CN112358986A - 一种丁酸梭菌及其在固定化发酵生产 1，3-丙二醇的应用 - Google Patents

一种丁酸梭菌及其在固定化发酵生产 1，3-丙二醇的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种丁酸梭菌及其在固定化发酵生产1,3‑丙二醇中的应用，该菌为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)SCUT343‑4，于2019年10月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60805。该菌能直接将纯甘油或者粗甘油转化为1,3‑丙二醇，有较高的底物转化率和底物耐受性，副产物种类和含量少，有利于后续产品分离纯化；该菌对底物粗甘油的耐受性最为突出，以粗甘油发酵时转化率和生产效率并未降低，有利于粗甘油的加工与利用并显著降低1，3‑丙二醇的生产成本。该菌在固定化发酵生产1,3‑丙二醇中应用，能够显著提高其生产效率，达到4.20g/L·h。

Description

一种丁酸梭菌及其在固定化发酵生产 1，3-丙二醇的应用
技术领域
本发明属于生物工程发酵技术领域，具体涉及一种高产1，3-丙二醇的丁酸梭菌及固定化发酵方法。
背景技术
1,3-丙二醇(1,3-propanediol)，分子式为C3H8O2，作为重要的化工原料被在广泛应用于制药、食品、化妆品及纺织等多个行业。目前工业化生产多采用化学合成法，成熟路线分别为(1)杜邦公司：丙烯醛路线，即丙烯醛通过水合作用转化为3-羟基丙醛(3-HPA)，然后加氢生成1,3-丙二醇；(2)皇家壳牌石油公司：环氧乙烷路线，即环氧乙烷氢甲酰化法制备3-羟基丙醛，然后加氢生成1,3-丙二醇。但是以上两种化学路径不仅技术难度大，设备投资高，更重要的是污染和能耗大，不符合绿色可持续发展需求。微生物发酵法产1,3- 丙二醇由于其操作过程简便、反应条件温和、环境污染小等特点受到越来越多的关注。[Sun YQet al.Advances in bioconversion of glycerol to 1,3-propanediol:prospects andchallenges. Process Biochemistry,2018,71:134-146]。
目前成熟的生物转化方法有两种：(1)一步法：其一为杜邦和杰能科共同开发的重组大肠杆菌葡萄糖转化法，该方法是将来自三种不同微生物的酶基因组合到大肠杆菌中获得基因工程菌株，在美国伊利诺依州Tate&Lyle公司建有中试工厂，规模为45.4t/a，但该基因工程菌发酵依赖维生素B12，导致成本太高，同时也存在专利垄断问题[Emptage MandHaynie S.Process for the biological production of 1,3-propanediol with hightiter.
2006.CA2733616]；其二是通过对一些天然微生物的诱变、驯化和适当的基因工程改造，一步法从甘油直接转化为1,3-丙二醇，菌株包括巴氏芽孢梭菌(Clostridiumpasteurianum)、克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)和罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)等[Saxena RK etal.Microbial production of 1,3-propanediol: Recent developments and emergingopportunities.Biotechnol Adv.2009,27(6):895-913]。(2)两步法：即先利用一种菌将葡萄糖转化为甘油，然后用另一种菌将甘油进一步转化为PDO，如清华大学刘德华教授等提出了先用耐高渗酵母转化葡萄糖为甘油然后用克雷伯氏肺炎杆菌转化甘油(以葡萄糖作为辅助底物)为PDO的二步偶联连发酵工艺。[韩克星.1,3-丙二醇生产工艺的对比及选择.工艺设备,2019,45(8):64-66]。但无论一步法或两步法，发酵产1,3- 丙二醇均存在转化率和生产效率低，副产物种类多和含量高等缺点。
丁酸梭菌(Clostridium butyricum)是一种专性厌氧的革兰氏阳性菌，其特点是转化率高，副产物简单，无致病性且不产2,3-丁二醇，适合作为发酵法产1,3-丙二醇的生物底盘细胞。但该菌最大局限在于严格厌氧条件下细胞生长缓慢从而导致其生产强度低，并且细胞对底物甘油耐受性偏低，特别是廉价底物粗甘油对发酵的抑制作用明显。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一株可高效利用甘油生产1,3-丙二醇的丁酸梭菌菌株，其底物转化率高，副产物种类和含量少，对底物甘油的耐受性好。并将纤维床(Fibrous-bed bioreactor，FBB)固定化发酵应用于1,3-丙二醇，实现菌体与底物和产物的分离，增强发酵菌株的鲁棒性，提高底物转化率和生产效率。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种丁酸梭菌，该菌为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)SCUT343-4，于2019年10月12 日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60805。
所述丁酸梭菌在固定化发酵生产1,3-丙二醇中应用，以纯甘油或粗甘油为底物。
所述丁酸梭菌(Clostridium butyricum)SCUT343-4进行发酵，当所述丁酸梭菌处于指数生长期时，菌体在固定化反应器中固定化后即进行发酵产1,3-丙二醇。具体包括如下步骤：
(1)菌种活化：将丁酸梭菌SCUT343-4菌液稀释后，涂布于固体活化培养基，35～37℃培养16～24h，挑取单菌落接种于种子培养基中，37±2℃静置厌氧培养16～24h，至OD600为1.2～1.8；
(2)种子培养；取丁酸梭菌SCUT343-4活化菌液接种于种子培养基中，35～37℃静置厌氧培养10～13h，至OD600为1.2～1.8；
(3)细胞固定化：将种子液按照发酵液体积的10±5％接入发酵罐中进行发酵；待发酵罐中OD600达到5时，连通发酵罐和固定化反应器，将发酵罐内菌液泵入固定化反应器中进行细胞固定化，待循环菌液OD稳定后，细胞固定化过程结束；
(4)固定化发酵：将灭菌后的新鲜发酵培养基泵入固定化反应器中，通氮气除氧，再将发酵罐内菌液泵入固定化反应器中，进行发酵；当甘油剩余浓度4～8g/L时，抽出发酵培养基，即完成一个批次发酵；更换新鲜发酵培养基后继续固定化发酵，进行固定化反复批次发酵。
优选地，所述发酵培养基(/L)：纯甘油或粗甘油(工业纯甘油或生物柴油废弃物)60～120g；酵母粉5～10g；K2PO4·3H2O 1～2g；KH2PO4 0.5～1g；(NH4)2SO4 2～5g；MgSO4·7H2O 0.2～0.5g；CaCl2 0.02～0.05g；丁酸梭菌微量元素液1ml/L；丁酸梭菌Fe溶液1ml/L。优选地，所述菌种活化培养基(/L)：胰蛋白胨8～10g；牛肉膏8～10g；葡萄糖4～5.5g；氯化钠3～5g；酵母粉2～3g；乙酸钠2～3g；可溶性淀粉0.5～1g；L-半胱胺酸盐酸盐 0.2～0.5g。
所述种子培养基(/L)：纯甘油20～30g；酵母提取物1～2g；三水合K2PO4·3H2O 4.5～6g； KH2PO4 1.4～3g；(NH4)2SO4 2～5g；MgSO4·7H2O 0.2～0.05g；CaCl2 0.02～0.05g；丁酸梭菌微量元素液1ml/L；丁酸梭菌Fe溶液1ml/L。
优选地，所述丁酸梭菌微量元素液(/L)：CoCl2·6H2O 0.2～0.3g；MnCl2·4H2O0.1～0.2g； ZnCl2 0.07～0.1g；H3BO3 0.06～0.1g；Na2MoO4·2H2O 0.035～0.07g；NiCl2·6H2O 0.025～0.05g； CuCl2·2H2O0.02g；HCl(37％)0.9～1.2mL。
优选地，所述丁酸梭菌Fe溶液(/L)：FeSO4·7H2O 4～6g；HCl(37％)4.0～5.0mL。
优选地，所述发酵培养基中甘油或粗甘油的浓度为80±10g/L。
优选地，所述发酵条件为：35～37℃，时间24～80h，pH 6.5～7.0，摇瓶转速120～150rpm。
优选地，所述固定化反应器为纤维床反应器。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
所筛选的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)SCUT343-4直接将甘油或粗甘油转化成1,3- 丙二醇，相对于其他相似菌株，具如下优势：(1)底物转化率高，达0.55g/g(约为理论转化率的90％)，已有文献及专利所报道的为～0.50g/g；(2)副产物种类和含量少(副产物只存在乙酸和丁酸，且有明显的乙酸重吸收过程)，有利于后续产品分离纯化；(3)较强的高浓度甘油耐受性，能够在高达120g/L甘油浓度下进行发酵且利用完全，最高能够耐受浓度为200g/L的甘油；(4)较强的粗甘油耐受性，在转化率与生产效率方面与纯甘油发酵相比无差异，有利于粗甘油的加工与利用并显著降低1，3-丙二醇的生产成本。此外本发明还提供了丁酸梭菌纤维床固定化发酵产1,3-丙二醇的方法，大大缩短发酵周期，提高了生产效率，生产效率为4.20g/(L·h)，为目前文献报道的最高水平。
本发明丁酸梭菌(Clostridium butyricum)SCUT343-4，于2019年10月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC NO：60805。
附图说明
图1丁酸梭菌SCUT343-4菌落形态图。
图2丁酸梭菌SCUT343-4细胞形态图。
图3丁酸梭菌SCUT343-4系统发育树。
图4丁酸梭菌SCUT343-4产物鉴定(b)与标准样品(a)HPLC峰图。
图5丁酸梭菌SCUT343-4底物甘油耐受性测试(240g/L未见任何生长，所以该列比生长速率值为0)。
图6丁酸梭菌SCUT343-4在不同浓度纯甘油与粗甘油下比生长速率对比。
图7丁酸梭菌SCUT343-4在不同浓度纯甘油与粗甘油下转化率和生产强度对比。
图8丁酸梭菌SCUT343-4游离细胞反复批次补料发酵曲线。
图9丁酸梭菌SCUT343-4细胞固定化反复批次发酵曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
实施例1、丁酸梭菌分离筛选
筛选方法：将采集水样直接5ml注射到45ml富集培养基中(富集培养基组成：A液41ml，成分为葡萄糖10g/L；B液1ml，成分为柠檬酸三钾盐100g/L、一水合柠檬酸62.5g/L、Na2SO450g/L、KH2PO450g/L、NaHCO3125g/L；C液1ml，成分为尿素250g/L、NH4Cl75g/L、酵母提取物50g/L；D液1ml，成分为半胱氨酸盐酸盐50g/L、MgCl2·6H2O50g/L、 CaCl2·2H2O10g/L、FeCl2·4H2O5g/L；E液1ml，成分为盐酸吡哆胺1g/L、对氨基苯甲酸0.2g/L、 Biotin0.1g/L、维生素B12 0.2g/L、维生素B1 0.2g/L)，37℃培养2～4天，将培养液稀释到 10-3，涂布于筛选平板(共600ml，其中A液450ml，成分为3g葡萄糖、9g琼脂和0.079g CaCl2·2H2O。B液60ml，成分为K2HPO4·3H2O 1.42g；KH2PO4 0.858g；Na-β-甘油磷酸盐 5.1g。C液30ml，成分为酵母提取物3g。D液60ml，成分为(NH4)2SO4 0.78g；FeSO4·7H2O 0.0056g；MgCl2·6H2O 1.56g；半胱氨酸盐酸盐0.3g。)，37℃厌氧培养2～4天即可形成菌落，挑取单菌落到RCM培养基(胰蛋白胨10g/L；牛肉膏10g/L；葡萄糖5.5g/L；氯化钠 5g/L；酵母粉3g/L；乙酸钠3g/L；可溶性淀粉1g/L；L-半胱胺酸盐酸盐0.5g/L)，37℃厌氧培养24h后取少量样品进行革兰氏染色镜检观察，挑选革兰氏染色为阳性，显微形态为杆状且有芽孢的菌株进行后续16S rDNA序列菌种鉴定和代谢特征鉴定。
实施例2、菌种鉴定
将上述菌株进行细胞形态鉴定、16SrRNA鉴定、菌落形态鉴定和以甘油为底物的发酵产物鉴定
一、菌株细胞形态鉴定
挑取实施例1中分离得到的单菌落，接种于含有富集培养基中的离心管中，37℃厌氧培养24h后取少量菌液进行革兰氏染色镜检观察。革兰氏染色试验：
(1)染色：取适量菌滴加到载玻片上，通过火焰4～6次固定，滴加草酸铵结晶紫液，染于固定过的涂片染色1min。
(2)水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。
(3)媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。
(4)脱色：吸去残留水，连续滴加95％乙醇脱色20～30s至流出液无紫色，立即水洗。
(5)吸去残留水，连续滴加95％乙醇脱色20～30s至流出液无紫色，立即水洗。
通过革兰氏染色镜检观察(图1)，参照《Bergey’s Manual of SystematicBacteriology》(第二版)，梭菌属形态特征描述，筛选相似菌株进行后续16S rDNA基因序列分析鉴定。
二、菌落形态鉴定
将富集后的SCUT343-4菌株的培养液稀释10-3后涂布到实施例1中的筛选平板上，37℃培养16h后观察。该菌株菌落凸起成圆形，表面光滑，边缘不整齐，白色或乳白色(图2)。
符合《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》(第二版)Clostridiumbutyricum菌落形态特征描述。
三、菌株的16SrRNA鉴定
所筛选菌株SCUT343-4的16SrRNA如附录中序列SEQ ID NO：1所示，其序列长度为1448bp。通过NCBI上的Blast工具在16SrRNA数据库进行比对，与其他丁酸梭菌的同源性可达到99％，从进化树(图3)上看该菌与Clostridium butyricum菌种同源性最高。
四、丁酸梭菌以甘油为底物的发酵产物测定
菌种活化，丁酸梭菌SCUT343-4菌液稀释后，涂布于固体活化RCM培养基，37℃培养24h，挑取单菌落接种于种子培养基中，37℃静置厌氧培养24h，至OD600为1.5。
菌种活化培养基(/L)：胰蛋白胨10g；牛肉膏10g；葡萄糖5.5g；氯化钠5g；酵母粉3g；乙酸钠3g；可溶性淀粉1g；L-半胱胺酸盐酸盐0.5g。
丁酸梭菌甘油种子培养基(/L)：纯甘油30g；酵母提取物1g；K2PO4·3H2O 4.5g；KH2PO41.4g；(NH4)2SO4 2g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl2 0.02g；丁酸梭菌微量元素液1ml/L；丁酸梭菌Fe溶液1ml/L。
将活化的菌液接入上述50ml丁酸梭菌甘油种子培养基，37℃静置培养培养10h后，待OD为1.5，取4ml菌液接入新的50ml丁酸梭菌甘油种子培养基，发酵培养24h后按照 HPLC要求制备检测样品(1.8ml样品+0.2ml稀硫酸)检测。同时也用HPLC级1,3-丙二醇、甘油、甲酸、乳酸、乙酸和丁酸制备标准对照样品(图4)，确定SCUT343-3摇瓶发酵甘油的产物为1,3丙二醇和丁酸，与其他菌株对比，符合丁酸梭菌发酵甘油后的产物情况。
实施例3、丁酸梭菌对底物甘油的耐受性测试
种子液准备：按照实施例2中描述准备发酵液，静置培养10h后，待OD1.5即接种至100ml摇瓶中。
发酵培养基(/L)：分别添加约40g，80g，120g，160g，200g，240g纯甘油；酵母粉5g；K2PO4·3H2O1g；KH2PO40.5g；(NH4)2SO4 2g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl2 0.02g；丁酸梭菌微量元素液1ml/L；丁酸梭菌Fe溶液1ml/L。
摇瓶培养：在37℃，将上述种子液按发酵体积的10％接入到摇瓶中，发酵体积为50ml，静置培养，每隔约1h取一次样，测试底物耐受性(图5)。
实施例4、丁酸梭菌的游离细胞单批次发酵
种子液准备：按照实施例2中描述准备发酵液，静置培养10h后，待OD1.5即接种至5L发酵罐中。
发酵培养基(/L)：约60g，80g，100g，120g纯甘油或60g，80g，100g，120g粗甘油(甘油70.02％wt，水份9.85％wt，硫酸盐灰分11％wt，非甘油有机质MONG8.13％wt，甲醇1％wt)；酵母粉5g；K2PO4·3H2O1g；KH2PO40.5g；(NH4)2SO4 2g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl2 0.02g；丁酸梭菌微量元素液1ml/L；丁酸梭菌Fe溶液1ml/L。
发酵罐培养：在37℃、150rpm、氮气，将上述种子液按发酵体积的10％接入到发酵罐中，发酵体积为1L，用4M NaOH控制pH至6.5，每4h取样，用HPLC对发酵产物进行检测，不同浓度梯度纯甘油与粗甘油下，比生长速率对比(图6)，转化率和生产强度对比 (图7)。
发酵结果见表1。
表1不同底物下Clostridium butyricum SCUT343-4发酵表现
Figure BDA0002767752050000061
Figure BDA0002767752050000071
实施例5、游离菌的流加补料分批发酵
种子液准备同实施例4。
发酵培养基：其中初始纯甘油60g/L，其他同实施例3。
补料培养基：灭菌后的纯甘油。
发酵罐培养：补料前培养与实施例3相同，待罐中甘油浓度降至25g/L时打开蠕动泵以0.4rpm开始补料(0.13g甘油/min)，直到甘油消耗速率明显下降时停止补料，待pH明显上升且OD明显下降时终止发酵，发酵曲线如图8所示。
发酵结果：共消耗甘油112.44g/L，发酵得59.15g/L 1,3-丙二醇，14.22g/L丁酸，2.91g/L 乙酸，1,3-丙二醇转化率为0.53g/g，生产效率为2.11g/L·h。
实施例6、丁酸梭菌固定化反复批次发酵实验
种子液准备同实施例4。
发酵培养基：其中初始纯甘油浓度为60g/L；其他同实施例3。
补料培养基：灭菌后的纯甘油。
菌种固定化过程：固定化反应器选用纤维床反应器，发酵培养基115℃灭菌，通氮气除氧，将种子液按照发酵体积的10％接入到普通搅拌式发酵罐中，4M NaOH控制pH至6.5。待OD至6左右，打开蠕动泵以30ml/min的速度将罐内菌液泵入纤维床反应器当中进行菌种固定化。待游离罐中的菌液OD稳定不变后，固定化过程结束。整个过程中，当罐内甘油浓度达到20g/L左右时，打开蠕动泵，调整转速，使甘油浓度维持在15～40g/L左右。
固定化发酵：发酵培养基115℃灭菌，使用蠕动泵将新鲜培养基泵入发酵罐中，通氮气除氧20分钟，打开蠕动泵以80ml/min的速度将罐内菌液泵入纤维床反应器当中，进行发酵，发酵条件为37℃，时间24h，pH 6.5，摇瓶转速150rpm。当补碱速率下降时(甘油剩余浓度4～8g/L时)，抽出培养基，即完成一个批次发酵；更换新鲜培养基后继续固定化发酵，无需再次接种，即为固定化反复批次发酵研究(图9)。整个过程中，当罐内甘油浓度达到20g/L左右时，打开蠕动泵，调整转速，使甘油浓度维持在15～40g/L。发酵结果见表2，第1，2和3循环的为纤维床固定化过程，第4，5，6，7和8循环为纤维床固定化发酵过程。
表2 Clostridium butyricum SCUT343-4固定化多批次发酵结果
Figure BDA0002767752050000081
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种丁酸梭菌及其在固定化发酵生产1,3-丙二醇的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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1 5 10 15
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20 25 30
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Cys Gly Gly Cys Thr Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Gly Cys Gly Ala
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1425 1430 1435 1440
Gly Thr Gly Thr Ala Ala Ala Cys
1445

Claims (10)

1.一种丁酸梭菌，其特征在于，该菌为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)SCUT343-4，于2019年10月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60805。
2.权利要求1所述丁酸梭菌在固定化发酵生产1,3-丙二醇中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述丁酸梭菌(Clostridium butyricum)SCUT343-4进行发酵，当所述丁酸梭菌处于指数生长期时，菌体在固定化反应器中固定化后即进行发酵产1,3-丙二醇。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)菌种活化：将丁酸梭菌SCUT343-4菌液稀释后，涂布于固体活化培养基，35～37℃培养16～24h，挑取单菌落接种于种子培养基中，37±2℃静置厌氧培养16～24h，至OD600为1.2～1.8；
(2)种子培养；取丁酸梭菌SCUT343-4活化菌液接种于种子培养基中，35～37℃静置厌氧培养10～13h，至OD600为1.2～1.8；
(3)细胞固定化：将种子液按照发酵液体积的10±5％接入发酵罐中进行发酵；待发酵罐中OD600达到5时，连通发酵罐和固定化反应器，将发酵罐内菌液泵入固定化反应器中进行细胞固定化，待循环菌液OD稳定后，细胞固定化过程结束；
(4)固定化发酵：将灭菌后的新鲜发酵培养基泵入固定化反应器中，通氮气除氧，再将发酵罐内菌液泵入固定化反应器中，进行发酵；当甘油剩余浓度4～8g/L时，抽出发酵培养基，即完成一个批次发酵；更换新鲜发酵培养基后继续固定化发酵，进行固定化反复批次发酵。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基(/L)：纯甘油或粗甘油60～120g；酵母粉5～10g；K2PO4·3H2O 1～2g；KH2PO4 0.5～1g；(NH4)2SO4 2～5g；MgSO4·7H2O0.2～0.5g；CaCl2 0.02～0.05g；丁酸梭菌微量元素液1ml/L；丁酸梭菌Fe溶液1ml/L。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，
所述菌种活化培养基(/L)：胰蛋白胨8～10g；牛肉膏8～10g；葡萄糖4～5.5g；氯化钠3～5g；酵母粉2～3g；乙酸钠2～3g；可溶性淀粉0.5～1g；L-半胱胺酸盐酸盐0.2～0.5g；
所述种子培养基(/L)：纯甘油20～30g；酵母提取物1～2g；三水合K2PO4·3H2O 4.5～6g；KH2PO4 1.4～3g；(NH4)2SO4 2～5g；MgSO4·7H2O 0.2～0.05g；CaCl2 0.02～0.05g；丁酸梭菌微量元素液1ml/L；丁酸梭菌Fe溶液1ml/L。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述丁酸梭菌微量元素液(/L)：CoCl2·6H2O 0.2～0.3g；MnCl2·4H2O 0.1～0.2g；ZnCl2 0.07～0.1g；H3BO3 0.06～0.1g；Na2MoO4·2H2O 0.035～0.07g；NiCl2·6H2O 0.025～0.05g；CuCl2·2H2O0.02g；HCl(37％)0.9～1.2mL；所述丁酸梭菌Fe溶液(/L)：FeSO4·7H2O 4～6g；HCl(37％)4.0～5.0mL。
8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基中甘油或粗甘油的浓度为80±10g/L。
9.根据权利要求2或3或4或5或6所述的应用，其特征在于，所述发酵条件为：35～37℃，时间24～80h，pH 6.5～7.0，摇瓶转速120～150rpm。
10.根据权利要求4或5或6所述的应用，其特征在于，所述固定化反应器为纤维床反应器。
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