CN100360679C - 酵母发酵联产麦角固醇和谷胱甘肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种酵母发酵联产麦角固醇和谷胱甘肽的方法，利用同一种酵母菌种发酵同时生产两种代谢产物——麦角固醇和谷胱甘肽，发酵法所用菌种为：酿酒酵母、产朊假丝酵母、热带假丝酵母或通过诱变和基因工程改造的工程菌等，采用的酵母培养基组分包括，碳源：葡萄糖、麦芽汁、蔗糖、糖蜜等，氮源：玉米浆、酵母粉、蛋白胨、尿素、氨水等，无机盐及所需的金属离子等，本发明在利用一次发酵联产麦角固醇和谷胱甘肽的同时实现了酵母细胞的高密度培养，使酵母表达联产的生物量达到现有单独发酵麦角固醇和谷胱甘肽的较高水平，充分利用培养基底物，提高了原料的利用率，降低了生产成本。

Description

酵母发酵联产麦角固醇和谷胱甘肽的方法

技术领域

本发明涉及一种高密度培养酵母细胞以及通过酵母细胞生产麦角固醇和谷胱甘肽的方法，属于生物发酵工程领域。

背景技术

麦角固醇和谷胱甘肽均为重要的医用品和保健品，目前国内外用发酵法生产麦角固醇或谷胱甘肽是最为普遍的方法，即通过培养生产麦角固醇或谷胱甘肽的酵母得到产品。为了提高该方法生产产品的水平，人们通过选育(或构建)合成能力强和胞内含量高的菌种，筛选和优化培养基配方，建立和优化发酵控制，改进和提高下游工程技术等多方面来提高产率和质量。如：Wenck采用曲霉菌生产麦角固醇，麦角固醇含量占细胞干重2.23％[Wenck P R，Peterson W.The production of yeast fat.Bacteriol Parasitenk.1935.92：330-338]。Savard采用青霉素菌生产麦角固醇，含量达到细胞干重1.8％[Savard K，Grant G A.Ergosterolaccumulation in yeast cells.Science.1994.104：459-460]。Eugene选育了不同酵母菌生产麦角固醇，含量可达到细胞干重的2％-3％[Eugene L D，Stapley E O，Katherine S.App Microbial.1954.2：371-379]。张博润等人对产麦角固醇酵母进行了原生质体融合，得到了高产麦角固醇菌种，产品含量达到细胞干重的2.7％[张博润.麦角固醇高产菌株的构建及其培养优化条件的研究.应用与环境生物学报.1999.15(1)：77-80]。高桦采用控制溶氧的脉冲式流加，使麦角固醇的产量稳定在1000mg/L左右[高桦.酵母发酵生产麦角固醇工艺的研究及应用.北京化工大学硕士学位论文.2002]。

发酵法生产谷胱甘肽的工艺及方法也不断改进，其中以诱变处理获得高谷胱甘肽含量的酵母变异菌株来生产谷胱甘肽最为常见。李寅等研究了谷胱甘肽发酵条件，确定了合适的摇瓶补糖策略，补糖结束时谷胱甘肽总量达到119mg/L[李寅，陈坚，伦世仪.高密度培养工程菌生产谷胱甘肽.中国医药工业杂志.1999.30(1)：1-4]。Sakato等同时利用补糖和乙醇控制方法，使谷胱甘肽总量和含量分别达到2360mg/L和3.7％[Sakato K，Tanaka H.Advanced control ofglutathione fermentation process.Biotechnol.Bioeng.1992.40(8)：904-912]。

综上所述，现有的技术所做的都是利用酵母菌培养来单独生产麦角固醇或单独生产谷胱甘肽一种产物，存在原料利用率低、成本高等问题。

发明内容

本发明提出了利用酵母发酵联产麦角固醇和谷胱甘肽的方法，同时通过酵母细胞的高密度培养，使酵母表达联产麦角固醇和谷胱甘肽的生物量水平达到单独发酵麦角固醇或谷胱甘肽的较高水平，从而提高了原料的利用率。

本发明以酵母作为培养菌株，采用优化的联产培养基配方，包括接入菌种、向发酵液中流加营养物和添加调节剂，控制发酵液生产酵母细胞以及酵母代谢产物的条件等发酵工艺过程，其中酵母培养基中按每升发酵液的质量含量配制：碳元素16g/L-25g/L，氮元素2g/L-3g/L，无机盐及金属离子7g/L-41g/L，所述的碳元素碳源来自葡萄糖、蔗糖或麦芽汁，氮元素氮源来自玉米浆、酵母粉或蛋白胨，无机盐是硫酸镁和磷酸盐；发酵过程中向发酵液中流加营养物质是：葡萄糖，玉米浆和糖蜜；添加的调节剂为：KOH、NH₄NO₃、尿素或氨水，控制发酵液中乙醇浓度为10-50g/L，发酵液的pH值调节在2-8之间，发酵液的温度控制范围在20-35℃，发酵周期为1-3天，得到联产麦角固醇和谷胱甘肽发酵液。

上述的金属离子是发酵液中通常用的：Zn²⁺、Fe²⁺、Cu²⁺和Mn²⁺。

上述的磷酸盐是发酵中常用的：磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或磷酸氢二铵。

上述所用菌种包括：酿酒酵母、产朊假丝酵母、热带假丝酵母或通过诱变和基因工程改造的工程菌。

在上述的发酵液中还可以加入硝酸钠，以促进产物的合成。

本发明利用优化的培养基配方，同时通过含氮的弱碱性调节剂和添加剂调节控制合理的发酵条件，促进产物合成，实现一次发酵联产麦角固醇和谷胱甘肽，使培养基底物得到充分利用，提高了原料的利用率，降低了生产成本；实现了酵母细胞的高密度培养，使酵母表达联产麦角固醇和谷胱甘肽的生物量水平达到单独发酵麦角固醇或谷胱甘肽时的较高水平。

具体实施方式：

本发明较好的实施方式是：配制发酵培养基配方为(以每升发酵液中质量含量配置)：葡萄糖40g/L-60g/L，玉米浆15g/L-45g/L，磷酸氢二钾2g/L-12g/L，磷酸二氢钾2g/L-12g/L，硫酸镁3g/L-6g/L，NaNO₃ 4g/L-8g/L，Zn²⁺8-15ppm，Fe²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺各2-6ppm。按常规的灭菌方式在121℃下实罐灭菌30分钟，待培养基温度降至30℃后接入菌种，按10％的(种子液与发酵液的体积比)接种量接入发酵罐，搅拌转速在200-600rpm，通风比为1.0-1.5VVM，控制温度30℃左右开始发酵，发酵液的温度控制范围在20-35℃，从发酵后第9-10小时开始流加葡萄糖溶液、玉米浆溶液，以及尿素和氨水，发酵进行至22-24小时，乙醇浓度降至17g/L-30g/L，此时根据乙醇浓度调节流加营养物速率，当乙醇浓度上升时，减小流加速率，当乙醇浓度下降时，增大流加速率，以控制发酵液中的乙醇浓度维持在10g/L-20g/L，发酵液的pH值控制在2-8之间，经过24-72小时发酵，生物量达到96g/L-124g/L(干重)，麦角固醇总量为810mg/L-1220mg/L，谷胱甘肽总量为930mg/L-1561mg/L。

上述所用菌种是：酿酒酵母、产朊假丝酵母、热带假丝酵母或通过诱变和基因工程改造的工程菌。其中通过诱变和基因工程改造的工程菌是指通过紫外线或化学试剂常规的诱变手段，以及通过PCR技术扩增表达基因并构建人工质粒等方法改造的菌种。

实施例1：培养热带假丝酵母生产麦角固醇和谷胱甘肽

使用5L通用式发酵罐配制3L发酵培养基，培养基配方：葡萄糖40g/L，玉米浆45g/L，麦芽汁20g/L，硫酸镁4.5g/L，磷酸氢二钾12g/L，磷酸二氢钾12g/L，Zn²⁺14ppm，Fe²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺各6ppm，在121℃下实罐灭菌30分钟。待培养基温度降至30℃后，按10％的(种子液与发酵液的体积比)接种量接种，调节通风比为1.3VVM，搅拌转速为400rpm，开始发酵，发酵12小时，发酵液的温度控制范围在20-35℃，此时发酵液中的乙醇浓度为降至50g/L，开始流加浓度为700g/L的葡萄糖、糖蜜和玉米浆水溶液，调节流加速率，维持发酵液中的乙醇浓度在35-40g/L，同时添加葡萄糖和氨水使发酵液pH值在5.5-6.5之间，发酵后期加入硝酸钠4g/L，发酵24小时，生物量达到96g/L(干重)，麦角固醇总量为810mg/L，谷胱甘肽总量为930mg/L。

实施例2：培养产朊假丝酵母生产麦角固醇和谷胱甘肽

使用5L通用式发酵罐发酵。配制3L发酵培养基，培养基配方：葡萄糖60g/L，玉米浆30g/L，麦芽汁10g/L，磷酸氢二铵7g/L，硫酸镁6g/L，磷酸氢二钾10g/L，磷酸二氢钾20g/L，Zn²⁺15ppm，Fe²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺各2ppm，在121℃下实罐灭菌30分钟。待培养基温度降至30℃后按10％的(种子液与发酵液的体积比)接种量接种，调节通风比为1.0VVM，搅拌转速为300rpm，开始发酵。发酵液的温度控制范围在20-35℃，发酵13小时，此时发酵液中的乙醇浓度为降至45g/L，开始流加浓度为600g/L的葡萄糖、玉米浆和糖蜜水溶液，调节流加速率，维持发酵液中的乙醇浓度在30-35g/L，同时添加葡萄糖、氨水和尿素，使发酵液pH值在2.2-4.3之间，发酵后期加入硝酸钠8g/L，发酵56小时，生物量达到110g/L(干重)，麦角固醇总量为960mg/L，谷胱甘肽总量为972mg/L。

实施例3：培养酿酒酵母生产麦角固醇和谷胱甘肽

使用5L通用式发酵罐发酵。配制2.5L发酵培养基，培养基配方：葡萄糖60g/L，玉米浆44g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁3g/L，Zn²⁺12ppm，Fe²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺各4ppm)，在121℃下实罐灭菌30分钟。待培养基温度降至30℃后按10％的(种子液与发酵液的体积比)接种量接种，调节通风比为1.0VVM，搅拌转速为200rpm，开始发酵。发酵液的温度控制范围在20-35℃，从发酵后第10小时开始流加浓度为600g/L的葡萄糖溶液和浓度为100g/L的玉米浆溶液，发酵进行至22小时，乙醇浓度降至17g/L，此时根据乙醇浓度调节流加速率，发酵液中的乙醇浓度维持在15-25g/L。同时添加葡萄糖、尿素和KOH，使发酵液pH值在6.5-8之间，发酵后期加入硝酸钠6g/L，经过64小时发酵，生物量达到124g//L(干重)，麦角固醇总量为1121mg/L，谷胱甘肽总量为1561mg/L。

实施例5：培养通过基因工程改造的酿酒酵母生产麦角固醇和谷胱甘肽

通过PCR技术构建酵母菌表达质粒，培养重组转化酿酒酵母菌株。使用30L通用式发酵罐发酵。配制25L发酵培养基，培养基配方：葡萄糖55g/L，玉米浆34g/L，麦芽汁30g/L，硫酸镁4g/L，磷酸氢二钾7g/L，磷酸二氢钾7g/L，Zn²⁺12ppm，Fe²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺各4ppm，在121℃下实罐灭菌30分钟。待培养基温度降至30℃后接种，调节通风比为1.0VVM，搅拌转速为600rpm，开始发酵。发酵液的温度控制范围在20-35℃，发酵15小时，发酵液中的乙醇浓度为降至15g/L，开始流加浓度为600g/L的葡萄糖、玉米浆和糖蜜水溶液，调节流加速率，维持发酵液中的乙醇浓度在10-15g/L，发酵48小时，生物量达到112g/L(干重)，麦角固醇总量为1220mg/L，谷胱甘肽总量为860mg/L。

实施例6：培养通过诱变技术改良的酿酒酵母生产麦角固醇和谷胱甘肽

通过人工诱变技术改良酿酒酵母菌株。使用30L通用式发酵罐发酵。配制25L发酵培养基，培养基配方：葡萄糖60g/L，玉米浆35g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁6g/L，Zn²⁺15ppm，Fe²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺各6ppm，在121℃下实罐灭菌30分钟。待培养基温度降至30℃后接种，调节通风比为1.2VVM，搅拌转速为300rpm，开始发酵。发酵液的温度控制范围在20-35℃，从发酵后第15小时开始流加浓度为600g/L的葡萄糖溶液和浓度为100g/L的玉米浆溶液，发酵进行至26小时，乙醇浓度降至45g/L，此时根据乙醇浓度调节流加速率，发酵液中的乙醇浓度维持在35-40g/L。同时添加葡萄糖、NH₄NO₃和KOH，使发酵液pH值在6.5-8之间，发酵后期加入硝酸钠4.5g/L，经过72小时发酵，生物量达到130g/L(干重)，麦角固醇总量为1217mg/L，谷胱甘肽总量为1344mg/L。

Claims (7)

1、一种酵母发酵联产麦角固醇和谷胱甘肽的方法，以酵母作为培养菌株，包括：培养基配制、接入菌种、向发酵液中流加营养物和添加调节剂、控制发酵液生产酵母细胞以及酵母代谢产物的发酵工艺过程，其特征在于，酵母培养基中以每升发酵液的质量含量配置碳元素：16g/L-25g/L，氮元素：2g/L-3g/L，无机盐及金属离子：7g/L-41g/L；所述的碳元素碳源来自葡萄糖、蔗糖或麦芽汁，氮元素氮源来自玉米浆、酵母粉或蛋白胨，无机盐是硫酸镁和磷酸盐，发酵过程中向发酵液中流加营养物质是：葡萄糖，玉米浆和糖蜜，添加的调节剂为：KOH、NH₄NO₃、尿素或氨水；控制发酵液中乙醇浓度为10-50g/L，发酵液的pH值调节在2-8之间，发酵液的温度控制范围在20-35℃，发酵周期为1-3天。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所用菌种包括：酿酒酵母、产朊假丝酵母、热带假丝酵母。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：磷酸盐是：磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或磷酸氢二铵。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：金属离子是Zn²⁺、Fe²⁺、Cu²⁺和Mn²⁺。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在发酵液中通过添加硝酸钠来促进产物合成。

6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：发酵罐搅拌转速在200-600rpm，通风比为1.0-1.5VVM。

7、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：培养基以每升发酵液中质量含量配制：葡萄糖40g/L-60g/L，玉米浆15g/L-45g/L，磷酸氢二钾2g/L-12g/L，磷酸二氢钾2g/L-12g/L，硫酸镁3g/L-6g/L，NaNO₃ 4g/L-8g/L，Zn²⁺8-15ppm，Fe²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺各2-6ppm。