CN106636240A - 一种高浓度γ‑聚谷氨酸及其发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种高浓度γ‑聚谷氨酸及其发酵方法，该发酵方法包括如下步骤：（1）将产γ‑聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌接种到含有Span20的发酵培养基中进行发酵培养；（2）在发酵培养5‑7h，添加一定量正十二烷；（3）在发酵培养5‑7h开始，每隔3‑5h，添加一定量H2O2；（4）从发酵培养18‑24h开始，流加蔗糖溶液、谷氨酸钠溶液和酵母粉溶液，流加至56‑78h，发酵结束；（5）分离提取发酵液中的γ‑聚谷氨酸。本发明的发酵方法可以解决菌体生长过程中供氧不足的难题，在低成本的液体培养基中实现γ‑聚谷氨酸的高产，还具有成本低、效率高、环境污染低、不增加能耗等优点。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种高浓度γ-聚谷氨酸及其发酵方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，简称γ-PGA）是一种氨基酸聚合物，由L/D-谷氨酸通过γ-聚谷酰键连接而成，其分子量一般在100-1000KDa之间，相当于500-5000个谷氨酸单体聚合而成。γ-聚谷氨酸具有优良的水溶性、超强的吸附性和生物可降解性，降解产物为无公害的谷氨酸，是一种优良的环保型高分子材料，可作为保水剂、重金属离子吸附剂、絮凝剂、缓释剂以及药物载体等，在化妆品、环境保护、食品、医药、农业、沙漠治理等产业均有很大的商业价值和社会价值。
γ-聚谷氨酸的主要发酵方法有化学合成法、提取法和生物合成法。相比于生物合成法，前两种方法工艺复杂、副产物多、产量低、环境污染较大。目前，国内外主要是利用以芽孢杆菌为代表的微生物来发酵生产γ-聚谷氨酸。在二十世纪九十年代以来，科研工作者们在筛选γ-聚谷氨酸高产菌株及改善γ-聚谷氨酸的发酵工艺方面做了大量的研究工作。Kubota从土壤中分离得到一株Bacillus subtilis F201，γ-聚谷氨酸的最大产量可达到50g/L。Yoon对Bacillus licheniformis ATCC9945a利用高密度流加培养，在发酵35h后，γ-聚谷氨酸的产量达到最大值39g/L。江波等从土壤中筛选一株Bacillusmethylotrophicus，该菌株可不依赖于谷氨酸进行发酵，产量达到17g/L，其专利公开号为CN102268389。乔长冕等通过向培养基中添加硝酸钠，调节聚谷氨酸合成酶的活性，提高了谷氨酸的转化率，γ-聚谷氨酸的产量达到45-55g/L，其专利公布号为CN103695485。
目前利用微生物发酵生产γ-聚谷氨酸的过程中，合成代谢途径较为复杂，发酵液极其粘稠，发酵液的高粘度显著降低了溶氧浓度，并大大增加了传质阻力系数，使得氧气供给困难，营养物质得不到有效利用。这极大地限制了菌体的生长代谢，最终导致γ-聚谷氨酸产量较低。因此，寻找一种改善培养菌体的低氧环境及提高发酵液的传质系数，是目前发酵生产γ-聚谷氨酸亟待解决的问题。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种高浓度γ-聚谷氨酸的发酵方法，该发酵方法可以解决菌体生长过程中供氧不足的难题，在低成本的液体培养基中实现γ-聚谷氨酸的高产。
本发明的另一目的在于提供一种高浓度γ-聚谷氨酸。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种高浓度γ-聚谷氨酸的发酵方法，包括如下步骤：
（1）将产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌接种到含有Span20的发酵培养基中进行发酵培养；
（2）在发酵培养5-7h，添加一定量的正十二烷；
（3）在发酵培养5-7h开始，每隔3-5h，添加一定量的H2O2；
（4）从发酵培养18-24h开始，流加蔗糖溶液、谷氨酸钠溶液和酵母粉溶液，流加至56-78h，发酵结束；
（5）分离提取发酵液中的γ-聚谷氨酸。
表面活性剂Span 20具有改善发酵环境的作用，它的非极性端结合在菌体表面，能够使菌体分散度增加，强化传质效果。此外，Span 20还能提高细胞膜的通透性，增加菌体细胞的摄氧速率。为了在不增加能耗的情况下，进一步改善菌体生长的低氧环境，本发明一方面进行了氧载体强化溶氧的研究，在载体中氧气的溶解度比在水中的溶解度高很多。氧载体增加溶氧的方法与提高通气量强化溶氧的方法相比，具有氧气传递速率快、利用率高、能耗低、气泡少、液体剪切力小等优点。因此，氧载体的方法非常适合应用于γ-聚谷氨酸的发酵生产，本发明选取了正十二烷进行研究，它与Span 20共同作用取得了更佳的实验效果。在另一方面，本发明通过添加合适浓度的H2O2来增加氧气的供应，并对菌体细胞产生一定的氧化胁迫，刺激更多γ-聚谷氨酸的形成，此种方法具有成本低、效率高、环境污染低、不增加能耗等优点。
本发明与相应的不添加Span 20、正十二烷和H2O2的方法相比可获得更多的γ-聚谷氨酸，在本发明的具体实施方式中，γ-聚谷氨酸的产量达到55g/L左右。
在本发明中，产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌为本邻域技术人员所熟知，如本发明背景技术部分所提及的，本发明优选采用的枯草芽孢杆菌将在下文中更详尽地描述；枯草芽孢杆菌的发酵温度为34-38℃，本发明优选采用37℃。
优选的，所述步骤（1）中，产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌是于2014年5月20日保藏于波顿香料有限公司保藏中心的枯草芽孢杆菌PBS55，其保藏编号为CMCC3366。
优选的，所述步骤（1）中，产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌是在种子培养基中活化培养而获得的，种子培养基包括如下组分：蛋白胨10-30g/L、酵母粉4-20g/L、氯化钠10-20g/L、硫酸镁0.5-4g/L、磷酸二氢钾1-8g/L和氯化铵2-10g/L，pH为6.0-8.0。更为优选的，种子培养基包括如下组分：蛋白胨为12-18g/L，酵母粉为6-12g/L，氯化钠为12-16g/L，硫酸镁1-3g/L，磷酸二氢钾1.5-5g/L，氯化铵为3-6g/L，pH为6.5-7.5。
在本发明中，如未特别指出培养基中的添加物，培养基仅仅是未添加相应添加物的培养基。
优选的，所述步骤（1）中，发酵培养基包括如下组分：蔗糖30-100g/L、蛋白胨10-30g/L、酵母粉5-20g/L、谷氨酸钠20-80g/L、硫酸镁0.5-3g/L和磷酸二氢钾2-5g/L，pH为6.5-7.5。更为优选的，所述步骤（1）中，发酵培养基包括如下组分：蔗糖40-100g/L、蛋白胨15-20g/L、酵母粉6-12g/L、谷氨酸钠30-70g/L、硫酸镁1-2g/L和磷酸二氢钾2-3g/L，pH为6.8-7.2。
优选的，所述步骤（1）中，培养参数为：培养温度为34-38℃，搅拌转速300-400r/min，通气量1-2vvm，罐压0.04-0.1mPa。更为优选的，所述步骤（1）中，培养参数为：培养温度为37℃，搅拌转速350r/min，通气量1.5vvm，罐压0.08mPa。
优选的，所述步骤（1）中，Span20的添加量为1-10ml/L；所述步骤（2）中，正十二烷的添加量为10-60ml/L；所述步骤（3）中，H2O2的添加量为3-20ml/L。更为优选的，所述步骤（1）中，Span20的添加量为2-6ml/L；所述步骤（2）中，正十二烷的添加量为20-40ml/L；所述步骤（3）中，H2O2的添加量为5-10ml/L。
优选的，所述步骤（4）中，蔗糖溶液的质量浓度为45-55%，流加速度为每小时6-12mL/L；酵母粉溶液的质量浓度为15-25%，流加速度为每小时3-6mL/L；谷氨酸钠溶液的质量浓度为45-55%，流加速度为每小时4-8mL/L。更为优选的，所述步骤（4）中，蔗糖溶液的质量浓度为50%，流加速度为每小时6-12mL/L；酵母粉溶液的质量浓度为20%，流加速度为每小时3-6mL/L；谷氨酸钠溶液的质量浓度为40%，流加速度为每小时4-8mL/L。
本发明在发酵罐上，通过连续留加底物方式控制菌体的生长和代谢，进一步促进了γ-聚谷氨酸的生成。分别在不同时间留加蔗糖、谷氨酸钠和酵母粉等营养物质，在10-100L发酵罐中培养，γ-聚谷氨酸产量可达50g/L以上，比利用该菌种单批发酵产量提高了25%左右。
本发明的另一目的通过下述技术方案实现：一种高浓度γ-聚谷氨酸，所述高浓度γ-聚谷氨酸根据上述所述的发酵方法制得。
本发明的有益效果在于：本发明的发酵方法可以解决菌体生长过程中供氧不足的难题，在低成本的液体培养基中实现γ-聚谷氨酸的高产，还具有成本低、效率高、环境污染低、不增加能耗等优点。
附图说明
图1是实施例2在10L发酵罐上不添加调节剂单批发酵生产γ-聚谷氨酸的蔗糖、谷氨酸及γ-聚谷氨酸含量变化图。
图2是实施例2在10L发酵罐上不添加调节剂单批发酵生产γ-聚谷氨酸的DO及相关氧化酶酶活变化图。
图3是实施例3在10L发酵罐上通过添加调节剂单批发酵生产γ-聚谷氨酸的蔗糖、谷氨酸及γ-聚谷氨酸含量变化图。
图4是实施例3在10L发酵罐上通过添加调节剂单批发酵生产γ-聚谷氨酸的DO及相关氧化酶酶活变化图。
图5是实施例4在10L发酵罐上通过连续流加补料的方式发酵生产γ-聚谷氨酸的蔗糖、谷氨酸及γ-聚谷氨酸含量变化图。
图6是实施例5在100L发酵罐上通过连续流加补料的方式发酵生产γ-聚谷氨酸的蔗糖、谷氨酸及γ-聚谷氨酸含量变化图。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图1-6对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例1
一种高浓度γ-聚谷氨酸的发酵方法，使用本发明所用菌种枯草芽孢杆菌PBS55进行不同处理的对比发酵，其中发酵方法1的过程如下：
将在25%（v/v）的甘油中保藏好的菌种接种到液体种子培养基中，以37℃和摇床转速180-220r/min，震荡培养12-16h。然后将获得的种子液以3%（v/v）的接种量，接种于发酵培养基中，以37℃和摇床转速180-220r/min，震荡培养60-80h。最后测定并计算发酵液中的γ-聚谷氨酸产量。其中，种子培养基的配方为：蛋白胨为12-18g/L，酵母粉为6-12g/L，氯化钠为12-16g/L，硫酸镁1-3g/L，磷酸二氢钾1.5-5g/L，氯化铵为3-6g/L，发酵初始PH为6.5-7.5；发酵培养基的配方为：蔗糖为60-120g/L，蛋白胨为10-40g/L，酵母粉为5-20g/L，谷氨酸钠为60-100g/L，硫酸镁0.5-5g/L，磷酸二氢钾2-7g/L，发酵初始PH为6.5-7.5；更优选可以是如下配方：蔗糖为80-100g/L，蛋白胨为15-20g/L，酵母粉为6-12g/L，谷氨酸钠为70-90g/L，硫酸镁2-4g/L，磷酸二氢钾3-5g/L，发酵初始PH为6.8-7.2。发酵结束后，测定发酵液黏度和γ-聚谷氨酸产量，并将发酵液稀释15倍后，在660nm处测定其吸光值。
发酵方法2、3、4的过程与发酵方法1基本相同，所不同的是在摇瓶发酵培养基中还含有2ml/L、4ml/L、6ml/L的Span20；
发酵方法5、6、7的过程与发酵方法1基本相同，所不同的是在发酵培养6h时，向发酵液添加了20ml/L、40ml/L、60ml/L的正十二烷；
发酵方法8、9、10的过程与发酵方法1基本相同，所不同的是分别在发酵培养6h开始，每隔3h向培养基中添加5ml/L、10ml/L、15ml/L的H2O2，直到发酵结束；
发酵方法11的过程与发酵方法1基本相同，所不同的是在摇瓶发酵培养基中还含有2ml/L的Span20，然后在发酵培养6h向发酵液中添加40ml/L的正十二烷；
发酵方法12的过程与发酵方法1基本相同，所不同的是在摇瓶发酵培养基中还含有2ml/L的Span20，然后在发酵培养6h向发酵液中添加40ml/L的正十二烷，并发酵培养6h开始，每隔3h，向发酵液中添加10ml/L的H2O2，直到发酵结束。
结果如表1所示，在Span20、正十二烷和H2O2单独作用下，γ-聚谷氨酸的产量均有不同程度的增加。其中，在Span20的作用下，发酵液黏度明显降低，促进了营养物质的传递。在正十二烷、H2O2的作用下，培养系统的低氧环境得到了改善，有效地解决了发酵液中氧气供应不足的问题。发酵方法11和发酵方法12的结果也表明，Span20、正十二烷和H2O2三者联合作用，可以起到协同效果，极大地提高了γ-聚谷氨酸的产量。
表1 不同发酵方法下菌种生物量及γ-聚谷氨酸的产量
| 发酵方法 | OD660 | 发酵液黏度（mPa·s） | γ-聚谷氨酸产量（g/L） |
| 1 | 0.471 | 26.5 | 23.6 |
| 2 | 0.532 | 19.7 | 27.2 |
| 3 | 0.483 | 18.9 | 24.5 |
| 4 | 0.298 | 14.3 | 19.8 |
| 5 | 0.496 | 23.8 | 25.7 |
| 6 | 0.563 | 27.2 | 31.6 |
| 7 | 0.558 | 25.4 | 29.3 |
| 8 | 0.468 | 28.7 | 31.5 |
| 9 | 0.452 | 30.8 | 34.3 |
| 10 | 0.386 | 23.7 | 21.7 |
| 11 | 0.579 | 21.8 | 36.7 |
| 12 | 0.531 | 27.4 | 43.8 |
实施例2
在10L发酵罐上不添加调节剂单批发酵生产γ-聚谷氨酸，发酵培养基配方为：蔗糖为100g/L，蛋白胨为20g/L，酵母粉为10g/L，谷氨酸钠为80g/L，硫酸镁2g/L，磷酸二氢钾3g/L，初始PH为6.8，装液量为5L。将培养好的种子液以3%（v/v）的接种量接种到发酵培养基中，培养72h，培养温度为37℃，发酵过程控制pH为6.5-7.2，搅拌转速300-400r/min，通气量1-2vvm，罐压0.04-0.1mPa。发酵结果如图1、图2所示。
结果表明，在不添加调节剂的情况下，γ-聚谷氨酸产量只有23.2g/L，DO从36h开始就低于20%，CAD和SOD的酶活力均较低，这极大地限制了枯草芽孢杆菌菌体的生长，从而影响最终γ-聚谷氨酸的合成。
实施例3
在10L发酵罐上通过添加调节剂单批发酵生产γ-聚谷氨酸，发酵初始培养基配方为：蔗糖为100g/L，蛋白胨为20g/L，酵母粉为10g/L，谷氨酸钠为80g/L，硫酸镁2g/L，磷酸二氢钾3g/L，Span202ml/L，发酵初始PH为6.8，装液量为5L。将培养好的种子液以3%（v/v）的接种量接种到发酵培养基中，发酵培养6h，向发酵液添加40ml/L的正十二烷，并发酵培养6h开始，每隔3h，向发酵液中添加10ml/L的H2O2，直到发酵结束。共发酵72h，发酵温度为37℃，发酵过程控制pH为6.5-7.2，搅拌转速300-400r/min，通气量1-2vvm，罐压0.04-0.1mPa。发酵结果如图3、图4所示。
结果表明，在Span20、正十二烷和H2O2的共同作用下，培养环境有了很大改善，DO始终维持在20%以上，CAT和SOD酶活活性较高，有效地解决了γ-聚谷氨酸发酵过程中供氧不足的问题，γ-聚谷氨酸产量有了显著的提高，达到42.8g/L。
实施例4
在10L发酵罐上通过连续流加补料的方式发酵生产γ-聚谷氨酸，发酵初始培养基配方为：蔗糖为50g/L，蛋白胨为20g/L，酵母粉为10g/L，谷氨酸钠为30g/L，硫酸镁2g/L，磷酸二氢钾3g/L，Span202ml/L，发酵初始PH为6.8，装液量为5L。将培养好的种子液以3%（v/v）的接种量接种到发酵培养基中，发酵培养6h，向发酵液添加40ml/L的正十二烷，并发酵培养6h开始，每隔3h，向发酵液中添加10ml/L的H2O2，发酵温度为37℃，发酵过程控制pH为6.5-7.2，搅拌转速300-400r/min，通气量1-2vvm，罐压0.04-0.1mPa。当发酵培养18-24h左右时，糖浓度较低，发酵液PH上升至7.0以上时，开始分别流加50%（w/v）的蔗糖溶液6-12ml/（L*h），20%（w/v）的酵母粉溶液3-6ml/（L*h），50%（w/v）的谷氨酸钠溶液4-8ml/（L*h），流加至72h，发酵结束。
发酵结果如图5所示，通过流加补料的方式，营养物质得到充分利用，γ-聚谷氨酸的产量有了进一步的提高，达到55.1g/L。
实施例5
在100L发酵罐上通过连续流加补料的方式发酵生产γ-聚谷氨酸，发酵初始培养基配方为：蔗糖为60g/L，蛋白胨为20g/L，酵母粉为10g/L，谷氨酸钠为40g/L，硫酸镁2g/L，磷酸二氢钾3g/L，Span202ml/L，发酵初始PH为6.8，装液量为5L。将培养好的种子液以3%（v/v）的接种量接种到发酵培养基中，发酵培养6h，向发酵液添加40ml/L的正十二烷，并发酵培养6h开始，每隔3h，向发酵液中添加10ml/L的H2O2，发酵温度为37℃，发酵过程控制pH为6.5-7.2，搅拌转速300-400r/min，通气量1-2vvm，罐压0.04-0.1mPa。当发酵培养18-24h左右时，糖浓度较低，发酵液PH上升至7.0以上时，开始分别流加50%（w/v）的蔗糖溶液6-12ml/（L*h），20%（w/v）的酵母粉溶液3-6ml/（L*h），50%（w/v）的谷氨酸钠溶液4-8ml/（L*h），流加至56h结束补料，继续发酵至74h时，蔗糖和谷氨酸钠消耗殆尽，结束发酵。
发酵结果如图6所示，100L发酵罐的发酵结果与10L发酵罐的发酵结果相似。在流加补料发酵方式下，γ-聚谷氨酸产量达到57.3g/L，比添加调节剂的单批发酵提高了32%，比不添加调节剂的单批发酵提高了148%。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种高浓度γ-聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）将产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌接种到含有Span20的发酵培养基中进行发酵培养；
（2）在发酵培养5-7h，添加一定量的正十二烷；
（3）在发酵培养5-7h开始，每隔3-5h，添加一定量的H2O2；
（4）从发酵培养18-24h开始，流加蔗糖溶液、谷氨酸钠溶液和酵母粉溶液，流加至56-78h，发酵结束；
（5）分离提取发酵液中的γ-聚谷氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种高浓度γ-聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于：所述步骤（1）中，产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌是于2014年5月20日保藏于波顿香料有限公司保藏中心的枯草芽孢杆菌PBS55，其保藏编号为CMCC3366。
3.根据权利要求1所述的一种高浓度γ-聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于：所述步骤（1）中，产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌是在种子培养基中活化培养而获得的，种子培养基包括如下组分：蛋白胨10-30g/L、酵母粉4-20g/L、氯化钠10-20g/L、硫酸镁0.5-4g/L、磷酸二氢钾1-8g/L和氯化铵2-10g/L，pH为6.0-8.0。
4.根据权利要求1所述的一种高浓度γ-聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于：所述步骤（1）中，发酵培养基包括如下组分：蔗糖30-100g/L、蛋白胨10-30g/L、酵母粉5-20g/L、谷氨酸钠20-80g/L、硫酸镁0.5-3g/L和磷酸二氢钾2-5g/L，pH为6.5-7.5。
5.根据权利要求4所述的一种高浓度γ-聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于：所述步骤（1）中，发酵培养基包括如下组分：蔗糖40-100g/L、蛋白胨15-20g/L、酵母粉6-12g/L、谷氨酸钠30-70g/L、硫酸镁1-2g/L和磷酸二氢钾2-3g/L，pH为6.8-7.2。
6.根据权利要求1所述的一种高浓度γ-聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于：所述步骤（1）中，培养参数为：培养温度为34-38℃，搅拌转速300-400r/min，通气量1-2vvm，罐压0.04-0.1mPa。
7.根据权利要求1所述的一种高浓度γ-聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于：所述步骤（1）中，Span20的添加量为1-10ml/L；所述步骤（2）中，正十二烷的添加量为10-60ml/L；所述步骤（3）中，H2O2的添加量为3-20ml/L。
8.根据权利要求7所述的一种高浓度γ-聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于：所述步骤（1）中，Span20的添加量为2-6ml/L；所述步骤（2）中，正十二烷的添加量为20-40ml/L；所述步骤（3）中，H2O2的添加量为5-10ml/L。
9.根据权利要求1所述的一种高浓度γ-聚谷氨酸的发酵方法，其特征在于：所述步骤（4）中，蔗糖溶液的质量浓度为45-55%，流加速度为每小时6-12mL/L；酵母粉溶液的质量浓度为15-25%，流加速度为每小时3-6mL/L；谷氨酸钠溶液的质量浓度为45-55%，流加速度为每小时4-8mL/L。
10.一种高浓度γ-聚谷氨酸，其特征在于：所述高浓度γ-聚谷氨酸根据权利要求1-9任一项所述的发酵方法制得。
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