CN109811017B

CN109811017B - 一种基于溶氧与pH调控高山被孢霉产EPA的发酵方法

Info

Publication number: CN109811017B
Application number: CN201910205750.5A
Authority: CN
Inventors: 陈海琴; 唐鑫; 陈卫; 黄明旺; 赵建新; 张灏; 陈永泉
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-03-18
Filing date: 2019-03-18
Publication date: 2021-09-24
Anticipated expiration: 2039-03-18
Also published as: CN109811017A

Abstract

本发明公开了一种基于溶氧与pH调控高山被孢霉产EPA的发酵方法，属于微生物发酵领域。本发明采用适宜的富氧空气策略满足菌体生长及产物积累的溶氧需求；在菌体生长期利用氨水调控pH，同时也起到了部分N源的作用，促使菌体快速生长；此外，采用分阶段调控pH的策略在菌体生长阶段与脂质积累阶段分阶段调控适宜的pH，进一步提高了EPA产量。整个发酵采用分批补料的发酵方式，其中初始葡萄糖浓度为30g/L，通过补料维持残糖浓度10‑30g/L。在7.5L发酵罐中发酵10天最终得到DCW 41.2g/L，总脂占菌干重31.5％，EPA占总脂26.7％，EPA产量可高达3.47g/L。

Description

一种基于溶氧与pH调控高山被孢霉产EPA的发酵方法

技术领域

本发明涉及一种基于溶氧与pH调控高山被孢霉产EPA的发酵方法，属于微生物发酵领域。

背景技术

EPA(全顺式-5、8、11、l4、17-二十碳五烯酸)在抗炎、抗癌、抗凝血、调节细胞活性因子以及促进神经系统的发育和组织的形成等方面有重要作用。EPA主要来源于深海鱼，由于海洋鱼类资源的有限性、提取工艺的复杂性以及海洋污染等众多缺点，微生物油脂成为研究热点。其优点是显而易见的：原料丰富、周期短、价格便宜、占地面积小、不受气候影响等。其中高山被孢霉油脂含量丰富，是花生四烯酸(Arachidonic acid，C20:4)的工业化生产菌株，经过FDA的安全认证，同时也是EPA工业化的潜力菌株之一。

经研究发现，被孢霉属的微生物能够通过发酵生产EPA。发明人所在的课题组在研究过程中发现，高山被孢霉在发酵过程中EPA的生产能力受到限制，底物葡萄糖浓度在发酵初期为50g/L，至发酵结束还余20g/L，葡萄糖消耗受到抑制。为提高EPA的生产能力，提供新的发酵策略是十分必要的。

高山被孢霉为专性好氧微生物，发酵过程中需要的溶氧量可能对菌株的代谢能力起到重要影响，溶氧过高可能会对菌体造成氧化应激反应，溶氧不足又无法满足菌体的生长，故提高EPA的产量需要将溶氧量控制在合理范围内。

pH是发酵过程的重要参数，pH值的变化会引起各种酶活力的改变，影响基质的利用速度和细胞结构，以致于影响菌体的生长和产物的合成。pH值通过影响菌体细胞膜电荷的状况，改变膜的渗透性，从而影响菌体对营养物质的吸收和代谢产物的形成等。因此，选择适宜的pH对于发酵过程至关重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用高山被孢霉高效产EPA的发酵方法，所述方法为采用溶氧与pH综合调控分批补料发酵。

本发明中所述溶氧调控的策略为：整个发酵过程中通入富氧空气维持体系DO在10％-50％。

本发明中所述pH调控的策略为：在菌体生长期(0-96h)利用14％(v/v)氨水溶氧作为碱液调控pH，氨水同时作为部分N源，有利于菌体生物量的积累。

本发明的一种实施方式中，所述分阶段调控pH是：在菌体生长期调控pH为5.8～6.2，在产物积累期调控pH为6.3～6.8。

本发明的一种实施方式中，所述分批补料发酵是指初始葡萄糖溶液30g/L，发酵过程中通过分批补加控制残糖浓度在10-30g/L。

本发明的一种实施方式中，所述菌体生长期包括接种后第0～96h。

本发明的一种实施方式中，所述产物积累期在菌体生长期之后。

在本发明的一种实施方式中，所述产物积累期为接种后第96～发酵末期。

本发明的一种实施方式中，所述高山被孢霉(Mortierella alpina)为高山被孢霉CCFM 698，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.11820，已于2017年公开于公开号为CN106754436A的专利申请文件中。

本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：

(1)菌体生长期(0-96h)：采用14％(v/v)的氨水调控pH，维持pH为6.0，当溶氧低于30％时通入富氧空气维持体系溶氧在10-50％范围内，控制总通气量不超过1vvm，初始葡萄糖浓度为30g/L，分批补加葡萄糖溶液维持残糖在10-30g/L；

(2)产物积累期(96-240h)：关闭14％(v/v)的氨水改用NaOH调控pH为6.5，通入富氧空气维持体系溶氧在10-50％，控制总通气量不超过1vvm，每隔24h取样检测残糖浓度，补加葡萄糖溶液维持残糖在10-30g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述pH通过14％(v/v)的氨水或NaOH调控。

本发明还要求保护所述方法在制备含EPA或其衍生产品方面的应用。

有益效果：本发明通过溶氧与pH综合调控高山被孢霉发酵产EPA，使发酵10天菌株DCW达41.2g/L，总脂占菌干重31.5％，EPA占总脂26.7％，EPA产量可高达3.47g/L。

附图说明

图1：分批发酵条件下通氧策略对高山被孢霉产EPA发酵过程中DO％(a)，生物量DCW(b)，总脂产量TFA(c)，EPA产量(d)，残糖浓度(e)的影响研究。

图2：分批补料发酵条件下氨水调控pH策略对高山被孢霉产EPA发酵过程中DO％(a)，生物量DCW(b)，总脂产量TFA(c)，EPA产量(d)，残糖浓度(e)的影响研究。

图3：分批补料发酵条件下分阶段调控pH策略对高山被孢霉产EPA发酵过程中DO％(a)，生物量DCW(b)，总脂产量TFA(c)，EPA产量(d)，残糖浓度(e)的影响研究。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做详细说明。

菌株：高山被孢霉(Mortierella alpina)CCFM 698，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11820，已于2017年公开于公开号为CN106754436A的专利申请文件中。

培养基：

斜面保藏培养基(1L)：葡萄糖30g，硝酸钾2g，Yeast extract 5g，七水合硫酸镁3g，磷酸二氢钠1g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000mL；

Broth培养基(1L)：葡萄糖20g，硝酸钾10g，Yeast extract 5g，七水合硫酸镁0.25g，磷酸二氢钠1g，蒸馏水定容至1000mL；

发酵培养基(1L)：葡萄糖30g，豆粕粉(200目过筛)20g，七水合硫酸镁0.25g，磷酸二氢钠2g，消泡剂1ml，蒸馏水定容至1000mL。

DCW的测定：用量筒量取100mL发酵液，用200目的标准样筛过滤后，清水洗涤直到滤液澄清透明，获得高山被孢霉湿菌体。将湿菌体置于冷冻干燥机中进行冻干，冻干后称取干菌体重量。

总脂的测定：将冷冻干燥后的干菌体用研钵进行粉碎，粉碎后准确称取50mg于7mL的玻璃提脂瓶中，用于脂肪酸的提取和检测分析。在上述玻璃提脂瓶中加入2mL 4M盐酸，置于正负80℃下进行反复冻融破壁(80℃维持1h后迅速转置负80℃，维持15min)，重复三次待破壁完全后，用微量进样器准确量取100μL十五烷酸(C15:0)加入提脂玻璃瓶中，用氯仿和甲醇进行脂肪萃取，重复3次后用1mL 10％盐酸甲醇进行60℃、3h的甲酯化操作，得到的脂肪酸甲酯采用气相色谱-质谱联用仪进行检测。气相色谱柱为Rtx-WAX(30m×0.25mm，

)，使用的载气为氦气，采用的进样方式为分流进样，色谱柱的升温程序为：初始温度150℃，保持2min后以5℃/min的速度升温至190℃，最后以16℃/min的速度升至220℃后保持15min。根据内标采用峰面积归一化法计算总脂和各脂肪酸含量。

实施例1：分批发酵条件下通入富氧空气促进高山被孢霉产EPA

挑取保藏于斜面培养基中的M.alpina CCFM 698培养物一环，接种于100mL活化培养基中，在28℃，200rpm的条件下振荡培养48h，待菌体长成白色球状，用分散机打碎后接种1mL至100mL活化培养基中进行传代培养，在28℃和200rpm的条件下培养36h，待菌球呈现均匀、放射羽状后，获得M.alpina发酵种子液。将培养36h的M.alpina种子按10％的接种量接种至7.5L搅拌型发酵罐中(装液量4L)，在28℃下发酵10天。发酵期间每隔24h通过火圈无菌取样一次，用于发酵参数的测定，同时通过补加消泡剂(聚丙二醇2000)控制发酵过程中产生泡沫的不利影响。实验分为2组，转速均控制为400rpm，对照组仅通空气，实验组为空气和富氧空气混合通气；控制对照组与实验组总通气量一致，且均不超过1vvm。结果如图1所示。

由图1可知，对照组条件第48h相对溶氧降为0，说明该条件溶氧供给不足，阻遏了菌体生长与产物积累的溶氧需求；相比对照组，通入富氧空气策略满足了菌体生长与产物积累的溶氧需求，其生物量可达24.5g/L，总脂产量为4.43g/L，EPA产量可达1.01g/L，相比对照组EPA产量提升至1.82倍，表明富氧空气策略可以有效的解决高山被孢霉CCFM698产EPA过程中的溶氧阻遏问题，并大幅度提高了EPA的产量。

与此同时，由检测的残糖数据可知，通入富氧空气会加快菌体耗糖速率，初始葡萄糖50g/L，到第144h葡萄糖已耗尽；而对照组到发酵末期仍有20g/L左右葡萄糖残留。由于高山被孢霉积累脂质的过程是需要消耗碳源的，通入富氧空气策略分批发酵后期葡萄糖不足，阻碍了脂质的进一步生产与积累，同时初始葡萄糖50g/L浓度过高也会导致菌体生长延滞期增长，故可以采用分批补料的方式进一步提高EPA的产量。

实施例2：分批补料发酵条件下调控pH促进高山被孢霉产EPA

共设计三组发酵实验，第一组对照组为富氧空气策略下的分批发酵，第二组实验组为富氧空气策略下的残糖反馈补料发酵，第三组实验组为富氧空气策略下氨水结合14％(v/v)NH₄OH调控pH的残糖反馈补料发酵。14％(v/v)NH₄OH既起到了调控pH的作用又充当了部分N源的作用。发酵过程中控制转速400rpm，通入富养空气维持体系DO在30％左右。初始葡萄糖浓度为30g/L，发酵过程中每24h取样测定残糖浓度，通过补加葡萄糖溶液维持残糖浓度在10-30g/L。检测数据如图2所示。

由图2可知，相比对照组，残糖反馈补料组DCW从24.5g/L增加到28.6g/L，提升16.7％，TFA从4.4g/L增加到8.1g/L，提升84.1％；EPA产量由1.01g/L增加到1.82g/L，提升79.1％。结果表明分批发酵后期葡萄糖不足会阻遏脂质产物的进一步积累，分批补料发酵有利于高山被孢霉积累脂质及提升EPA的产量。相比残糖反馈补料，利用氨水调控pH的策略DCW从28.6g/L增加到37.2g/L，提升30％；总脂从8.1g/L增加至12.5g/L，提升54.3％；EPA从1.82g/L增加至2.92g/L，提升61％。结果表明基于氨水调控pH的补料发酵策略可以有效的提高高山被孢霉的生物量及EPA的产量。

实施例3：分批补料发酵条件下通过分阶段调控pH促进高山被孢霉产EPA

为了考察pH对高山被孢霉产EPA的影响，共设计三组基于14％(v/v)NH₄OH调控pH的残糖反馈补料发酵实验，第一组控制pH为6.0(0-240h)，第二组pH为6.5(0-240h)，第三组pH为6.0(0-96h)～6.5(96-240h)。其检测数据图3和表1。

表1：不同pH条件下发酵末期高山被孢霉CCFM698产EPA发酵数据对比

由图3及表1可知，生物量积累与脂质积累的最适pH不同。pH为6.0更有利于生物量的积累，pH为6.5有利于脂质的积累，三组DCW分别为39.6，30.1，41.2g/L；三组EPA产量分别为2.74，2.86，3.47g/L。采用分阶段调控pH的措施EPA产量提高26.6％，表明该策略有利于提高EPA产量。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种利用高山被孢霉发酵产EPA的方法，其特征在于，采用溶氧与pH综合调控高山被孢霉发酵；所述调控具体是：控制发酵过程中DO在10%~50%，并控制pH为6.0~6.5；所述控制pH是分阶段控制pH；所述分阶段是以接种为起始点，分为菌体生长期、产物积累期，在菌体生长期调控pH为6.0，在产物积累期调控pH为6.5；

发酵过程中通过补料控制残糖浓度在10-30g/L；

所述菌体生长期为接种后第0~96 h；菌体生长期之后为产物积累期；

在菌体生长期利用氨水调控pH；

发酵过程通入富氧空气控制DO；

发酵初始葡萄糖浓度为25~30 g/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述补料是间歇性分批补料。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以保藏编号为CGMCC No. 11820的高山被孢霉CCFM 698为发酵微生物。

4.权利要求1~3任一所述方法在制备含EPA产品方面的应用。