CN102952745A - 一种双菌固定化厌氧发酵生产丁醇的装置和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双菌固定化厌氧发酵生产丁醇的装置和方法，包括依次由管路串联的发酵培养基储罐、产丁酸固定化反应器A、产丁醇固定化反应器C和产物收集罐。将产丁酸和产丁醇的厌氧菌分别固定于固定化反应器A、C中，即双菌固定化；然后控制发酵培养基从培养基储罐流出，依次流经固定化反应器A、C进行连续厌氧发酵，最后流入产物收集罐即可。产丁酸厌氧菌首先利用底物生产丁酸，然后产丁醇厌氧菌以丁酸为底物发酵产丁醇。本发明生产丁醇的方法可以大大缩短发酵周期，提高丁醇的底物转化率和产率。

Description

一种双菌固定化厌氧发酵生产丁醇的装置和方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及丁醇的生产装置和方法，特别是利用双菌固定化厌氧发酵生产丁醇的装置和方法。

背景技术

丁醇是一种四碳的饱和醇，又称正丁醇，分子式为C₄H₉OH，无色、具特殊气味，能与有机溶剂完全互溶，能与水部分互溶。

正丁醇是生产抗生素、维生素和激素的良好溶剂，也用于制造脂肪族二元酸、邻苯二甲酸和磷酸的正丁酯类增塑剂，此外，还用于制造醋酸丁酯、丙烯酸丁酯、乙二醇丁醚、作为有机合成中间体以及制造表面活性剂等。丁醇也是刹车液配方中的优良稀释剂。作为燃料，丁醇比乙醇具有很多优势，包括更高的能量（比乙醇多30%）、低挥发性、吸湿性低、腐蚀性低、易燃性低、能与汽油以任意比混溶(Qureshi,N.and T.C.Ezeji(2008)."Butanol,'a superiorbiofuel'production from agricultural residues(renewable biomass):recent progressintechnology."Biofuels Bioproducts&Biorefining-Biofpr 2(4):319-330.)。

随着石油资源的日益枯竭，原油价格的长期高位运行，传统化工合成对环境造成的污染，以及人们对生物基化学品的日益偏爱，利用生物发酵和现代化工分离技术，将可再生的生物质资源转化为工业资源，逐步取代化学合成的石油基产品，已经成为一个重大的研究方向。利用生物技术生产丁醇重新得到人们的重视。很多公司开始研发生物丁醇生产工艺，如英国石油公司（BP）和杜邦公司（DuPont）在2007年宣布联合研发生物丁醇生产工艺，目标是在短时间内使生物丁醇变得有市场吸引力。

典型梭菌的丁醇发酵是一个两阶段发酵。目前丁醇的生产工艺是采用单菌游离发酵，第一阶段称为产酸阶段，此时产酸途径被激活，主要产物为乙酸、丁酸、H₂和CO₂，这个阶段主要是在菌体的对数生长期。第二个阶段被称为产溶剂阶段，此阶段菌体将酸吸收掉，主要产物为丙酮(Acetone)、丁醇(Butanol)和乙醇(Ethanol)，也称为ABE发酵。该方法丁醇得率、产率以及ABE得率、产率都相对较低。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种双菌固定化厌氧发酵生产丁醇的装置。

本发明目的之二在于提供一种双菌固定化厌氧发酵生产丁醇的方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种双菌固定化厌氧发酵生产丁醇的装置，包括依次由管路串联的发酵培养基储罐、产丁酸固定化反应器A、产丁醇固定化反应器C和产物收集罐。

优选地，所述固定化反应器A连接一生物反应器B，两者之间形成循环回路；固定化反应器C连接一生物反应器D，两者之间形成循环回路。

优选地，所述固定化反应器A、C为填充床、流化床或纤维床，其中固定化介质包括经过处理的农业秸秆、活性炭、棉纤维、玉米芯中的任意一种。固定化介质可以采取沸水浴、聚丙烯亚胺、戊二醛处理以提高菌体固定化效率。

一种双菌固定化厌氧发酵生产丁醇的方法，包括如下步骤：将产丁酸和产丁醇的厌氧菌分别固定于固定化反应器A、C中，即双菌固定化；然后控制发酵培养基从培养基储罐流出，依次流经固定化反应器A、C进行连续厌氧发酵，最后流入产物收集罐即可。

优选地，所述固定化反应器A、C中发酵液体系pH控制在5.0～5.5，发酵温度控制在35～38℃，总糖浓度范围为20～80g/L，稀释率范围为0.1～0.8h^-1。

优选地，所述的产丁醇厌氧菌可利用丁酸为底物，发酵后主要产物为丁醇，发酵pH维持在5.0～5.5左右；所述的产丁酸厌氧菌可利用多种可发酵糖类，主要发酵产物为丁酸。所述的发酵培养基含有碳源、氮源、无机盐和生长因子的液体培养基，培养基初始pH为6.0～6.5。该培养基碳源可为葡萄糖、木糖、糖蜜或糖蜜水解液、木薯淀粉水解液、木薯渣水解液、菊芋水解液及木质纤维素水解液的任意一种或几种。

优选地，所述的产丁醇的厌氧菌为丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum）、拜氏梭菌（Clostridium  beijerinckii）、糖乙酸多丁醇梭菌（Clostridium saccharoperbutylacetonicum）和糖丁酸梭菌（Clostridiumsaccharobutylicum）中任意一种。

产丁醇的厌氧菌具有在发酵初期产生大量丁酸但产丁醇较少，在发酵后期将前期产的大量丁酸转化为丁醇的特性，优选的产丁酸的厌氧菌为酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）、丁酸梭菌（Clostridium butyricum）和拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）任意一种。

优选地，所述双菌固定化方法之一具体步骤如下：

（1）分别向固定化反应器A、C中泵入发酵培养基，将培养至对数中期的产丁酸和产丁醇的厌氧菌分别接种于固定化反应器A、C中，并继续泵入发酵培养基直至充满整个反应器，固定化过程中，分别向固定化反应器A、C中通入无菌高纯氮气；

（2）待固定化反应器A、C中菌液OD升高并开始产气，此时停止通氮气，然后以低流速分别从固定化反应器A、C底部泵入发酵培养基，让菌体在载体材料中进一步富集，待反应器A、C中菌体大量产气且发酵液中可分别检测到丁酸、丁醇时固定化结束。

优选地，所述双菌固定化方法之二具体步骤如下：

（1）分别向生物反应器B、D中通入发酵培养基；

（2）向固定化反应器A和/或生物反应器B以及固定化反应器C和/或生物反应器D中通入无菌高纯氮气；

（3）将培养至对数中期的产丁酸和产丁醇的厌氧菌分别接种于生物反应器B、D中，待厌氧菌生长至对数中期时，将生物反应器B、D中的发酵液分别泵入固定化反应器A、C中进行循环，将生物反应器B、D中的游离菌体分别固定于固定化反应器A、C中；当生物反应器B、D中游离菌体OD不再下降时，视为菌体固定化过程结束。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

（1）本发明是利用双菌固定化发酵生产丁醇，前一个固定化生物反应器固定产丁酸的厌氧菌，其利用可发酵糖类产丁酸，丁酸为后一个固定化生物反应器所固定的产丁醇厌氧菌所利用，转化为丁醇。通过该工艺能大大缩短发酵周期，提高丁醇得率及产率。

（2）减少了单菌游离发酵中设备清洗空消的环节，大大提高设备的利用率和单位时间产量。

（3）可以有效的解除底物、产物对菌体的抑制作用。

（4）采用生物反应器B、D间接接种的方式，便于及时补充菌种，有利于连续发酵的进行。

附图说明

图1为本发明发酵生产丁醇装置的结构示意图。

具体实施方式

通过以下实施例可以更好的理解本发明，以下实施例用于说明本发明，但不能理解为限制本发明。

实施例1

菌种：产丁酸菌为Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755（酪丁酸梭菌），产丁醇菌为Clostridium beijerinckii ATCC 55025（拜氏梭菌）。

种子培养基：

拜氏梭菌用种子培养基Ⅰ（CM 149)（/L）：酵母提取物3g，牛肉浸膏10g，蛋白胨10g，葡萄糖5g，可溶性淀粉1g，NaCl5g，乙酸钠3g，盐酸半胱氨酸0.5g，碳源和氮源分开灭菌，pH 6.8±0.2。

酪丁酸梭菌用种子培养基Ⅱ（RCM）(/L）：矿物1溶液40mL；矿物2溶液40mL，微量金属元素溶液10mL，维生素溶液10mL，0.005%NiCl·6H₂O10mL，0.2%FeSO₄·7H₂O 2mL，葡萄糖30g，蛋白胨5g，酵母抽提物5g，NaCl6g，半胱氨酸-HCl 0.3g，0.1%刃天青0.5mL，在沸水浴中煮沸除氧，碳源和氮源分开灭菌，pH 6.0。

上述各溶液配方如下：

矿物1溶液：7.86g/L K₂HPO₄·3H₂O；

矿物2溶液：6g/L KH₂PO₄，2.5g/L MgSO₄·7H₂O，6g/L(NH₄)₂·SO₄，0.16g/L CaCl₂·2H₂O，12g/L NaCl；

微量金属元素溶液：1.5g/L次氮基三乙酸，0.1g/L FeSO₄·7H₂O，0.5g/LMnSO₄·2H₂O，1.0g/L NaCl，0.1g/L CoCl₂，0.1g/L CaCl₂·2H₂O，0.1g/LZnSO₄·5H₂O，0.01g/L CuSO₄·5H₂O，0.01g/LAlK(SO₄)₂，0.01g/L H₃BO₃，0.01g/L Na₂MoO₄·3H₂O；

维生素溶液：5mg/L维生素B1，5mg/L核黄素，5mg/L烟酸，5mg/L泛酸，0.1mg/L维生素B12，5mg/L对氨基苯酸，5mg/L硫辛酸。

发酵培养基：1L体系：50g葡萄糖,10mL醋酸盐缓冲液，10mL维生素溶液，10mL矿物溶液，酵母提取物1g，碳源，碳氮源分开灭菌。初始pH约为6.5。

上述各溶液配方如下：

醋酸盐缓冲液：50g/L KH₂PO₄，50g/L K₂HPO₄，220g/L乙酸铵；

维生素溶液：0.1g/L对氨基苯甲酸，0.001g/L生物素，0.1g/L硫胺素；

矿物溶液：20g/L MgSO₄·7H₂O，1g/L MnSO₄·7H₂O，1g/L FeSO₄·7H₂O，1g/LNaCl。

上述三种溶液过滤除菌（0.2μm）。

双菌固定化厌氧发酵生产丁醇的装置，包括依次由管路串联的发酵培养基储罐、产丁酸固定化反应器A、产丁醇固定化反应器C和产物收集罐。所述固定化反应器A、C均为纤维床，其中固定化介质为棉纤维，将棉纤维织物铺于不锈钢网上，并将两者卷起来置于固定化反应器A、C内部。并将固定化反应器A、C分别与生物反应器B、D串联，形成两个循环回路。

双菌固定化厌氧发酵生产丁醇的方法包括如下步骤：

（1）将发酵培养基储罐在使用前进行空消，然后装入发酵培养基进行实消，均为高温蒸汽灭菌；固定化反应器A、C经高温蒸汽灭菌（120℃，30min）后冷却过夜，并再次高温灭菌。

（2）将产丁酸的厌氧菌和产丁醇的厌氧菌分别固定于固定化反应器A、C中。

（3）分别向5L生物反应器B、D中通入发酵培养基，装液量均为2L；装有发酵培养基的生物反应器B、D经高温蒸汽灭菌（120℃，30min）后，从生物反应器底部通入无菌高纯氮30min，以使反应器内达到严格的厌氧环境，然后分别接入培养至对数中期的Clostridium beijerinckii ATCC55025（拜氏梭菌）和Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755（酪丁酸梭菌），发酵温度均为37℃，pH均用6M NaOH控制于5。

（4）待菌种生长至对数中期时，打开阀3、5和蠕动泵4，打开阀7、9和蠕动泵8，进行菌体的固定化过程（在固定化之前向固定化反应器A、C中通无菌高纯氮30min）。固定化40h后，关闭阀3、5和蠕动泵4，关闭阀7和9和蠕动泵8，结束固定化过程。打开阀1、6和10以及蠕动泵2，发酵培养基由培养基储罐依次流向固定化反应器A、固定化反应器C，进行连续发酵，发酵温度为37℃，糖浓度为50g/L，稀释率为：0.144h^-1，最后流入产物收集罐。

表1以葡萄糖为底物不同发酵方式对丁醇发酵的影响

共培养连续发酵丁醇得率、产率分别比拜氏梭菌游离批次或批次补料发酵提高了25.0%和800.0%。

共培养连续发酵ABE得率、产率分别比拜氏梭菌游离批次或批次补料发酵提高了56.25%和963.6%。

实施例2

菌种：产丁酸菌为Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755（酪丁酸梭菌），产丁醇菌为Clostridium beijerinckiiATCC 55025（拜氏梭菌）。

种子培养基：

拜氏梭菌用种子培养基Ⅰ（CM 149)（/L）：酵母提取物3g，牛肉浸膏10g，蛋白胨10g，葡萄糖5g，可溶性淀粉1g，NaCl5g，乙酸钠3g，盐酸半胱氨酸0.5g，碳源和氮源分开灭菌，pH 6.8±0.2。

酪丁酸梭菌用种子培养基Ⅱ（RCM）(/L）：矿物1溶液40mL；矿物2溶液40mL，微量金属元素溶液10mL，维生素溶液10mL，0.005%NiCl·6H₂O10mL，0.2%FeSO₄·7H₂O 2mL，葡萄糖30g，蛋白胨5g，酵母抽提物5g，NaCl6g，半胱氨酸-HCl 0.3g，0.1%刃天青0.5mL，在沸水浴中煮沸除氧，碳源和氮源分开灭菌，pH 6.0。

上述各溶液配方如下：

矿物1溶液：7.86g/L K₂HPO₄·3H₂O；

矿物2溶液：6g/L KH₂PO₄，2.5g/L MgSO₄·7H₂O，6g/L(NH₄)₂·SO₄，0.16g/L CaCl₂·2H₂O，12g/LNaCl；

微量金属元素溶液：1.5g/L次氮基三乙酸，0.1g/L FeSO₄·7H₂O，0.5g/LMnSO₄·2H₂O，1.0g/L NaCl，0.1g/L CoCl₂，0.1g/L CaCl₂·2H₂O，0.1g/LZnSO₄·5H₂O，0.01g/L CuSO₄·5H₂O，0.01g/LAlK(SO₄)₂，0.01g/L H₃BO₃，0.01g/L Na₂MoO₄·3H₂O；

维生素溶液：5mg/L维生素B1，5mg/L核黄素，5mg/L烟酸，5mg/L泛酸，0.1mg/L维生素B12，5mg/L对氨基苯酸，5mg/L硫辛酸。

发酵培养基：以稀酸木薯淀粉水解液（水解条件：0.25mol/L稀盐酸，固液比：1:10，121℃、45min（普通高压灭菌锅），水解后4500rpm离心30min取上清备用）为底物发酵丁醇，1L水解液中含有：约50g总还原糖，10mL醋酸盐缓冲液，10mL维生素溶液，10mL矿物溶液，酵母提取物1g，碳源，碳氮源分开灭菌。初始pH约为6.5。

上述各溶液配方如下：

醋酸盐缓冲液：50g/L KH₂PO₄，50g/L K₂HPO₄，220g/L乙酸铵；

维生素溶液：0.1g/L对氨基苯甲酸，0.001g/L生物素，0.1g/L硫胺素；

矿物溶液：20g/L MgSO₄·7H₂O，1g/L MnSO₄·7H₂O，1g/L FeSO₄·7H₂O，1g/LNaCl。

上述三种溶液过滤除菌（0.2μm）。

双菌固定化厌氧发酵生产丁醇的装置和生产方法同实施例1。

表2以预处理木薯淀粉为底物不同发酵方式对丁醇发酵的影响

共培养连续发酵丁醇得率、产率分别比拜氏梭菌游离批次或批次补料发酵提高了12.5%和860.0%。

共培养连续发酵ABE得率、产率分别比拜氏梭菌游离批次或批次补料发酵提高了56.5%和1186.7%。

实施例3

菌种：产丁酸菌为Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755（酪丁酸梭菌），产丁醇菌为Clostridim beijerinckii ATCC 55025（拜氏梭菌）。

种子培养基：

拜氏梭菌用种子培养基Ⅰ（CM 149)（/L）：酵母提取物3g，牛肉浸膏10g，蛋白胨10g，葡萄糖5g，可溶性淀粉1g，NaCl5g，乙酸钠3g，盐酸半胱氨酸0.5g，碳源和氮源分开灭菌，pH 6.8±0.2。

酪丁酸梭菌用种子培养基Ⅱ（RCM）(/L）：矿物1溶液40mL；矿物2溶液40mL，微量金属元素溶液10mL，维生素溶液10mL，0.005%NiCl·6H₂O10mL，0.2%FeSO₄·7H₂O 2mL，葡萄糖30g，蛋白胨5g，酵母抽提物5g，NaCl6g，半胱氨酸-HCl 0.3g，0.1%刃天青0.5mL，在沸水浴中煮沸除氧，碳源和氮源分开灭菌，pH 6.0。

上述各溶液配方如下：

矿物1溶液：7.86g/L K₂HPO₄·3H₂O；

矿物2溶液：6g/L KH₂PO₄，2.5g/L MgSO₄·7H₂O，6g/L(NH₄)₂·SO₄，0.16g/L CaCl₂·2H₂O，12g/L NaCl；

微量金属元素溶液：1.5g/L次氮基三乙酸，0.1g/L FeSO₄·7H₂O，0.5g/LMnSO₄·2H₂O，1.0g/L NaCl，0.1g/L CoCl₂，0.1g/L CaCl₂·2H₂O，0.1g/LZnSO₄·5H₂O，0.01g/L CuSO₄·5H₂O，0.01g/LAlK(SO₄)₂，0.01g/L H₃BO₃，0.01g/L Na₂MoO₄·3H₂O；

维生素溶液：5mg/L维生素B1，5mg/L核黄素，5mg/L烟酸，5mg/L泛酸，0.1mg/L维生素B12，5mg/L对氨基苯酸，5mg/L硫辛酸。

发酵培养基：以糖蜜水解液（水解方法：取一定体积糖蜜稀释6倍，用浓盐酸调pH至2，60℃水浴水解24h，水解结束后用NaOH固体颗粒调pH至6.5，4500rpm离心30min去上清备用）为底物发酵丁醇，1L体系：约50g总还原糖,10mL醋酸盐缓冲液，10mL维生素溶液，10mL矿物溶液，酵母提取物1g，碳源，碳氮源分开灭菌。初始pH约为6.5。

上述各溶液配方如下：

醋酸盐缓冲液：50g/L KH₂PO₄，50g/L K₂HPO₄，220g/L乙酸铵；

维生素溶液：0.1g/L对氨基苯甲酸，0.001g/L生物素，0.1g/L硫胺素；

矿物溶液：20g/L MgSO₄·7H₂O，1g/L MnSO₄·7H₂O，1g/L FeSO₄·7H₂O，1g/LNaCl。

上述三种溶液过滤除菌（0.2μm）。

双菌固定化厌氧发酵生产丁醇的装置和生产方法同实施例1。

表3以预处理甘蔗废糖蜜为底物不同发酵方式对丁醇发酵的影响

共培养连续发酵丁醇得率、产率分别比拜氏梭菌游离批次或批次补料发酵提高了140%和6100.0%。

共培养连续发酵ABE得率、产率分别比拜氏梭菌游离批次或批次补料发酵提高了185.7%和6700.0%。

Claims (10)

1.一种双菌固定化厌氧发酵生产丁醇的装置，其特征在于，包括依次由管路串联的发酵培养基储罐、产丁酸固定化反应器A、产丁醇固定化反应器C和产物收集罐。

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述固定化反应器A连接一生物反应器B，两者之间形成循环回路；固定化反应器C连接一生物反应器D，两者之间形成循环回路。

3.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述固定化反应器A、C为填充床、流化床或纤维床，其中固定化介质包括经过处理的农业秸秆、活性炭、棉纤维、玉米芯中的任意一种。

4.权利要求1或2或3所述装置发酵生产丁醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：将产丁酸和产丁醇的厌氧菌分别固定于固定化反应器A、C中，即双菌固定化；然后控制发酵培养基从培养基储罐流出，依次流经固定化反应器A、C进行连续厌氧发酵，最后流入产物收集罐即可。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述固定化反应器A、C中发酵液体系pH控制在5.0～5.5，发酵温度控制在35～38℃，总糖浓度范围为20～80g/L，稀释率范围为0.1～0.8h^-1。

6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述的产丁醇厌氧菌可利用丁酸为底物，发酵后主要产物为丁醇，发酵pH维持在5.0～5.5左右；所述的产丁酸厌氧菌可利用多种可发酵糖类，主要发酵产物为丁酸。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述的产丁醇的厌氧菌为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）、拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）、糖乙酸多丁醇梭菌（Clostridium saccharoperbutylacetonicum）和糖丁酸梭菌（Clostridium saccharobutylicum）中任意一种。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的产丁酸的厌氧菌为酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）、丁酸梭菌（Clostridium butyricum）和拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）任意一种。

9.根据权利要求4或5或6或7或8所述方法，其特征在于，所述双菌固定化方法之一具体步骤如下：

（1）分别向固定化反应器A、C中泵入发酵培养基，将培养至对数中期的产丁酸和产丁醇的厌氧菌分别接种于固定化反应器A、C中，并继续泵入发酵培养基直至充满整个反应器，固定化过程中，分别向固定化反应器A、C中通入无菌高纯氮气；

（2）待固定化反应器A、C中菌液OD升高并开始产气，此时停止通氮气，然后以低流速分别从固定化反应器A、C底部泵入发酵培养基，让菌体在载体材料中进一步富集，待反应器A、C中菌体大量产气且发酵液中可分别检测到丁酸、丁醇时固定化结束。

10.根据权利要求4或5或6或7或8所述方法，其特征在于，所述双菌固定化方法之二具体步骤如下：

（1）分别向生物反应器B、D中通入发酵培养基；

（2）向固定化反应器A和/或生物反应器B以及固定化反应器C和/或生物反应器D中通入无菌高纯氮气；

（3）将培养至对数中期的产丁酸和产丁醇的厌氧菌分别接种于生物反应器B、D中，待厌氧菌生长至对数中期时，将生物反应器B、D中的发酵液分别泵入固定化反应器A、C中进行循环，将生物反应器B、D中的游离菌体分别固定于固定化反应器A、C中；当生物反应器B、D中游离菌体OD不再下降时，视为菌体固定化过程结束。