CN101709318B - 一种产朊假丝酵母流加发酵制备谷胱甘肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种产朊假丝酵母流加发酵制备谷胱甘肽的方法，以产朊假丝酵母(Candida utilis)SZU 07-01为出发菌株，经斜面培养和种子培养后，发酵至少42小时；所述发酵具体包括以下步骤：将扩大培养后的种子按5％～10％的接种量接入发酵培养基，发酵温度28～32℃，搅拌转速250～300rpm，通气量0.5～1.5vvm；并且，在发酵的第10～12小时，向发酵培养基中流加补料培养基，并且，通过手动调节转速及通气量，控制溶解氧浓度大于等于35％。由于本发明采用了多项式流加发酵方式，在满足酵母细胞对营养物质需求的基础上，可以进一步提高细胞密度和GSH产量；同时明显降低发酵时间，提高生产效率。

Description

一种产朊假丝酵母流加发酵制备谷胱甘肽的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种产朊假丝酵母流加发酵制备谷胱甘肽的方法。

背景技术

自1938年发表的用酵母制造GSH的最早专利以来，国外学者围绕GSH的生产开展了大量的研究，概括来说，谷胱甘肽的生产方法主要有溶剂萃取法、化学合成法、酶转化法和发酵法。萃取法主要是通过萃取和沉淀的方法从含有GSH的动植物组织中进行GSH的分离提取，由于原料不易获得且GSH的含量极低，因此该法的实际应用价值不大。化学合成法生产GSH，即将L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸缩合成GSH。该法较早应用于GSH生产，但操作过程复杂、耗时且得到的GSH是左旋体和右旋体的混合物，分离十分困难，造成产品纯度不高，且生物效价很难保持一致。GSH的酶法合成是利用GSH合成酶系，在ATP的存在下将三种组成氨基酸催化形成GSH。该法首先需要获得GSH合成的相关酶系，其次需要加入价格昂贵的前体氨基酸和ATP，目前还处于实验室研究阶段。发酵法就是采用廉价的糖类原料，利用细菌或酵母体内物质的代谢途径来进行GSH生物合成的方法。

综合比较，发酵法生产GSH最具有竞争力，由于微生物容易培养，因此该法将具有极大的应用潜力。

由于GSH属于胞内产物，且其最大胞内含量在一定条件下变化不大，因此，发酵法生产GSH的最关键问题在于提高GSH的单位体积生产率，即在GSH胞内含量一定的情况下，通过提高细胞量来提高发酵液单位体积的GSH产量，即实现高细胞密度发酵。

补料分批培养技术是实现高细胞密度发酵的主要途径之一，它是在微生物的分批培养过程中向生物反应器中间歇或连续补加一种或多种限制性底物直到培养结束后才排出培养液的一种操作方式。流加培养的类型很多，按培养基加入的方式可分为恒速流加、指数流加和反馈流加等等。一个好的流加控制系统必须避免两种倾向：一是流加过量，补料组分在反应器中积累从而对细胞生长和产物形成产生抑制；二是流加不足，这可能会导致细胞必需营养物的缺乏。因此，需要在实际培养过程中，通过实时的检测和控制实现酵母细胞对营养物质的高效利用，在高速生长及代谢的前提下最终达到高产GSH的目的。

现有技术中，发明人卫功元曾经研究了产朊假丝酵母在不同葡萄糖浓度下的谷胱甘肽(GSH)分批发酵过程，在此基础上进一步考察了重复补料、恒速流加和指数流加等不同培养方式对GSH发酵生产的影响(参见：卫功元等，过程工程学报，2005，5(3)：327-331)。其中，恒速流加方法在补加的开始阶段可以满足酵母细胞对营养的需要，但是随着酵母细胞数目的不断增多，恒速流加必然导致营养物质供应的不足；指数流加方法在补加的开始阶段补加量少，但补加量随时间呈指数级增加，因此会导致酵母前期营养供给不足，后期营养过剩。因此，需要一种可以同时保证发酵期间酵母所需营养，又不会过剩的流加控制系统。

发明内容

本发明目的是提供一种产朊假丝酵母流加发酵制备谷胱甘肽的方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：以产朊假丝酵母(Candidautilis)SZU 07-01为出发菌株，经斜面培养和种子培养后，发酵至少42小时；其特征在于，所述发酵具体包括以下步骤：将扩大培养后的种子按5％～10％的接种量接入发酵培养基，发酵温度28～32℃，搅拌转速250～300rpm，通气量0.5～1.5vvm；并且，在发酵的第10～12小时，向发酵培养基中流加补料培养基，流加速率F(mL/h)由多项式方程确定：

F＝A+B×t+C×t²+D×t³

其中，t代表时间，单位为小时(h)，A、B、C、D为方程式的系数，其范围分别为：34.5～34.6；4.8～5.0；1.2～1.3；0.04～0.045。

并通过手动调节转速及通气量，控制溶解氧浓度大于等于35％。

上述技术方案中，所述发酵过程在发酵罐中进行。

上述技术方案中，所述扩大培养后的种子选自：一级种子、二级种子或三级种子中的一种。本领域技术人员可根据体积需要自行选择扩大倍数。

上述技术方案中，所述菌株产朊假丝酵母(Candida utilis)SZU 07-01由苏州大学工业微生物实验室保藏，该菌株已在文献(葛晓光，卫功元，聂敏，邵娜.富硒产朊假丝酵母的制备条件研究.粮食与饲料工业，2009，10：31-33)中公开。

具体地，本领域技术人员可以参考以下具体发酵过程，发酵条件为：

(1)菌株：

产朊假丝酵母(Candida utilis)SZU 07-01；

(2)培养基：

每1L所述斜面培养基含有：葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏10g，琼脂20g，所述斜面培养基pH为6.0～6.5；

每1L所述种子培养基含有：葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏10g，所述种子培养基pH为6.0～6.5；

每1L所述发酵培养基含有：葡萄糖30g，硫酸铵8g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁0.25g，所述发酵培养基pH为5.5～6.0；

每1L所述补料培养基含有：葡萄糖600g，硫酸铵80g，磷酸二氢钾30g，硫酸镁2.5g；

(3)种子扩大培养：

斜面种子活化4～6小时后接入装有种子培养基的三角瓶中培养，装液量为30～50mL种子培养基/500mL，18～24小时即得一级种子；之后再按5～10％(10％为体积比，如40mL发酵培养基接种量4mL)的接种量将一级种子接入相同培养基中培养18～24小时制备二级种子，培养温度28～32℃，转速150～250rpm；

(4)发酵具体包括以下步骤：将二级种子按5％～10％的接种量接入发酵培养基，在装有3L发酵培养基的全自动发酵罐中，发酵至少42小时，发酵温度28～32℃，搅拌转速250～300rpm，通气量0.5～1.5vvm；并且，在发酵的10～12小时，向发酵培养基中流加补料培养基，流加速率F(mL/h)由多项式方程确定：

F＝A+B×t+C×t²+D×t³

其中，t代表时间(h)，A、B、C、D为方程式的系数，其范围分别为：34.5～34.6；4.8～5.0；1.2～1.3；0.04～0.045。

培养条件为：发酵温度28～32℃，并通过手动调节转速及通气量，控制溶解氧浓度大于等于35％。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1.由于本发明采用了多项式流加发酵方式，在满足酵母细胞对营养物质需求的基础上，进一步提高细胞密度和GSH产量。

2.由于本发明采用了多项式流加发酵方式，在其他培养条件相同的情况下，进一步降低发酵时间，提高生产效率。

3.本发明中采用的多项式流加发酵方式，为实现微生物高密度发酵提供了一种新的方法。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：在总葡萄糖浓度为150g/L的条件下采用恒速流加发酵培养

(1)菌株

产朊假丝酵母(Candida utilis)SZU 07-01，苏州大学工业微生物实验室保藏。

(2)培养基

斜面及种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，pH 6.0；

分批发酵培养基(g/L)：葡萄糖30，硫酸铵8，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.25，pH 5.5；

补料培养基(g/L)：葡萄糖600，硫酸铵80，磷酸二氢钾30，硫酸镁2.5。

(3)种子培养

斜面种子活化4～6小时后，接入装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中培养18～24小时即得一级种子，之后再按10％的接种量将一级种子接入相同培养基中培养18～24小时制备二级种子。培养温度28～32℃，HYG-II型回转式恒温调速摇瓶柜，转速200rpm。

(4)发酵罐培养

分批发酵：将准备好的二级种子按10％的接种量接入装有3L发酵培养基的全自动发酵罐中，分批培养24～30小时，发酵温度28～32℃，搅拌转速300rpm，通气量1vvm。

恒速流加发酵：在分批发酵的10～12小时，向发酵罐中流加补料培养基，流加速率恒定控制在10～40mL/h之间。培养条件同分批培养，并通过手动调节转速及通气量，控制溶解氧浓度不低于35％。

(5)胞内谷胱甘肽的提取

发酵培养得到的新鲜酵母用蒸馏水洗涤3次后，在40％乙醇中30℃下处理2小时，离心取上清液作为样品进行GSH测定。

(6)细胞干重的测定

一定量的发酵液离心后用蒸馏水洗涤3次，得到的新鲜细胞在70℃下烘干至恒重。

(7)葡萄糖质量浓度的测定

3，5-二硝基水杨酸法。

(8)谷胱甘肽的测定

采用DTNB[5，5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)]-谷胱甘肽还原酶循环法。

(9)结果：

流加速度：4.0～8.0g/(L·h)；葡萄糖补加时间：15～30小时；

发酵时间：54～60小时；细胞干重：41.5～65.1g/L；

GSH产量：419.9～654.3mg/L；最佳恒速流加速率为6.7g/(L·h)。

实施例二：在总葡萄糖浓度为150g/L的条件下采用指数流加发酵培养

参照实施例一，区别在于：

(4)发酵罐培养

分批发酵：将准备好的二级种子按10％的接种量接入装有3L发酵培养基的全自动发酵罐中，分批培养24～30小时，发酵温度28～32℃，搅拌转速300rpm，通气量1vvm。

指数流加发酵：在分批发酵的10～12小时，向发酵罐中流加补料培养基，流加速率F(mL/h)由指数方程式确定：

$F=\frac{\mathrm{\μ}{\left(\mathrm{VX}\right)}_0}{Y_{X/S}(S_F-S)}\exp \left(\mathrm{\μt}\right)$

其中V₀＝3L，Y_X/S＝0.55，X₀＝13.8g/L，S＝0，S_F＝600g/L。培养条件同分批培养，并通过手动调节转速及通气量，控制溶解氧浓度不低于35％。

(9)结果：

比生长速率μ：0.08～0.14h^-1；葡萄糖补加时间：17～21小时；

发酵时间：48～54小时；细胞干重：65.5～70.0g/L；

GSH产量：642.8～672.6mg/L；最佳比生长速率μ为0.1h^-1。

实施例三：在总葡萄糖浓度为150g/L的条件下采用多项式流加发酵培养

参照实施例一，区别在于：

(4)发酵罐培养

分批发酵：将准备好的二级种子按10％的接种量接入装有3L发酵培养基的全自动发酵罐中，培养24～30小时，发酵温度28～32℃，搅拌转速300rpm，通气量1vvm。

多项式流加发酵：在分批发酵的第10～12小时，向发酵罐中流加补料培养基，流加速率F(m L/h)由多项式方程确定：

F＝34.566-4.994*t+1.235*t²-0.041*t³

培养条件同分批培养，并通过手动调节转速及通气量，控制溶解氧浓度不低于35％。

(9)结果：

葡萄糖补加时间：13小时；发酵时间：42小时；

细胞干重：68.9g/L；GSH产量：691.3mg/L。

实施例四：在总葡萄糖浓度为200g/L的条件下采用多项式流加发酵培养

参照实施例一，区别在于：

(4)发酵罐培养

分批发酵：将准备好的二级种子按10％的接种量接入装有3L发酵培养基的全自动发酵罐中，培养24～30小时，发酵温度28～32℃，搅拌转速300rpm，通气量1vvm。

多项式流加发酵：在分批发酵的第10～12小时，向发酵罐中流加补料培养基，流加速率F(mL/h)由多项式方程确定：

F＝34.566-4.994*t+1.235*t²-0.041*t³

培养条件同分批培养，并通过手动调节转速及通气量，控制溶解氧浓度不低于35％。

(9)结果：

葡萄糖补加时间：17小时；发酵时间：48小时；

细胞干重：91.2g/L；GSH产量：825.0mg/L。

Claims (1)

1.一种产朊假丝酵母流加发酵制备谷胱甘肽的方法，在总葡萄糖浓度为150g/L的条件下采用多项式流加发酵培养，以产朊假丝酵母(Candida utilis)SZU 07-01为出发菌株，斜面种子活化4～6小时后，接入装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中培养18～24小时即得一级种子，之后再按10％的接种量将一级种子接入相同培养基中培养18～24小时制备二级种子，培养温度28～32℃，转速200rpm；斜面及种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，pH 6.0；再进行发酵；其特征在于，所述发酵具体包括以下步骤：

分批发酵：将准备好的二级种子按10％的接种量接入装有3L发酵培养基的全自动发酵罐中，培养24～30小时，发酵温度28～32℃，搅拌转速300rpm，通气量1vvm；分批发酵培养基(g/L)：葡萄糖30，硫酸铵8，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.25，pH 5.5；

多项式流加发酵：在分批发酵的第10～12小时，向发酵罐中流加补料培养基，补料培养基(g/L)：葡萄糖600，硫酸铵80，磷酸二氢钾30，硫酸镁2.5，流加速率F(mL/h)由多项式方程确定：

F＝34.566-4.994×t+1.235×t²-0.041×t³

其中，t代表时间，单位为小时；

培养条件同分批培养，并通过手动调节转速及通气量，控制溶解氧浓度大于等于35％。