菌RAM0101、丁酸梭菌RAM0216和凝结芽孢杆菌RAM1202的菌体数量比为1:1:1:1。
本发明采用的长双歧杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为CICC6197；所述罗伊氏乳杆菌RAM0101的保藏编号为CGMCC No.17853，保藏日期为2019年5月27日；所述丁酸梭菌RAM0216保藏编号为CGMCC No.17854，保藏日期为2019年5月27日；所述凝结芽孢杆菌RAM1202保藏编号为CGMCC No.17852，保藏日期为2019年5月27日。罗伊氏乳杆菌RAM0101、丁酸梭菌RAM0216和凝结芽孢杆菌RAM1202的保藏单位均为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址均为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
优选地，所述长双歧杆菌CICC6197、罗伊氏乳杆菌RAM0101、丁酸梭菌RAM0216和凝结芽孢杆菌RAM1202均为活菌菌体形式。
优选地，所述的长双歧杆菌CICC6197、罗伊氏乳杆菌RAM0101、丁酸梭菌RAM0216和凝结芽孢杆菌RAM1202的菌体是由均处于稳定期的菌液培养物分别离心收集的菌体。
上述预防溃疡性结肠炎的复合益生菌的制备方法，包括如下步骤：
(1)将长双歧杆菌CICC6197、罗伊氏乳杆菌RAM0101、丁酸梭菌RAM0216和凝结芽孢杆菌RAM1202四种益生菌进行菌种活化后，挑取单菌落在相应的液体培养基中进行扩大培养；
(2)取丁酸梭菌RAM0216 125mL，长双歧杆菌CICC6197200mL，罗伊氏乳杆菌RAM0101 125mL，凝结芽孢杆菌RAM12021000mL；培养后，离心菌液，收取菌体，弃去培养基，将各菌体溶于无菌PBS中重悬菌体，得菌悬液。
优选地，步骤(2)中，培养时间为30小时。
优选地，步骤(2)中，菌悬液中活菌数为1×109cfu/mL。
本发明的有益效果是：
本发明复合益生菌中涉及的罗伊氏乳杆菌RAM0101、丁酸梭菌RAM0216和凝结芽孢杆菌RAM1202均为从生态养殖管理条件下饲养的松辽黑猪仔猪断奶后饲养59日龄猪的肠道内容物中分离到。四株菌具有各自的特性，在预防溃疡性结肠炎的作用不同，联合使用具有显著的协同效应。
四种益生菌混合物在修复粘膜微生物生态学的失调和减少肠道炎症方面比单一菌株和抗炎药物更有效。复合益生菌增加有益菌的比例，降低结肠粘膜中促炎菌的比例，显着增强白介素-10和肠屏障的表达。
本发明选用几种益生菌进行复合属于发明人新发现的组合，之前研究发现，几种菌均具有较好的抗溃疡性结肠炎作用，但几种菌联合使用后，效果显著增加，具有明显的协同作用。具体表现在显著改善溃疡性结肠炎的表观状态，降低小鼠结肠组织病理学评分，并降低小鼠炎症性反应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为各试验组疾病活动指数统计结果。
图2为各试验组结肠长度比较结果。
图3为各试验组结肠组织切片及其病理分析结果。从左至右的三组柱形图中，第一组柱形图的纵坐标为结构损伤，第二组柱形图的纵坐标为炎性细胞浸润。第三组柱形图的纵坐标为南希指数，三组柱形图的横坐标上，从左至右的长条柱均依次对应的为建模组、罗伊氏乳杆菌、凝结芽孢杆菌、长双歧杆菌、丁酸梭菌、复合菌。
图4为各试验组肠道组织炎性因子表达结果。12组柱形图依次对应的12种炎症因子为：肿瘤坏死因子α、干扰素γ、白介素-1β、白介素-6、白介素-10、白介素-17a、白介素-22、环氧化酶-2、转化生长因子-β、C型凝集素-3γ、基质金属蛋白酶-3和基质金属蛋白酶-9。12组柱形图中，纵坐标为倍数变化，从左至右的长条柱均依次对应的为对照组、建模组、罗伊氏乳杆菌、凝结芽孢杆菌、长双歧杆菌、丁酸梭菌、复合菌。
图5为各试验组肠道屏障蛋白基因表达结果；
图6为各试验组肠道屏障蛋白免疫印迹试验结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1材料与试剂
1.1试验菌株：罗伊氏乳杆菌RAM0101、丁酸梭菌RAM0216、凝结芽孢杆菌RAM1202均分离自无抗生素添加的饲养环境下的松辽黑猪。具体处理方式为：仔猪断奶后，采用吉林省农科院畜牧研究所配制的全价饲料，饲料中不添加抗生素。为了提高仔猪的自身免疫能力，在每吨全价料中混合2kg益生菌发酵六神曲生物饲料添加剂。在此条件下饲养59天，之后进行解剖，从解剖的肠道内容物中分离得到罗伊氏乳杆菌RAM0101、丁酸梭菌RAM0216、凝结芽孢杆菌RAM1202。将上述三种菌株进行纯化、鉴定后保存在-80℃超低温冰柜中。
采用的长双歧杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为CICC6197。
一种混合益生菌对DSS诱导C57/BL6小鼠溃疡性结肠炎的预防应用试验。
目的：提供一种复合益生菌，可以有效的治疗溃疡性结肠炎。
溃疡性结肠炎诱导方式：采用在饮水中添加2.5％DSS的方法，建立小鼠的溃疡性结肠炎模型；根据建模小鼠体重丢失、腹泻、便血与疾病活动指数判断建模是否成功。
复合益生菌干预方式：疾病诱导与菌体干预同时进行，目的是观察混合益生菌组合对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎的预防作用。
1.2培养基
罗伊氏乳杆菌RAM0101所用MRS液体培养基：吐温80 1g/L，牛肉膏10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬氢二铵2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，pH 6.8，115℃、20min灭菌。
罗伊氏乳杆菌RAM0101所用MRS固体培养基：吐温80 1g/L，牛肉膏10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬氢二铵2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，琼脂15g/L，pH 6.8，115℃、20min灭菌。
凝结芽孢杆菌RAM1202所用MRS液体培养基：吐温80 1g/L，牛肉膏10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬氢二铵2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，pH 6.8，115℃、20min灭菌。
凝结芽孢杆菌RAM1202所用MRS固体培养基：吐温80 1g/L，牛肉膏10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬氢二铵2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，琼脂15g/L，pH 6.8，115℃、20min灭菌。
丁酸梭菌RAM0216所用丁酸梭菌液体培养基：葡萄糖34g/L，胰蛋白胨40g/L，酵母浸粉38g/L，牛肉浸膏15g/L，可溶性淀粉1g/L，氯化钠5g/L，乙酸钠3g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，磷酸氢二钾2g/L、硫酸铵1g/L，pH 7.1，115℃、20min灭菌。
丁酸梭菌RAM0216所用丁酸梭菌固体培养基：葡萄糖34g/L，胰蛋白胨40g/L，酵母浸粉38g/L，牛肉浸膏15g/L，可溶性淀粉1g/L，氯化钠5g/L，乙酸钠3g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，磷酸氢二钾2g/L、硫酸铵1g/L，琼脂15g/L，pH 7.1，115℃、20min灭菌。
长双歧杆菌CICC6197所用PYG液体培养基：蛋白胨20g/L，葡萄糖5g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠0.08g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，氯化钙0.008g/L，硫酸镁0.008g/L，磷酸氢二钾0.04g/L，磷酸二氢钾0.04g/L，碳酸氢钠0.4g/L，pH 6.0，115℃、20min灭菌。
长双歧杆菌CICC6197所用PYG固体培养基：蛋白胨20g/L，葡萄糖5g/L，酵母浸粉10g/L，氯化钠0.08g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，氯化钙0.008g/L，硫酸镁0.008g/L，磷酸氢二钾0.04g/L，磷酸二氢钾0.04g/L，碳酸氢钠0.4g/L，琼脂15g/L，pH 6.0，115℃、20min灭菌。
1.3主要试剂：葡聚糖硫酸钠(DSS)，分子量36000-50000，购买于上海翊盛生物技术有限公司。
1.4试验动物：6周龄C57/BL6小鼠，雄性，体重18-20g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。
2试验方法
2.1灌胃益生菌的准备
本实验室保存的长双歧杆菌CICC6197、罗伊氏乳杆菌RAM0101、丁酸梭菌RAM0216和凝结芽孢杆菌RAM1202的菌种，分别在各自固体营养培养基上进行菌株活化。37℃厌氧条件下，培养约48h，待长出单菌落后，挑取单菌落，接种于各菌株液体培养基中进行扩大培养，之后进行菌落计数试验。
其中，各菌种具体的活化、扩大培养的方法如下。
罗伊氏乳杆菌RAM0101：(1)菌株活化：将实验室保存的罗伊氏乳杆菌菌种，在MRS固体培养基上进行平板划线。放置于恒温厌氧培养箱，厌氧条件下，37℃，培养48h。(2)扩大培养：挑取单菌落，接种于MRS液体培养基中进行扩大培养，条件：厌氧、37℃。
凝结芽孢杆菌RAM1202：(1)菌株活化：将实验室保存的凝结芽孢杆菌菌种，在MRS固体培养基上进行平板划线。放置于恒温厌氧培养箱，厌氧条件下，37℃，培养48h。(2)扩大培养：挑取单菌落，接种于MRS液体培养基中进行扩大培养，条件：厌氧、37℃。
丁酸梭菌RAM0216：(1)菌株活化：将实验室保存的丁酸梭菌菌种，在丁酸梭菌培养基固体培养基上进行平板划线。放置于恒温厌氧培养箱，厌氧条件下，37℃，培养48h。(2)扩大培养：挑取单菌落，接种于丁酸梭菌培养基液体培养基中进行扩大培养，条件：厌氧、37℃。
长双歧杆菌CICC6197：(1)菌株活化：将实验室保存的长双歧杆菌菌种，在PYG固体培养基上进行平板划线。放置于恒温厌氧培养箱，厌氧条件下，37℃，培养48h。(2)扩大培养：挑取单菌落，接种于PYG液体培养基中进行扩大培养，条件：厌氧、37℃。
根据菌落计数结果，最终确定丁酸梭菌RAM0216 125mL，长双歧杆菌CICC6197200mL，罗伊氏乳杆菌RAM0101 125mL，凝结芽孢杆菌RAM1202 1000mL，培养30小时。离心菌液，收取菌体，弃去培养基，将各菌体溶于无菌PBS中重悬菌体，并调制菌悬液活菌数达到1×109cfu/mL，用于小鼠灌胃，每只小鼠灌胃体积为200μL。
2.2溃疡性结肠炎小鼠模型的构建
建模用药：葡聚糖硫酸钠(DSS)，分子量36000-50000，建模所用的浓度为2.5％。
模型建立：试验小鼠进行一周的适应性喂养后，将2.5％DSS溶解于灭菌的饮用水中替代小鼠正常饮用水，小鼠自由获取，连续7天。
2.3试验分组设计
对照组：10只，正常健康小鼠，饮用正常灭菌水，灌胃介质为PBS。
模型组：10只，2.5％DSS溶解于灭菌水中替代正常饮用水进行疾病模型建立，连续7天。建模开始后每天进行体重、腹泻、便血情况的监测，评估模型是否建立成功，灌胃介质为PBS。
益生菌处理组：共分为5组，每组小鼠10只。小鼠每天自由饮用含2.5％DSS饮用水，同时进行益生菌灌胃处理。每日一次，每只小鼠200μL(含活菌数1×109cfu/mL)灌胃量，连续7天。
2.4症状学观察
试验开始后每天观察小鼠的活动状态、腹泻、便血及体重丢失情况，根据严重程度，采用表1的标准进行评分，然后三者加和进行疾病活动指数的计算。
表1溃疡性结肠炎典型症状评分标准
2.5结肠组织切片及其病理指标分析
结肠组织用无菌的PBS缓冲液清理干净，放入10％的福尔马林溶液中固定，之后嵌入在石蜡中作成块，在显微镜下进行组织切片，切片厚度为5μm。将切好组织固定在载玻片上，用苏木精和伊红混合染色液染色，在显微镜下观察结肠组织变化情况，包括：粘膜厚度、绒毛高度、隐窝深度、杯状细胞和炎症细胞浸润等。
2.6肠黏膜中炎症因子基因和肠道屏障相关基因表达分析
取肠道黏膜组织，利用RNA提取试剂盒提取总RNA，之后利用反转录试剂盒将mRNA反转录成cDNA，随后利用相关因子的特异性引物(见表2)进行定量PCR(qPCR)测定。最后根据qPCR结果分析试验各组小鼠的病理情况。
表2用于本发明实例的qPCR反应引物
附注：参考文献
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2.7蛋白免疫印迹试验
取试验各组小鼠结肠组织约0.02g加入装有0.2mL高效RIPA裂解液的离心管中珠打匀浆，12000r/min离心5min，取其上清用BCA法分析蛋白含量。经15％分离胶浓度的SDS-PAGE凝胶电泳后，将蛋白转移到0.2μm的PVDF膜上，并用5％BSA室温封闭1h。然后一抗过夜孵育(4℃)，1×TBST洗膜3次，每次10min。二抗37℃孵育30min，1×TBST洗膜3次，每次10min。最后使用Odyssey红外线成像系统进行荧光检测。
3结果与分析
3.1各试验组溃疡性结肠炎症状比较
在试验干预后每天对小鼠的体重进行测量，观察小鼠腹泻、便血情况，依据溃疡性结肠炎典型症状评分标准进行打分，计算疾病活动指数。与对照组相比，建模组小鼠在DSS疾病诱导的第三天开始出现体重降低，出现腹泻与粪便潜血症状，在第5天，模型对照组小鼠出现水样便，直肠严重出血，小鼠活动状态极度萎靡，体重丢失严重。
表3是各试验组体重变化情况统计。建模组从第4天开始体重下降，第5天之后下降明显。分别使用单菌和复合菌处理对由于DSS引起的体重丢失均有不同程度的抑制作用，复合菌组明显优于其他单一菌株处理组。图1是各试验组疾病活动指数统计结果。综合体重丢失、腹泻、便血情况，复合益生菌处理显著缓解了DSS诱导溃疡性结肠炎所引起的疾病活动。
表3各试验组体重变化情况统计
3.2各试验组结肠长度及其病理结果分析
小鼠解剖后，我们测量了结肠长度。图2是各试验组结肠长度比较结果。建模组因DSS对肠道的损伤结肠明显缩短，这一指标也是小鼠溃疡性结肠炎模型建模成功的典型标志。与建模组相比，单一菌株处理对结肠的缩短有不同程度的缓解作用。复合益生菌处理，无论是结肠的长度、外观状态均与对照组接近，这说明复合益生菌干预效果显著，有效缓解了小鼠结肠缩短的情况。
我们对各试验组结肠的组织切片进行了对比分析，图3是各试验组结肠组织切片及其病理分析结果。结果显示，与对照组相比，建模组小鼠结肠组织粘膜损伤严重、杯状细胞减少、固有层细胞炎症浸润严重，并伴有肠壁增厚现象。凝结芽孢杆菌、丁酸梭菌对炎症细胞浸润及结肠黏膜损伤均有较好的保护作用，而罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌对炎症细胞浸润无明显保护作用。复合益生菌干预的结肠炎小鼠结肠组织粘膜损伤和炎症细胞浸润现象均得到缓解，说明复合益生菌处理能够改善DSS导致的结肠损伤。
3.3各试验组肠道组织中相关炎性因子比较分析
溃疡性结肠炎的表观变化情况会引起免疫炎症反应。为了观察各组的免疫炎症反应的差异，在小鼠处死后，我们取小鼠结肠组织进行mRNA的提取，反转录为cDNA。通过q-PCR定量了结肠组织炎性细胞因子，共完成12种炎症因子的基因表达定量，结果见图4。与对照组相比，建模组显著上调了肿瘤坏死因子α、干扰素γ、白介素1β、白介素6、白介素22、环氧化酶2、C型凝集素3γ、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶9的表达水平；显著下调了白介素10、白介素17a和转化生长因子β的表达水平。各个单一菌株的处理表现不同，凝结芽孢杆菌极显著的下调了白介素1β的表达水平；长双歧杆菌显著上调了白介素17a和转化生长因子β的表达水平；罗伊氏乳杆菌显著下调了基质金属蛋白酶3的表达水平；丁酸梭菌显著下调了白介素22的表达水平。在测量的其中11种炎症因子的表达上，复合益生菌相对于对照组和建模组，均起到了正向调节作用。这些结果说明，复合益生菌在调控因DSS引起的炎症紊乱起到了积极作用。
3.4肠道屏障功能比较分析
采用q-PCR定量和蛋白免疫印迹试验，我们测定了各试验组肠道屏障蛋白的变化情况。图5是四种肠道屏障蛋白的基因表达结果。结果显示，凝结芽孢杆菌显著上调了闭合蛋白的表达水平；罗伊氏乳杆菌和长双歧杆菌对控制黏蛋白2的表达有积极作用；综合肠道屏障作用来看，复合益生菌在维护肠道屏障方面起到了积极作用。图6是各试验组的肠道屏障蛋白免疫印迹试验结果。免疫印迹试验检测的是分泌到肠上皮细胞外的屏障蛋白。结果显示，建模组破坏了结肠黏膜中闭合蛋白和紧密连接蛋白1，单一菌株处理改善了因DSS引起的对结肠黏膜屏障蛋白破坏，而符合益生菌极显著地改善了黏膜屏障功能。
4复合益生菌对溃疡性结肠炎效果评价
通过利用DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型验证了本发明的复合益生菌对DSS引起的小鼠溃疡性结肠炎具有预防和治疗性效果。每天灌胃200μL复合益生菌菌悬液(菌数为1×109cfu/mL)，能够有效控制因DSS引起的体重丢失、便血和前期腹泻；显著降低了因DSS引起的结肠缩短；明显改善了因DSS引起的肠道结构损伤、炎性细胞浸润；较显著地改善了由DSS引起的紧密连接蛋白-1(Claudin-1)、闭合蛋白(Occludin)恶性变化，使肠道屏障向好的方向发展。相关炎症因子表达结果表明，复合益生菌处理，在11炎症因子的表达上均起到了正向调节作用。实验结果可见，四种益生菌虽然功能各不相同，但是它们的复合使用对DSS引起的溃疡性结肠炎起到了良好的预防和治疗效果，发挥了功能各异益生菌的协同作用。本发明为益生菌的复合使用提供了新思路，为治疗溃疡性结肠炎提供了新的益生菌治疗方案和方法。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种用于预防溃疡性结肠炎的复合益生菌，其特征在于，该复合益生菌由长双歧杆菌CICC6197、罗伊氏乳杆菌RAM0101、丁酸梭菌RAM0216和凝结芽孢杆菌RAM1202构成；所述罗伊氏乳杆菌RAM0101的保藏编号为CGMCC No.17853；所述丁酸梭菌RAM0216的保藏编号为CGMCC No.17854；所述凝结芽孢杆菌RAM1202的保藏编号为CGMCC No.17852；
所述复合益生菌的制备方法包括如下步骤：
（1）将长双歧杆菌CICC6197、罗伊氏乳杆菌RAM0101、丁酸梭菌RAM0216和凝结芽孢杆菌RAM1202四种益生菌进行菌种活化后，挑取单菌落在对应的液体培养基中进行扩大培养；
（2）取丁酸梭菌RAM0216 125mL，长双歧杆菌CICC6197 200mL，罗伊氏乳杆菌RAM0101125mL，凝结芽孢杆菌RAM1202 1000mL；培养后，离心菌液，收取菌体，弃去培养基，将各菌体溶于无菌PBS中重悬菌体，得菌悬液。
2.根据权利要求1所述的复合益生菌，其特征在于，所述复合益生菌中，长双歧杆菌CICC6197、罗伊氏乳杆菌RAM0101、丁酸梭菌RAM0216和凝结芽孢杆菌RAM1202的菌体数量比为1:1:1:1。
3.根据权利要求1所述的复合益生菌，其特征在于，所述长双歧杆菌CICC6197、罗伊氏乳杆菌RAM0101、丁酸梭菌RAM0216和凝结芽孢杆菌RAM1202均为活菌菌体形式。
4.根据权利要求3所述的复合益生菌，其特征在于，所述的长双歧杆菌CICC6197、罗伊氏乳杆菌RAM0101、丁酸梭菌RAM0216和凝结芽孢杆菌RAM1202的菌体是由均处于稳定期的菌液培养物分别离心收集的菌体。
5.根据权利要求1所述的复合益生菌，其特征在于，步骤（2）中，培养时间为30小时。
6.根据权利要求1所述的复合益生菌，其特征在于，步骤（2）中，菌悬液中活菌数为1×109cfu/mL。
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