KR102030776B1 - 최적화된 배양조건을 이용하여 슈도모나스 테트로렌스(Pseudomonas taetrolens)로부터 락토비온산을 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유청 배지가 아닌 최적화된 합성 배지 중에서 슈도모나스 테트로렌스를 배양하여 락토비온산을 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 락토비온산 생산성이 매우 우수하여 짧은 시간 내에 많은 양의 락토비온산을 생산할 수 있으므로 생산 단가를 크게 낮출 수 있다.

Description

최적화된 배양조건을 이용하여 슈도모나스 테트로렌스(Pseudomonas taetrolens)로부터 락토비온산을 생산하는 방법{A Method of Producing Lactobionic Acid Using Pseudomonas taetrolens By Optimization of Culture Condition}

본 발명은 슈도모나스 속 미생물을 이용하여 락토비온산 생산성 향상을 위한 방법에 관한 것이다.

더 상세하게는 본 발명은 유청 배지가 아닌 최적화된 합성 배지 중에서 슈도모나스 테트로렌스를 배양하여 락토비온산을 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.

글리콜릭산 (Glycolic acid), 젖산 (Lactic acid)과 같은 저분자량의 α-하이드록시산은 1970년대에 이미 피부를 박피하는 기능을 가지고 있는 것이 밝혀져서, 현재까지 각질제거제, 주름개선제, 피부미백제 등으로 화장품에 널리 이용되어 오고 있다. 그러나, 사용자에 따라 홍조, 가려움, 따끔거림 등의 피부에 대한 자극 및 부작용이 발생하여 새로운 대체소재의 필요성이 대두되고 있다. 차세대 피부미백 소재로서의 폴리하이드록시 비온산 (Polyhydroxy bionic acid)의 한 종류인 락토비온산 (Lactobionic acid)은 이와 같이 α-하이드록시산이 가지고 있는 각질제거, 주름개선, 피부미백효과는 그대로 가지고 있으면서, 피부에 대한 자극이 적어, 글리콜릭산, 젖산을 대체할 수 있는 차세대 미백제로 주목 받고 있다. 락토비온산은 갈락토오스 (Galactose)와 글루콘산 (Gluconic acid)이 β-1,4 결합으로 형성된 물질로서, 분자량은 358.3이고, 하얀색의 가루형태로 존재하는 물질이다. 락토비온산은 각질제거, 주름개선, 피부미백 효과 외에 생분해성, 생체친화성, 항노화성, 항산화성, 보습성, 킬레이트성 등의 다양한 특성을 가지고 있기 때문에, 화장품 소재로서 매우 유용하여, 락토비온산이 함유된 화장품이 상용화되어 현재 판매되고 있다.

락토비온산은 락토스의 free aldehyde group의 산화에 의해 만들어진다. 락토비온산은 화학적, 전기화학적, 불균일 촉매반응 또는 생물학적 산화에 의해 만들어지며, 이 중 환경친화적인 생물학적 산화에 의한 락토비온산 생산이 최근 많이 연구되고 있다. 생물학적 산화에 의한 락토비온산 생산은 환경친화적이며 부산물 생성이 거의 없다는 점에서 장점을 가진다. 생물학적 락토비온산 생산은 크게 두 가지로 나누어 볼 수 있다. 첫째는 락토스 산화 효소를 이용한 효소적 산화방법이다. 이 방법은 짧은 시간에 높은 수율로 락토스를 락토비온산으로 전환한다. 하지만, 효소의 활성 유지를 위한 조효소를 지속적으로 필요로 하기 때문에 오랜 시간 연속적인 반응에 적합하지 않고, 반응의 부산물로 과산화수소 (H₂O₂)가 생성되기 때문에 식품첨가물 생산에 부적합하다는 단점을 가지고 있다. 두 번째는 미생물을 이용한 생물학적 락토비온산 생산방법이다. 이 방법은 효소를 이용한 반응에 비해 느리다는 단점이 있지만 스케일-업을 통한 대량생산이 가능하고, 유청과 같이 저렴한 재생가능 자원을 활용해서 생산이 가능하다는 큰 장점이 있다.

현재까지 대표적인 락토비온산 생산 미생물 균주로 Pseudomonas taetrolens, Buckholderia cepacia, 및 Zymomonas mobilis 등이 보고되고 있다. 지금까지 보고된 락토비오산 생산성이 가장 높은 균주는 Buckholderia cepacia 이다. 하지만 이 균주는 병원성으로 분류되어 있어 산업적인 활용이 불가능하다. 또한, Pseudomonas 속 미생물로서 Pseudomanas fluorescence를 이용하여 락토비온산을 생산하고자 하는 시도도 있었지만 Pseudomanas fluorescence 역시 병원균이고 특히 암 치료 환자와 같이 면역 체계가 손상된 환자에게 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.

반면 P. taetrolens는 그람 음성의 비병원성으로 분류되어있고, GRAS에 등록된 균주이다. P. taetrolens를 이용한 락토비온산 생산은 대부분 유청을 원료로 사용한 연구들이며, 200 g/L 이하의 낮은 양의 락토비온산 생산이 보고되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

유럽 특허공보 EP 1753297 B1호

본 발명은 미생물 숙주로부터 락토비온산 생산성 향상을 현저히 증가시킬 수 있는 락토비온산 생산성 향상 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 연구에서는 유청이 아닌 새로운 합성배양 배지를 이용한 배양조건 최적화를 통하여 P. taetrolens 미생물에서 락토비온산 생산성 향상에 관한 연구를 진행하였다. 배양조건 최적화는 플라스크를 이용한 pH, 배양온도, 기질인 락토스의 농도 최적화에 따른 락토비온산 생산성 향상을 조건을 탐색하였으며, 유가식 배양에서 feeding 방법 개선과 새로운 feeding 방법 도입을 통해 락토비온산 생산성 극대화를 위한 연구를 진행하였다. 이러한 일련의 연구과정을 통해, 현재까지 보고된 락토비온산 생산을 훨씬 능가하는 생산농도와 생산속도 그리고 생산 수율을 달성하였다.

본 발명의 하나의 관점은 탄소원, 질소원 및 솔트를 포함하는 배지 중에서 슈도모나스 속 미생물을 배양하여 락토비온산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따른 락토비온산의 생산성 향상 방법은 락토비온산 생산능을 가지며, 그람 음성, 비병원성 슈도모나스 속 미생물을 다양한 배양 조건인 pH, 배양온도, 기질인 락토스 농도 등의 배양조건 변화를 포함하는 배양 단계와 feeding 방법 변화를 통한 발효 단계 그리고 분석, 정량하는 방법을 포함한다.

지금까지 알려진 미생물 중에서 가장 높은 락토비온산 생산성은 Buckholderia cepacia 균주로 보고되고 있다. 이 균주를 이용한 락토비온산 생산은 비록 높은 농도의 락토비온산 생산이 가능하지만, 배양시간이 길어 생산성이 낮은 단점을 가지고 있으며, 병원성 미생물이기 때문에 상업적인 제품 생산에 제약이 있다. 반면 P. taetrolens 균주는 비병원성 균주로 분류되고 GRAS 목록에 포함되어있는 안전한 균주이며, 락토비온산 생산능도 뛰어난 것으로 보고되고 있다. 이 균주를 이용한 락토비온산 생산은 지금까지 유청을 이용한 락토비온산 생산성 증가에 관한 연구만 진행되었고, 생산성 또한 낮은 것으로 보고되고 있다. 본 발명자들은 P. taetrolens를 이용하여 유청이 아닌 새로운 합성배지에서 락토비온산 생산성을 획기적으로 증가 시킬 수 있는 배양 조건을 고안하였다.

락토비온산 생산능을 가진 슈도모나스 속 미생물은 예를 들면, 슈도모나스 플로로스캔스 (P. fluorescens), 슈도모나스 모라비언시스 (Pseudomonas moraviensis), 슈도모나스 그라나덴시스 (Pseudomonas granadensis) 또는 슈도모나스 코레언시스 (Pseudomonas Koreensis) 등이 있으나, 바람직하게는 비병원성이자 안전한 균주인 슈도모나스 테트로렌스(Pseudomonas taetrolens)이다.

배양은 합성, 반합성, 또는 복합 배양 배지 상에서 수행될 수 있다. 배양 배지로는 탄소원, 질소원, 염류, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, NB (Nutrient broth) 액체 배지 및 단백질 발현 물질이 첨가된 액체 배지를 사용할 수 있다. 바람직한 구현예에서 상기 배지는 유청(whey)을 포함하지 않는 것을 사용할 수 있다.

탄소원으로는 갈락토스, 맥아당, 올리고당, 전분, 포도당, 과당, 목당, 자당, 젖당 그리고 글리세롤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 젖당이다.

질소원으로는 황산암모늄, 질산암모늄, 질산나트륨, 글루탐산, 카사미노산, 효모추출물, 펩톤, 트립톤, 대두박, 요소, 소고기 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있으며, 바람직하기로는 효모추출물, 펩톤 그리고 소고기추출물 이다. 비타민 및 미네랄 구성원으로는 효모추출물, 소고기추출물, NaCl의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있다.

염류(솔트)는 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염, 리튬염, 철염 및 바륨염으로부터 선택된 1 이상을 사용할 수 있고, 바람직하게는 NaCl을 포함하는 것을 사용할 수 있다.

본 발명은 이와 같이 슈도모나스 테트로렌스(Pseudomonas taetrolens) 배양을 위하여 탄소원으로서 젖당; 질소원으로서 효모추출물(yeast extract), 펩톤(peptone) 및 소고기추출물(beef extract)로부터 선택되는 1 이상; 및 솔트를 포함하는 슈도모나스 테트로렌스(Pseudomonas taetrolens) 배양용 조성물을 제공할 수 있다.

배양은 통상의 미생물 배양 조건으로 수행될 수 있다. 배양은 예를 들어 약 15-45℃, 예를 들면, 15-44℃, 15-43℃, 15-42℃, 15-41℃, 15-40℃, 15-39℃, 15-38℃, 15-37℃, 15-36℃, 15-35℃, 15-34℃, 15-33℃, 15-32℃, 15-31℃, 15-30℃, 20-45℃, 20-44℃, 20-43℃, 20-42℃, 20-41℃, 20-40℃, 20-39℃, 20-38℃, 20-37℃, 20-36℃, 20-35℃, 20-34℃, 20-33℃, 20-32℃, 20-31℃, 20-30℃, 25-45℃, 25-44℃, 25-43℃, 25-42℃, 25-41℃, 25-40℃, 25-39℃, 25-38℃, 25-37℃, 25-36℃, 25-35℃, 25-34℃, 25-33℃, 25-32℃, 25-31℃, 25-30℃, 27-45℃, 27-44℃, 27-43℃, 27-42℃, 27-41℃, 27-40℃, 27-39℃, 27-38℃, 27-37℃, 27-36℃, 27-35℃, 27-34℃, 27-33℃, 27-32℃, 27-31℃ 또는 27-30℃에서 수행될 수 있다.

배양액 중의 배양 배지를 제거하고 농축된 균체 만을 회수하거나 제거하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자의 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동하거나 냉동건조하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.

배양의 일 예에 있어서, 배양은 질소원으로서 효모추출물, 펩톤 그리고 소고기추출물을 포함하는 배지에서 이루어지는 것일 수 있다. 효모추출물, 펩톤 소고기추출물은 배지 중의 유일한 질소원 일 수 있다. 0.5-5.0%(w/v), 예를 들면, 0.5-4.5%(w/v), 0.5-4.0%(w/v), 0.5-3.5%(w/v), 0.5-3.0%(w/v), 0.5-2.5%(w/v), 0.5-2.0%(w/v), 1-5.0%(w/v), 1-4.5%(w/v), 1-4.0%(w/v), 1-3.5%(w/v), 1-3.0%(w/v) 또는 1-2.5%(w/v)의 효모추출물, 펩톤 그리고 소고기추출물을 포함하는 배지에서 이루어지는 것일 수 있다.

상기 배지는 젖당이 첨가된 NB 배지일 수 있으며, 효모추출물, 펩톤, 소고기추출물을 포함할 수 있으며, 그리고 NaCl이 포함된 배지일 수 있다. NB 배지는 리터당 1g beef extract, 2g yeast extract, 5g 펩톤, 5g NaCl (pH 7.5)이다.

상기 NB 배지는 젖당, 효모추출물, 펩톤, 소고기추출물, NaCl 그리고 pH 보정을 위해 CaCO₃를 포함한 것일 수 있다. 0.5-5.0%(w/v), 예를 들면, 0.5-4.5%(w/v), 0.5-4.0%(w/v), 0.5-3.5%(w/v), 0.5-3.0%(w/v), 0.5-2.5%(w/v), 0.5-2.0%(w/v), 1-5.0%(w/v), 1-4.5%(w/v), 1-4.0%(w/v), 1-3.5%(w/v), 1-3.0%(w/v) 또는 1-2.5%(w/v)의 CaCO₃를 포함하는 배지일 수 있다.

CaCO₃는 배양 도중 첨가 될 수 있다. 2.0-20.0%(w/v), 예를 들면, 2.0-18%(w/v), 2.0-16%(w/v), 2.0-14%(w/v), 2.0-12%(w/v), 2.0-10%(w/v), 2.0-8%(w/v), 5.0-20%(w/v), 5.0-18%(w/v), 5.0-16%(w/v), 5.0-14%(w/v), 5.0-12%(w/v) 또는 5.0-10%(w/v)의 CaCO₃ 가 첨가 될 수 있다.

배양의 일 예에 있어서, 배양은 탄소원으로서 젖당을 포함하는 배지에서 이루어지는 것일 수 있다. 젖당이 유일한 탄소원 일 수 있다. 2.0-20.0%(w/v), 예를 들면, 2.0-18%(w/v), 2.0-16%(w/v), 2.0-14%(w/v), 2.0-12%(w/v), 2.0-10%(w/v), 2.0-8%(w/v), 5.0-20%(w/v), 5.0-18%(w/v), 5.0-16%(w/v), 5.0-14%(w/v), 5.0-12%(w/v) 또는 5.0-10%(w/v)의 젖당을 포함하는 배지에서 이루어지는 것일 수 있다.

상기 젖당은 배양 도중 완전히 용해되지 않은 상태 또는 가루 형태로 첨가 될 수 있다. 2.0-20.0%(w/v), 예를 들면, 2.0-18%(w/v), 2.0-16%(w/v), 2.0-14%(w/v), 2.0-12%(w/v), 2.0-10%(w/v), 2.0-8%(w/v), 5.0-20%(w/v), 5.0-18%(w/v), 5.0-16%(w/v), 5.0-14%(w/v), 5.0-12%(w/v) 또는 5.0-10%(w/v)의 젖당을 용해되지 않은 상태 또는 가루 형태로 첨가 될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 슈도모나스의 경우 상기 배양하는 단계에서 상기 배지는 1 내지 20부피 % 농도의 젖당을 포함하고, 0.2 % 효모추출물과 0.5 % 펩톤 그리고 0.1 % 소고기추출물을 포함하고, 0.5 % NaCl을 포함한다. 상기 슈도모나스 속 미생물은 슈도모나스 테트로렌스 이고, 상기 배양하는 단계는 NB 배지 50 ml 내지 2.0 L, 20 ℃ 내지 37 ℃에서 48 내지 120시간 동안 배양시키는 것일 수 있다.

필요에 따라, 배양은 젖당 농도에 따라 배양 할 수 있고, pH 보정물질인 CaCO₃ 존재 하의 배양 배지에서, 예를 들면 배지에 젖당 농도를 10 g/L 에서 200 g/L까지 다양하게 사용할 수 있고, CaCO₃ 첨가 또는 미첨가 상태로 수행될 수 있다.

배양은 교반되는 상태에서 수행될 수 있다. 교반되는 경우, 100 내지 300rpm, 예를 들면, 100 내지 280rpm, 100 내지 260rpm, 100 내지 240rpm, 100 내지 220rpm, 100 내지 200rpm, 100 내지 180rpm, 100 내지 160rpm, 100 내지 140rpm, 100 내지 120rpm, 120 내지 300rpm, 120 내지 280rpm, 120 내지 260rpm, 120 내지 240rpm, 120 내지 220rpm, 120 내지 200rpm, 120 내지 180rpm, 120 내지 160rpm, 120 내지 140rpm, 150 내지 300rpm, 150 내지 280rpm, 150 내지 260rpm, 150 내지 240rpm, 150 내지 220rpm, 150 내지 200rpm, 150 내지 180rpm, 140 내지 160rpm, 200 내지 300rpm, 200 내지 280rpm, 200 내지 260rpm, 200 내지 240rpm, 200 내지 220rpm, 또는 150 rpm으로 교반 될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 배양은 유가식 배양(fed-batch culture) 방법에 의하여 수행될 수 있다. 배양 방법 중 회분배양은 발효가 일단 시작되면 배지를 추가하지도 제거하지도 않는다. 연속배양은 배지를 연속으로 공급하고 또한 제거한다. 그러나 유가식 배양이란 배지를 간헐으로 공급하는 배양법으로서 배양액 중의 기질농도를 임의로 제어할 수 있다. 그리고 기질은 적당한 속도로 첨가되며 유출이 없기 때문에 공급되는 기질의 양과 미생물에 의한 소비량 사이에 균형을 유지함으로써 기질을 자유롭게 제어할 수 있다. 유가식 배양에서는 배양 시간에 따라 배양액의 부피, 균체농도 등이 변화하며, 유가식 배양은 기질이 비교적 낮은 농도에서 세포의 생장을 해하는 경우, 특정 기질의 농도가 높아지면 목적 생산물의 생성이 억제되는 경우 또는 영양요구성주(auxotroph)의 배양에서 특정 요구물질의 첨가가 필요한 경우에 유용한 배양방법이다.

본 발명의 유가식 배양 방법은 슬러시 형태의 젖당과 젖당 분말을 직접적으로 첨가하는 방식으로 수행될 수 있다.

본 발명의 락토비온산 생산용 배지와 배양조건 그리고 유가식 발효 조건은 락토비온산 생산성이 매우 우수하다. 이에 따라, 짧은 시간 내에 많은 양의 락토비온산을 생산할 수 있어, 생산성을 크게 높일 수 있다.

도 1은 P. taetrolens를 이용하여 젖당 첨가 농도에 따른 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 P. taetrolens를 이용하여 pH 보정 유무에 따른 생산성 차이를 알아보기 위하여 모든 배양에 동일하게 30 g/L를 CaCO₃를 첨가하여 배양을 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 P. taetrolens에서 온도 변화에 따른 락토비온산 생산성을 비교하기 위한 배양을 진행한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 P. taetrolens의 5 L 발효기에서 락토비온산 생산을 위한 발효를 진행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 P. taetrolens를 이용하여 발효 초기 젖당의 첨가량을 기존 젖당의 용해도인 200 g/L 에서 500 g/L로 높게 조정하여 발효를 진행한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 P. taetrolens를 이용한 슬러시 형태의 젖당을 부가적으로 첨가한 유가식 발효 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 P. taetrolens를 이용한 젖당 분말을 직접 첨가한 유가식 발효 결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

1. 배양온도 변화와 pH 보정 유무에 따른 락토비온산 생산성 변화

호스트 균주인 P. taetrolens(한국생명공학연구원 생물자원센터에서 P. taetrolens KCTC 12501 균주를 구매함)를 이용하여 락토비온산 생산에 가장 효과적인 최적인 젖당 농도와 pH 보정 유무에 따른 생산성 차이를 알아보기 위한 배양을 진행하였다(도 1).

배양에 사용한 배지는 Nutrient broth (NB) (1 g/L beef extract, 2 g/L yeast extract, 5 g/L 펩톤, 5 g/L NaCl)을 사용하였다. 최적의 젖당 농도를 확인하기 위하여 배지에 각각 0, 50, 100, 150 그리고 200 g/L 젖당을 첨가하여 배양하였다. 슈도모나스 테트로렌스 냉동보관 균주를 NB plate에 streaking 하고 25 ℃에서 48 시간 배양 후 형성된 colony를 5 ml NB 배지에 접종하여 25 ℃에서 200 rpm으로 24 시간 진탕 배양 하였다. 배양된 seed culture를 최종 OD 0.1이 되도록 본 배지에 접종하였다. 배양은 250 ml round flask에 50 ml 배지를 첨가하여 25 ℃ 에서 200 rpm으로 진행하였다. 배양 결과는 12시간 간격으로 이루어졌으며, 세포생장, pH, 젖당 소모량 그리고 락토비온산 생산량을 측정하였다.

배양결과 젖당 첨가 농도와 상관없이 10 g/L 미만의 젖당 소모량과 락토비온산 생산이 확인되었다 (도 1C, D). 이는 젖당의 락토비온산 전환으로 인한 pH의 하락이 원인이며, pH 6.0 이하의 조건에서 락토비온산 생산이 급격히 저하 또는 생산이 되지 않는다는 것으로 확인하였다 (도 1B). 상기 결과로 P. taetrolens가 젖당을 락토비온산으로 효율적으로 전환하기 위해서는 pH의 보정이 반드시 수반되어야 한다는 사실을 확인하였다. 세포생장은 젖당이 포함된 배양에서 대부분 약 OD 4.5 정도의 세포생장을 나타내었으며, 젖당이 포함되지 않은 배양에서 세포생장이 낮게 나타나는 것은 P. taetrolens 균주가 젖당을 탄소원으로 사용한다는 것을 의미한다 (도 1A).

상기 젖당 농도를 포함한 배지에 pH 보정 유무에 따른 생산성 차이를 알아보기 위하여 CaCO₃를 첨가한 배양을 진행하였다. 모든 배양에 동일하게 30 g/L를 CaCO₃를 첨가하여 배양을 실시하였다 (도 2). 배양 조건은 상기 배양과 동일하다. 배양결과 젖당을 첨가한 모든 배양에서 pH 6.0을 유지하였으며 (도 2B), 락토비온산 생산 또한 배양 종료시점인 72시간 까지 지속되는 것으로 확인되었다 (도 2D). 가장 높은 락토비온산 생산을 보인 배양은 200 g/L 젖당을 첨가한 배양이며 109.5 g/L 젖당을 소모하여 95 g/L 락토비온산을 생산한 것으로 나타내었으며, 수율은 약 90.5 %, 시간당 생산성은 약 1.32 g/L/h를 나타내었다 (도 2D). 이 결과는 50 g/L 젖당을 첨가한 배양 (40 g/L 락토비온산 생산)에 비해 약 240 % 높은 수치이며, 이 결과는 P. taetrolens 에서 높은 농도의 젖당 첨가가 락토비온산 생산 효율을 증가시킨다는 사실을 보여준다. 세포생장의 경우 가장 높은 젖당 농도인 200 g/L 첨가 배양에서 세포생장의 저해를 보이지 않은 것으로 나타났고, 이는 P. taetrolens 균주가 높은 농도의 젖당에 저항성을 가지고 있다는 것을 나타낸다 (도 2A).

상기의 결과들을 종합해볼 때 P. taetrolens를 이용한 락토비온산 생산에서 pH의 보정은 중요한 요소이며 pH 6.0 이상으로 유지하는 것이 중요하다. 젖당의 농도가 높을수록 더 효율적으로 락토비온산을 생산하며, 높은 농도의 젖당에도 세포생장의 저해를 받지 않는다는 사실을 확인하였다.

2. 배양 온도 변화에 따른 락토비온산 생산성 비교

슈도모나스 균주의 경우 넓은 범위 (10 ~ 42 ℃)의 온도에서 생장이 가능 하지만, 대부분의 슈도모나스 균주는 중저온성 균주로 대장균에 비해 낮은 온도에서 더 높은 활성을 나타내는 경우가 많다. 이러한 결과로 인해 지금까지 P. taetrolens를 이용한 락토비온산 생산은 30 ℃ 에서 주로 이루어졌다. 하지만 다양한 온도에서 P. taetrolens의 락토비온산 생산성을 확인한 보고는 현재까지 없다. 이에 P. taetrolens에서 온도 변화에 따른 락토비온산 생산성을 비교하기 위한 배양을 진행하였다 (도 3).

배양에 사용된 배지는 Nutrient broth (NB) (1 g/L beef extract, 2 g/L yeast extract, 5 g/L 펩톤, 5 g/L NaCl)을 사용하였고, 상기 젖당 농도 변화와 pH 보정 실험결과를 바탕으로 200 g/L 젖당과 pH 보정을 위해 30 g/L CaCO₃를 첨가한 배지를 사용하였다. 배양은 250 ml round flask에 50 ml 배지를 첨가하여 200 rpm으로 진탕 배양 하였다. 배양 온도는 20, 25, 30, 37 ℃ 4 가지 다른 온도로 진행되었다. 최종 접종 농도는 OD 0.1 되도록 접종하였다. 배양은 72시간 진행되었으며, 결과는 12시간 간격으로 이루어졌고, 세포생장, pH, 젖당 소모량 그리고 락토비온산 생산량을 측정하였다.

배양결과 세포 생장이 가장 높은 온도는 30 ℃, 락토비온산 생산이 가장 높았던 온도는 25 ℃로 나타났다. 반면 37 ℃ 에서는 세포생장과 락토비온산 생산이 매우 저조한 것으로 나타났다 (도 3A). 락토비온산 생산성이 가장 높았던 25 ℃ 에서는 180.5 g/L 락토비온산이 생산 되었으며 전환율은 90 %, 시간당 생산성은 약 2.5 g/L/h 를 나타내어 기존 P. taetrolens 배양 온도인 30 ℃에 비해 약 184 % 향상된 결과를 보여주었다 (도 3D). 더 세밀한 배양온도 최적화를 위하여 23, 28, 34 ℃ 에서 배양을 실시한 결과 25 ℃ 배양 결과에 미치지 못하는 결과를 얻었으며, P. taetrolens에서 락토비온산 생산을 위한 최적 온도는 25 ℃ 라는 것을 확인하였다.

3. 발효기를 통한 락토비온산 생산

젖당으로부터 락토비온산 생산을 위해서는 P. taetrolens의 oxidase 효소의 작용이 중요하고, 이 효소의 효과적인 작용을 위해서는 적당한 산소가 공급되어야 한다. 이를 위해서는 지속적인 용존 산소 농도유지가 중요한 요소이다. 이를 위해 상기 플라스크 배양에서 최적화된 배양 조건을 이용하여 5 L 발효기에서 락토비온산 생산을 위한 발효를 진행하였다 (도 4).

발효에 사용된 배지는 Nutrient broth (NB) (1 g/L beef extract, 2 g/L yeast extract, 5 g/L 펩톤, 5 g/L NaCl)을 사용하였고, 상기 젖당 농도 변화와 pH 보정 실험결과를 바탕으로 200 g/L 젖당과 pH 보정을 위해 30 g/L CaCO₃를 첨가한 배지를 사용하였다. 배양은 5 L 발효조에 2 L 배지를 첨가하여 온도는 25 ℃에서 실시하였다. 용존산소 농도는 30 %로 지정하였으며 용존산소 농도 유지를 위하여 교반 속도를 200 ~ 500 rpm까지 조절하며 발효를 실시하였다. 슈도모나스 테트로렌스 냉동보관 균주를 NB plate에 streaking 하고 25 ℃에서 48 시간 배양 후 형성된 colony를 5 ml NB 배지에 접종하여 25 ℃에서 200 rpm으로 24 시간 진탕 배양 하였다. 배양된 seed culture를 100 ml NB 배지에 접종하여 25 ℃에서 200 rpm으로 24 시간 진탕 배양 한 후 최종 OD 0.1이 되도록 발효 배지에 접종하였다. 발효는 48시간 진행되었으며, 결과는 12시간 간격으로 이루어졌고, 세포생장, pH, 젖당 소모량 그리고 락토비온산 생산량을 측정하였다.

배양결과 첨가된 젖당은 배양 36 시간에 모두 소진되었으며 락토비온산 생산 농도는 178 g/L로 플라스크 배양 결과인 180 g/L 에 비해 낮은 농도를 나타내었다. 하지만 시간당 락토비온산 생산성은 2.5 g/L/h 에서 4.9 g/L/h로 198 % 증가한 결과를 나타내었다. 이 결과는 현재까지 보고된 P. taetrolens를 이용한 락토비온산 생산에서 가장 높은 수치이다. 상기 결과로 적절한 산소의 공급이 P. taetrolens에서 락토비온산 생산성을 향상시키는데 매우 중요한 요소라는 것을 확인하였다.

4. 고농도 젖당이 첨가된 발효 방법을 통한 락토비온산 생산성 향상

젖당의 낮은 용해도(198 g/L)로 인해 젖당을 전구체로 하는 물질 생산에서 젖당의 용해도 보다 높은 농도의 물질 생산이 불가능 하다는 문제점이 있다. 하지만 이런 낮은 용해도는 젖당을 전구체로 활용해서 유용물질을 생산하는 호스트 균주에게는 삼투압으로 인한 세포활성 저해 현상을 완화할 수 있기 때문에 장점으로 작용할 수 있다. 젖당의 용해도보다 많은 양의 젖당을 첨가해 배양을 시작하게 되면 일부의 젖당은 배지에 용해된 상태로 존재하고 일부는 용해되지 않은 슬러시 상태로 존재하게 된다. 배지에 용해된 젖당은 호스트 균주인 P. taetrolens에 의해 락토비온산으로 전환되고 젖당이 소모된 양 만큼 슬러시 형태의 젖당이 배지에 용해되어 젖당의 농도를 유지할 것이다. 이러한 과정이 반복되어 기존 젖당의 용해도 이상의 농도로 생산이 불가능 했던 락토비온산의 생산농도를 그 이상으로 높일 수 있을 것이다. 상기의 이론들을 참고하여 발효 초기 젖당의 첨가량을 기존 젖당의 용해도인 200 g/L 에서 500 g/L로 높게 조정하여 발효를 진행하였다 (도 5).

발효에 사용된 배지는 Nutrient broth (NB) (1 g/L beef extract, 2 g/L yeast extract, 5 g/L 펩톤, 5 g/L NaCl)을 사용하였고, 500 g/L 젖당과 pH 보정을 위해 30 g/L CaCO₃를 첨가한 배지를 사용하였다. 배양은 5 L 발효조에 2 L 배지를 첨가하여 온도는 25 ℃에서 실시하였다. 용존산소 농도는 30 %로 지정하였으며 용존산소 농도 유지를 위하여 교반 속도를 200 ~ 500 rpm까지 조절하며 발효를 실시하였다. 발효배지에 접종할 seed culture의 배양과 본배양에 접종 방법은 상기 실시예 3과 동일하게 실시하였다. 발효도중 배지의 pH 보정을 위하여 CaCO₃를 4 회 첨가하였다. 발효는 120시간 진행되었으며, 결과는 12시간 간격으로 이루어졌고, 세포생장, pH, 젖당 소모량 그리고 락토비온산 생산량을 측정하였다.

배양결과 배양 120 시간에 첨가된 젖당이 완전히 소진되었으며 락토비온산 생산농도는 373.25 g/L를 나타내었고 젖당에서 락토비온산으로 전환율은 약 75 %, 시간당 생산성은 3.1 g/L/h로 확인되었다 (도 5A). 이 결과는 기존 200 g/L 젖당 첨가 발효에 비해 전환율과 시간당 생산성이 낮아지는 결과를 보였다. 하지만 현재까지 보고된 batch-fermentation 결과 중 가장 높은 농도의 락토비온산 생산을 기록하였다.

5. 유가식발효를 통한 락토비온산 생산성 향상

상기 실시예 4의 결과를 고려하여, 높은 농도의 락토비온산 생산을 위해 유가식발효에 필요한 feeding 방법을 고안하고 적용하였다. 유가식발효에서 젖당의 낮은 용해도로 때문에 최고 농도의 젖당을 배양도중 첨가하더라도 생산물의 농도는 증가하지 않고 배양 용량만 증가하게 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 배양도중 첨가하는 젖당을 완전 용해되지 않은 슬러시(slush) 형태와 가루 형태로 첨가하는 유가식 배양 방식을 고안하고 발효에 직접 적용하였다 (도 6, 7).

발효에 사용된 배지는 Nutrient broth (NB) (1 g/L beef extract, 2 g/L yeast extract, 5 g/L 펩톤, 5 g/L NaCl)을 사용하였고, 200 g/L 젖당과 pH 보정을 위해 30 g/L CaCO₃를 첨가한 배지를 사용하였다. 배양은 5 L 발효조에 2 L 배지를 첨가하여 온도는 25 ℃에서 실시하였다. 용존산소 농도는 30 %로 지정하였으며 용존산소 농도 유지를 위하여 교반 속도를 200 ~ 500 rpm까지 조절하며 발효를 실시하였다. 발효배지에 접종할 seed culture의 배양과 본배양에 접종 방법은 상기 실시예 3과 동일하게 실시하였다. 발효도중 젖당의 첨가는 500 g/L 젖당을 슬러시 형태로 첨가하거나 젖당 분말을 직접 첨가하는 방법을 사용하였다. 발효 중 배지의 pH 보정을 위하여 CaCO₃를 젖당 첨가 시점에 부가적으로 첨가하였다. 발효는 120시간 진행되었으며, 결과는 12시간 간격으로 이루어졌고, 세포생장, pH, 젖당 소모량 그리고 락토비온산 생산량을 측정하였다.

슬러시 형태의 젖당을 부가적으로 첨가한 유가식발효 결과 (도 6), 500 g/L 젖당을 총 6 회 첨가하여 최종 1,500 g 젖당을 3.0 L 용량으로 첨가되었고, 30 g/L CaCO₃를 7 회 첨가되었다. 배양 60 시간에 증가된 발효 용량을 2.0 L로 1회 조정하였다. 배양 120 시간에 락토비온산 생산 농도는 362.3 g/L를 나타내었다. 첫 번째 젖산 첨가 전인 배양 34 시간에 젖산 농도는 188 g/L로 매우 높은 생산성을 나타내었지만, 50 % 농도의 젖산 첨가 후 기존 생산되었던 락토비온산의 농도가 희석되어 낮아지는 결과를 나타내었다. 실시예 4의 발효 결과에 비해 락토비온산 생산성은 매우 향상되었지만, 배양도중 첨가되는 젖당으로 인한 희석 비율이 높아 최종적인 락토비온산 생산농도는 예상보다 높아지지 않는 결과를 보였다.

젖당 분말을 직접 첨가한 발효 (도 7)의 경우 200 g 젖당을 5 회 첨가하여 최종 1,000 g 젖당이 첨가되었고 30 g/L CaCO₃를 5 회 첨가되었다. 락토비온산은 배양 120 시간에 505.4 g/L 생산되었고, 전화률은 84.2 %, 시간당 생산성은 4.2 g/L/h를 나타내었다. 이 결과는 현재까지 보고된 미생물 유래 락토비온산 생산에서 세계 최고의 결과이며 (125 % 향상), 기존 보고된 P. taetrolens를 이용한 락토비온산 생산 농도에 비해 약 310 % 향상된 결과이다.

Claims (11)

1. 탄소원, 질소원 및 솔트를 포함하는 배지 중에서 슈도모나스 테트로렌스(Pseudomonas taetrolens)를 배양하여 락토비온산을 생산하는 방법으로서,
   상기 배양은 유가식 배양(fed-batch culture) 방법에 의하여 수행되고,
   상기 유가식 배양 방법은 슬러시 형태의 젖당 및 젖당 분말로부터 선택되는 1 이상을 직접적으로 첨가하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 배지는 유청(whey)을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 유가식 배양 방법은 젖당 분말을 직접적으로 첨가하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 탄소원은 용존 젖당(dissolved lactose)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 질소원은 효모추출물(yeast extract), 펩톤(peptone) 및 소고기추출물(beef extract)로부터 선택되는 1 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 솔트는 NaCl을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제5항에 있어서, 상기 용존 젖당은 10 내지 200 g/L의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 배양은 CaCO₃를 첨가하는 것에 의하여 pH를 보정하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 배양은 20 내지 37℃의 온도 조건 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
    
11. 삭제

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