CN101617038B - 利用棒状杆菌从含有甘油的碳源中生产发酵产品的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用棒状杆菌从含甘油的多种碳源中生产发酵产品的方法。更特殊地，本发明涉及一种利用发酵棒状杆菌从含有甘油或部分甘油的碳源中高效且高产地生产发酵产品的方法，其中所述棒状杆菌中引入了促进培养基中甘油的利用并促进工业上有用的氨基酸积累的外源基因glpDFK。

Description

利用棒状杆菌从含有甘油的碳源中生产发酵产品的方法
技术领域
本发明涉及一种利用棒状杆菌从含有甘油的多种碳源中生产发酵产品的方法。更特殊地，本发明涉及通过棒状杆菌利用甘油以高得率、高产率生产诸如氨基酸之类发酵产品的方法，其中所述发酵棒状杆菌中引入了利用外源性甘油并能够在添加甘油的培养基中积累商业用途的氨基酸的外源基因，所述氨基酸为例如天门冬氨酸、苏氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及其中间代谢产物，其中作为碳源的甘油是石油工业中生产生物柴油的过程中所产生的副产品。
背景技术
上述氨基酸都是非常有用的。天门冬氨酸被用作天门冬氨酰苯丙氨酸甲酯的原料，而赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和色氨酸被用作饲料、食物和药品中的氨基酸。天冬酰胺酸、异亮氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸和酪氨酸也被用作食物和药品中的氨基酸。并且，高丝氨酸和O-琥珀酰基高丝氨酸也可用作氨基酸生产中的前体。
随着油价的不断上涨，利用自然界可循环材料开发替代能源越来越受关注。在众多作为替代能源的候选物中，从植物油中获取的生物柴油和通过发酵产生的生物酒精是最引人注目的候选物。生物柴油是指通过以植物油为底物在催化剂存在的情况下与产生的甲醇经过酯化反应所合成的脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯。在合成过程中，必然产生占总重10％的副产品甘油。
甘油(C3H8O3)是由葡萄糖(C6H12O6)通过一步还原转变而来的，其能在微生物的代谢过程中提供改进的还原力。发酵产生的许多产物在其代谢途径中都需要还原力。因此，假如甘油能被有效地用作底物，所期望的发酵产品的产量和产率都将提高。尽管期望如此，但关于甘油的研究仍仅限于reuterin(Talarico等Antimicrob.Agents Chemother.，32：1854-1858(1988))，2，3-丁二醇(Biebl，等，Appl Microbiol.Biotechnol.50：24-29(1998))，1，3-丙二醇(Menzel，et.al.，Enzyme Microb.Technol.，20：82-86(1997))，丁二酸(韩国专利号10-0313134)，甲叉丁二酸(美国专利号5,457,040)，3-羟丙醛(Doleyres等Appl.Micribiol.Biotechnol.68(4)：467-474(2005))和丙酸(Himmi等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，53：435-440(2000))。这是因为甘油的价格比用于发酵工业的任何其他碳源都要高。目前，关于通过发酵生产甘油的研究都正在进行中(Wang等，Biotechnol.Adv.，19(3)：201-223(2001))。
然而，随着生物柴油产量的增加，甘油的产量也在增加，导致其价格迅速下降。因此，有报道称，已经用包括甘油在内的生物柴油副产品，生产出了1，3-丙二醇(Gonzalez-Pajuelo等，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.31：442-446，(2004))、氢气和乙醇(Ito等，J.Biosci.Bioeng.，100(3)：260-265(2005))。然而，尚未有报道利用甘油生产最具有代表性的发酵产物氨基酸以及其它主要代谢物。
迄今甘油产自肥皂、脂肪酸、蜡和表面活性剂工业。然而，如上所提及的，随着生物柴油产量的不断增加，有效处理包括甘油在内的副产品的问题也可能随之产生。同时，可以预料纯化甘油的价格也将下降。因此，利用甘油生产有用的发酵产品的也可能带来远超预期的效果。
在微生物中利用甘油的案例已报道有大肠杆菌和肺炎克雷伯菌。在大肠杆菌中，通过利用GlpF，使甘油从细胞外渗入细胞内却不消耗能量。GlpF是一种对水、甘油和尿素都具有渗透性的水甘油通道蛋白(Heller等，J.Bacteriol.144：274-278，(1980))。甘油在甘油激酶的作用下转化为甘油-3-磷酸，其在甘油-3-磷酸脱氢酶的作用下转化为二羟基丙酮磷酸(DHAP)，然后在磷酸丙糖异构酶(TpiA)的作用下转化为甘油醛-3-磷酸(G-3-P)，之后是最终代谢作用(Lin EC，Annu.Rev.Microbiol.30：535-578，(1976))。如果甘油激酶不具有活性，甘油则在甘油脱氢酶(Gdh)的作用下转化为二羟基丙酮(DHA)，随后在甘油激酶或二羟基丙酮激酶(DHA激酶)的作用下转化为二羟基丙酮磷酸(DHAP)，然后在最终代谢前转化为甘油醛-3-磷酸(G-3-P)(Paulsen等，Microbiology，146：2343-2344，(2000))。这种甘油代谢途径受到多种因子的调节。特别地，当甘油和葡萄糖同时存在时，野生型大肠杆菌首先完全利用葡萄糖，然后利用甘油(Lin，Annu.Rev.Microbiol.30：535-578，(1976))。
棒状杆菌属微生物已经被广泛应用于工业领域。例如，谷氨酸棒状杆菌已用于生产赖氨酸和谷胺酸钠等这类氨基酸，并且产氨棒杆菌已被工业上广泛用于发酵生产核酸。据报道，棒状杆菌可以利用各种碳源如葡萄糖和原糖来进行发酵。另据报道，通过引入一种基因如xylAB后，棒状杆菌也可以利用木糖(Kawaguchi等，Appl.Envion.Microbiol.72(5)：3418-3428(2006))。然而，很少有棒状杆菌可利用甘油作为碳源的报道。谷氨酸棒状杆菌利用甘油的情况也非常少(Korean Patent Application No.2006-057633)。
在棒状杆菌属微生物中，只对4种微生物进行了分析以确认它们的总基因组序列。而且，仅在白喉棒状杆菌中发现了利用甘油的完整基因，并且，在其它三种微生物谷氨酸棒状杆菌、棒杆菌efficiens和杰克棒状杆菌则缺乏参与甘油消耗的这种基因如GlpF。基因缺陷是棒状杆菌有效利用甘油的主要障碍。
发明内容
技术问题
正如上文所述，使用生物柴油生产的副产品甘油作为碳源具有附加价值。因此，在此基础上，本发明人将我们的研究重点放在诸如谷氨酸棒状杆菌和产氨棒杆菌之类具有高工业实用价值的棒状杆菌对甘油的可利用性上。结果，本发明人通过证实将参与甘油利用的外源基因引入到这些棒状杆菌能够显著提高其对甘油的利用率从而完成了本发明。
本发明的目的在于提供一种参与利用甘油的基因来显著提高棒状杆菌对甘油的同化作用。
本发明的另一目的在于提供一种能单独利用甘油作为其碳源或同时利用其它碳源的源于棒状杆菌的突变体。
本发明的又一目的在于提供一种通过发酵利用含甘油或一部分甘油的碳源的棒状杆菌来生产发酵产品的方法。
技术方案
本发明的上述目的和其它目的能通过本发明的下列具体实施例实现。
下面对本发明作具体说明。
为实现本发明的目的，本发明提供了参与甘油利用的基因来显著提高棒状杆菌对甘油的同化作用。
本文中参与甘油利用的基因是指编码源于白喉棒状杆菌的促进甘油摄取蛋白的基因(下文称为glpF)，编码利用ATP进行磷酸化作用产生甘油-3-磷酸的甘油激酶的基因(下文称为glpK)，以及编码通过氧化甘油-3-磷酸产生二羟基丙酮-3-磷酸的甘油-3-磷酸脱氢酶的基因(下文称为glpD)。
这种基因包括能在棒状杆菌中编码多肽的一些基因以具有摄取细胞外甘油的作用并通过磷酸化作用将甘油转化为甘油-3-磷酸，以及将甘油-3-磷酸转化为二羟基丙酮-3-磷酸，最后将二羟基丙酮-3-磷酸转化为糖酵解的中间产物甘油醛-3-磷酸，从而来代谢甘油的过程中发挥重要作用。
这种基因可来源于动物、植物和微生物。但更优选选择来自微生物的基因，特别是来源于白喉棒状杆菌NCTC13129(Genebank登录号：NC_002935)的基因。
本发明也提供了一种来源于棒状杆菌，能单独利用甘油作为其碳源或同时利用其它碳源的突变体。
本发明所用菌株能同时靠消耗甘油和葡萄糖以有效利用甘油来生长。当葡萄糖和甘油同时作为碳源时，野生型大肠杆菌先利用葡萄糖，等消耗了全部葡萄糖后，野生型大肠杆菌才利用甘油，这种方式称为“二次生长现象”。因此，当提供含甘油的复合碳源时，发酵效率会降低。
为了克服上述难题，本发明人研究了本菌株中同时利用葡萄糖和甘油的可能性。结果，本发明人证实插入来源于棒状杆菌中的参与甘油利用的外源基因能有效利用甘油以及其它碳源。
在本发明的一个优选实施例中，本发明人提供了其中包含来源于白喉棒状杆菌的基因的微生物，该基因编码参与甘油利用的蛋白GlpF(Genebank登录号：NC_940539.1)，GIpK(Genebank登录号：NC_940538.1)和GIpD(Genebank登录号：NC_040540.1)。该基因在棒状杆菌中的转化能够通过本领域已知的常规方法实现，并且能提供利用含甘油或一部分甘油的碳源生产氨基酸的棒状杆菌突变体。
用于本发明的载体并不仅限于特定的一种，任何报告过的表达载体均可被使用。特别地，优选大肠杆菌-棒状杆菌穿梭载体pECCG117(Biotechnology letters vol 13，No.10，p.721-726(1991))。
在本说明书中，术语“转化”是指将一种基因引入宿主细胞并在其中表达基因的过程。该转化基因包括一些基因，只要其能在细胞中表达，无论是插入宿主细胞的染色体中或存在于染色体外都可以。该基因是能编码多肽的多聚核苷酸并包括DNA和RNA。该基因的引入只要它能在宿主细胞中表达，就不仅限于这种模式。例如，该基因能作为一个表达框被引入宿主细胞，该表达框是包含了对自动表达而言所必须的每个表达元件的多聚核苷酸构建体。该包含启动子的表达框与基因，转录终止子/核糖体结合位点以及翻译终止子可操作地连接。该表达框可以是能自我复制的表达载体。此外，通过将其本身或以多聚核苷酸构建体的形式引入宿主细胞的方式，该基因能可操作地连接到在宿主细胞中表达所必须的序列上。
在本发明的优选实施方式中，该转化是通过将带有glpDFK基因的载体转入宿主细胞中，并通过电脉冲的方法引入获得质粒来实现的。该转化宿主细胞可以是大肠杆菌CO02-0014(保藏号：KCCM 10834P)。
在本发明中，转入了参与甘油利用的基因以便利用甘油来有效生产氨基酸的微生物可以是棒状杆菌科的一种，更优选是棒状杆菌属的微生物，最优选的则是选自谷氨酸棒状杆菌(ex.ATCC13032)、产氨棒杆菌(ex.ATCC 6872)、乳酸发酵短杆菌(ex.ATCC13869)、黄色短杆菌(ex.ATCC14067)、热产氨棒杆菌(ex.FERM-BP1539)和棒杆菌efficiens(ex.C.efficiens str.YS-314)所构成组中的一种微生物，但并不总是限于此。同时，可以包括生产如氨基酸或核苷酸之类有用材料的微生物，例如产谷氨酸的谷氨酸棒状杆菌SM5和产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌CF905(KFCC-10881)，但并不总是仅限于此。
本发明进一步提供了通过发酵棒状杆菌利用甘油或部分甘油作为碳源生产发酵产品的方法。特别地，本发明提供了利用甘油生产发酵产品的方法，其步骤包括：将带有促进甘油利用的基因复合物glpDFK的载体转入宿主细胞中；通过电脉冲的方法将从转化宿主细胞所获得的质粒转入棒状杆菌中；将转化的棒状杆菌接种于以甘油或部分甘油作为碳源的培养基中进行培养；并分离培养基中的发酵产品。
在本发明的生产发酵产品的方法中，可以用该领域已知的适宜培养基和适宜培养条件来培养微生物。这些条件可以根据该领域所选择的菌株进行调整。培养方法可以是分批、连续和补料分批培养，但不仅限于此。各种培养方法在James M.Lee所著的″Biochemical Engineering″，Prentice-Hall，International Editions，第138-176页中有描述。
培养基必须满足培养特定菌株的要求。本发明所使用的培养基以甘油或部分甘油作为碳源，优选含甘油含量为1克-300克每升的培养基。除了甘油，也可以适量加入其它碳源，并且此时，优选葡萄糖作为碳源。加入培养基的氮源可以是有机氮源：蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽汁、玉米浆和豆粉，无机氮源：尿素、硫酸铵、氯化铵，磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。加入培养基的磷酸盐来源可以是磷酸二氢钾、磷酸氢二钾以及与其相对应的钠盐。此外，也可以包括如硫酸镁或硫酸亚铁之类金属盐。也可以包括氨基酸、维生素和适当的前体。这些基质或前体可以成批或连续地加入培养物中。
在培养过程中可以通过加入如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸之类的化合物来调节培养物的pH。在培养过程中所产生的气泡可以通过利用除泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯来除去。为了维持培养物的有氧条件，可将氧气或含有氧气的气体注入培养物中。培养物的温度则优选20-45℃，更优选25-40℃。培养物可以连续培养直到氨基酸的产量达到所需水平，优选的培养时间为10-160个小时。
附图说明
参考附图来具体描述本发明的优选实施方案，其中：
图1显示了谷氨酸棒状杆菌ATCC13032、谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-1和谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-2在添加100％葡萄糖作为碳源的基本培养基中的时间依赖性生长率，用光密度值表示。
图2表示在添加葡萄糖∶甘油(50∶50％)作为碳源的基本培养基中微生物的时间依赖性生长率，用光密度值表示。
图3表示在添加100％甘油作为碳源的基本培养基中微生物的时间依赖性生长率，用光密度值表示。
ATCC13032：谷氨酸棒状杆菌ATCC13032
DFK-1：谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-1
DFK-2：谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-2
具体实施方式
本发明的实际和目前的优选实施方式示意性地阐述于如下列实施例中。
然而，本领域技术人员理解，考虑到所公开的内容，可以在本发明的实质和范围内进行修改、改进。
实施例
实施例1：筛选并克隆可在棒状杆菌中操作的参与甘油利用的基因
白喉棒状杆菌中参与甘油利用的基因的核酸序列已经被确认并正式公布。从美国国立卫生研究院基因库获得编码白喉棒状杆菌中参与甘油利用的蛋白GIpF，GIpK和GIpD的基因(分别为glpF，glpK和glpD)以及相邻核苷酸序列的信息。白喉棒状杆菌的GipF的Genebank登录号是NC_940539.1，GlpK的Genebank登录号是NC_940538.1和GlpD的Genebank登录号是NC_940540.1。这些基因被证实一系列地排布在一个基因组中。所以，一次PCR就可以将全部三个基因作为单个多核苷酸进行扩增。SEQ.ID NO：1和NO：2所代表的引物被用于PCR来扩增白喉棒状杆菌中参与甘油利用的基因。
SEQ.ID NO：1：5′GATGCGGCCGCGCTGTGTGGCGTATGTCG 3′
SEQ.ID NO：2：5′GATGCGGCCGCAATCATCAAACCCAACCCCA 3′
从美国典型培养物保藏中心(ATCC)(ATCC ID.NO：700971D-5)购买白喉棒状杆菌NCTC13129的染色体来扩增白喉棒状杆菌中参与甘油利用的的基因。利用白喉棒状杆菌NCTC13129的染色体作为模板来实施PCR以扩增参与甘油利用的基因。PCR按照如下进行：94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃下聚合4分钟30秒，从变性到聚合循环25个周期，最后72℃下延伸5分钟。结果，获得4281bp的多核苷酸。多核苷酸通过TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)被克隆到pCR2.1中。
实施例2：核苷酸序列的测定和glpDFK基因氨基酸突变的恢复
上述获得质粒用Not I消化获得含有参与甘油利用的基因的DNA片段。DNA片段克隆入大肠杆菌-棒状杆菌穿梭载体pECCG117，然后转化大肠杆菌TOP10。转化株命名“大肠杆菌CO02-0014”，其于2007年1月8日(保藏号：KCCM 10834P)保藏在韩国的国际保藏单位KFCC(韩国联邦菌物保藏中心)的KCCM(韩国微生物保存中心)，位于361-221，Hongjie-1-Dong，Seodaemungu-Gu，首尔，韩国。
通过常规的质粒小量提取试剂盒所获得的质粒被命名为pECCG117-cdi glpDFK-1。pECCG117-cdi glpDFK-1的DNA核苷酸序列被确定，并且据此确认该核苷酸序列从第171到第1904编码glpD基因(SEQ.ID.NO：4)，核苷酸序列从第1904至第2644编码glpF基因(SEQ.ID.NO：5)和核苷酸序列从第2663到第4181编码glpK基因(SEQ.ID.NO：6)，而且相比于常规基因组测序所获得的序列有5个核苷酸序列变化(SEQ.ID.NO：3)。核苷酸序列的变化如下：第54位胸腺嘧啶变为胞苷，第1598位腺嘌呤变为鸟嘌呤，第2608位腺嘌呤变为鸟嘌呤，第2829位腺嘌呤变为鸟嘌呤，以及第3037位腺嘌呤变为鸟嘌呤。在这些变化中，只有第2829位的变化引起氨基酸的突变，核苷酸序列的其余4个变化被证实为沉默突变。突变的氨基酸是glpK区第56位的天冬酰胺变为丝氨酸。产生突变氨基酸的glpK氨基酸序列用SEQ.ID NO：6表示。
为了把突变的氨基酸恢复到原来的天冬酰胺，实施了定点突变。构建了定点突变中用于将第56位氨基酸即突变的丝氨酸变成天冬氨酸的引物，其由SEQ.ID NO：7和NO：8表示。
SEQ.ID.NO：7：5′GGAAATCTGGGCCAACACGCGCCAAGCC 3′
SEQ.ID.NO：8：5′GGCTTGGCGCGTGTTGGCCCAGATTTCC 3′
用上述引物所进行的定点突变通过
Figure G2008800031163D00101
II XL定点突变试剂盒(Stratagene)完成。实验按照制造商的说明书进行。按常规方法从获得的菌落提取质粒，并通过常规方法测定了核苷酸序列。结果，证实第2829位的腺嘌呤变为鸟嘌呤，从而使pECCG117-cdi glpDFK-1的glpK区的第56位丝氨酸变为天冬酰胺，由此提示这可能会产生与所制备的白喉棒状杆菌GlpK蛋白(SEQ.ID.NO：9；SEQ.ID.NO：10)相同的蛋白质。所获得的glpDFK质粒命名为pECCG117-cdi glpDFK-2。
实施例3：导入谷氨酸棒状杆菌ATCC13032
制备的pECCG117-cdi glpDFK-1和pECCG117-cdi glpDFK-2各自通过电脉冲的方法引入了谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中。细胞在含有细菌培养用蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 2.5g/L和卡那霉素25μg/mL的平板培养基上进行培养。所获得的菌落继续进行PCR克隆以选择含有包括参与甘油利用的基因的质粒的菌落。所选定的菌株，分别命名为谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032/pECCG117-cdiglpDFK-1，和谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-2。
实施例4：谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的甘油可利用性
为了证实谷氨酸棒状杆菌/pECCG117-cdi glpDFK-1和谷氨酸棒状杆菌/pECCG117-cdi glpDFK-2的甘油可利用性，在固体基本培养基中分别对含有上述质粒的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032和不含有质粒的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032进行了培养。基本培养基的组成如下。
用于谷氨酸棒状杆菌培养物的基本培养基的组成成分(pH 7.2)：
甘油10g/L、KH2PO4 1g/L、K2HPO4 2g/L、MgSO4·H2O 0.4g/L、尿素2g/L、(NH4)2SO4 5g/L、NaCl 0.5g/L、烟酰胺5mg/L、泛酸钙1mg/L、硫胺3mg/L、生物素200μg/L、微量元素1mL、琼脂20g/L
所接种的菌株在一个30℃的培养箱中培养了48小时。结果，在基本培养基中证实了引入pECCG117-cdi glpDF-1或pECCG117-cdi glpDF-2的谷氨酸棒状杆菌的生长。但是，未引入质粒的菌株，其生长不是非常明显。
对这两种菌株在液体基本培养基中的生长也进行了研究。首先，将该两种菌株接种于种子培养基中，然后培养24小时。通过离心将培养基除去。通过在磷酸盐缓冲液(pH 7.0)分散两次将残留的培养基完全除去。把该菌株接种于40mL的基本培养基中，然后在30℃下培养36小时。比较两个菌株的生长情况。往基本培养基补充不同的碳源，葡萄糖12g/L；甘油12g/L；葡萄糖和甘油各6g/L，来比较甘油的可利用性。结果如图1所示。
如图1所示，未引入与参与甘油利用的基因时，谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的生长情况不是太好，因为其不能有效利用甘油。同时，引入与利用甘油相关的基因的菌株，其通过利用作为碳源的甘油而生长良好。如果单独加入甘油，则有利于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/PGCCG117-cdi glpDFK-2的生长。但是，如果单独加入葡萄糖或同时加入葡萄糖和甘油，则有利于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032/PGCCG117-cdi glpDFK-1的生长，因此它们都被本实验采用。
实施例5：产谷氨酸菌株的甘油可利用性
为了证实利用甘油是否有可能不仅能生产有用材料而且还能促进棒状杆菌的生长，通过实施例3所述的方法将表达载体pECCG117-cdiglpDFK-1引入一个产生谷氨酸的菌株，谷氨酸棒状杆菌SM5(KFCC-11112)中。比较含有不同碳源(仅有甘油，仅有葡萄糖，以及同时有葡萄糖和甘油(以所需比例混合))的谷氨酸棒状杆菌SM5和谷氨酸棒状杆菌SM5/pECCG117-cdi glpDFK-1的谷氨酸生产率。谷氨酸棒状杆菌SM5和谷氨酸棒状杆菌SM5/pECCG117-cdi glpDFK-1均用接种环接种于种子培养基中，然后在30℃下培养18小时。种子培养基的组分如下：蛋白胨1g/L、酵母提取物0.5g/L、肉汁0.5g/L、葡萄糖1g/L、氯化钠0.25g/L、尿素0.13g/L、pH7.2。为了发酵，将1mL种子培养物溶液接种于培养基中，然后在30℃下培养24小时。培养基的组分如下：HSM3mL、生物素1μg/L、废糖浆0.05g/L、硫酸铵0.1g/L、硫酸亚铁0.002g/L、硫酸锰0.002g/L、硫酸镁0.05g/L、硫胺-HCl 500μg/L、磷酸二氢钾0.2g/L、尿素0.95g/L、pH7.2。碳源根据培养条件加入其中。结果，证实了L-谷氨酸的生产情况，比较结果如表1所示。
表1
谷氨酸棒状杆菌SM5和谷氨酸棒状杆菌SM5/pECCG117-cdiglpDFK-1在含甘油的发酵培养基中的生长情况及谷氨酸生产率的比较
Figure G2008800031163D00121
Figure G2008800031163D00131
如表1所示，当将甘油作为碳源单独加入时，谷氨酸棒状杆菌SM5的生长情况很差，而且谷氨酸生产率并不显著。同时，谷氨酸棒状杆菌SM5/pECCG117-cdi glpDFK-1在仅以甘油作为碳源时也可以生长，而且即使其生产率下降了，也可以以相似的产量生产谷氨酸。当甘油与葡萄糖一起加入时(约50∶50)，谷氨酸的得率和生产率并没有下降。但是SM5表现出谷氨酸产量的减少。
实施例6：把与利用甘油相关的基因引入产赖氨酸菌株并利用其生产 赖氨酸
为了研究利用甘油不仅能生产有用材料又能促进棒状杆菌的生长的可能性，通过实施例3所述的方法将表达载体pECCG117-cdi glpDFK-1引入产谷氨酸的菌株，谷氨酸棒状杆菌CF905(KFCC-10881)中。
将谷氨酸棒状杆菌亲本株KFCC 10881和本发明的菌株KFCC10881/pECCG117-cdi glpDFK-1分别接种于含有25mL种子培养基的250mLcorner-baffled瓶中，然后在30℃下振荡培养(200rpm)20小时。将1mL种子培养物溶液接种于含有24mL生产培养基的250mLcorner-baffled瓶中，然后在30℃下振荡培养(200rpm)72小时。培养结束后，L-赖氨酸的产量用氨基酸分析仪测量。考察了谷氨酸棒状杆菌KFCC10881和KFCC10881/pECCG117-cdi glpDFK-1培养物中L-赖氨酸的水平，结果如表2所示。
表2
Figure G2008800031163D00141
如表2所示，当将含有与甘油利用相关基因的载体PGCCG117-cdiglpDFK-1引入生产赖氨酸的菌株时，与其亲本株不同，菌株显示出利用甘油的能力，并且赖氨酸的产量也增加了。
种子培养基(pH7.0)：
原糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、K2HPO4 8g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、硫胺-HCl 1000μg、泛酸钙2000μg、烟碱2000μg(1升工业用水中的含量)。
生产培养基(pH7.0)：
葡萄糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浆5g、尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、硫胺-HCl 1000μg、泛酸钙2000μg、烟碱3000μg、CaCO3 30g(1升工业用水中的含量)。
工业实用性
如上所述，本发明提供了一种高效利用石油工业和生物柴油生产的副产品甘油来高得率地生产发酵产品的方法。本发明的微生物可以在含有包括甘油的复合碳源或单独以甘油作为碳源的培养基内高效生产发酵产品。因此，基于本发明的微生物，能生产发酵产品的微生物能够高效地把甘油用作碳源。
所属领域技术人员可以理解上文中所公开的概念及特定实施方式容易作为修改或设计为实现与本发明相同目的的其它实施方式的基础。所属领域的技术人员也理解这些等同实施方式没有脱离本发明提出的附加权利要求的精神和保护范围。
Figure IYZ000006107184700011
Figure IYZ000006107184700031
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Figure IYZ000006107184700091
Figure IYZ000006107184700101
Figure IYZ000006107184700111

Claims (11)

1.具有SEQ.ID.NO：9所示的来自白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)NCTC13129的核苷酸序列的棒状杆菌(Corynebacteria)，该棒状杆菌中转化有促进甘油利用的基因复合体glpDFK。
2.具有SEQ.ID.NO：3所示的来自白喉棒状杆菌NCTC13129的核苷酸序列的棒状杆菌，该棒状杆菌中转化有促进甘油利用的基因复合体glpDFK。
3.如权利要求1或2所述的棒状杆菌，其特征在于，该棒状杆菌选自由谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、保藏号为KFCC-11112的谷氨酸棒状杆菌SM5和保藏号为KFCC-10881的谷氨酸棒状杆菌CF905所构成的组中。
4.利用甘油生产发酵产品的方法，其包括如下步骤：
在含有作为碳源的甘油或部分甘油的培养基中接种并培养转化有促进甘油利用的基因复合体glpDFK的棒状杆菌，该glpDFK是编码促进甘油摄取蛋白的基因glpF、编码利用ATP进行磷酸化作用产生甘油-3-磷酸的甘油激酶的基因glpK以及编码通过氧化甘油-3-磷酸产生二羟基丙酮-3-磷酸的甘油-3-磷酸脱氢酶的基因的基因复合体，并从该培养物中分离发酵产品。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述glpDFK为SEQ.ID.NO：9所示的来自白喉棒状杆菌NCTC13129的核苷酸序列。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述glpDFK为SEQ.ID.NO：3所示的来自白喉棒状杆菌NCTC13129的核苷酸序列。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述转化通过含有基因复合体glpDFK的载体实现。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述转化通过以电脉冲的方法将质粒引入棒状杆菌的方式来实现，其中的质粒为从转化了含基因复合体glpDFK的载体的宿主细胞中所获得。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是保藏号为KCCM 10834P的大肠杆菌(E.coli)CO02-0014。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述棒状杆菌选自由谷氨酸棒状杆菌、保藏号为KFCC-11112的谷氨酸棒状杆菌SM5和保藏号为KFCC-10881的谷氨酸棒状杆菌CF905所构成的组中。
11.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵产品为谷氨酸或赖氨酸。
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