CN110591944A - 一株用于预防溃疡性结肠炎的优良丁酸梭菌 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株具有预防溃疡性结肠炎的丁酸梭菌，该菌株已于2019年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.17854。本发明以C57BL/6N小鼠为试验对象，利用葡聚糖硫酸钠DSS诱导小鼠形成溃疡性结肠炎模型，并利用该模型考察该发明菌株在预防溃疡性结肠炎的有效性。本发明的丁酸梭菌能够改善由DSS诱导造成结肠炎小鼠的体重丢失、腹泻、便血及疾病活动指数DAI评分，能够保护由DSS诱导造成的小鼠结肠组织病理学损伤，能够增强结肠组织上皮屏障完整性，且无毒无害。

Description

一株用于预防溃疡性结肠炎的优良丁酸梭菌

技术领域

本发明涉及微生物学领域，具体涉及一株用于预防溃疡性结肠炎的优良丁酸梭菌。

背景技术

炎症性肠病(inflammatory bowel diseases,IBD)是发生于结肠和小肠部分的慢性非特异性炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)。IBD发生在基因易感人群中，由过度活跃的T细胞介导的，对肠道微生物的特定组分产生免疫应答而导致的，易受环境影响而反复发作。IBD的具体发病原因还不清楚，一般认为由宿主基因、环境因素、肠道微生物及免疫反应共同作用所导致。但越来越多的研究证实，肠道微生物(细菌、真菌和病毒)在IBD发生发展过程中起着关键作用。在IBD发病初期，病人肠道微生物多样性减少，某些具有侵略性的细菌种类(Proteobacteria,Fusobacterium species,and Ruminococcus gnavus)增加，同时具有保护性的细菌种类(Lachnospiraceae,Bifidobacterium species,Roseburia and Sutterella)减少。有研究证实肠道生态失调能够引起IBD和T细胞介导的慢性试验性结肠炎。肠道中的粘附和入侵性E.coli和Enterococcus faecalis能够激活诱发疾病的免疫反应，以及引起肠道上皮损伤。同时，IBD和试验性结肠炎也进一步改变肠道微生物组成和细菌基因表达。此外，炎症反应也能够改变肠道上皮防御功能、黏液层厚度和黏性。

UC是IBD的一种，病变多位于乙状结肠和直肠，也可蔓延至降结肠，甚至整个结肠部位。临床上，UC表现为持续或反复发作的腹泻，粘液便或脓血便，体重减轻、里急后重等，属于中“泄泻”、“痢疾”、“肠澼”、“下痢”、“滞下”等疾病范畴。单独的UC很少致命，但是UC引起的高度的炎症水平，增加了结直肠癌(Colorectal cancer)的发病风险。临床上治疗UC的药物主要包括水杨酸类药物、皮质类固醇类药物为主，及其它包括免疫抑制剂类药物、抗生素、抗凝药物、抗炎性细胞因子、神经免疫调节剂等。水杨酸类抗炎剂(如柳氮磺胺吡啶Sulfasalazine,SASP)是UC的一线治疗药物，但会引起消化道反应、头痛和过敏反应引起的皮疹、肝毒性、白细胞较少、贫血等不良反应。临床常用的皮质类固醇药物有强的松、地塞米松、氢化可的松等，但该类药长期应用易产生副作用，如情绪改变、满月脸、高血压等，且不能防止复发。另外，某些抗生素，如喹诺酮类环丙沙星、青霉素类、非氨基糖苷类利福昔明也用于UC的治疗。但抗生素的使用不能防止UC的复发，且会导致严重的细菌耐药性的产生。除此之外，研究者还关注中药制剂治疗结肠炎的效果，如黄连煎剂、乌梅丸、参灵白术散、葛根芩连汤、四白汤和四神丸等，虽然表现出对结肠炎的预防效果，但中药制剂具有组成复杂且含有不明成分的特点。因此，寻找安全、有效且经济的治疗方法具有重要意义。

肠道菌群在人类肠道代谢和免疫方面扮演着重要角色，肠道菌群失调会引起肠道代谢紊乱，导致各种慢性疾病的发生，其中包括炎症性肠病(IBD)。有研究指出，肠道菌群失调有可能是IBD的触发点，并表明可以将肠道菌群作为治疗靶点，通过调节肠道菌群结构，恢复肠道微生态平衡，达到治疗IBD的目的。

益生菌，其被定义为“活的微生物有机体，当给予合适的量时会赋予宿主健康益处”，其被认为能够积极主动的调节肠道微生物，能够在包括IBD在内的大范围生态失调中提供跨领域的治疗益处。事实上，益生菌经常被推荐作为IBD缓解的诱导或维持的辅助治疗策略。益生菌能够维持肠道微生态平衡，增强粘膜屏障功能，促进肠粘膜免疫耐受，干预肠道炎症反应，抑制上皮细胞凋亡，故而已被用于IBD的治疗。

丁酸梭菌(Clostridium butyricum)又名酪酸菌，它是梭状芽孢菌属的一种，是1933年由日本千叶医科大学宫入近治博士首次发现并报告的，因此又叫宫入菌。1935年，Kingimiyairi博士从人的粪便与土壤中分离出丁酸梭菌，随后发现其厌氧培养的过滤物中含有较少的脂肪酸，具有极强的整肠作用，它可抑制肠道中的致病菌，促进肠道中有益菌如双歧杆菌和乳杆菌的生长。

丁酸梭菌的生理作用：(1)调整肠道菌群平衡，促进肠道有益菌生长。肠道菌群失衡会导致各种疾病的发生。实验表明，健康人的粪便菌群以厌氧菌为主，并且双歧杆菌在人和动物体中是含量最高和最常见的正常菌群之一。丁酸梭菌能促进有益菌中双歧杆菌和乳酸菌的增殖，其中一个原因是：丁酸梭菌可以产生淀粉酶，淀粉酶水解淀粉和碳水化合物生成低聚糖，这些低聚糖更容易被双歧杆菌和乳酸菌所利用。(2)抑制肠道有害菌生长，降低有毒物质在肠道积累。丁酸梭菌还能有效的抑制能引起疾病的葡萄球菌、念珠菌、克雷伯菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌和伤寒沙门氏菌以及腐败菌的繁殖，调整肠道微生态恢复平衡，同时也减少了氨类、胺类、吲哚类和硫化氢等有害物质产生(这些产物如果被肠吸收可损害肝功能)。(3)增强免疫功能，预防肿瘤发生。丁酸梭菌可以激活免疫系统，促进免疫功能，维持机体的健康状况。当机体摄食酪酸菌死菌体(10⁹个/克)后，从小肠上皮无菌取出派伊尔氏淋巴集结细胞，用ELISA法测定血清中免疫球蛋白IgA含量，实验组(6μg/mL)明显高于未摄入菌体的对照组(0.5μg/mL)。给鸡饲喂酪酸菌体饲料后，测其血清中ND-HI抗体效价的变化，结果显示，摄食一周后，ND-HI滴度迅速上升。用小鼠肝癌H22株建制移植肝癌小鼠模型，灌胃丁酸梭菌做抑瘤实验，结果表明丁酸梭菌对小鼠移植肝癌具有较强的抑制作用。(4)在肠道产生益生产物。丁酸梭菌在肠道内产生淀粉酶、蛋白酶、糖苷酶、纤维素酶。特别要重要指出的是，日本学者Nakajima发现肠道中丁酸梭菌组中的菌产生内切和外切果胶的裂解酶和果胶甲基化酶，能把肠道内的果胶降解为中间产物，即寡半乳糖和4,5-不饱和二半乳糖醛酸，最终分解为挥发性短链脂肪酸-乙酸和少量丁酸及甲酸。丁酸梭菌的主要代谢产物为丁酸，其是肠道上皮组织细胞再生和修复的主要营养物质。因此，丁酸梭菌对肠道上皮组织的再生和修复有很重要的意义。(5)稳定性好。丁酸梭菌产生内生芽孢，所以能耐热、耐酸、耐胆汁、耐抗生素，在人体内不受胃酸、胆汁酸等影响，因而通过消化道不失活，并且对青霉素、氨苄西林、链霉素、庆大霉素、妥布霉素、氯霉素等有一定抗性。(6)其他功效。大量数据表明，单用丁酸梭菌或与双歧杆菌、益生元等合用，对于菌群失调而引起的急慢性腹泻、肠易激综合征、抗生素等相关性肠炎、便秘等症状有良好的疗效，对于肠炎、肝硬化和放疗造成的免疫功能下降也能起到辅助的治疗作用。

随着肠道菌群研究的不断深入，肠道菌群对健康的影响也日益明了。近10年间，以丁酸梭菌为组成成分的各类专利超过100余件，明确丁酸梭菌在预防溃疡性结肠炎的专利尚未见有公开。同时，作为益生菌，菌株的安全性和特异性需要引起高度重视。

发明内容

为了弥补已有技术缺陷，本发明提供了一种可调节肠道屏障功能、预防溃疡性结肠炎的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)RAM0216，通过DSS诱导的小鼠结肠炎模型，考察丁酸梭菌对溃疡性结肠炎的预防效果。

为实现上述目的，本发明通过以下方案予以实现：

本发明提供了一株用于预防溃疡性结肠炎的优良丁酸梭菌，该菌种已于2019年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC NO.17854。

优选地，菌株分离自松辽黑猪仔猪肠道内容物。

优选地，菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，通过BLAST数据库比对结果表明该菌株为丁酸梭菌属的菌株，并命名为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)RAM0216。

优选地，丁酸梭菌RAM0216为革兰氏阳性厌氧杆菌，其菌体大小为(0.7-1.2)×(3-6)μm，两端钝圆，中间部分轻度膨胀，单个或者成对，短链。

本发明还提供了丁酸梭菌RAM0216的培养方法，包括以下步骤：将超低温保存的菌株平板划线接种于丁酸梭菌固体培养基，37℃厌氧条件下，培养至有单菌落生成，挑取单菌落接种于丁酸梭菌液体培养基，37℃厌氧条件下，扩大培养。

优选地，液体培养基成分包括：葡萄糖3.4g、胰蛋白胨4.0g、酵母浸粉3.8g、牛肉浸膏1.5g、可溶性淀粉0.1g、氯化钠0.5g、乙酸钠0.3g、L-半胱氨酸盐酸盐0.05g、磷酸氢二钾0.2g、硫酸铵0.1g和蒸馏水100ml。

优选地，固体培养基成分包括：葡萄糖3.4g、胰蛋白胨4.0g、酵母浸粉3.8g、牛肉浸膏1.5g、琼脂1.6g、可溶性淀粉0.1g、氯化钠0.5g、乙酸钠0.3g、L-半胱氨酸盐酸盐0.05g、磷酸氢二钾0.2g、硫酸铵0.1g和蒸馏水100ml。

本发明还提供了一株用于预防溃疡性结肠炎的优良丁酸梭菌预防溃疡性结肠炎和改善肠道屏障功能的应用。

本发明利用DSS诱导的C57BL/6小鼠溃疡性结肠炎模型，通过观察模型小鼠体重丢失、腹泻、便血与疾病活动指数(Disease activity index，DAI)与小鼠解剖后比较试验各组结肠长度及测定结肠组织中相关指标，检测丁酸梭菌对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的预防效果。本发明的试验结果显示，与造模组相比，丁酸梭菌处理能有效降低小鼠体重丢失、腹泻、便血与结肠炎小鼠疾病活动指数，抑制结肠炎造成的结肠长度缩短。病理切片结果表明，丁酸梭菌处理能缓解由DSS造成的小鼠结肠结构损伤、炎性细胞浸润。qPCR实验结果表明，丁酸梭菌可以显著下调白介素-1β、白介素-6、白介素-22、肿瘤坏死因子-α与基质金属蛋白酶-3的mRNA表达水平，对白介素-10、干扰素-γ和基质金属蛋白酶-9没有影响。同时，丁酸梭菌的处理在不同程度上上调了结肠组织紧密连接相关蛋白，如：紧密连接蛋白-1、黏蛋白-2、皮细胞紧密连接蛋白-1的表达，对闭合蛋白无明显影响。由此可见，丁酸梭菌对DSS诱导的小鼠结肠炎具有良好的预防效果。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一株用于预防溃疡性结肠炎的优良丁酸梭菌,该丁酸梭菌从松辽黑猪肠道内容物中分离得到，经16S rRNA基因序列鉴定为丁酸梭菌，并命名为丁酸梭菌RAM0216，本发明通过利用DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型验证了本发明的丁酸梭菌RAM0216菌株对DSS引起的小鼠溃疡性结肠炎具有预防性效果，能够有效控制因DSS引起的体重丢失、便血和前期腹泻，降低了因DSS引起的结肠缩短，改善了因DSS引起的肠道结构损伤、炎性细胞浸润，改善了由DSS引起的紧密连接蛋白-1(Claudin-1)、闭合蛋白(Occludin)、皮细胞紧密连接蛋白-1(ZO-1)与黏蛋白-2(MUC-2)的恶性变化，使肠道屏障向好的方向发展。

附图说明

图1为丁酸梭菌RAM0216显微镜下菌体形态；

图2为丁酸梭菌RAM0216的16S rRNA基因比对结果；

图3为试验各组小鼠体征结果；

图4为试验各组小鼠结肠长度比较结果；

图5为试验各组小鼠结肠组织切片及其病理统计结果；

图6为试验各组小鼠炎症因子表达结果；

图7为试验各组小鼠肠道屏障相关基因表达结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

一株用于预防溃疡性结肠炎的优良丁酸梭菌，该菌株分离自松辽黑猪仔猪肠道内容物，经16S rRNA基因序列鉴定为丁酸梭菌，并命名为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)RAM0216，已于2019年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCCNO.17854。

丁酸梭菌RAM0216显微镜下菌体形态如图1，端圆、单个或成对、短链，偶见有丝状菌体，无荚膜。孢子卵圆，偏心或次端生，半固体穿刺培养发现菌体可运动，推断该菌有鞭毛，平板生长菌落为白色或奶油色，圆形并不十分规则，稍凸，菌体大小平均为1-3.6μm，这是梭菌的典型形态特征，其生理生化特征如表1所示。

表1菌株的生理生化特征

注：+表示结果是阳性；-表示结果是阴性；+-表示结果可疑。

该菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，通过BLAST数据库比对结果表明该菌株为丁酸梭菌属的菌株。比对结果见图2。

丁酸梭菌RAM0216的培养方法，包括以下步骤：将超低温保存的菌株平板划线接种于丁酸梭菌固体培养基，37℃厌氧条件下，培养至有单菌落生成，挑取单菌落接种于丁酸梭菌液体培养基，37℃厌氧条件下，扩大培养。

液体培养基成分包括：葡萄糖3.4g、胰蛋白胨4.0g、酵母浸粉3.8g、牛肉浸膏1.5g、可溶性淀粉0.1g、氯化钠0.5g、乙酸钠0.3g、L-半胱氨酸盐酸盐0.05g、磷酸氢二钾0.2g、硫酸铵0.1g和蒸馏水100ml。

固体培养基成分包括：葡萄糖3.4g、胰蛋白胨4.0g、酵母浸粉3.8g、牛肉浸膏1.5g、琼脂1.6g、可溶性淀粉0.1g、氯化钠0.5g、乙酸钠0.3g、L-半胱氨酸盐酸盐0.05g、磷酸氢二钾0.2g、硫酸铵0.1g和蒸馏水100ml。

丁酸梭菌RAM0216对DSS诱导的C57/BL6小鼠溃疡性结肠炎的预防应用试验

1、材料与方法

1.1试验动物：6周龄C57/BL6小鼠，雄性，体重18～20g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2试验药品：葡聚糖硫酸钠(DSS)，分子量36000-50000，购买于上海翊盛生物技术有限公司。

1.3试验菌株：丁酸梭菌RAM0216，本实验室分离自无抗生素添加的饲养环境下的松辽黑猪。具体处理方式为：仔猪断奶后，采用吉林省农科院畜牧研究所自行配制的全价饲料，饲料中不添加抗生素。为了提高仔猪的自身免疫能力，在每吨全价料中混合2kg益生菌发酵六神曲生物饲料添加剂。在此条件下饲养59天，之后进行解剖，从解剖的肠道内容物中分离得到该菌株。菌株纯化、鉴定后保存在-80超低温冰柜中。

1.4试验菌悬液的准备：保存的菌种，在丁酸梭菌固体培养基上37℃厌氧培养约48h，待长出单菌落后，挑取单菌落，接种于丁酸梭菌液体培养基中进行扩大培养，之后进行活菌计数。将菌株接种在500ml丁酸梭菌液体培养基中，厌氧条件下培养30小时，使菌数达到最大。停止发酵，离心菌液，弃去培养基，用PBS重悬菌体，并调制菌悬液活菌数达到1×10⁹cfu/mL，用于小鼠灌胃，每只小鼠灌胃体积为200μL。

1.5试验方法

1.5.1小鼠溃疡性结肠炎模型的建立

模型建立：试验小鼠进行一周的适应性喂养后，将2.5％DSS溶解于灭菌的饮用水中替代小鼠正常饮用水，小鼠自由获取，连续7天。

1.5.2实验分组

正常对照组：10只，正常健康小鼠，饮用正常灭菌水，灌胃介质为PBS。

模型组对照组：10只，2.5％DSS溶解于灭菌水中替代正常饮用水进行疾病模型建立，连续7天。建模开始后每天进行体重、腹泻、便血情况的监测，评估模型是否建立成功，灌胃介质为PBS。

丁酸梭菌组：10只，2.5％DSS进行疾病诱导的同时进行丁酸梭菌(1×10⁹cfu/mL)灌胃处理，每日一次，每只小鼠200μL灌胃量，连续7天。

1.5.3症状学观察：试验开始后每天观察小鼠的活动状态、腹泻、便血及体重丢失情况，根据严重程度，采用表2的标准进行评分，然后三者加和进行疾病活动指数的计算。

表2溃疡性结肠炎典型症状评分标准。

1.5.4结肠组织切片及其病理指标分析：结肠组织用无菌的PBS缓冲液清理干净，放入10％的福尔马林溶液中固定，之后嵌入在石蜡中作成块，在显微镜下进行组织切片，切片厚度为5μm。将切好组织固定在载玻片上，用苏木精和伊红混合染色液染色，在显微镜下观察结肠组织变化情况，包括：粘膜厚度、绒毛高度、隐窝深度、杯状细胞和炎症细胞浸润等。

1.5.5肠黏膜中炎症因子基因和肠道屏障相关基因表达分析：取肠道黏膜组织，利用RNA提取试剂盒提取总RNA，之后利用反转录试剂盒将mRNA反转录成cDNA，随后利用相关因子的特异性引物(见表3)进行定量PCR(qPCR)测定。最后根据qPCR结果分析试验各组小鼠的病理情况。

表3特异性引物

附注：参考文献

1.Della Latta,V.,Cabiati,M.,Burchielli,S.,et al.(2017)Lunginflammation after bleomycin treatment in mice:Selection of an accuratenormalization strategy for gene expression analysis in an ex-vivo and in-vitro model.Int J Biochem Cell Biol 88:145-154.

2.Gao,X.,Xie,Q.,Liu,L.,et al.(2017)Metabolic adaptation to theaqueous leaf extract ofMoringa oleifera Lam.-supplemented diet is related tothe modulation of gut microbiota in mice.Appl Microbiol Biotechnol 101:5115-5130.

3.Wu,W.R.,Lv,L.X.,Shi,D.,et al.(2017)Protective effect of Akkermansiamuciniphila against immune-mediated liver injury in a mouse model.FrontMicrobiol 8:1804.

4.Saha,B.,Momen-Heravi,F.,Furi,I.,et al.(2018)Extracellular vesiclesfrom mice with alcoholic liver disease carry a distinct protein cargo andinduce macrophage activation through heat shock protein 90.Hepatology 67:1986-2000.(Yang et al.,2018).

5.Chen,M.,Gao,L.,Chen,P.,et al.(2016)Serotonin-exacerbated DSS-induced colitisis associated with increase in MMP-3 and MMP-9 expression inthe mouse colon.Mediators Inflamm 2016:5359768.

6.Cresci,G.A.,Glueck,B.,McMullen,M.R.,et al.(2017)Prophylactictributyrin treatment mitigates chronic-binge ethanol-induced intestinalbarrier and liver injury.J Gastroenterol Hepatol 32:1587-1597.

2结果与分析

2.1溃疡性结肠炎症状比较

试验各组小鼠体征结果见图3。与对照组相比，造模组小鼠在DSS疾病诱导的第三天开始出现体重降低，出现腹泻与粪便潜血症状，在第5天，造模组小鼠出现水样便，直肠严重出血，小鼠活动状态极度萎靡，体重丢失严重，DAI显著高于对照组。这些结果说明溃疡性结肠炎小鼠建模成功。与造模组相比，丁酸梭菌RAM0216处理显著控制了DSS诱导溃疡性结肠炎所引起的体重丢失、腹泻、便血及DAI情况。

2.2结肠长度及其病理结果分析

解剖后对试验各组小鼠结肠长度及其病理情况进行了比较分析。图4是试验各组小鼠结肠长度的照片。与对照组相比造模组结肠长度明显缩短，而丁酸梭菌RAM0216处理显著改善这种病变引起的缩短。图5是试验各组小鼠结肠组织切片及其病理统计结果。与造模组相比，丁酸梭菌RAM0216处理明显控制了肠道结构的损伤和炎性细胞浸润。

2.3肠道组织中相关炎性因子比较分析

小鼠处死后，取小鼠结肠组织进行mRNA的提取，反转录为cDNA。通过q-PCR定量结肠组织炎性细胞因子白介素1β、白介素6、白介素10、白介素22、肿瘤坏死因子α、干扰素γ、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶9的表达水平。图6是各组小鼠炎症因子表达结果。与对照组相比，造模组显著调高了白介素1β、白介素6、白介素22、肿瘤坏死因子α、干扰素γ、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶9的表达水平；显著抑制了白介素10的表达水平。而丁酸梭菌RAM0216处理显著抑制了白介素1β、白介素6、白介素22、肿瘤坏死因子α和基质金属蛋白酶3的表达水平；而对白介素10、干扰素γ和基质金属蛋白酶9没有表现出显著的影响。这一结果说明丁酸梭菌RAM0216对DSS引起的肠炎的调节作用是通过调控白介素1β、白介素6、白介素22、肿瘤坏死因子α和基质金属蛋白酶3的表达完成的。

2.4肠道屏障功能比较分析

图7是肠道屏障相关基因表达结果。与对照组相比，造模组破坏了肠道屏障相关基因的表达，而丁酸梭菌RAM0216的给予使这种表达向对照组方向发展，特别是皮细胞紧密连接蛋白-1和黏蛋白-2的表达水平较对照组有提高，这说明丁酸梭菌RAM0216不仅对DSS造成的肠道屏障损伤起到了保护作用，同时还具有一定的修复作用。

3丁酸梭菌RAM0216对溃疡性结肠炎效果评价

通过利用DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型验证了本发明的丁酸梭菌RAM0216菌株对DSS引起的小鼠溃疡性结肠炎具有预防性效果。每天灌胃200μL丁酸梭菌RAM0216菌悬液(菌数为1×10⁹cfu/mL)，能够有效控制因DSS引起的体重丢失、便血和前期腹泻；降低了因DSS引起的结肠缩短；改善了因DSS引起的肠道结构损伤、炎性细胞浸润；改善了由DSS引起的紧密连接蛋白-1(Claudin-1)、闭合蛋白(Occludin)、皮细胞紧密连接蛋白-1(ZO-1)与黏蛋白-2(MUC-2)的恶性变化，使肠道屏障向好的方向发展。相关炎症因子表达结果表明，丁酸梭菌RAM0216处理下调了白介素1β、白介素6、白介素22、肿瘤坏死因子α和基质金属蛋白酶3的表达水平，控制了因DSS引起的小鼠炎症的发展。由此可见，丁酸梭菌RAM0216对DSS诱导的小鼠结肠炎具有良好的预防和治疗效果。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

SEQ ID NO.1

<210> 1

<211> 1477

<212> DNA

<213> 丁酸梭菌RAM0216（Clostridium butyricum RAM0216）

<400> 1

agagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgagc 60

gatgaagctccttcgggagtggattagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctg 120

cctcatagaggggaatagcctttcgaaaggaagattaataccgcataagattgtagtacc 180

gcatggtacagcaattaaaggagtaatccgctatgagatggacccgcgtcgcattagcta 240

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acgatgaatactaggtgtaggggttgtcatgacctctgtgccgccgctaacgcattaagt 840

attccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaagggaattgacgggggcccgca 900

caagcagcggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttacctagacttgac 960

atctcctgaattactctgtaatggaggaagccacttcggtggcaggaagacaggtggtgc 1020

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aggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgtctagggctacacacgtgct 1200

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Claims (8)

1.一株用于预防溃疡性结肠炎的优良丁酸梭菌，其特征在于，该菌株已于2019年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.17854。

2.根据权利要求1所述的用于预防溃疡性结肠炎的优良丁酸梭菌，其特征在于，所述菌株分离自松辽黑猪仔猪肠道内容物。

3.根据权利要求1所述的用于预防溃疡性结肠炎的优良丁酸梭菌，其特征在于，所述菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，通过BLAST数据库比对结果表明该菌株为丁酸梭菌属的菌株，并命名为丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)RAM0216。

4.根据权利要求1所述的用于预防溃疡性结肠炎的优良丁酸梭菌，其特征在于，所述菌株为革兰氏阳性厌氧杆菌，其菌体大小为(0.7-1.2)×(3-6)μm，两端钝圆，中间部分轻度膨胀，单个或者成对，短链。

5.根据权利要求1所述的用于预防溃疡性结肠炎的优良丁酸梭菌，其特征在于，所述菌株的培养方法包括以下步骤：将超低温保存的菌株平板划线接种于丁酸梭菌固体培养基，37℃厌氧条件下培养至有单菌落生成，挑取单菌落接种于丁酸梭菌液体培养基，37℃厌氧条件下，扩大培养。

6.根据权利要求5所述的用于预防溃疡性结肠炎的优良丁酸梭菌，其特征在于，所述液体培养基成分包括：葡萄糖3.4g、胰蛋白胨4.0g、酵母浸粉3.8g、牛肉浸膏1.5g、可溶性淀粉0.1g、氯化钠0.5g、乙酸钠0.3g、L-半胱氨酸盐酸盐0.05g、磷酸氢二钾0.2g、硫酸铵0.1g和蒸馏水100ml。

7.根据权利要求5所述的用于预防溃疡性结肠炎的优良丁酸梭菌，其特征在于，所述固体培养基成分包括：葡萄糖3.4g、胰蛋白胨4.0g、酵母浸粉3.8g、牛肉浸膏1.5g、琼脂1.6g、可溶性淀粉0.1g、氯化钠0.5g、乙酸钠0.3g、L-半胱氨酸盐酸盐0.05g、磷酸氢二钾0.2g、硫酸铵0.1g和蒸馏水100ml。

8.根据权利要求1-4任意一项所述的用于预防溃疡性结肠炎的优良丁酸梭菌预防溃疡性结肠炎和改善肠道屏障功能的应用。