DE112008000243B4

DE112008000243B4 - Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsproduktes aus Kohlenstoffquellen, die Glycerin enthalten, unter Verwendung von Corynebacteria

Info

Publication number: DE112008000243B4
Application number: DE112008000243.6T
Authority: DE
Inventors: Kwang-Myung Cho; Kyung-Ho Choi; Hyun-ae Bae
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2007-01-24
Filing date: 2008-01-22
Publication date: 2018-12-13
Anticipated expiration: 2028-01-23
Also published as: KR100830826B1; BRPI0807802A2; CN101617038A; JP2010516274A; BRPI0807802B1; US20100129884A1; WO2008091093A1; CN101617038B; DE112008000243T5; JP5264778B2; US8426165B2

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsproduktes aus verschiedenen Kohlenstoffquellen, die Glycerin enthalten, unter Verwendung von Corynebacteria, Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsproduktes aus Kohlenstoffquellen, die Glycerin oder einen Glycerinanteil enthalten, mit hoher Ausbeute und hoher Produktivität durch Fermentieren von Corynebacteria, in das das fremde Gen glpDFK eingeführt wurde, das die Verwertung von Glycerin erleichtert, und industrielles Akkumulieren nützlicher Aminosäuren in dem Kulturmedium.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsproduktes aus verschiedenen Kohlenstoffquellen, die Glycerin enthalten, unter Verwendung von Corynebacteria. Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsproduktes, z.B. einer Aminosäure, unter Verwendung von Glycerin, mit hoher Ausbeute und hoher Produktivität durch Fermentieren von Corynebacteria, in das ein fremdes Gen für die Verwertung von fremdem Glycerin eingeführt wurde, das fähig ist, kommerziell nützliche Aminosäuren, z.B. Aspartat, Threonin, Lysin, Methionin, Isoleucin, Asparagin, Glutaminsäure, Glutamin, Prolin, Alanin, Valin, Leucin, Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin und ihre metabolischen Intermediate in dem Kulturmedium, das mit Glycerin, dem Nebenprodukt, das während der Produktion von Biodiesel in der Ölindustrie erzeugt wird, als Kohlenstoffquelle supplementiert ist, zu akkumulieren.
Stand der Technik
Die erwähnten Aminosäuren sind sehr nützlich. Aspartat wird als Ausgangsmaterial für Aspartam verwendet und Lysin, Threonin, Methionin und Tryptophan werden als Aminosäuren für Futter, Nahrungsmittel und Arzneimittel verwendet. Asparagin, Isoleucin, Glutaminsäure, Glutamin, Leucin, Valin, Alanin, Prolin, Phenylalanin und Tyrosin werden als Aminosäuren für Nahrungsmittel und Arzneimittel verwendet. Auch Homoserin und O-Succinylhomoserin können als Vorläufer in der Produktion von Aminosäuren eingesetzt werden.
Mit dem kontinuierlichen Ansteigen des Ölpreises wird der Entwicklung alternativer Energie unter Verwendung von Recyclingmaterialien in der Natur Aufmerksamkeit geschenkt. Unter vielen Kandidaten für eine alternative Energiequelle sind Biodiesel, der aus Pflanzenöl erhalten wird, und Bioethanol, der durch Fermentation produziert wird, die vielversprechendsten Kandidaten. Biodiesel bezeichnet Fettsäuremethylester oder Fettsäureethylester, synthetisiert durch Veresterung von Methanol, produziert unter Verwendung von Pflanzenöl als Substrat, in Gegenwart eines Katalysators. Während der Synthese wird das Nebenprodukt Glycerin notwendigerweise mit 10% des Gesamtgewichts erzeugt.
Glycerin (C₃H₈O₃) wird aus Glucose (C₆H₁₂O₆) durch eine 1-Schritt-Reduktion umgewandelt, die eine verbesserte reduzierende Kraft während des Metabolismus eines Mikroorganismus bereitstellen kann. Viele durch Fermentation produzierte Produkte erfordern bei ihren Stoffwechselwegen eine reduzierende Kraft. Wenn das Glycerin wirksam als Substrat verwendet werden könnte, würde daher die Ausbeute und die Produktivität des gewünschten Fermentationsproduktes verbessert werden. Trotz dieser Erwartung wurden die Untersuchungen über Glycerin auf Reuterin (Talarico et al., Antimicrob. Agents Chemother., 32:1854-1858 (1988), 2,3-Butandiol (Biebl et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 50:24-29 (1998)), 1,3-Propandiol (Menzel et al., Enzyme Microb. Technol., 20:82-86 (1997), Bernsteinsäure ( koreanisches Patent Nr. 10-0313134 ), Itaconsäure ( US-Patent Nr. 5,457,040 ), 3-Hydroxypropanaldehyd (Doleyres et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 68(4):467-474 (2005)) und Propionsäure (Himmi et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 53:435-440 (2000)) beschränkt Der Grund ist, dass der Preis für Glycerin höher als der jeder anderen Kohlenstoffquelle, die zur Fermentation in dieser Industrie eingesetzt wird, ist. Es wurden nun Untersuchungen unternommen, um Glycerin durch Fermentation zu produzieren (Wang et al., Biotechnol. Adv., 19(3):201-223 (2001)).
Allerdings ist mit Zunahme der Biodieselproduktion auch die Glycerinproduktion im Ansteigen, was in einer schnellen Senkung des Preises resultiert. Dementsprechend wurde beschrieben, dass 1,3-Propandiol (Gonzalez-Pajuelo et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 31:442-446, (2004)), Wasserstoff und Ethanol (Ito et al., J. Biosci. Bioeng., 100(3):260-265 (2005)) produziert wurden, indem das Nebenprodukt von Biodiesel, das Glycerin umfasst, verwendet wurde. Allerdings wurden keine Berichte gemacht, um das typischste Fermentationsprodukt, Aminosäuren und andere Hauptmetabolite unter Verwendung von Glycerin zu produzieren.
Glycerin wurde bisher in der Industrie von Seife, Fettsäure, Wachs und Tensiden bzw. oberflächenaktiven Mitteln produziert. Allerdings kann, wie oben erwähnt wurde, als Folge der Erhöhung der Biodieselproduktion das Problem auftreten, ein Nebenprodukt, das Glycerin umfasst, effektiv zu behandeln. In der Zwischenzeit wird auch erwartet, dass der Preis für gereinigtes Glycerin fällt Daher könnte die Produktion von nützlichen Fermentationsprodukten unter Verwendung von Glycerin mehr Effekte bringen, als erwartet.
Die Fälle einer Verwendung von Glycerin in Mikroorganismen wurden für E. coli und Klebsiella pneumoniae beschrieben. Bei E. coli infiltriert extracelluläres Glycerin in Zellen unter Verwendung von GlpF, einem Aquaglyceroporin mit Permeabilität für Wasser, Glycerin und Harnstoff, ohne Energieverbrauch (Heller et al., J. Bacteriol, 144:274-278, (1980)). Das Glycerin wird in Glycerin-3-phosphat durch Glycerinkinase umgewandelt, welches wiederum durch Glycerin-3-phosphatdehydrogenase in Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) umgewandelt wird und dann durch Triosephosphatisomerase (TpiA) in Glyceraldehyd-3-phosphat (G-3-P) umgewandelt wird, gefolgt vom finalen Metabolismus (Lin EC, Annu. Rev. Microbiol., 30:535-578, (1976)). In dem Fall, dass Glycerinkinase keine Aktivität hat, wird Glycerin durch Glycerindehydrogenase (Gdh) in Dihydroxyaceton (DHA) umgewandelt, welches wiederum durch Glycerinkinase oder Dihydroxyacetonkinase (DHA-Kinase) in Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) umgewandelt wird, worauf wiederum eine Umwandlung in Glyceraldehyd-3-phosphat (G-3-P) vor dem finalen Metabolismus folgt (Paulsen et al., Microbiology, 146:2343-2344, (2000)). Ein solcher Glycerin-Stoffwechselweg wird durch verschiedene Faktoren reguliert. Insbesondere wenn Glycerin und Glucose zusammen vorliegen, verwendet Wildtyp-E. coli zuerst ausschließlich Glucose und verwendet dann Glycerin (Lin, Annu. Rev. Microbiol., 30:535-578, (1976)).
Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium sind solche, die in großem Umfang auf industriellen Gebieten eingesetzt werden. Beispielsweise wird Corynebacterium glutamicum für die Produktion von solchen Aminosäuren wie Lysin und Mononatriumglutamat verwendet und C. ammoniagenes wird in großem Umfang für die Produktion von Nucleinsäure durch industrielle Fermentation eingesetzt. Es wurde beschrieben, dass Corynebacteria verschiedene Kohlenstoffquellen, z.B. Glucose und Rohzucker, zur Fermentation nutzen kann. Es wurde auch beschrieben, dass Corynebacteria durch die Einführung eines Gens, z.B. xylAB, Xylose verwerten kann (Kawaguchi et al., Appl. Envion. Microbiol. 72(5):3418-3428, (2006)). Allerdings gibt es nur wenige Fälle, die beschreiben, dass Corynebacteria Glycerin als Kohlenstoffquelle nutzen. Die Fälle der Verwertung von Glycerin bei Corynebacterium glutamicum sind sehr wenige ( koreanische Patentanmeldung Nr. 2006-057633 ).
Unter den Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium wurden nur 4 Mikroorganismen zur Identifizierung ihrer gesamten Genomsequenzen analysiert, und ein vollständiges Gen, das Glycerin verwendet, wurde nur in Corynebacterium diphtheriae gefunden, und solche Gene, die beim Glycerinverzehr involviert sind, wie G1pF, fehlten in den anderen drei Mikroorganismen Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens und Corynebacterium jeikeium. Das Fehlen des Gens ist das Haupthindernis für Corynebacteria, Glycerin effizient zu verwerten.
Offenbahrung der Erfindung
Technisches Problem
Wie oben erläutert wurde, wird durch Verwertung von Glycerin, das das Nebenprodukt der Biodiesel-Produktion ist, als Kohlenstoffquelle eine Wertsteigerung erreicht. Darauf basierend fokussierten die Erfinder der vorliegenden Erfindung ihre Studien auf die Glycerinverwertbarkeit durch Corynebacteria mit industriell hohem Verwertungswert, z.B. Corynebacterium glutamicum und Corynebacterium ammoniagenes. Als Resultat vervollständigten die Erfinder der vorliegenden Erfindung diese Erfindung, indem sie bestätigten, dass die Glycerinverwertbarkeit deutlich verbessert werden konnte, indem ein fremdes Gen eingeführt wurde, das bei der Verwertung von Glycerin in solchen Corynebacteria involviert ist.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Gens, das in der Verwertung von Glycerin involviert ist, um die Glycerinassimilation von Corynebacteria signifikant zu verbessern.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Mutante, die von Corynebacteria stammt, die Glycerin entweder allein als Kohlenstoffquelle oder zusammen mit anderen Kohlenstoffquellen verwertet.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Fermentationsproduktes durch Fermentieren von Corynebacteria unter Verwendung einer Kohlenstoffquelle, die Glycerin oder einen Glyccrinanteil umfasst.
Technische Lösung
Die obigen Aufgaben und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung können durch die folgenden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst werden.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben.
Zur Lösung der Aufgabe der Erfindung stellt die vorliegende Erfindung ein Gen beriet, das in der Verwendung bzw. Verwertung von Glycerin involviert ist, um die Glycerinassimilation von Corynebacteria signifikant zu verbessern.
Das Gen, das in der Verwertung von Glycerin involviert ist, bezeichnet hier ein Gen, das Glycerinaufnahme-Facilitator-Protein codiert, das von Corynebacterium diphtheriae stammt (hierin im Folgenden als glpF bezeichnet), ein Gen, das Glycerinkinase codiert, welche das Enzym ist, das Glycerin-3-phosphat durch Phosphorylierung unter Verwendung von ATP produziert (im Folgenden als glpK bezeichnet), und ein Gen, das Glycerin-3-phosphodihydrogenase codiert, die das Enzym ist, das Dihydroxyaceton-3-phosphat durch Oxidieren von Glycerin-3-phosphat produziert (im Folgenden als glpD bezeichnet).
Das Gen umfasst ein beliebiges Gen, das ein Polypeptid in Corynebacteria codiert, das eine Rolle bei der Aufnahme von extracellulärem Glycerin spielt und das Glycerin in Glycerin-3-phosphat durch Phosphorylierung umwandelt und Glycerin-3-phosphat in Dihydroxyaceton-3-phosphat umwandelt und dann schließlich Dihydroxyaceton-3-phosphat in Glyceraldehyd-3-phosphat, das Zwischenprodukt der Glycolyse, umwandelt, um Glycerin zu metabolisieren.
Das Gen kann von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen stammen. Es ist bevorzugter, ein Gen auszuwählen, das von einem Mikroorganismus stammt, insbesondere von Corynebacterium diphtheriae NCTC13129 (Genbank-Zugangsnummer: NC_002935).
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Mutante bereit, die von Corynebacteria abstammt, die Glycerin entweder allein als Kohlenstoffquelle oder zusammen mit anderen Kohlenstoffquellen verwertet.
Der in dieser Erfindung eingesetzte Stamm kann wachsengelassen werden, indem Glycerin und Glucose gleichzeitig verbraucht werden, um Glycerin effektiv zu nutzen. Wenn Glucose und Glycerin gleichzeitig als Kohlenstoffquelle gegeben werden, verwendet die Wildtyp-E. coli ausschließlich Glucose und nach Verzehr der gesamten Glucose verwendet die Wildtyp-E. coli Glycerin, was als „Diauxie“ bezeichnet wird. Wenn eine komplexe Kohlenstoffquelle, die Glycerin enthält, zugeführt wird, so wird die Fermentationseffizienz verringert.
Um das obige Problem zu lösen, untersuchten die Erfinder der vorliegenden Erfindung die Möglichkeit einer gleichzeitigen Verwendung bzw. Verwertung von Glucose und Glycerin in dem Stamm. Als Resultat bestätigten die Erfinder, dass Glycerin und andere Kohlenstoffquellen effektiv durch die Insertion eines fremden Gens, das in der Verwendung von Glycerin involviert ist, das aus Corynebacteria stammt, effektiv verwertet werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellen die Erfinder der vorliegenden Erfindung einen Mikroorganismus bereit, der das Gen enthält, das GlpF (Genbank-Zugangsnummer: NC_940539.1), GlpK (Genbank-Zugangsnummer: NC_940538.1) und GlpD (Genbank-Zugangsnummer: NC_040540.1) codiert, wobei das Protein, das in der Verwendung bzw. Verwertung von Glycerin involviert ist, aus Corynebacterium diphtheriae stammt. Die Transformation von Corynebaeteria mit dem Gen kann durch das herkömmliche Verfahren, das auf dem Fachgebiet bekannt ist, durchgeführt werden, und es kann eine Mutante von Corynebacterium, die Aminosäuren unter Verwendung einer Kohlenstoffquelle, die Glycerin oder einen Glycerinanteil umfasst, bereitgestellt werden.
Der Vektor für die vorliegende Erfindung ist nicht auf einen spezifischen beschränkt und es kann ein beliebiger geeigneter Expressionsvektor verwendet werden. Der E. coli-Corynebacterium-Shuttlevektor pECCG117 (Biotechnology letters, Band 13, Nr. 10, S. 721-726, (1991)) ist besonders bevorzugt.
In dieser Beschreibung gibt der Ausdruck „Transformation“ das Verfahren der Einführung eines Gens in eine Wirtszelle und das Exprimierens des Gens darin an. Das transformierte Gen umfasst ein beliebiges Gen, entweder insertiert in das Chromosom der Wirtszelle oder an der Chromosomaußenseite präsentiert, solange es in der Zelle exprimiert werden kann. Das Gen ist ein Polynucleotid, das fähig ist, ein Polypeptid zu codieren und DNA und RNA zu enthalten. Das Gen ist in seiner Form zur Einführung nicht beschränkt, solange es in der Wirtszelle exprimiert werden kann. Beispielsweise kann das Gen in die Wirtszelle als eine Expressionskassette, das Polynucleotidkonstrukt, das jedes notwendige Element zur Autoexpression enthält, eingeführt werden. Die Expressionskassette umfasst einen Promotor funktionell verknüpft mit dem Gen, einen Transcriptionstenninator, eine Ribosomenbindungsstelle und einen Translationsterminator. Die Expressionskassette kann der Expressionsvektor sein, der zur Autoreplikation fähig ist Das Gen kann auch funktionell mit der Sequenz verknüpft werden, die für die Expression in der Wirtszelle notwendig ist, indem es selbst oder in Form eines Polynucleotidkonstrukts in eine Wirtszelle eingeführt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Transformation durchgeführt, indem eine Wirtszelle mit dem Vektor, der das glpDFKGen enthält, transformiert wird und das erhaltene Plasmid durch ein Elektropulsverfahren eingeführt wird. Die transformierte Wirtszelle kann E. coli CO02-0014 (Zugangsnummer: KCCM 10834P) sein.
In dieser Erfindung kann der Mikroorganismus, der mit einem Gen transformiert ist, das bei der Verwertung von Glycerin involviert ist, zur effektiven Produktion von Aminosäuren unter Verwertung von Glycerin, einer von Corynebacteriaceae, bevorzugter ein Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium und am bevorzugtesten ein Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Corynebacterium glutamicum (ex. ATCC13032), Corynebacterium ammoniagenes (ex. ATTC6872), Brevibacterium lactofermentum (ex. ATCC13869); Brevibacterium flavum (ex. ATCC14067), Corynebacterium thermoaminogenes (ex. FERM-BP1539) und Corynebacterium efficiens (ex. C. efficiens-Stamm YS-314) sein, allerdings nicht immer beschränkt auf diese. Und auch der Mikroorganismus, der nützliche Materialien, z.B. Aminosäuren oder Nucleinsäuren, produziert, wie z.B. Corynebacterium glutamicum SM5, das Glutaminsäure produziert, und Corynebacterium glutamicum CF905 (KFCC-10881), das Lysin produziert, kann eingeschlossen werden, allerdings nicht immer beschränkt darauf.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsproduktes durch Fermentieren von Corynebacteria unter Verwendung einer Kohlenstoffquelle, die Glycerin oder einen Glycerinanteil umfasst, bereit. Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsproduktes unter Verwendung von Glycerin bereit, das die folgenden Schritte umfasst: Transformieren einer Wirtszelle mit dem Vektor, der glpDFK enthält, welches ein Genkomplex ist, der die Verwendung bzw. Verwertung von Glycerin erleichtert; Transformieren von Corynebacteria mit dem Plasmid, erhalten aus der transformierten Wirtszelle, durch Elektropulsverfahren; Kultivieren der transformierten Corynebacteria durch Inokulieren im Kulturmedium, das Glycerin oder einen Glycerinanteil als Kohlenstoffquelle enthält, und Abtrennen des Fermentationsproduktes aus dem Kulturmedium.
In dem Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsproduktes der vorliegenden Erfindung kann eine Kultur des Mikroorganismus in einem geeigneten Medium und unter geeigneten Kulturbedingungen, die dem Fachmann auf dem Fachgebiet bekannt sind, durchgeführt werden. Diese Bedingungen können vom Fachmann entsprechend dem ausgewählten Stamm reguliert werden. Beispiele für Kultivierungsverfahren sind Chargen-, kontinuierliche und Fed-Batch-(Kultur mit periodischer Beschickung)-Kulturen, allerdings nicht beschränkt auf diese. Verschiedene Kulturverfahren werden in „Biochemical Engineering" von James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, S. 138-176 beschrieben.
Das Medium muss den Anforderungen für die Kultur eines spezifischen Stamms erfüllen. Das in dieser Erfindung verwendete Medium enthält Glycerin oder einen Glycerinanteil als Kohlenstoffquelle, enthält vorzugsweise Glycerin mit 1 g bis 300 g pro 1 Liter Kulturmedium. Zusätzlich zu Glycerin können andere Kohlenstoffquellen geeigneterweise zugesetzt werden und dabei ist Glucose als Kohlenstoffquelle bevorzugt. Als Stickstoffquelle können in dem Medium, z.B. als Quelle für organischen Stickstoff Pepton, Hefeextrakt, Bratensaft, Malzextrakt, Maisquellwasser und Sojabohnenmehl, und als Quelle für anorganischen Stickstoff, z.B. Harnstoff, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat, enthalten sein. Als Phosphatquelle können Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat und ihre entsprechenden natriumenthaltenden Salze in dem Medium enthalten sein. Außerdem kann auch ein Metallsalz, z.B. Magnesiumsulfat, oder Eisensulfat, enthalten sein. Ebenfalls enthalten sein können Aminosäuren, Vitamine und geeignete Vorstufen. Diese Medien oder Vorstufen können chargenweise oder kontinuierlich zu der Kultur gegeben werden.
Der pH der Kultur kann während der Kultur eingestellt werden, indem eine Verbindung wie Ammoniumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak, Phosphorsäure und Schwefelsäure zugesetzt wird. Die Bildung von Luftblasen kann während der Kultur unter Verwendung eines Antischaummittels, z.B. Fettsäurepolyglycolester, inhibiert werden. Um aerobe Bedingungen der Kultur aufrechtzuerhalten, kann Sauerstoff oder sauerstoffhaltiges Gas in die Kultur injiziert werden. Die Temperatur der Kultur ist vorzugsweise 20 bis 45°C, bevorzugter 25 bis 40°C. Die Kultur kann fortgesetzt werden, bis die Aminosäureproduktion einen gewünschten Level erreicht, und die bevorzugte Kulturzeit ist 10 bis 160 Stunden.
Figurenliste
Die Anwendung der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird am besten anhand der beigefügten Zeichnungen verstanden, wobei:

1 die zeitabhängigen Wachstumsraten, dargestellt durch optische Dichten von Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-1 und Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-2 in Minimalmedium, supplementiert mit Glucose 100% als Kohlenstoffquelle, darstellt;
2 die zeitabhängigen Wachstumsraten der Mikroorganismen in Minimalmedium, supplementiert mit Glucose : Glycerin (50 : 50%) als Kohlenstoffquelle, dargestellt durch optische Dichten, darstellt;
3 die zeitabhängigen Wachstumsraten der Mikroorganismen in Minimalmedium, supplementiert mit Glycerin 100% als Kohlenstoffquelle, dargestellt durch die optischen Dichten, darstellt;

ATCC13032: Corynebacterium glutamicum ATCC13032
DFK-1: Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-1
DFK-2: Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-2
Bester Modus zur Durchführung der Erfindung
Praktische und derzeit bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in den folgenden Beispielen erläuternd gezeigt.
Man wird sich allerdings bewusst sein, dass der Fachmann auf dem Fachgebiet in Anbetracht dieser Offenbarung Modifikationen und Verbesserungen bezüglich des Geistes und des Umfangs der vorliegenden Erfindung durchführen kann.
[Beispiele]
Beispiel 1: Screening und Klonierung eines Gens, das bei der Verwertung von Glycerin involviert ist, das in Corynebacteria funktionell ist
Die Nucleotidsequenz des Gens, das in der Verwertung von Glycerin involviert ist, von Corynebacterium diphtheriae wurde bereits identifiziert und offiziell freigegeben. Informationen über Gene, die G1pF, GlpK und GlpD (glpF, glpK bzw. glpD), welche Proteine von Corynebacterium diphtheriae sind, die mit der Verwertung von Glycerin assoziiert sind, codieren und benachbarte Nucleotidsequenzen wurden von GeneBank, NIH, USA, erhalten. Die Genbank-Zugangsnummer für GlpF von Corynebacterium diphtheriae war NC 940539.1, die Genbank-Zugangsnummer für GlpK war NC_940538.1 und die Genbank-Zugangsnummer für GlpD war NC 940540.1. Es wurde bestätigt, dass die Gene in einer Reihe auf einem Genom angeordnet sind. So konnte eine einmalige PCR alle drei Gene als ein einzelnes Polynucleotid amplifizieren. Primer, die durch SEQ ID NO: 1 und NO: 2 dargestellt sind, wurden für eine PCR eingesetzt, um die Gene, die bei der Verwertung von Glycerin involviert sind, von Corynebacterium diphtheriae zu amplifizieren.
SEQ ID NO: 1: 5' GATGCGGCCGCGCTGTGTGGCGTATGTCG 3'
SEQ ID NO: 2: 5' GATGCGGCCGCAATCATCAAACCCAACCCCA 3'
Chromosom von Corynebacterium diphtheriae NCTC13129 wurde von American Type Culture Collectino (ATCC) bezogen (ATCC ID. Nr.: 700971D-5), um das Gen, das bei der Verwertung von Glycerin involviert ist, von Corynebacterium diphtheriae zu amplifizieren. Es wurde eine PCR unter Verwendung des Chromosoms von Corynebacterium diphtheriae NCTC13129 als Matrize durchgeführt, um das Gen zu amplifizieren, das bei der Verwertung von Glycerin involviert ist. Die PCR wurde wie folgt durchgeführt: Vordenaturierung bei 94°C für 3 Minuten, Denaturierung bei 94°C für 30 Sekunden, Anlagerung bei 56°C für 30 Sekunden, Polymerisation bei 72°C für 4 Minuten 30 Sekunden, 25 Zyklen von Denaturierung bis Polymerisation und eine Endverlängerung bei 72°C für 5 Minuten. Als Resultat wurde ein Polynukleotid mit einer Größe von 4281 bp erhalten. Das Polynukleotid wurde in pCR2.1 kloniert, wobei ein TOPO TA-Klonierungskit (Invitrogen) verwendet wurde.
Beispiel 2: Bestimmung der Nukleotidsequenz und Wiederherstellung der Aminosäuren der Mutation des glpDFK-Gens
Das obige Plasmid wurde mit Not I verdaut, um ein DNA-Fragment zu erhalten, das das Gen enthält, das in die Verwertung von Glycerin involviert ist. Das DNA-Fragment wurde in pECCG117, E.-coli-Corynebacterium-Shuttle-Vektor kloniert, gefolgt von einer Transformation von E. coli TOP10. Der transformierte Stamm wurde „E. coli CO02-0014“ genannt, der bei KCCM (Korean Culture Center of Microorganisms) der KFCC (Korean Federation of Culture Collection), der Internationalen Hinterlegungsbehörde, 361-221, Hongje-1-Dong, Seodaemungu-Gu, Seoul, Korea, am 8. Januar 2007 hinterlegt (Zugangsnummer: KCCM 10834P).
Das Plasmid, das mittels herkömmlicher Plasmid-Miniprep erhalten worden war, wurde pECCG117-cdi glpDFK-1 genannt. Die DNA-Nukleotidsequenz des pECCG117-cdi glpDFK-1 wurde bestimmt und danach wurde bestätigt, dass die Nukleotidsequenz von 171 bis 1904 das glpD-Gen (SEQ ID NO:4) codiert, die Nukleotidsequenz von 1904 bis 2644 das glpF-Gen (SEQ ID NO:5) codiert und die Nukleotidsequenz von 2663 bis 4181 das glpK-Gen (SEQ ID NO:6) codiert, und es gab 5 Nukleotidsequenzänderungen (SEQ ID NO:3) verglichen mit der Sequenz, die durch herkömmliche Genomsequenzierung erhalten wurde. Die Änderungen in der Nukleotidsequenz waren wie folgt: das Thymin in Position 54 war in Cytidin geändert, das Adenin in Position 1598 war in Guanin geändert, das Adenin in Position 2608 war in Guanin geändert, das Adenin in Position 2829 war in Guanin geändert und das Adenin in Position 3037 war in Guanin geändert. Unter diesen Änderungen induzierte nur die Änderung in der Position 2829 eine Mutation der Aminosäure und die restlichen 4 Änderungen der Nukleotidsequenz wurden als stumme Mutation bestätigt. Die Mutation der Aminosäure bestand darin, dass das Asparagin in Position 56 der glpK-Region in Serin geändert war. Die Aminosäuresequenz von glpK, die die mutierte Aminosäure hat, wird durch SEQ ID NO:6 dargestellt.
Um die mutierte Aminosäure wieder zu dem ursprünglichen Asparagin zurückzuführen, wurde eine ortspezifische Mutagenese durchgeführt. Die Primer für die ortspezifische Mutagenese, um die Aminosäure in Position 56 zu ändern, das mutierte Serin in Asparagin, wurden konstruiert und werden durch SEQ ID NO:7 und NO:8 dargestellt.
SEQ ID NO:7: 5' GGAAATCTGGGCCAACACGCGCCAAGCC 3'
SEQ ID NO:8: 5' GGCTTGGCGCGTGTTGGCCCAGATTTCC 3'
Eine ortspezifische Mutagenese wurde mit den obigen Primern unter Verwendung eines QuickChange^® II XL-Kits zur ortspezifischen Mutagenese (Stratagene) durchgeführt. Das Experiment wurde nach Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Plasmid wurde aus den erhaltenen Kolonien nach dem herkömmlichen Verfahren extrahiert, wonach die Nukleotidsequenz bestimmt wurde. Als Resultat wurde bestätigt, dass das Adenin in Position 2829 in Guanin geändert war, so dass das Serin in Position 56 der glpK-Region von pECCG117-cdi glpDFK-1 in Asparagin geändert war, was nahe legt, dass dies dasselbe Protein wie das GlpK-Protein, das von Corynebacterium diphtheriae produziert wird, (SEQ ID NO.9, SEQ ID NO:10), produzieren könnte. Das erhaltene glpDFK-Plasmid wurde pECCG117-cdi glpDFK-2 genannt.
Beispiel 3: Einführung in Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Die hergestellten pECCG117-cdi glpDFK-1 und pECCG117-cdi glpDFK-2 wurden durch Elektropulsverfahren in Corynebacterium glutamicum ATCC13032 eingeführt. Die Zellen wurden auf Plattenmedium, enthaltend Bacto-Pepton 10g/l, Hefeextrakt 10 g/l, Rinderextrakt 5 g/l, NaCl 2,5 g/l und Kanamycin 25 □(µg)/ml, kultiviert. Die erhaltenen Kolonien kamen dann zu einer PCR-Klonierung, um die Kolonien auszuwählen, die das Plasmid enthalten, das das Gen umfasst, welches in der Verwertung von Glycerin involviert ist. Die ausgewählten Stämme wurden Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-1 bzw. Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-2 genannt.
Beispiel 4: Glycerin-Verwertbarkeit von Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Um die Glycerinverwertbarkeit von Corynebacterium glutamicum/pECCG117-cdi glpDFK-1 und Corynebacterium glutamicum/pECCG117-cdi glpDFK-2 zu bestätigen, wurde Corynebacterium glutamicum ATCC13032, das das obige Plasmid enthielt, und Corynebacterium glutamicum ATCC13032, das das Plasmid nicht enthielt, in festem Minimalmedium kultiviert. Die Zusammensetzung für das Minimalmedium ist wie folgt.
Zusammensetzung des Minimalmediums für eine Corynebacterium glutamicum-Kultur (pH 7,2):
Glycerin 10 g/l, KH₂PO₄ 1 g/l, K₂HPO₄ 2 g/l, MgSO₄·H₂O 0,4 g/l, Harnstoff 2 g/l, (NH4)₂SO₄ 5 g/l, NaCl 0,5 g/l, Nikotinsäureamid 5 mg/l, Calciumpantothenat 1 mg/l, Thiamin 3 mg/l, Biotin 200 □(µg)/l, Spurenelemente 1 ml, Agar 20 g/l.
Der inokulierte Stamm wurde in einem 30?-Inkubator für 48 Stunden kultiviert. Als Resultat wurde das Wachstum von Corynebacterium glutamicum, in das pECCG117-cdi glpDF-1 oder pECCG117-cdi glpDF-2 eingeführt worden war, in dem Minimalmedium bestätigt. Allerdings war das Wachstum des Stamms, in den das Plasmid nicht eingeführt worden war, unbedeutend.
Das Wachstum der zwei Stämme in flüssigem Minimalmedium wurde ebenfalls untersucht. Zuerst wurden die zwei Stämme in Impfmedium inokuliert, gefolgt von einer Kultur für 24 Stunden. Das Medium wurde durch Zentrifugation eliminiert. Das verbleibende Medium wurde durch zweifache Dispersion in Phosphatpuffer (pH 7,0) vollständig entfernt. Die Stämme wurden in 40 ml Minimalmedium inokuliert, gefolgt von einer Kultur bei 30°C für 36 Stunden. Das Wachstum zwischen den zwei Stämmen wurde verglichen. Minimalmedia wurden mit verschiedenen Kohlenstoffquellen, 12 g/l Glucose; 12 g/l Glycerin; je 6 g/l Glucose und Glycerin, supplementiert, um die Glycerinverwertung zu vergleichen. Die Resultate sind in 1 gezeigt.
Wie in 1 gezeigt ist, wuchs Corynebacterium glutamicum ATCC13032, bei dem das Gen, das in der Verwertung von Glycerin involviert ist, nicht eingeführt war, nicht so gut, da es Glycerin nicht effektiv verwerten konnte. Dagegen wuchs der Stamm, bei dem das Gen, das in der Verwertung von Glycerin involviert ist, eingeführt wurde, gut, indem Glycerin als Kohlenstoffquelle verwertete. Wenn Glycerin allein zugesetzt wurde, begünstigte dies das Wachstum von Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-2. Wenn allerdings Glucose allein oder sowohl Glucose als auch Glycerin zugesetzt wurden, begünstigte dies das Wachstum von Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECCG117-cdi glpDFK-1, so dass sie in diesem Experiment eingesetzt wurden.
Beispiel 5: Glycerinverwertbarkeit bei einem Stamm, der Glutaminsäure produziert

Um festzustellen, ob es nicht nur möglich ist, unter Verwendung von Glycerin nützlich Materialien zu produzieren, sondern auch das Wachstum von Corynebacteria zu stimulieren, wurde der Expressionsvektor pECCG117-cdi glpDFK-1 in Corynebacterium glutamicum SM5 (KFCC-11112), einen Stamm, der Glutaminsäure produziert, auf dieselbe Weise, wie in Beispiel 3 beschrieben, eingeführt. Die Glutaminsäureproduktivität wurde zwischen Corynebacterium glutamicum SM5 und Corynebacterium glutamicum SM5/pECCG117-cdi glpDFK-1 mit verschiedenen Kohlenstoffquellen (Glycerin allein, Glucose allein und Glucose und Glycerin zusammen (gemischt im erforderlichen Verhältnis)) verglichen. Das Corynebacterium glutamicum SM5 und das Corynebacterium glutamicum SM5/pECCG1 17-cdi glpDFK1 wurden durch eine Platinöse in Impfmedium eingeimpft, gefolgt von einer Kultur bei 30°C für 18 Stunden. Die Zusammensetzung des Impfmediums war wie folgt: Pepton 1 g/l, Hefeextrakt 0,5 g/l, Bratensaft 0,5 g/l, Glucose 1 g/l, Natriumchlorid 0,25 g/l, Harnstoff 0,13 g/l, pH 7,2. Zur Fermentation wurde 1 ml der Impfkulturlösung in Kulturmedium inokuliert, gefolgt von einer Kultur bei 30°C für 24 Stunden. Die Zusammensetzung des Kulturmediums war wie folgt: HSM 3 ml, Biotin 1 □(µg)/l, Abfallmelasse 0,05 g/l, Ammoniumsulfat 0,1 g/l, Eisensulfat 0,002 g/l, Mangansulfat 0,002 g/l, Magnesiumsulfat 0,05 g/l, Thiamin-HCl 500 □(µg)/l, Monokaliumphosphat 0,2 g/l, Harnstoff 0,95 g/l, pH 7,2. Unter Berücksichtigung der Kulturbedingungen wurde eine Kohlenstoffquelle zugesetzt. Als Resultat wurde die Produktion von L-Glutaminsäure bestätigt und die Vergleichsresultate sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

Vergleich des Wachstums und der Glutaminsäure-Produktivität in Fermentationsmedium, das Glycerin enthält, zwischen Corynebacterium glutamicum SM5 und SM5/pECCG117-cdi glpDFK-1
		SM5				SM5/117-cdi glpDFK-1
		24 h	51 h	72 h	120 h	24 h	51 h	72 h	120 h
OD	Glucose 30 g/l	7,73	10,15	9,36	9,72	5,94	9,92	9,0	9,89
	Glucose 15 g/l, Glycerin 15 g/l	4,69	7,09	6,86	6,27	4,68	7,94	6,8	6,77
	Glycerin 30 g/l	1,45	2,16	1,56	1,14	1,87	1,82	1,4	1,38
verbrauchte Glucose (g/l)	Glucose 30 g/l	10,47	30,93	30,93	30,93	8,73	30	30	30
	Glucose 15 g/l, Glycerin 15 g/l	5,21	15,21	15,21	15,21	3,96	15	15	15
	Glycerin 30 g/l	0,00	0	0,00	0,00	0,00	0	0,0	0,00
verbrauchte Glycerin (g/l)	Glucose 30 g/l	0,00	0	0,00	0,00	0,00	0	0,0	0,00
	Glucose 15 g/l, Glycerin 15 g/l	1,46	2,3	2,30	2,30	2,15	15	15	15
	Glycerin 30 g/l	2,75	3,4	4,75	4,31	3,62	6,5	8,0	7,89
produzierte Glutamin- säure (g/l)	Glucose 30 g/l	0,85	6,63	6,42	6,55	1,17	11,06	11,1	11,21
	Glucose 15 g/l, Glycerin 15 g/l	0,23	1,69	1,76	1,71	0,82	11,86	12,0	12,47
	Glycerin 30 g/l	0,03	0	0,05	0,00	0,19	1,6	1,9	1,96

Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, war das Wachstum von Corynebacterium glutamicum SM5, wenn Glycerin allein als Kohlenstoffquelle verwendet wurde, sehr schlecht und die Glutaminsäureproduktivität war unbedeutend. Dagegen konnte Corynebacterium glutamicum SM5/pECCG117-cdi glpDFK-1 wachsen, selbst wenn Glycerin allein als Kohlenstoffquelle verwendet wurde, und konnte Glutaminsäure mit ähnlicher Ausbeute produzieren, selbst wenn die Produktivität verringert war. Wenn Glycerin zusammen mit Glucose zugesetzt wurde (etwa 50:50), wurde Glutaminsäure ohne Verringerung der Ausbeute oder Produktivität produziert. Allerdings wies SM5 eine verringerte Glutaminsäureproduktion auf.
Beispiel 6: Einführung eines Gens, das in die Verwertung von Glycerin involviert ist, in einen Stamm, der Lysin produziert, und Lysinproduktion unter Verwendung desselben
Um zu untersuchen, ob es möglich war, unter Verwendung von Glycerin nicht nur nützlich Materialien zu produzieren, sondern auch das Wachstum von Corynebacteria zu stimulieren, wurde der Expressionsvektor pECCG117-cdi glpDFK-1 in Corynebacterium glutamicum CF 905 (KFCC-10881), einen Stamm, der Lysin produziert, auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 beschrieben, eingeführt.

Der Corynebacterium-glutamicum-Eltemstamm KFCC10881 und KFCC10881/pECCG117-cdi glpDFK-1, der Stamm der vorliegenden Erfindung, wurden jeweils in einen 250-ml-Kolben mit Schikanen, der 25 ml des Impfmediums enthielt, inokuliert, gefolgt von einer Schüttelkultur (200 UpM) bei 30°C für 20 Stunden. 1 ml der Impfkulturlösung wurde in einem 250-ml-Kolben mit Schikanen, der 24 ml des Produktionsmediums enthielt, inokuliert, gefolgt von einer Schüttelkultur (200 UpM) bei 30°C für 72 Stunden. Nach Beendigung der Kultur wurde die L-Lysin-Produktion mit einem Aminosäureanalysator gemessen. Die L-Lysin-Konzentrationen in Corynebacterium glutamicum KFCC10881- und KFCC10881/pECCG117-cdi glpDFK-1-Kulturen wurden untersucht und die Resultate sind in Tabelle 2 gezeigt Tabelle 2

	Kohlenstoffquelle	72 h
	Kohlenstoffquelle	OD	verbrauchte Glucose (g/l)	verbrauchtes Glycerin (g/l)	Lys
KFCC 10881	Glc 100 g/l	42,4	100,0		23,90
	Glc 100 g/l	43,2	100,0		21,74
	Glc 50 g/l Glycerin 50 g/l	32,8	50,0	0,0	13,22
	Glc 50 g/l Glycerin 50 g/l	32,7	50,0	0,0	13,52
KFCC10881/ pECCG117-cdi glpDFK-1	Glc 100 g/l	27,4	100,0		41,27
	Glc 100 g/l	22,3	100,0		41,42
	Glc 50 g/lGlycerin 50 g/l	34,3	50,0	50,0	28,95
	Glc 50 g/lGlycerin 50 g/l	33,9	50,0	50,0	30,89

Wie in Tabelle 2 gezeigt ist, wies der Stamm Glycerin-Verwertbarkeit auf, - anders als der Elternstamm - und die Lysinproduktion war erhöht, wenn der Vektor pECCG117-cdi glpDFK-1, der das Gen enthielt, das in der Verwertung von Glycerin involviert ist, in den lysinproduzierenden Stamm eingeführt war.
Impfmedium (pH 7,0):
Rohzucker 20 g, Pepton 10 g, Hefeextrakt 5 g, Harnstoff 1,5 g, K₂HPO₄ 8 g, MgSO₄ - 7H₂O 0,5 g, Biotin 100 □(µg), Thiamin-HCl 1000 □(µg), Calciumpantothenat 2000 □(µg), Nicotinamid 2000 □(µg) (in 11 Verfahrenswasser).
Produktionsmedium (pH 7,0):
Glucose 100 g, (NH₄)₂SO₄ 40 g, Sojaprotein 2,5 g, Maisquellwasser-Feststoffe 5 g, Harnstoff 3 g KH₂PO₄ 1 g, MgSO₄·7H₂O 0,5 g, Biotin 100 □(µg), Thiamin HCl 1000 □(µg), Calcium-Pantothensäure 2000 □(µg), Nicotinamid 3000 □(µg), CaCO3 30 g (in 11 Verfahrenswasser).
Industrielle Anwendbarkeit
Wie vorstehend erläutert wurde, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsproduktes mit hoher Ausbeute unter effektiver Verwertung von Glycerin, welches das Nebenprodukt der Ölindustrie und Biodiesel-Produktion ist, bereit. Der Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung kann ein Fermentationsprodukt effektiv in dem Medium, das eine komplexe Kohlenstoffquelle, die Glycerin umfasst, enthält, und in dem Medium, das Glycerin allein als Kohlenstoffquelle enthält, produzieren. Daher kann der Mikroorganismus, der fähig ist, das Fermentationsprodukt zu produzieren, basierend auf dem Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung, Glycerin effektiv als Kohlenstoffquelle verwerten.
Der Fachmann auf dem Fachgebiet wird verstehen, dass Konzeptionen und spezifische Ausführungsformen, die in der vorangehenden Beschreibung offenbart sind, leicht als Basis zur Modifizierung oder Entwicklung anderer Ausführungsformen zur Verfolgung derselben Zwecke wie die vorliegende Erfindung genutzt werden können. Der Fachmann wird auch erkennen, dass derartige äquivalente Ausführungsformen den Geist und Rahmen der Erfindung, wie sie in den beigefügten Ansprüchen beschrieben ist, nicht verlassen.
SEQUENZPROTOKOLL

<110> CJ Cheiljedang Corporation
<120> Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsproduktes aus Kohlenstoffquellen, die Glycerin enthalten, unter Verwendung von Corynebacteria
<130> 20359DE
<150> KR 10-2007-007513 <151> 2007-01-24
<160> 10
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence
<220> <223> primer 1
<400> 1 gatgcggccg cgctgtgtgg cgtatgtcg 29
<210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence
<220> <223> primer 2
<400> 2 gatgcggccg caatcatcaa acccaacccc a 31
<210> 3 <211> 4261 <212> DNA <213> Artificial Sequence
<220> <223> DNA sequence of glpDFK-1 from pECCG117-cdi glpDFK-1
<220> <221> mutation <222> (54) ... (54) <223> thymine → cytidine
<220> <221> mutation <222> (1598)...(1598) <223> adenine → guanine
<220> <221> mutation <222> (2608) ... (2608) <223> adenine → guanine
<220> <221> mutation <222> (2829) ... (2829) <223> adenine → guanine
<220> <221> mutation <222> (3037)...(3037) <223> adenine → guanine
<400> 3
<210> 4 <211> 577 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> Amino acid sequence of GlpD from pECCG117-cdi glpDFK-1
<400> 4
<210> 5 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> Amino acid sequence of GlpF from pECCG117-cdi glpDFK-1
<400> 5
<210> 6 <211> 506 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> Amino acid sequence of GlpK from pECCG117-cdi glpDFK-1
<400> 6
<210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence
<220> <223> primer 3
<400> 7 ggaaatctgg gccaacacgc gccaagcc 28
<210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence
<220> <223> primer 4
<400> 8 ggcttggcgc gtgttggccc agatttcc 28
<210> 9 <211> 4261 <212> DNA <213> Artificial Sequence
<220> <223> DNA sequence of glpDFK-2 from pECCG117-cdi glpDFK-2
<400> 9
<210> 10 <211> 506 <212> PRT <213> Artificial Sequence
<220> <223> Amino acid sequence of GlpK from pECCG117-cdi glpDFK-2
<400> 10

Claims

Corynebacterium glutamicum, das eine durch SEQ ID N0:9 dargestellte Nucleotidsequenz, die von Corynebacterium diphtheriae NCTC13129 stammt, hat, das mit glpDFK, einem Genkomplex, der die Verwertung von Glycerin erleichtert, transformiert ist.
Corynebacterium glutamicum, das die durch SEQ ID NO:3 dargestellte Nucleotidsequenz, die von Corynebacterium diphtheriae NCTC13129 stammt, hat, das mit glpDFK, einem Genkomplex, der die Verwertung von Glycerin erleichtert, transformiert ist.
Corynebacterium glutamicum gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Corynebacterium glutamicum ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium glutamicum SM5 (KFCC-11112) und Corynebacterium glutamicum CF 905 (KFCC-10881).
Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsproduktes unter Verwendung von Glycerin, umfassend die folgenden Schritte: Inokulieren und Kultivieren von Corynebacterium glutamicum, das mit glpDFK, der Genkomplex, der die Verwertung von Glycerin erleichtert, transformiert ist, in einem Kulturmedium, das Glycerin oder einen Glycerinanteil als Kohlenstoffquelle enthält, und Abtrennen des Fermentationsproduktes von der Kultur.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei das glpDFK die durch SEQ ID NO:9 dargestellte Nucleotidsequenz hat, die von Corynebacterium diphtheriae NCTC13129 stammt.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei das glpDFK die durch SEQ ID NO:3 dargestellte Nucleotidsequenz hat, die von Corynebacterium diphtheriae NCTC 13129 stammt.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Transformation mit dem Vektor, der das glpDFK-Gen enthält, durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Transformation durch Einführen eines Plasmids, das nach Transformieren einer Wirtszelle mit dem Vektor, der das glpDFK-Gen enthält, erhalten wurde, in das Corynebacterium glutamicum durch ein Elektropulsverfahren durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Wirtszelle E. coli CO02-00I4 (Zugangsnummer: KCCM 10834P) ist.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei das Corynebacterium glutamicum ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium glutamicum SM5 (KFCC-11112) und Corynebacterium glutamicum CF 905 (KFCC-10881).
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei das Fermentationsprodukt Glutaminsäure oder Lysin ist.