CN102952832B - 一种发酵生产尼莫克汀的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种发酵生产尼莫克汀的方法。在发酵生产尼莫克汀的过程中，当发酵液中的总糖浓度低于30g/L时，通过向发酵液间歇或连续补加糖类物质，使发酵液中的总糖浓度维持在10-40g/L进行发酵生产。该方法使尼莫克汀发酵单位提高50％以上，同时，生产操作简单，对设备要求低，成本较低，是一种适用于工业化生产的工艺。

Description

一种发酵生产尼莫克汀的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵生产抗生素技术领域，特别涉及尼莫克汀的发酵生产。更具体的，涉及通过向发酵液中连续补加或间歇补加高浓度单糖、二糖或多糖溶液来培养蓝灰链霉菌，以达到生产高浓度尼莫克汀的方法。
背景技术
尼莫克汀(Nemadectin)是一种十六元大环内酯类抗生素，由蓝灰链霉菌(Streptomycescyaneogriseus sp.Noncyanogenus)经发酵过程生产。作为米尔贝霉素族的一员，尼莫克汀主要用于合成活性更强的农药兽药莫西克汀(Moxidectin)。莫西克汀20世纪80年代中期以来开始作为兽用驱虫药使用，能够高效的杀灭线虫和体表寄生虫，同时对动物有很好的安全性，是目前被广泛用于兽医临床的广谱、高效、新型大环内酯类驱虫抗生素。
尼莫克汀结构式：
尼莫克汀的制备主要通过蓝灰链霉菌菌株生物发酵制得。目前的发酵生产工艺初始糖浓度较高，菌种进入次级代谢过程较慢，发酵产物合成过程易受到阻遏，且发酵中后期菌丝裂解过快，发酵结束时的产量还有待提高(朱皖宜，罗红瑜，张赛萍，等.尼莫克丁产生菌的诱变育种[J].生物学杂志，2008，25(2)：62)。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有尼莫克汀发酵工艺存在的不足，基于微生物生长动力学基础，提供一种能够提高尼莫克汀收率的液体发酵过程的补糖方法。
为了实现本发明的目的，发明人提供了如下发酵生产尼莫克汀的方法，即在发酵生产尼莫克汀的过程中补加糖类物质，包括单糖、二糖或多糖。发明人在研究中发现，当在发酵生产尼莫克汀的过程中补加糖类物质，包括单糖、二糖或多糖后，其发酵水平具有显著的提高。为此，发明人作了进一步研究并得出了更为改进的生产方法。
其技术方案如下：
一种发酵生产尼莫克汀的方法，在发酵生产尼莫克汀的过程中，当发酵液中的总糖浓度低于30g/L时，通过向发酵液间歇或连续补加糖类物质，使发酵液中的总糖浓度维持在10-40g/L进行发酵。
所述糖类物质可以是单糖、二糖或多糖，或者是它们的混合物。所述单糖如葡萄糖、果糖；所述二糖为代谢能够产生葡萄糖的二糖，如乳糖、蔗糖、麦芽糖等；所述多糖为分解能产生单糖的可溶性淀粉、糊精、麦芽糊精等(注：麦芽糊精为以淀粉为原料，经控制水解DE值在20％以下的产品；糊精为淀粉在受到加热、酸或淀粉酶作用下将大分子转化成为小分子的中间物质，行业内通常将两者区分开来作为不同的原材料)。
优选地，上述发酵生产尼莫克汀的方法中，补糖的形式可以是将糖类物质配制为300-600g/L单糖、二糖和/或多糖的单一或混合溶液，然后间歇补加或连续补加到发酵液中。
优选地，上述发酵生产尼莫克汀的方法中，将发酵液的初始溶氧设定为100％，则在发酵培养过程中，发酵液溶氧会先下降然后回升，当发酵液溶氧回升至70％以上且总糖浓度低于30g/L时开始进行补糖。
优选地，上述发酵生产尼莫克汀的方法中，发酵使用的菌株为蓝灰链霉菌(Streptomycescyaneogriseus sp.Noncyanogenus)。
本发明优选的发酵实施过程是，在发酵罐中发酵培养蓝灰链霉菌，控制发酵罐的温度为27-29℃，压力为0.04-0.06Mpa；根据发酵液的溶氧状况控制通气与转速，设发酵液初始溶氧为100％，在培养过程中要确保发酵液溶氧在30％以上(例如：通气为0.5-1VVM，转速为120-250rpm)；并在培养过程中流加氨水和稀硫酸以控制pH在6.0-7.5；溶氧在发酵培养开始后持续下降，然后开始回升，当发酵液溶氧回升至70％以上且总糖浓度低于30g/L时，开始间歇或连续补加糖类物质，使总糖浓度维持在10-40g/L，同时溶氧恢复并介于40-70％之间，发酵280h之后且当菌浓(PMV，取10ml发酵液3000rpm离心20min，计算固形物体积占发酵液体积的比例)降至15％以下时停止补糖，当溶氧升至90％以上且总糖降至10g/L以下即可停止发酵，收获产物。
现有技术在发酵生产尼莫克汀的程中普遍没有连续补糖或间歇补糖操作。本发明的方法在发酵过程中连续补加或间歇补加高浓度单糖、二糖或多糖溶液，与目前工艺相比可提高发酵产量50％以上，且操作方法简单易行，原材料来源广泛，价格低廉，适用于工业化生产，能够很大程度提高生产水平，降低成本。
具体实施方式
下面通过实施例进一步详细说明本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。
以下具体实施例中所需补加的糖溶液的配制方法、种子培养基及发酵培养基的配制方法均如下：
补加糖溶液的配制：配制300-600g/L的单糖、二糖或多糖单独或混合溶液，118℃灭菌20min待用。
种子培养基：葡萄糖20g/L，糊精10g/L，黄豆饼粉20g/L，棉籽饼粉15g/L，蛋白胨8g/L，硫酸镁1g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，pH6.5。
发酵培养基：葡萄糖45g/L，乳糖20g/L，黄豆饼粉20g/L，棉籽饼粉15g/L，硝酸钠0.5g/L，硫酸镁1g/L，硫酸亚铁氨0.66g/L，氯化镍0.03g/L，碳酸钙4g/L，pH6.8。葡萄糖和乳糖与其他不含碳源的物质分开灭菌。
实施例1 500L发酵罐发酵过程中的间歇补料
在50L种子罐中配制30L种子培养基，120℃灭菌30min后冷却至27-29℃，按0.5％(体积比)接种量接入48h种龄的摇瓶种子，然后27-29℃培养28-36h。
在500L发酵罐中配制350L发酵培养基，120℃灭菌30min后冷却至27-29℃，按5％(体积比)接种量接入培养好的种子培养基，发酵过程中控制温度在27-29℃，控制压力在0.04-0.06Mpa，根据溶氧状况控制通气与转速，以确保溶氧在30％以上(设发酵罐初始溶氧为100％)，通气控制在0.5-1VVM，转速控制在120-250rpm，培养过程中流加氨水和10％稀硫酸控制pH在6.0-7.5之间。将发酵罐初始溶氧设定为100％，溶氧在发酵培养开始后持续下降，8-16h左右降至最低点，24h-48h左右开始回升，当发酵液溶氧回升至70％以上且总糖浓度低于30g/L时，每次补加相当于葡萄糖溶液与发酵液质量体积比为2％的500g/L葡萄糖溶液使总糖维持在10-40g/L，同时溶氧恢复并介于40-70％之间。发酵300h左右停止补糖，当溶氧升至90％以上且总糖降至10g/L以下即可放罐，测定最后发酵单位在2.95g/L。
实施例2 5000L发酵罐发酵过程中的连续补料
在500L种子罐中配制300L种子培养基，120℃灭菌30min后冷却至27-29℃，按0.5％(体积比)接种量接入48h种龄的摇瓶种子，然后27-29℃培养28-36h。
在5000L发酵罐中配制3500L发酵培养基，120℃灭菌30min后冷却至27-29℃，按5％(体积比)接种量接入种子培养基，发酵过程中控制温度在27-29℃，控制压力在0.04-0.06Mpa，根据溶氧状况控制通气与转速以确保溶氧在30％以上(设发酵罐初始溶氧为100％)，通气控制在0.5-1VVM，转速控制在90-180rpm，培养过程中流加氨水和10％稀硫酸控制pH在6.0-7.5之间。将发酵罐初始溶氧设定为100％，溶氧在发酵培养开始后持续下降，8-16h左右降至最低点，24h-48h左右开始回升，当发酵液溶氧回升至70％以上且总糖浓度低于30g/L时，以适当流速流加500g/L乳糖与麦芽糖比例1∶1混合溶液使总糖维持在10-40g/L，同时溶氧恢复并介于40-70％之间。发酵300h左右停止补糖，当溶氧升至90％以上且总糖降至10g/L以下即可放罐，测定最后发酵单位在3.24g/L。

Claims (6)

1.一种发酵生产尼莫克汀的方法，在发酵罐中发酵培养蓝灰链霉菌，控制发酵罐的温度为27-29℃，压强为0.04-0.06Mpa；根据发酵液的溶氧状况控制通气与转速，设发酵液初始溶氧为100％，在培养过程中要确保发酵液溶氧在30％以上；并在培养过程中流加氨水和稀硫酸控制pH在6.0-7.5；溶氧在发酵培养开始后持续下降，然后开始回升，当发酵液溶氧回升至70％以上且总糖浓度低于30g/L时，开始间歇或连续补加糖类物质，使总糖浓度维持在10-40g/L，同时溶氧恢复并介于40-70％之间，发酵280h之后当菌浓降至15％以下时停止补糖，当溶氧升至90％以上且总糖降至10g/L以下停止发酵，收获产物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述糖类物质选自单糖、二糖和多糖中一种或多种。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述单糖是葡萄糖和果糖中的一种或两种。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述二糖是乳糖、蔗糖和麦芽糖中的一种或多种。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述多糖是可溶性淀粉、糊精和麦芽糊精中的一种或多种。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述糖类物质配制为300-600g/L的糖溶液，然后间歇补加或连续补加到发酵液中。
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