CN115094010A - 一种高产甲酸丁酸梭菌 - Google Patents

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Abstract

本发明基于公开了一种高产甲酸丁酸梭菌(Clostridium butyricum)HZNDC‑1，从牛肠道分离得到，保藏编号为：CCTCC：NO：M2021874。本发明验证了丁酸梭菌HZNDC‑1产甲酸，且通过发酵试验出HZNDC‑1较之其他菌株具备高产甲酸性能。该丁酸梭菌HZNDC‑1还可通过液体发酵获得高含甲酸的发酵产物。该菌株及其发酵产物在饲料添加剂应用方面具有很大的潜力。

Description

一种高产甲酸丁酸梭菌
技术领域
本发明属于微生物学，微生物发酵技术领域，具体涉及一种高产甲酸的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)HZNDC-1。
背景技术
丁酸梭菌又称丁酸梭状芽孢杆菌，是一种专性厌氧的革兰氏阳性菌，细菌可生成芽孢，即将产生芽孢时，菌体中间膨大成梭状，且由于其主要代谢产物为丁酸，故名丁酸梭菌。由于其为厌氧芽孢杆菌，对于胃酸、胆汁酸、多种饲用抗生素有较强的耐受性，适用面广。
甲酸在促进畜禽消化，杀灭病原微生物,维持肠道稳态方面有重要功能。现行业中，就有在饲粮中添加甲酸类酸制剂显著提高胃蛋白酶和淀粉酶活性，促进植物蛋白和淀粉消化的作用的实例。甲酸类酸制剂提高营养物质的消化利用率的主要机理包括：激活胃蛋白酶原，为胃蛋白酶提供适宜的pH环境，使植物蛋白和淀粉变性，提高内源酶活性。同时甲酸对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等病原菌有较强的抑制作用。有研究表明，甲酸类有机酸制剂可促进肠道发育，进而提高营养物质利用率。
而甲酸在前肠端易被胆汁等消化液中和失去其效果，丁酸梭菌作为后肠定植菌，若其高产甲酸可对维护调理后肠健康，提高营养物质利用率有重大贡献，将对养殖端提供很大帮助。
本发明人查阅相关专利及文献，发现例中国专利CN108456698A中只提及甲酸、乙酸、丁酸是丁酸梭菌代谢副产物，并未提及具体产甲酸能力。鉴于此，本发明人验证了丁酸梭菌HZNDC-1产甲酸，且通过相应发酵方法试验出 HZNDC-1较之其他菌株具备高产甲酸性能。
发明内容
本发明的一个目的在于提供了一株具备高产甲酸能力的丁酸梭菌菌株。
该菌株从牛肠道分离得到，于2021年7月13日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名为：丁酸梭菌(Clostridium butyricum)HZNDC-1，保藏编号为：CCTCC：NO：M2021874，地址：中国湖北武汉武汉大学。
HZNDC-1菌株具有典型丁酸梭菌的生理生化特征：菌体形态呈杆状，产芽孢；菌落在TSC固体培养基上呈黑色圆形菌落，略有酸臭味；菌体革兰染色为阳性；严格厌氧，耐热，80℃加热10min不影响芽孢活力；对抗菌素卡那霉素有耐药性；能利用葡萄糖；液体培养时，前期产生大量的气体，后期产生较多菌体沉淀。
附图说明
图1丁酸梭菌HZNDC-1菌株的菌落和显微形态。
图2丁酸梭菌HZNDC-1菌株16s序列
具体实施方式
实施例1：
高产甲酸丁酸梭菌HZNDC-1菌株的筛选、纯培养、及鉴定。
1)固体培养基配制：成品TSC培养基；液体培养基配制：牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母浸粉5g，葡萄糖5g，乙酸钠0.1-1.0g，丁酸钠0.1-1.0g，蒸馏水 1000ml，ph7±0.2，115℃，20min灭菌备用。
2)培养步骤：
(1)将采集的动物原生肠道内容物用蒸馏水制成悬浊液，置于80℃水浴 10min杀死绝大多数非芽孢菌，经平板划线接种到固体培养基，置于厌氧工作站 E200G，37℃厌氧培养24h。
(2)待长出菌落，挑单菌落，接种到含20mL液体培养基的PA瓶中，放置于厌氧工作站E200G中，37℃厌氧培养24h。
(3)取菌样进行革兰氏染色和显微观察、负染电镜观察、PCR检测，选择检测结果均符合丁酸梭菌特征的单一菌落，挑取厌氧生长优势明显的菌落再进行分离和纯培养。
(4)获得的菌株HZNDC-1为革兰氏阳性芽孢杆菌，能形成黑色圆形菌落，菌体大小约为0.8～1.4×4～8μm，两端钝圆，呈直杆状或稍弯曲，单个或成对。
(5)据NCBI中丁酸梭菌16srDNA序列设计引物 27F:GTCGAGCGATGAAGCTCCTT；1492R:TCCCTTTACGCCCAGTAAATC，再进行PCR测试，得到一条1046bp的片段。进一步对该扩增片段进行测序分析，并与丁酸梭菌典型株16srDNA进行比对。结果显示HZNDC-1菌株与丁酸梭菌典型株同源性高达98％。因此鉴定HZNDC-1菌株为丁酸梭菌。
3)鉴定步骤：
基于申请号为：201810202334.5，名称为：一种基于丁酸梭菌的1，3—丙二醇和乳酸联产的发酵生产方法的发明专利，测试确认HZNDC-1具备产甲酸能力。
实施例2：
对高产甲酸丁酸梭菌HZNDC-1的液体发酵。
1)固体培养基配制：成品TSC培养基；液体培养基配制：牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母浸粉5g，葡萄糖5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，ph7±0.2，115℃， 20min灭菌备用。
2)挑单菌落培养：将平板上的丁酸梭菌HZNDC-1用枪头沾取，接种到20ml 液体培养基中，37℃厌氧培养24h，获得单菌落培养液。
3)扩大培养：取2ml活化菌液置于含有300ml液体培养基锥形瓶中悬浮， ph7±0.2，37℃厌氧培养24h，得到含菌量108cfu/mL的菌液。
4)将上述得到的菌液以2％接种量接种于发酵培养基中发酵。完成发酵后得到丁酸梭菌发酵液。
不同丁酸梭菌菌株发酵后的产甲酸差异比对，结果如下：
菌株名称 甲酸含量(g/L) 乙酸含量(g/L) 丁酸含量(g/L)
HZNDC-1 5.85±0.687 16.77±1.346 26.33±1.253
HZJND5 0.45±0.041** 8.32±0.654** 13.45±1.229**
HZJND17 0.33±0.028** 9.79±0.832** 12.93±0.498**
HZNJD13 0.92±0.146** 11.28±1.129** 13.76±0.668**
HZBTY19 0.75±0.185** 10.44±0.602** 11.68±0.592**
HZZBD3 1.81±0.381* 13.16±0.886* 18.42±1.512*
HZZBD6 1.53±0.335* 11.67±0.973** 16.14±1.105**
HZBTY7 0.65±0.092** 7.42±0.569** 10.95±0.948**
如上表所示，通过HZNDC-1与其他丁酸梭菌菌株在该发酵体系下产酸结果比较，HZNDC-1相较其他菌株产酸结果显著差异，HZNDC-1产甲酸能力是其他菌株的3.2-17.8倍。

Claims (1)

1.一种高产甲酸丁酸梭菌，其特征在于，所述高产甲酸丁酸梭菌为从牛肠道分离得到的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)HZNDC1，保藏编号为：CCTCC：NO：M 2021874。
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