DE112010004851T5

DE112010004851T5 - Verfahren und rekombinante Mikroorganismen für die Herstellung von Cadaverin

Info

Publication number: DE112010004851T5
Application number: DE112010004851T
Authority: DE
Inventors: Hartwig Schröder; Weol Kyu Jeong; Annegret Welzel; Oskar Zelder
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2009-12-17
Filing date: 2010-12-15
Publication date: 2012-09-20
Also published as: WO2011073278A1; CN102753682A; EP2513302A1; JP2013514069A; JP5960604B2; KR20120094137A; CN106906175A; US20120295317A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von rekombinanten Mikroorganismen, die DNA-Moleküle in einer deregulierten Form umfassen, welche die Herstellung von Cadaverin verbessern, wie auch rekombinante DNA-Moleküle und Polypeptide, die verwendet werden, um den Mikroorganismus herzustellen, wobei der Mikroorganismus eine intrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität und eine gesteigerte Lysin-Import-Aktivität umfasst, oder eine intrazelluläre und eine extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität umfasst oder eine intrazelluläre und extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität und eine gesteigerte Lysin-Import-Aktivität umfasst. Die vorliegende Erfindung betrifft auch (ein) Verfahren zur Herstellung von Cadaverin unter Verwendung rekombinanter Mikroorganismen.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von rekombinanten Mikroorganismen, die DNA-Moleküle in einer deregulierten Form umfassen, welche die Herstellung von Cadaverin verbessern, wie auch rekombinante DNA-Moleküle und Polypeptide, die verwendet werden, um den Mikroorganismus herzustellen, wobei der Mikroorganismus eine intrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität und eine gesteigerte Lysin-Import-Aktivität umfasst, oder eine intrazelluläre und eine extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität umfasst oder eine intrazelluläre und extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität und eine gesteigerte Lysin-Import-Aktivität umfasst. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Cadaverin unter Verwendung rekombinanter Mikroorganismen.
STAND DER TECHNIK
Das JP 2002223770 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Cadaverin durch die Einbringung eines Lysin-Decarboxylierungs-Gens und/oder eines Lysin-Cadaverin-Antiporter-Gens in einen Lysin produzierenden Mikroorganismus.
Das JP 2004222569 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Cadaverin durch Kultivieren rekombinanter coryneformer Bakterien mit L-Lysin-Decarboxylase-Aktivität und einer Homoserin-Auxotrophie.
Die WO 2007113127 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Cadaverin durch die Kultivierung rekombinanter coryneformer Bakterien mit einer deregulierten L-Lysin-Decarboxylase-Aktivität, die Detektion einer Cadaverin-Acetyltransferase und deren Deletion, um die Cadaverin-Produktion zu verbessern.
Die WO 2008092720 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Cadaverin durch Fermentieren von Hoch-Lysin-produzierenden Mikroorganismen, welche eine intrazellulär exprimierte Decarboxylase exprimieren. Dabei können diese Mikroorganismen eine reduzierte oder eliminierte Expression eines Lysin/Cadaverin-Antiporter aufweisen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem Aspekt, stellt die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus bereit, welcher eine intrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität und eine gesteigerte Lysin-Import-Aktivität aufweist, oder eine intrazelluläre und eine extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität aufweist, oder eine intrazelluläre und eine extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität und eine gesteigerte Lysin-Import-Aktivität aufweist.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus, wie oben beschrieben, und ein Verfahren zur Herstellung von Cadaverin durch Kultivieren des Mikroorganismus, wie oben beschrieben, bereit, wobei die intrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität oder die extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität oder die intrazelluläre und die extrazelluläre Decarboxylase-Aktivität des Mikroorganismus zumindestens teilweise auf die Expression von mindestens einem Polypeptid zurückzuführen ist, das ein Homolog einer cadA-Lysin-Decarboxylase oder einer IdcC-Lysin-Decarboxylase ist.
In einem weitereren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus vor, welcher eine intrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität und eine gesteigerte Lysin-Import-Aktivität aufweist oder eine intrazelluläre und eine extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität aufweist oder eine intrazelluläre und eine extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität und eine gesteigerte Lysin-Import-Aktivität aufweist, wobei die gesteigerte Lysin-Import-Aktivität auf eine gesteigerte Lysin-Permease-Aktivität oder eine gesteigerte Lysin/Cadaverin-Antiporter-Aktivität zurückzuführen ist.
In einem weitereren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus, wie oben beschrieben, vor, wobei die gesteigerte Lysin-Import-Aktivität auf die Verringerung oder Eliminierung der Expression eines Lysin-Exporter-Polypeptid zurückzuführen ist, oder auf eine gesteigerte Lysin-Permease-Aktivität zurückzuführen ist oder auf einer gesteigerten Lysin/Cadaverin-Antiporter-Aktivität oder einer beliebigen Kombination davon beruht.
In einem weitereren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus, wie oben beschrieben, vor, wobei die Aktivität eines lysE-Polypeptids verringert ist oder wobei die Aktivität eines Lysinpermease-Polypeptids gesteigert ist oder wobei die Aktivität eines Lysin/Cadaverin Antiporter-Polypeptids gesteigert ist, oder der eine beliebige Kombination aus einer verringerten lysE-Polypeptid-Aktivität, einer gesteigerten Aktivität eines Lysinpermease-Polypeptids oder einer gesteigerten Aktivität eines Lysin/Cadaverin-Anti porter-Polypeptids aufweist.
In einem weitereren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus vor, der eine beliebige Kombination von oben beschriebenen Merkmalen aufweist und keine oder eine verringerte Acetylcadaverin-bildende Aktivität aufweist oder keine oder eine verringerte Aminopropylcadaverin-bildende Aktivität aufweist oder keine oder eine verringerte Homoserin-Dehydrogenase-Aktivität aufweist oder keine oder eine verringerte Lysin-Abbau-Aktivität aufweist oder wobei mindestens zwei dieser Aktivitäten nicht vorhanden oder verringert sind. In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus bereit, der eine beliebige Kombination von oben beschriebenen Merkmalen aufweist, wobei die Aktivität eines NP_600742-Proteins oder eines Spermidin-Synthase-Proteins oder eines Homoserin-Dehydrogenase-Proteins oder eines Lysin-Hydroxylase-Proteins oder wobei die Aktivität von jedweder Kombination dieser Proteine verringert ist.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus bereit, der eine deregulierte Spermidin bildende oder -Aufnahme-Aktivität oder eine deregulierte Putrescin bildende oder -Aufnahme-Aktivität oder jedwede Kombination davon aufweist.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus bereit, der die oben beschriebenen Merkmale aufweist, wobei der Mikroorganismus zu der Klade Eubacteria, z. B. der Gattung Corynebacterium oder Escherichia, insbesondere der Spezies Corynebacterium glutamicum oder Escherichia coli gehört.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Cadaverin-Produktionssystem bereit, umfassend Mikroorganismen mit den oben beschriebenen Merkmalen und ein Kulturmedium, das Lysin enthält.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Produktion von Cadaverin bereit, umfassend das Fermentieren von einem beliebigen der oben beschriebenen Mikroorganismen in einem Kulturmedium, das Lysin umfasst oder Lysin nicht umfasst.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, wobei das Kulturmedium mindestens 0,25 mol/l Cadaverin, aber nicht mehr als 0,1 mol/l Acetylcadaverin oder mehr als 0,1 mol/l Aminopropylcadaverin umfasst, oder wobei die Konzentration (mol/l) von Cadaverin in dem Kulturmedium mindestens 1,2-fach höher ist als der Prozentsatz (Gewicht/Volumen) an Acetylcadaverin oder mindestens 1,2-fach höher ist als der Prozentsatz (Gewicht/Volumen) an Aminopropylcadaverin.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Kulturmedium bereit, das mindestens 0,25 mol/l Cadaverin umfasst, aber nicht mehr als 0,1 mol/l Acetylcadaverin oder mehr als 0,1 mol/l Aminopropylcadaverin umfasst, oder ein Kulturmedium, worin die Konzentration (mol/l) an Cadaverin mindestens 1,2-fach höher als die Konzentration (mol/l) von Acetylcadaverin ist oder mindestens 1,2-fach höher als die Konzentration (mol/l) von Aminopropylcadaverin ist.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von einem beliebigen der oben beschriebenen Mikroorganismen) für die Produktion von Cadaverin, oder die Verwendung in einem Verfahren zur Produktion von Cadaverin bereit.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Fermentationsnährbrühe, die durch die Fermentation von einem beliebigen der oben beschriebenen Mikroorganismen hergestellt wurde, oder einer Fermentationsnährbrühe, die eine hohe Konzentration an Cadaverin und eine geringe Konzentration an Acetylcadaverin oder eine geringe Konzentration an Aminopropylcadaverin aufweist, für die Gewinnung von Cadaverin bereit.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus bereit, der die Merkmale des Umwandelns von Hemicellulose-abgeleiteten Pentosen zu Feinchemikalien, wie Cadaverin oder Lysin, aufweist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
Die 1 ist ein Schema des DAP-Biosynthesewegs in Corynebacterium glutamicum, einschließlich eines Cadaverin-Acetylierungs-Schrittes.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In der Beschreibung, die folgt, wird eine Reihe von Begriffen umfangreich benutzt. Definitionen werden hierin bereitgestellt, um das Verständnis der Erfindung zu erleichtern.
Der Begriff Cadaverin bedeutet 1,5-Diaminopentan (CAS-Nummer: 462-94-2). Die Methodiken der vorliegenden Erfindung beinhalten rekombinante Mikroorganismen, die vorzugsweise Vektoren oder Gene (z. B. Wildtyp- und/oder mutierten Gene), wie hierin beschrieben, einschließen und/oder in einer Weise kultiviert werden, die zur Herstellung von Cadaverin führt.
Der Begriff ”rekombinanter” Mikroorganismus beinhaltet einen Mikroorganismus (z. B. Bakterien, Hefezelle, Pilzzelle, etc.), der genetisch verändert, modifiziert oder konstruiert (z. B. gentechnisch verändert) worden ist, so dass er einen geänderten, modifizierten oder anderen Genotyp und/oder Phänotyp aufweist (z. B. wenn die genetische Modifikation codierende Nukleinsäuresequenzen des Mikroorganismus beeinflußt) im Vergleich zu dem natürlich vorkommenden Mikroorganismus, aus dem er abgeleitet wurde.
Promotor. Eine DNA-Sequenz, welche die Transkription eines Strukturgens zum Herstellen von mRNA steuert. Typischerweise ist ein Promotor in der 5'-Region eines Gens, proximal zum Startcodon eines Strukturgens, lokalisiert. Wenn ein Promotor ein induzierbarer Promotor ist, dann steigt die Rate der Transkription in Antwort auf ein induzierendes Mittel. Im Gegensatz dazu wird die Rate der Transkription nicht durch ein induzierendes Mittel reguliert, wenn der Promotor ein konstitutiver Promotor ist.
Enhancer. Ein Promotorelement. Ein Enhancer kann die Effizienz erhöhen, mit der ein betreffendes Gen in mRNA transkribiert wird, ungeachtet des Abstands oder der Orientierung des Enhancers im Verhältnis zur Startstelle der Transkription.
Klonierungsvektor. Ein DNA-Molekül, wie etwa ein Plasmid, Cosmid, Phagmid oder Bakteriophage, das die Fähigkeit zum autonomen Replizieren in einer Wirtszelle besitzt und das zum Transformieren von Zellen für eine Genmanipulation verwendet wird. Klonierungsvektoren enthalten typischerweise eine oder eine kleine Anzahl von Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen, an denen Fremd-DNA-Sequenzen in einer vorbestimmbaren Weise ohne Verlust einer essentiellen biologischen Funktion des Vektors inseriert werden können, sowie ein Markergen, welches zur Verwendung bei der Identifizierung und Selektion von Zellen, die mit dem Klonierungsvektor transformiert wurden, geeignet ist. Markergene schließen typischerweise Gene ein, welche Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz vorsehen.
Expressionsvektor. Ein DNA-Molekül, welches ein kloniertes Strukturgen umfasst, das ein Fremdprotein codiert, was die Expression des Fremdproteins in einem rekombinanten Wirt bereitstellt. Typischerweise wird die Expression des klonierten Gens unter die Kontrolle von gewissen regulatorischen Sequenzen, wie Promotor- und Enhancersequenzen, gebracht (d. h. funktionsfähig mit diesen verknüpft). Promotersequenzen können entweder konstitutiv oder induzierbar sein.
Rekombinanter Wirt. Ein rekombinanter Wirt kann eine beliebige prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein, welche entweder einen Klonierungsvektor oder einen Expressionsvektor enthält. Dieser Begriff soll ebenfalls diejenigen prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen einschließen, welche genetisch verändert wurden, so dass sie die klonierten Gen(e) im Chromosom oder Genom der Wirtszelle enthalten. Für Beispiele von geeigneten Wirten, siehe Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) ["Sambrook"].
Die Begriffe ”exprimieren”, ”Exprimieren”, ”exprimiert” und ”Expression” beziehen sich auf die Expression eines Genprodukts (z. B. eines biosynthetischen Enzyms von einem Gen eines Wegs oder einer Reaktion, welche(r) in dieser Patentanmeldung definiert und beschrieben ist) bei einem Spiegel, so dass die resultierende Enzymaktivität dieses codierten Proteins, oder des Weges oder der Reaktion, welche(n) sie belangt, einen metabolischen Fluss durch diesen Weg oder eine Reaktion in dem Organismus gestattet, in welchem dieses Gen/dieser Weg exprimiert wird. Die Expression kann durch genetische Veränderung des Mikroorganismus vorgenommen werden, der als ein Ausgangsorganismus verwendet wird. In manchen Ausführungsformen kann ein Mikroorganismus genetisch verändert sein (z. B. gentechnisch verändert sein), um ein Genprodukt bei einem erhöhten Spiegel im Vergleich zu jenem zu exprimieren, der von dem Ausgangsmikroorganismus oder in einem vergleichbaren Mikroorganismus welcher nicht verändert worden ist, hervorgebracht wird. Genetische Veränderung beinhaltet, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, das Verändern oder Modifizieren von regulatorischen Sequenzen oder Stellen, die mit der Expression eines bestimmten Gens assoziiert sind (z. B. durch Hinzufügen starker Promotoren, induzierbarer Promotoren oder multipler Promotoren oder durch Entfernen regulatorischer Sequenzen, so dass die Expression konstitutiv ist), das Modifizieren der chromosomalen Lage eines bestimmten Gens, das Verändern von zu einem bestimmten Gen benachbarten Nukleinsäuresequenzen, wie etwa einer Ribosomenbindungsstelle oder einem Transkriptionsterminator, das Erhöhen der Kopienzahl eines bestimmten Gens, das Modifizieren von Proteinen (z. B. regulatorischen Proteinen, Suppressoren, Enhancern, transkriptionalen Aktivatoren und dergleichen), die an der Transkription eines bestimmten Gens und/oder der Translation eines bestimmten Genprodukts beteiligt sind, oder jegliche anderen herkömmlichen Mittel zum Deregulieren der Expression eines bestimmten Gens unter Anwendung der Routine des Fachgebiets (einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuremolekülen, zum Beispiel, um die Expression von Repressorproteinen zu blockieren).
In manchen Ausführungsformen kann ein Mikroorganismus physikalisch oder umgebungsmäßig verändert werden, so dass er ein Genprodukt bei einem erhöhten oder niedrigeren Spiegel im Vergleich zum Spiegel der Expression des Genprodukts durch den Ausgangsmikroorganismus exprimiert. Zum Beispiel kann ein Mikroorganismus behandelt werden mit oder kultiviert werden in Gegenwart von einem Agens, das bekanntermaßen oder vermutlich die Transkription eines bestimmten Gens und/oder die Translation eines bestimmten Genprodukts erhöht, so dass die Transkription und/oder die Translation gesteigert oder erhöht werden. Alternativ kann ein Mikroorganismus bei einer Temperatur kultiviert werden, die ausgewählt ist, um die Transkription eines bestimmten Gens und/oder die Translation eines bestimmten Genprodukts zu erhöhen, so dass Transkription und/oder Translation gesteigert oder erhöht werden.
Die Begriffe ”deregulieren”, ”deregulierte”, und ”Deregulation” beziehen sich auf die Veränderung oder Modifikation von mindestens einem Gen in einem Mikroorganismus, wobei die Veränderung oder Modifikation zur Erhöhung der Effizienz der Cadaverinproduktion in dem Mikroorganismus im Vergleich zur Cadaverinproduktion in Abwesenheit der Veränderung oder Modifikation führt. In manchen Ausführungsformen codiert ein Gen, das verändert oder modifiziert wird, ein Enzym in einem biosynthetischen Weg oder ein Transportprotein, so dass der Spiegel oder die Aktivität des biosynthetischen Enzyms in dem Mikroorganismus verändert oder modifiziert wird oder dass die Transportspezifität oder -effizienz verändert oder modifiziert wird. In manchen Ausführungsformen wird mindestens ein Gen, das ein Enzym in einem biosynthetischen Weg codiert, so verändert oder modifiziert, dass der Spiegel oder die Aktivität des Enzyms im Vergleich zum Spiegel in Gegenwart des unveränderten oder Wildtyp-Gens gesteigert oder erhöht ist. Deregulation schließt auch das Verändern der codierenden Region von einem oder mehreren Genen ein, um zum Beispiel ein Enzym zu ergeben, welches Rückkopplungs-resistent ist oder eine höhere oder niedrigere spezifische Aktivität aufweist. Des Weiteren umfasst eine Deregulation das genetische Verändern von Genen, die transkriptionale Faktoren (z. B. Aktivatoren, Repressoren) codieren, welche die Expression von Genen regulieren, die Enzyme oder Transportproteine codieren.
Die Begriffe ”überexprimieren”, ”Überexprimieren”, ”überexprimiert” und ”Überexpression” beziehen sich auf die Expression eines Genprodukts, insbesondere auf die Steigerung der Expression eines Genprodukts (z. B. eines Lysin-biosynthetischen Enzyms oder Sulfatreduktionsweg-Enzyms oder Cysteinbiosynthese-Enzyms oder eines Gens oder eines Weges oder einer Reaktion, welche(r) in dieser Anmeldung definiert und beschrieben ist) bei einem größeren Spiegel als jenem, der vor einer genetischen Veränderung des Ausgangsmikroorganismus vorhanden war. In manchen Ausführungsformen kann ein Mikroorganismus genetisch verändert (z. B. gentechnisch verändert) sein, um ein Genprodukt bei einem erhöhten Spiegel im Vergleich zu jenem zu exprimieren, der von dem Ausgangsmikroorganismus hervorgebracht wurde. Genetische Veränderung beinhaltet, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, das Verändern oder Modifizieren von regulatorischen Sequenzen oder Stellen, die mit der Expression eines bestimmten Gens assoziiert sind (z. B. durch Hinzufügen von starken Promotoren, induzierbaren Promotoren oder multiplen Promotoren oder durch Entfernen von regulatorischen Sequenzen, so dass die Expression konstitutiv ist), das Modifizieren der chromosomalen Lage eines bestimmten Gens, das Verändern von zu einem bestimmten Gen benachbarten Nukleinsäuresequenzen, wie etwa einer Ribosomenbindungsstelle oder einem Transkriptionsterminator, das Erhöhen der Kopienzahl eines bestimmten Gens, das Modifizieren von Proteinen (z. B. regulatorischen Proteinen, Suppressoren, Enhancern, transkriptionalen Aktivatoren und dergleichen), die an der Transkription eines bestimmten Gens und/oder der Translation eines bestimmten Genprodukts beteiligt sind, oder jegliche anderen herkömmlichen Mittel zum Deregulieren der Expression eines bestimmten Gens unter Anwendung der Routine des Fachgebiets (einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuremolekülen, zum Beispiel, um die Expression von Repressorproteinen zu blockieren). Ein anderer Weg zum Überexprimieren eines Genprodukts besteht darin, die Stabilität des Genprodukts zu steigern, um dessen Lebensdauer zu erhöhen. Beispiele für die Überexpression von Genen in Organismen, wie C. glutamicum, können in Eikmanns et al (Gene. (1991) 102, 93–8) gefunden werden.
Der Begriff ”dereguliert” beinhaltet die Expression eines Genprodukt (z. B. Lysin-Decarboxylase) bei einem Spiegel, der niedriger oder höher ist als jener, der vor der Manipulation des Mikroorganismus oder in einem vergleichbaren Mikroorganismus, der nicht manipuliert worden ist, exprimiert wird. In einer Ausführungsform kann der Mikroorganismus genetisch manipuliert (z. B. gentechnisch verändert) werden, um einen Spiegel an Genprodukt bei einem geringeren oder höheren Spiegel als jenem zu exprimieren, der vor der Manipulation des Mikroorganismus oder in einem vergleichbaren Mikroorganismus der nicht manipuliert worden ist, exprimiert wird. Genetische Manipulation kann, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, das Verändern oder Modifizieren von regulatorischen Sequenzen oder Stellen, die mit der Expression eines bestimmten Gens assoziiert sind (z. B. durch Entfernen von starken Promotoren, induzierbaren Promotoren oder multiplen Promotoren), das Modifizieren der chromosomalen Lage eines bestimmten Gens, das Verändern von zu einem bestimmten Gen benachbarten Nukleinsäuresequenzen, wie einer Ribosomenbindungsstelle oder eines Transkriptionsterminators, das Verringern der Kopienzahl eines bestimmten Gens, das Modifizieren von Proteinen (z. B. regulatorischen Proteinen, Suppressoren, Enhancern, transkriptionalen Aktivatoren und dergleichen), die an der Transkription eines bestimmten Gens und/oder Translation eines bestimmten Genprodukts beteiligt sind, oder jegliche anderen im Fachgebiet routinemäßigen herkömmlichen Mittel zum Deregulieren der Expression eines bestimmten Gens (einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuremolekülen oder anderer Verfahren zum Knockout oder Blockieren der Expression des Zielproteins) einschließen.
Der Begriff ”deregulierte Genaktivität”, z. B. deregulierte Lysin-Decarboxylase, bedeutet auch, dass eine Genaktivität, z. B. eine Lysin-Decarboxylase-Aktivität, in einen Mikroorganismus eingebracht wird, worin die betreffende Genaktivität, z. B. die Lysin-Decarboxylase-Aktivität, zuvor nicht beobachtet wurde, z. B. indem ein heterologes Gen, z. B. ein Lysin-Decarboxylase-Gen, in einer oder mehreren Kopien in den Mikroorganismus, vorzugsweise mittels gentechnischer Manipulierung, eingebracht wird.
Der Ausdruck ”deregulierte(r) Weg oder Reaktion” bezieht sich auf einen biosynthetischen Weg oder eine Reaktion, in welcher mindestens ein Gen, das ein Enzym in einem biosynthetischen Weg oder einer biosynthetischen Reaktion codiert, so verändert oder modifiziert ist, dass der Spiegel oder die Aktivität von mindestens einem biosynthetischen Enzym verändert oder modifiziert wird. Der Ausdruck ”deregulierter Weg” beinhaltet einen biosynthetischen Weg, in welchem mehr als ein Gen verändert oder modifiziert worden ist, wodurch der Spiegel und/oder die Aktivität der entsprechenden Genprodukte/Enzyme verändert wird. In manchen Fällen erwächst die Fähigkeit zum ”Deregulieren” eines Weges (z. B. zum simultanen Deregulieren von mehr als einem Gen in einem gegebenen biosynthetischen Weg) in einem Mikroorganismus aus dem betreffenden Phänomen bei Mikroorganismen, bei dem mehr als ein Enzym (z. B. zwei oder drei biosynthetische Enzyme) von Genen codiert werden, welche aneinander angrenzend auf einem zusammenhängenden Stück von genetischem Material vorkommen, das man als ein ”Operon” bezeichnet. In anderen Fällen muss zum Deregulieren eines Wegs eine Anzahl von Genen in einer Serie von sequentiellen Manipulierungsschritten dereguliert werden.
Zum Exprimieren der deregulierten Gene gemäß der Erfindung muss die das Enzym codierende DNA-Sequenz funktionsfähig an regulatorische Sequenzen, welche die transkriptionale Expression in einem Expressionsvektor steuern, verknüpft und dann in entweder eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle eingebracht werden. Zusätzlich zu transkriptionalen regulatorischen Sequenzen, wie Promotoren und Enhancern, können Expressionsvektoren translationale regulatorische Sequenzen und ein Markergen, welches für die Selektion von Zellen, die den Expressionsvektor tragen, geeignet ist, einschließen.
Geeignete Promotoren zur Expression in einem prokaryotischen Wirt können reprimierbar, konstitutiv oder induzierbar sein. Geeignete Promotoren sind dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt und schließen Promotoren, die zur Erkennung der T4-, T3-, Sp6- und T7-Polymerasen in der Lage sind, die PR- und Pi-Promotoren von Bacteriophage-Lambda, die trp-, recA-, Hitzeschock-, lacUV5-, tac-, lpp-lac pr-, phoA-, gal-, trc- und lacZ-Promotoren von E. coli, die Alpha-Amylase- und die sigma28-spezifischen Promotoren von B. subtilis, die Promotoren der Bakteriophagen von Bacillus, Streptomyces-Promotoren, den int-Promotor von Bakteriophage Lambda, den bla-Promotor des β-Lactamase-Gens von pBR322 und den CAT-Promotor des Chloramphenicolacetyltransferase-Gens sowie PGRO, PSOD, PEFTU, PEFTS aus Corynebacterium und Kombinationen dieser Promotoren, wie in WO 2005059144 , WO 2007011939 , WO 2007012078 , WO 2005059093 , WO 2008049782 , WO 2006069711 , WO 2007020295 beschrieben, ein. Prokaryotische Promotoren sind übersichtsmäßig zusammengefasst bei Glick, J. Ind. Microbiol. 1: 277 (1987); Watson et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, 4. Aufl., Benjamin Cummins (1987); Ausubel et al., siehe oben, und Sambrook et al., siehe oben.
Ein bevorzugter Promotor für die Expression der E.coli-Lysin-Decarboxylase ist der PsodA-, der PGRO- und der PEFTU-Promotor von C. glutamicum, der in WO 2005059144 , WO 2007011939 , WO 2007012078 , WO 2005059093 , WO 2008049782 , WO 2006069711 , WO 2007020295 beschrieben ist.
Verfahren zum Exprimieren von Proteinen in prokaryotischen Wirten sind dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. Siehe zum Beispiel, Williams et al., "Expression of foreign Proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies," in DNA CLONING 2: EXPRESSION SYSTEMS, 2. Auflage, Glover et al. (Hrsg.), Seiten 15-58 (Oxford University Press 1995). Siehe ebenfalls Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Seiten 137–185 (Wiley-Liss, Inc. 1995); und Georgiou, "Expression of Proteins in Bacteria," in PROTEIN ENGINEERING: PRINCIPLES AND PRACTICE, Cleland et al. (Hrsg.), Seiten 101–127 (John Wiley & Sons, Inc. 1996). Weitere Verfahren zum Erhöhen oder Verringern von Genexpression und Proteinproduktion können in WO 2008049782 gefunden werden.
Ein Expressionsvektor kann mit Hilfe einer Vielzahl von Techniken in bakterielle Wirtszellen eingebracht werden, einschließlich Calciumchlorid-Transformation, Elektroporation und dergleichen. Siehe zum Beispiel, Ausubel et al. (Hrsg.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3. Auflage, Seiten 1-1 bis 1-24 (John Wiley & Sons, Inc. 1995).
Wie hierin verwendet, bedeutet ein im Wesentlichen reines Protein, dass das gewünschte gereinigte Protein im Wesentlichen frei von kontaminierenden zellulären Komponenten ist, wie durch eine Einzelbande im Anschluß an Polyacrylamid-Natriumdodecylsulfat-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) verdeutlicht. Der Begriff ”im Wesentlichen rein ”soll ferner ein Molekül beschreiben, das hinsichtlich eines oder mehrerer vom Fachmann angewandter Reinheits- oder Homogenitätscharakteristika homogen ist. Zum Beispiel wird eine im Wesentlichen reine Lysin-Decarboxylase konstante und reproduzierbare Charakteristika innerhalb standardmäßiger experimenteller Abweichungen für Parameter wie die folgenden zeigen: Molekulargewicht, chromatographisches Wanderungsverhalten, Aminosäurezusammensetzung, Aminosäuresequenz, blockierter oder unblockierter N-Terminus, HPLC-Elutionsprofil, biologische Aktivität und andere derartige Parameter. Der Begriff soll jedoch künstliche oder synthetische Gemische von Lysin-Decarboxylase mit anderen Verbindungen nicht ausschließen. Darüber hinaus soll der Begriff nicht Lysin-Decarboxylase-Fusionsproteine ausschließen, die aus einem rekombinanten Wirt isolert wurden.
In einem ersten Aspekt liefert die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus, der eine intrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität und eine gesteigerte Lysin-Import-Aktivität aufweist oder eine intrazelluläre und eine extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität umfasst oder eine intrazelluläre und eine extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität und eine gesteigerte Lysin-Import-Aktivität umfasst.
Der Mikroorganismus kann ein beliebiger prokaryotischer oder eukaryotischer Mikroorganismus sein, insbesondere Bakterien, Archaea, Hefen und Pilze. Bevorzugt sind Mikroorganismen, die aus der Gattung Corynebacterium, mit besonderer Berücksichtigung von Corynebacterium glutamicum, aus der Gattung Escherichia, mit besonderer Berücksichtigung von Escherichia coli, aus der Gattung Bacillus, insbesondere Bacillus subtilis, und aus der Gattung Streptomyces ausgewählt sind.
Wie oben dargelegt, betrifft eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung die Verwendung von Wirtszellen, welche aus coryneformen Bakterien, wie Bakterien der Gattung Corynebacterium, ausgewählt sind. Besonders bevorzugt sind die Spezies Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium melassecola und Corynebacterium effiziens. Andere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung betreffen die Verwendung von Brevibacteria und insbesondere die Spezies Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum und Brevibacterium divarecatum.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung können die Wirtszellen aus der Gruppe gewählt sein, die Corynebacterium glutamicum ATCC13032, C. acetoglutamicum ATCC 15806, C. acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERMBP-1539, Corynebacterium melassecola ATCC17965, Corynebacterium effiziens DSM 44547, Corynebacterium effiziens DSM 44549, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactoformentum ATCC13869, Brevibacterium divarecatum ATCC 14020, Corynebacterium glutamicum KFCC10065 und Corynebacterium glutamicum ATCC21608 sowie Stämme, welche z. B. durch klassische Mutagenese und Selektion oder durch gerichtete Mutagenese davon abgeleitet sind, umfasst.
Andere besonders bevorzugte Stämme von C. glutamicum können aus der Gruppe gewählt werden, welche folgende umfasst:
ATCC13058, ATCC13059, ATCC13060, ATCC21492, ATCC21513, ATCC21526, ATCC21543, ATCC13287, ATCC21851, ATCC21253, ATCC21514, ATCC21516, ATCC21299, ATCC21300, ATCC39684, ATCC21488, ATCC21649, ATCC21650, ATCC19223, ATCC13869, ATCC21157, ATCC21158, ATCC21159, ATCC21355, ATCC31808, ATCC21674, ATCC21562, ATCC21563, ATCC21564, ATCC21565, ATCC21566, ATCC21567, ATCC21568, ATCC21569, ATCC21570, ATCC21571, ATCC21572, ATCC21573, ATCC21579, ATCC19049, ATCC19050, ATCC19051, ATCC19052, ATCC19053, ATCC19054, ATCC19055, ATCC19056, ATCC19057, ATCC19058, ATCC19059, ATCC19060, ATCC19185, ATCC13286, ATCC21515, ATCC21527, ATCC21544, ATCC21492, NRRL68183, NRRL W8182, B12NRRLB12416, NRRLB12417, NRRLB12418 und NRRLB11476.
Die Abkürzung KFCC steht für Korean Federation of Culture Collection (Koreanische Föderation für Kultursammlung), ATCC steht für American-Type Strain Culture Collection (Amerikanische Stamm-Kultur-Typ-Sammlung) und die Abkürzung DSM steht für Deutsche Sammlung von Mikroorganismen. Die Abkürzung NRRL steht für "ARS cultures collection Northern Regional Research Laboratory", Peorea, IL, USA.
In bestimmten Ausführungsformen ist ein Mikroorganismus der Erfindung ein ”Campbell in”- oder ”Campbell out”-Mikroorganismus (oder -Zelle oder -Transformante). Wie hierin verwendet, soll der Ausdruck ”Campbell in”-Transformante eine Transformante einer ursprünglichen Wirtszelle bedeuten, in welcher ein ganzes zirkuläres doppelsträngiges DNA-Molekül (zum Beispiel ein Plasmid) durch ein einzelnes Ereignis der homologen Rekombination (ein ”Cross-in”-Ereignis) in ein Chromosom der Zelle integriert hat, und welche effektiv zur Insertion einer linearisierten Version des zirkulären DNA-Moleküls in eine erste DNA-Sequenz des Chromosoms führt, die homolog zu einer ersten DNA-Sequenz des zirkulären DNA-Moleküls ist. Der Ausdruck ”einge-Campbell-t” bzw. ”Campbelled in” bezieht sich auf die linearisierte DNA-Sequenz, welche in das Chromosom der ”Campbell in”-Transformante integriert worden ist. Eine ”Campbell in”-Transformante enthält eine Duplikation der ersten homologen DNA-Sequenz, welche den Crossover-Punkt der homologen Rekombination einschließt und umgibt.
”Campbell out” bezieht sich auf eine Zelle, die von einer ”Campbell in”-Transformante abstammt, in welcher ein zweites homologes Rekombinations-Ereignis (ein Cross-out-Ereignis) zwischen einer zweiten DNA-Sequenz, die auf der linearisierten inserierten DNA der ”Campbelled-in” DNA enthalten ist, und einer zweiten DNA-Sequenz von chromosomalem Ursprung, welche homolog zur zweiten DNA-Sequenz des linearisierten Inserts ist, stattgefunden hat, wobei das zweite Rekombinationsereignis zur Deletion (Abwerfen) eines Abschnitts der integrierten DNA-Sequenz führt, aber, bedeutenderweise, auch dazu führt, dass ein Abschnitt (dieser kann so klein wie eine einzige Base sein) der integrierten DNA-Sequenz im Chromosom verbleibt, so dass, im Vergleich zur ursprünglichen Wirtszelle, die ”Campbell out”-Zelle eine oder mehr absichtliche Veränderungen im Chromosom enthält (zum Beispiel eine Einzel basensubstitution, mehrfache Basensubstitutionen, Insertion einer heterologen Gen- oder DNA-Sequenz, Insertion einer zusätzlichen Kopie oder von Kopien von einem homologen Gen oder einem modifizierten homologes Gen, oder Insertion einer DNA-Sequenz, umfassend mehr als eines von diesen oben aufgezählten vorgenannten Beispielen).
Ein(e) ”Campbell out”-Zelle oder -Stamm wird üblicherweise, aber nicht notwendigerweise, durch eine Gegenselektion gegen ein Gen erhalten, das in einem Abschnitt (der Abschnitt, der gewünschtermaßen ausgeworfen werden soll) der ”Campbelled in”-DNA-Sequenz enthalten ist, zum Beispiel dem Bacillus subtilis-sacB-Gen, das bei Expression in einer Zelle, welche in Gegenwart von etwa 5% bis 10% Saccharose wachsen gelassen wird, letal ist. Entweder mit oder ohne eine Gegenselektion kann eine gewünschte ”Campbell out”-Zelle mittels Screening hinsichtlich der gewünschten Zelle erhalten oder identifiziert werden, wobei ein beliebiger screenbarer Phänotyp verwendet wird, wie, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Kolonie-Morphologie, Koloniefarbe, Gegenwart oder Abwesenheit von Antibiotikumresistenz, Gegenwart oder Abwesenheit einer gegebenen DNA-Sequenz bei Polymerasekettenreaktion, Gegenwart oder Abwesenheit einer Auxotrophie, Gegenwart oder Abwesenheit eines Enzyms, Kolonie-Nukleinsäurehybridisierung, und so fort.
Die homologen Rekombinations-Ereignisse, welche zu einem ”Campbell in” oder ”Campbell out” führen, können über einen Bereich von DNA-Basen innerhalb der homologen DNA-Sequenz hinweg auftreten, und da die homologen Sequenzen zueinander für mindestens einen Teil dieses Bereichs identisch sein werden, ist es üblicherweise nicht möglich, anzugeben, wo exakt das Crossover-Ereignis stattgefunden hat. Mit anderen Worten ist es nicht möglich, präzise anzugeben, welche Sequenz ursprünglich aus der inserierten DNA war, und welche ursprünglich aus der chromosomalen DNA war. Außerdem sind die erste homologe DNA-Sequenz und die zweite homologe DNA-Sequenz üblicherweise durch eine Region von partieller Nicht-Homologie getrennt, und es ist diese Region der Nicht-Homologie, welche im Chromosom der ”Campbell out”-Zelle abgelagert bleibt.
Aus praktischen Gründen sind in C. glutamicum eine typische erste und zweite homologe DNA-Sequenz mindestens etwa 200 Basenpaare lang und können bis zu mehreren tausend Basenpaaren lang sein, wobei jedoch die Prozedur gestaltet werden kann, um mit kürzeren oder längeren Sequenzen zu funktionieren. Eine bevorzugte Länge für die ersten und zweiten homologen Sequenzen beträgt etwa 500 bis 2000 Basen, und der Erhalt eines ”Campbell out” aus einem ”Campbell in” wird durch derartiges Einrichten der ersten und zweiten homologen Sequenzen erleichtert, dass sie ungefähr die gleiche Länge aufweisen, vorzugsweise mit einem Unterschied von weniger als 200 Basenpaaren, und wobei am meisten bevorzugt die Kürzere von den beiden mindestens 70% der Länge von der Längeren in Basenpaaren besitzt. Lysin-Decarboxylase-Aktivität bezieht sich auf die Decarboxylierung von L-Lysin zu Cadaverin, welche durch eine Lysin-Decarboxylase katalysiert wird. Das Enzym ist als E.C. 4.1.1.18 klassifiziert worden. Zum Beispiel sind aus Escherichia coli isolierte Enzyme mit Lysin-Decarboxylase-Aktivität das cadA-Genprodukt (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Eintrag b4131) und das IdcC-Genprodukt (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Eintrag JW0181).
Verfahren zum Messen und Vergleichen von enzymatischen Aktivitäten sind im Fachgebiet bekannt und sind zum Beispiel in "Handbook of Corynebacetrium glutamicum 2005, Eggeling, Borth, Hrsg., CRC Press Boca Raton USA, und den Referenzen darin) oder in Methods in Enzymology, Band 17, Teil 1, S. 3–1098 (1970), Band 17, Teil 2, S. 3–961 (1971) Band 41, S. 3–564 (1975), Band 42, S. 3–537 (1975), Band 63, S. 3–547 (1979), Band 64, S. 3–418 (1980), Band 89, S. 3–656 (1982), Band 90 S. 3–602 (1982), Band 142, S. 3–732 (1987), Band 143 S. 3–582 (1987) und den Referenzen darin beschrieben. Ein Standardstamm, der für den Vergleich von Corynebacterium glutamicum-Stämmen verwendet wird, ist ATCC13032 (Handbook of Corynebacetrium glutamicum 2005 Eggeling, Borth Hrsg. CRC Press Boca Raton USA).
Die Aminosäuresequenz von E. coli-IdcC ist in Eintrag Nummer SEQ ID NR.: 1 offenbart, und jene von E. coli-cadA ist in der SEQ ID NR.: 2 offenbart.
DNA-Moleküle, welche das E. coli-Lysin-Decarboxylase-Gen codieren, können durch Screening von cDNA- oder genomischen Bibliotheken mit Polynukleotidsonden erhalten werden, welche Nukleotidsequenzen besitzen, die aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR.: 1 oder 2 revers-translatiert wurden.
Alternativ dazu können die E. coli-Lysin-Decarboxylase-Gene oder beliebige hierin beschriebene Gene durch Synthetisieren von DNA-Molekülen mit Hilfe von sich wechselseitig primenden langen Oligonukleotiden erhalten werden. Siehe, zum Beispiel, Ausubel et al., (Hrsg.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Seiten 8.2.8 bis 8.2.13 (1990) [”Ausubel”]. Siehe auch Wosnick et al., Gene 60: 115 (1987); und Ausubel et al. (Hrsg.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3. Auflage, Seiten 8-8 bis 8-9 (John Wiley & Sons, Inc. 1995). Etablierte Techniken unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion bieten die Fähigkeit, DNA-Moleküle von mindestens 2 Kilobasen Länge zu synthetisieren. Adang et al., Plant Molec. Biol. 21: 1131 (1993); Bambot et al., PCR Methods and Applications 2: 266 (1993); Dillon et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes," in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Bd. 15: PCR PROTOCOLS: CURRENT METHODS AND APPLICATIONS, White (Hrsg.), Seiten 263–268, (Humana Press, Inc. 1993); Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4: 299 (1995).
Varianten von E. coli-Lysin-Decarboxylase oder Varianten von einem beliebigen hierin beschriebenen Gen können hergestellt werden, welche konservative Aminosäureaustausche im Vergleich mit dem Stammform-Enzym enthalten. Das heißt, es können Varianten erhalten werden, die eine oder mehr Aminosäuresubstitutionen von z. B. SEQ ID NR.: 1 oder 2 enthalten, in welchen eine Alkyl-Aminosäure für eine Alkyl-Aminosäure in der Lysin-Decarboxylase-Aminosäuresequenz substituiert ist, eine aromatische Aminosäure für eine aromatische Aminosäure in der E. coli-Lysin-Decarboxylase-Aminosäuresequenz substituiert ist, eine Schwefel-enthaltende Aminosäure für eine Schwefel-enthaltende Aminosäure in der E. coli-Lysin-Decarboxylase-Aminosäuresequenz substituiert ist, eine Hydroxy-enthaltende Aminosäure für eine Hydroxy-enthaltende Aminosäure in der E.coli-Lysin-Decarboxylase-Aminosäuresequenz substituiert ist, eine saure Aminosäure für eine saure Aminosäure in der E. coli-Lysin-Decarboxylase-Aminosäuresequenz substituiert ist, eine basische Aminosäure für eine basische Aminosäure in der E. coli-Lysin-Decarboxylase-Aminosäuresequenz substituiert ist.
Unter den gewöhnlichen Aminosäuren wird eine ”konservative Aminosäuresubstitution” zum Beispiel veranschaulicht durch eine Substitution unter Aminosäuren innerhalb jeder der folgenden Gruppen: (1) Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin, (2) Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan, (3) Cystein und Methionin, (4) Serin und Threonin, (5) Aspartat und Glutamat, (6) Glutamin und Asparagin, und (7) Lysin, Arginin und Histidin.
Konservative Aminosäure-Austausche in der E. coli-Lysin-Decarboxylase können durch Substituieren von Nukleotiden für die in SEQ ID NR.: 1 oder 2 rezitierten Nukleotide eingebracht werden. Solche ”konservativen Aminosäure”-Varianten können, zum Beispiel, durch Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese, Linker-Scanning-Mutagenese, Mutagenese unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion und dergleichen erhalten werden. Ausubel et al., siehe oben, auf Seiten 8.0.3–8.5.9; Ausubel et al., (Hrsg.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3. Auflage, Seiten 8-10 bis 8-22 (John Wiley & Sons, Inc. 1995). Siehe auch, im Allgemeinen, McPherson (Hrsg.), DIRECTED MUTAGENESIS: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1991). Die Fähigkeit solcher Varianten zum Umwandeln von L-Lysin in Cadaverin kann mit Hilfe eines standardmäßigen Enzymaktivität-Assay, wie dem hierin beschriebenen Assay, bestimmt werden.
Bevorzugte Lysin-Decarboxylasen gemäß der Erfindung sind die Lysin-Decarboxylase aus E. coli und ihre äquivalenten Gene, welche bis zu 80%, vorzugsweise 90% und am meisten bevorzugt 95% und 98% Sequenzidentität (basierend auf der Aminosäuresequenz) mit dem entsprechenden ”ursprünglichen” Genprodukt aufweisen und immer noch die biologische Aktivität von Lysin-Decarboxylase besitzen. Diese äquivalenten Gene können leicht durch Einbringen von Nukleotidsubstitutionen, -deletionen oder -insertionen durch im Fachgebiet bekannte Verfahren konstruiert werden, oder durch Klonieren von homologen Genen von anderen Organismen, welche gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren identifiziert und kloniert werden können, z. B. Datenbanksuchen, Bibliothekscreenings, Komplementations-Assays oder Tests der enzymatischen Aktivität. Vorzugsweise ist die Nukleotidsequenz von klonierten homologen Genen für die Expression in dem angestrebten Wirtsmikroorganismus optimiert, z. B. indem sie an die Codon-Verwendung von Corynebacterium glutamicum oder Escherichia coli angepasst wird.
Andere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung verwenden die Lysin-Decarboxylasen von E. coli (SEQ ID NR.: 1 oder 2), welche durch Benutzen der Codon-Verwendung von Corynebacterium glutamicum in DNA retranslatiert werden. Diese Lysin-Decarboxylase-Polynukleotidsequenzen sind nützlich für die Expression von Lysin-Decarboxylase in einem Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium, speziell Corynebacterium glutamicum.
Eine intrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität wird herbeigeführt durch eine Lysin-Decarboxylase, die auf der zytoplasmatischen Seite der Zellmembran des Mikroorganismus lokalisiert ist. Im Fall eines eukaryotischen Mikroorganismus kann die Lysin-Decarboxylase in einem oder mehreren Kompartimenten der Zelle lokalisiert sein. Vorzugsweise ist sie im Zytoplasma von dem Mikroorganismus lokalisiert, inseriert oder angeheftet an die Zellmembran. Eine extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität wird durch eine Lysin-Decarboxylase, die außerhalb der Zellmembran lokalisiert ist, herbeigeführt. Die Lysin-Decarboxylase kann im periplasmatischen Raum, in der Zellwand, auf der Oberfläche der Zellwand lokalisiert, in das Medium sezerniert, oder jedwede Kombination von diesen sein.
Ein Mikroorganismus der Erfindung umfasst eine intrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität. vorzugsweise eine hohe intrazelluläre Decarboxylase-Aktivität. Eine intrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität kann erzeugt oder gesteigert werden durch Transformieren des Mikroorganismus mit einem oder mehreren Lysin-Decarboxylase-Genen, die von dem Mikroorganismus exprimiert werden sollen. Zusätzlich oder alternativ dazu können Lysin-Decarboxylase-Gene mutiert werden, um die Expression oder die enzymatische Aktivität der codierten Lysin-Decarboxylase zu steigern.
In einer anderen Ausführungsform wird die intrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität mit einer extrazellulären Lysin-Decarboxylase-Aktivität kombiniert. Ein Mikroorganismus, dem entweder eine intrazelluläre oder extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität fehlt, kann transformiert werden, damit er eine Lysin-Decarboxylase entweder intrazellulär oder extrazellulär exprimiert. Die extrazelluläre Expression kann erreicht werden durch Mutieren eines Lysin-Decarboxylase-Gens, damit es Signalsequenzen für extrazelluläre Expression, z. B. Sekretionssignale oder Signale für molekulare Anker, umfasst, welche in dem zu transformierenden Mikroorganismus funktionsfähig sind. Beispiele für extrazelluläre Expression können in Choi und Lee, Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 64: 625–635, Current Opinion in Biotechnology 2005, 16: 538–545, Trends in Biotechnology 2007, 16, 73–79, gefunden werden.
Falls die intrazelluläre oder extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität auf eine Expression von mehr als einem Lysin-Decarboxylase-Gen(en), die für unterschiedliche Polypeptide mit Lysin-Decarboxylase-Aktivität codieren, zurückzuführen ist, wird die insgesamte intrazelluläre oder extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität das Ergebnis von diesen unterschiedlichen Lysin-Decarboxylase-Aktivitäten sein. Der Beitrag eines bestimmten Lysin-Decarboxylase-Gens zur insgesamten Lysin-Decarboxylase-Aktivität kann durch Vergleichen des Expressionsspiegels von unterschiedlichen Lysin-Decarboxylase-Genen in einem jeweiligen Mikroorganismus und Vergleichen der spezifischen enzymatischen Aktivitäten der Lysin-Decarboxylasen, die von diesen Genen exprimiert werden, gemessen werden. Der Expressionsspiegel von verschiedenen Genen kann gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren gemessen werden, und vorzugsweise wird der Expressionsspiegel auf Proteinebene, z. B. durch Western-Blots oder ELISA-Assays, gemessen. Verfahren zum Messen der spezifischen enzymatischen Aktivität einer Lysin-Decarboxylase sind im Fachgebiet ebenfalls allgemein bekannt. Ein bevorzugtes Verfahren ist in WO 2007113127 offenbart.
Falls eine endogene Lysin-Decarboxylase-Aktivität durch transgene Expression von mindestens einem weiteren Polypeptid mit Lysin-Decarboxylase-Aktivität gesteigert wird, kann der Beitrag von diesem oder diesen zusätzlichen Polypeptiden durch Vergleichen der insgesamten Lysin-Decarboxylase-Aktivität des transformierten und des untransformierten Mikroorganismus gemessen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die intrazelluläre oder die extrazelluläre Decarboxylase-Aktivität, oder sind beide Aktivitäten, zumindest teilweise, vorzugsweise zu mehr als 30% oder zu mehr als 50% oder zu mehr als 60% oder zu mehr als 70% oder zu mehr als 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 98%, 99% auf ein oder mehr Polypeptide zurückzuführen, die eine Aminosäuresequenz umfassen, die mindestens 80% oder mindestens 85% oder mindestens 90% oder mindestens 95% oder mindestens 98% mit SEQ ID NR.: 1 oder 2 identisch ist und Lysin-Decarboxylase-Aktivität aufweist, vorzugsweise eine hohe Lysin-Decarboxylase-Aktivität aufweist.
In einer Ausführungsform sind die intrazelluläre oder die extrazelluläre Decarboxylase-Aktivität oder beide Aktivitäten zu mehr als 98% oder zu mehr als 99% zurückzuführen auf ein oder mehrere Polypeptide, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80% oder mindestens 85% oder mindestens 90% oder mindestens 95% oder zumindest 98% mit SEQ ID NR.: 1 oder 2 identisch ist und Lysin-Decarboxylase-Aktivität aufweist, vorzugsweise eine hohe Lysin-Decarboxylase-Aktivität aufweist.
In einer Ausführungsform sind die intrazelluläre oder die extrazelluläre Decarboxylase-Aktivität oder beide Aktivitäten mindestens teilweise, vorzugsweise zu mehr als 30% oder zu mehr als 50% oder zu mehr als 60% oder zu mehr als 70% oder zu mehr als 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 98%, 99% zurückzuführen auf ein oder mehrere Polypeptide, umfassend eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80% oder mindestens 85% oder mindestens 90% oder mindestens 95% oder mindestens 98% mit SEQ ID NR.: 1 identisch ist und Lysin-Decarboxylase-Aktivität aufweist, vorzugsweise eine hohe Lysin-Decarboxylase-Aktivität aufweist.
In einer Ausführungsform sind die intrazelluläre oder die extrazelluläre Decarboxylase-Aktivität oder beide Aktivitäten mindestens teilweise, vorzugsweise zu mehr als 30% oder zu mehr als 50% oder zu mehr als 60% oder zu mehr als 70% oder zu mehr als 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 98%, 99% auf ein oder mehrere Polypeptide zurückzuführen, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80% oder mindestens 85% oder mindestens 90% oder mindestens 95% oder mindestens 98% mit SEQ ID NR.: 2 identisch ist und Lysin-Decarboxylase-Aktivität aufweist, vorzugsweise eine hohe Lysin-Decarboxylase-Aktivität aufweist.
In einer Ausführungsform umfassen die Mikroorganismen, die eine intrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität oder eine intrazelluläre und eine extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität umfassen, ebenfalls eine gesteigerte Lysin-Import-Fähigkeit.
Eine verbesserte Lysin-Import-Fähigkeit kann durch eine beliebige Maßnahme, welche den Fluß von Lysin aus dem Fermentationsmedium in den Mikroorganismus steigert, oder durch Verringern des Flußes von Lysin aus dem Mikroorganismus zum Fermentationsmedium erzielt werden.
Verfahren zur Bestimmung der Lysinexport- und -import-Aktivität können in Bellmann, A, Vrljic, M, Patek, M, et al., MICROBIOLOGY-SGM 147, S. 1765–1774, 2001, und in Burkovski, A, Kramer, R., APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY 58, S. 265–274, 2002, und in den darin zitierten Referenzen, gefunden werden.
Zum Beispiel kann die Lysin-Import-Fähigkeit durch Verringern oder Eliminieren von Lysin-Exporter-Aktivität oder Steigern von Lysin-Permease-Aktivität oder Steigern der Lysin/Cadaverin-Antiporter-Aktivität oder jedwede Kombination davon verbessert werden.
Eine Lysin-Exporter-Aktivität kann auf ein beliebiges Polypeptid zurückzuführen sein, das zum Transportieren von Lysin aus dem Medium in die Zelle in der Lage ist, z. B. Lysin-Exporter-, -Symporter- oder -Antiporter-Polypeptide.
Falls der Mikroorganismus eine extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität und eine hohe Lysin-Produktionskapazität aufweist, wird es von Vorteil sein, die Lysin-Exportkapazität zu verstärken, indem man entgegengesetzte Maßnahmen zu denjenigen ergreift, die für das Verstärken der Lysin-Importkapazität beschrieben sind, z. B. durch Steigern einer gewissen Genexpression anstatt dem Verringern der Expression eines gewissen Gens. Beispiele für Mikroorganismen mit einer hohen Lysin-Produktionskapazität und einer verringerten oder eliminierten Expression eines Lysinexporter-Polypeptids, aber ohne eine extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität, können in WO 97/23597 und WO 2005073390 , welche Verfahren für die gesteigerte Produktion von Aminosäuren durch Kultivieren eines Mikroorganismus mit einer gesteigerten Expression oder Aktivität von Aminosäure-Export-Proteinen offenbaren, und in US 7 435 584 gefunden werden, welche ein Verfahren für die gesteigerte Produktion von L-Lysin durch Kultivieren von Corynebacteria mit einer hohen Expression des lysE(Lysin-Export-Träger)-Gens offenbart.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Aktivität von mindestens einem Lysinexporter-Polypeptid verringert, wobei das Lysinexporter-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 80% oder mindestens 85% oder mindestens 90% oder mindestens 95% oder mindestens 98% zu SEQ ID NR.: 3 identisch ist und Lysinexport-Aktivität aufweist, oder wobei das Lysinexporter-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 80% oder mindestens 85% oder mindestens 90% oder mindestens 95% oder mindestens 98% zu SEQ ID NR.: 4 identisch ist und Lysinexport-Aktivität aufweist, oder wobei die Aktivität von mindestens zwei Lysinexporter-Polypeptiden verringert sind, wobei mindestens eines eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 80% oder mindestens 85% oder mindestens 90% oder mindestens 95% oder mindestens 98% identisch mit SEQ ID NR.: 3 ist und Lysinexport-Aktivität aufweist, und mindestens eines eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 80% oder mindestens 85% oder mindestens 90% oder mindestens 95% oder mindestens 98% identisch mit SEQ ID NR.: 4 ist und Lysinexport-Aktivität aufweist.
Das lysE-Gen ist in der Literatur beschrieben worden, Eggeling, L, Sahm, H JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING 92, 3 201–213, Eggeling, L, Sahm, H ARCHIVES OF MICROBIOLOGY 180, 3 155–160 2003, siehe auch die Deutsche Patentanmeldung DE 95-01048222 .
Das YbjE-Genprodukt (SEQ ID NR.: 4) und Mutanten davon sind zum Beispiel in WO 2005073390 beschrieben worden.
Der Begriff ”verringerte Aktivität” beinhaltet die Expression eines Genprodukts, z. B. eines Lysinexporter-Moleküls, Spermidin-Synthase, Homoserin-Dehydrogenase oder anderen, bei einem niedrigeren Spiegel als jenem, der vor der Manipulation des Mikroorganismus oder in einem vergleichbaren Mikroorganismus, der nicht manipuliert worden ist, exprimiert wird, vorzugsweise wird die Expression eines Genprodukts mit einem gut bekannten Stamm einer bestimmten Mikroorganismus-Spezies verglichen, welcher unter denselben Bedingungen wachsen gelassen wird, wobei z. B. im Fall von Corynebacterium die Expression eines Gens vorzugsweise mit dem Expressionsspiegel im Stamm ATCC13032 verglichen wird. Im Fall von E. coli wird die Expression eines Gens vorzugsweise mit dem Expressionsspiegel im Stamm MG1665 verglichen, der bei der Stamm-Sammlung ATCC hinterlegt wurde, im Fall von Saccharomyces cerevisiae wird der Expressionsspiegel mit dem Stamm W303 verglichen, der bei der Stamm-Sammlung ATCC hinterlegt wurde. In einer Ausführungsform kann der Mikroorganismus genetisch manipuliert (z. B. gentechnisch verändert) sein, um einen Spiegel an Genprodukt bei einem geringeren [Spiegel] als jenem zu exprimieren, der vor der Manipulierung des Mikroorganismus oder in einem vergleichbaren Mikroorganismus, der nicht manipuliert worden ist, exprimiert wird. Die genetische Manipulation kann, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, das Verändern oder Modifizieren von regulatorischen Sequenzen oder Stellen, die mit der Expression eines bestimmten Gens assoziiert sind (z. B. durch Entfernen starker Promotoren, induzierbarer Promotoren oder multipler Promotoren), das Modifizieren der chromosomalen Lage eines bestimmten Gens, das Verändern von zu einem bestimmten Gen benachbarten Nukleinsäuresequenzen, wie etwa einer Ribosomenbindungsstelle oder einem Transkriptionsterminator, das Verringern der Kopienzahl eines bestimmten Gens, das Modifizieren von Proteinen (z. B. regulatorischen Proteinen, Suppressoren, Enhancern, transkriptionalen Aktivatoren und dergleichen), die an der Transkription eines bestimmten Gens und/oder Translation eines bestimmten Genprodukts beteiligt sind, oder jegliche anderen herkömmlichen Mittel zum Verringern der Expression eines bestimmten Gens, die Routine im Fachgebiet sind (einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuremolekülen oder anderer Verfahren zum Knock-out oder Blockieren der Expression des Zielproteins) einschließen. Im Besonderen kann das Gen so manipuliert werden, dass 1 oder mehr Nukleotide aus dem Chromosom des Wirtsorganismus deletiert werden. Die verringerte Aktivität des Genprodukts, z. B. eines Lysin-Exporter-Moleküls, kann auch durch Einbringen einer oder mehrerer Genmutationen erhalten werden durch, welche zu einer verringerten Aktivität des Genprodukts führen. Darüber hinaus kann die Aktivität eines Genprodukts auch verringert werden durch Beeinflussen von regulatorischen Proteinen, welche die Expression oder Aktivität des Genprodukts regulieren, z. B. durch Beeinflussen der Transkription des Gens. Beispiele sind transkriptionelle Repressoren und transkriptionelle Aktivatoren. Zum Beispiel wird die Expression des lysE-Gens negativ durch das lysG-Genprodukt beeinflußt. Die Sequenz des lysG-Gens (hierin offenbart als SEQ ID NR.: 5) und des LysG-Genprodukts (hierin offenbart als SEQ ID NR.: 6) kann ebenfalls unter den folgenden Hinterlegungsnummern gefunden werden: P94632, X96471.
In einer anderen Ausführungsform wird die Lysin-Import-Kapazität durch eine gesteigerte Lysin-Permease-Aktivität oder durch eine gesteigerte Lysin/Cadaverin-Antiporter-Aktivität oder eine Kombination von beiden gesteigert.
Die Lysin-Permease-Aktivität eines gegebenen Mikroorganismus kann zum Beispiel durch Erhöhen der Expression von einem oder mehreren endogenen Lysinpermease-Genen, zum Beispiel wie in SEQ ID NR.: 7 offenbart, oder Erhöhen der Permease-Aktivität von Lysinpermease-Polypeptiden, zum Beispiel wie in SEQ ID NR.: 8 offenbart, z. B. durch zufallsmäßige Mutagenese des Mikroorganismus oder durch Transformieren des Mikroorganismus mit einem oder mehreren Lysinpermease-Genen oder durch eine beliebige Kombination davon gesteigert werden.
In einer Ausführungsform wird die Lysin-Permease-Aktivität des Mikroorganismus durch rekombinante Expression von einem oder mehreren Lysin-Permease-Polypeptiden, umfassend eine Aminosäuresequenz, welche mindestens 80% oder mindestens 85% oder mindestens 90% oder mindestens 95% oder mindestens 98% zu SEQ ID NR.: 8 identisch ist und Lysin-Permease-Aktivität aufweist, z. B. Homologen oder Mutanten mit Lysin-Permease-Aktivität, gesteigert. Verfahren zum Bestimmen der Lysin-Permease-Aktivität können in Bellmann, A, Vrljic, M, Patek, M, et al. MICROBIOLOGY-SGM 147, S. 1765–1774, 2001, und in Burkovski, A, Kramer, R, APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY 58, S. 265–274, 2002, in Fujii, T., et al., sowie in BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY 66, S. 1981–1984, 2002, und in den darin zitierten Referenzen) gefunden werden.
Rekombinante Expression kann zum Beispiel durch Transformation von einem oder mehreren Lysin-Permease-Genen, durch Bereitstellen von endogenen Lysin-Permease-Genen mit einem deregulierten Promotor mit einer höhen Expressionsaktivität oder durch Verringern negativer Regulatoren von Lysinpermease-Genexpression oder -Genproduktaktivität erzielt werden.
In einer anderen Ausführungsform wird die Lysin-Import-Kapazität gesteigert durch eine gesteigerte Lysin/Cadaverin-Antiporter-Aktivität. Lysin/Cadaverin-Antiporter sind Proteine, welche Lysin und Cadaverin gleichzeitig in verschiedenen Richtungen quer über die Membran der Zelle transportieren. Verstärkte Lysin/Cadaverin-Antiporter-Aktivität kann durch Erhöhen der Expression von einem oder mehreren endogenen Lysin/Cadaverin-Antiporter-Genen, durch zufallsmäßige Mutation des Mikroorganismus, Transformieren des Mikroorganismus mit einem oder mehreren Lysin/Cadaverin-Antiporter-Genen oder durch Optimieren der Lysin/Cadaverin-Antiporter-Aktivität von Lysin/Cadaverin-Antiporter-Polypeptiden z. B. für eine Präferenz von Lysin-Import und Cadaverin-Export, oder durch eine beliebige Kombination davon erzielt werden.
In einer Ausführungsform wird die Lysin/Cadaverin-Antiporter-Aktivität eines Mikroorganismus gesteigert durch rekombinante Expression von einem oder mehreren Lysin/Cadaverin-Antiporter-Polypeptiden, umfassend eine Aminosäuresequenz, welche mindestens 80% oder mindestens 85% oder mindestens 90% oder mindestens 95% oder mindestens 98% mit SEQ ID NR.: 9 identisch ist, die Lysin/Cadaverin-Antiporter-Aktivität aufweist, z. B. Homologen oder Mutanten, die Lysin/Cadaverin-Antiporter-Aktivität aufweisen.
Rekombinante Expression kann zum Beispiel durch Transformation von einem oder mehreren Lysin/Cadaverin-Antiporter-Genen, durch Bereitstellen von endogenen Lysin/Cadaverin-Antiporter-Genen mit einem deregulierten Promotor mit einer höheren Expressionsaktivität oder durch Vermindern von negativen Regulatoren der Lysin/Cadaverin-Antiporter-Genexpression oder Genprodukt-Aktivität erzielt werden.
Es ist bekannt, dass die Import- oder Export-Aktivität des cadB-Genprodukts, das hierin als SEQ ID NR.: 9 offenbart ist, von den Lysin- und Cadaverin-Konzentrationen in der Zelle und dem Fermentationsmedium abhängt. Deshalb kann die Lysin-Import-Kapazität eines bestimmten Mikroorganismus, der ein funktionales cadB-Genprodukt exprimiert, durch Steigern der Lysin-Konzentration im Fermentationsmedium, durch Verhindern eines niedrigen pH-Werts des Fermentationsmediums oder durch Inserieren von Mutationen, welche den Lysin-Import bei einer gegebenen Lysinkonzentration oder gegebenem pH-Wert im Fermentationsmedium fördern, oder durch eine Kombination davon verbessert werden (Soksawatmaekhin W. et al.; Excretion and uptake of cadaverine by CadB and its physiological functions in Escherichia coli; Molecular Microbiology; 2004,; Band 51,5; Seiten 1401 bis 1412).
Es sind mehrere Mutationen beschrieben, welche den Lysin-Import des Escherichia coli-cadB-Genprodukts bei einer gegebenen Lysin-Konzentration oder gegebenem pH-Wert im Fermentationsmedium fördern (Soksawatmaekhin W. et al.; Identification of the Cadaverine Recognition Site on the Cadaverine-Lysine Antiporter CadB; The Journal of Biological Chemistry; 2006; Band 281, 39; Seiten 29213 bis 29220). Der Fachmann auf dem Gebiet wird in der Lage sein, ähnliche Mutationen in anderen cadB-Proteinen, z. B. Homologen oder Mutanten von cadB, zu identifizieren.
Demzufolge umfassen, in einer Ausführungsform, die Lysin/Cadaverin-Antiporter-Polypeptide eine Aminosäuresequenz, welche mindestens 80% oder mindestens 85% oder mindestens 90% oder mindestens 95% oder mindestens 98% identisch zu SEQ ID NR.: 9 ist, und eine oder mehrere der folgenden Mutationen umfasst: C12S, W41L, W43L, Y55L, Y57L, Y73L, Y73F, Y73W, Y89L, Y89F, Y89W, Y90L, Y90F, Y90W, Y107L, Y174L, C125S, D185N, E204Q, E204D, Y235L, Y235F, Y235W, W289L, D303N, D303E, Y310L, Y366L, Y368L, D372N, E377Q, E408Q, Y423L, Y423F und Y423W. Die oben erwähnten Mutationen sind gemäß der Aminosäuresequenz des cadB-Genprodukt benannt. Der Fachmann auf dem Gebiet ist im Stande, diese Mutationen auf andere Genprodukte, z. B. Genprodukte, die homolog zum cadB-Genprodukt sind, durch Anwenden von Sequenzvergleichs-Tools z. B. durch Verwenden von Sequenzalignments, zu übertragen.
Vorzugsweise umfassen die Lysin/Cadaverin-Antiporter-Polypeptide eine Aminosäuresequenz, welche mindestens 80% oder mindestens 85% oder mindestens 90% oder mindestens 95% oder mindestens 98% identisch zu SEQ ID NR.: 9 ist und eine oder mehrere der folgenden Mutationen umfasst: W41L, W43L, Y57L, Y89L, Y107L, Y174L, D185N, E204Q, Y235L, W2891, D303N, Y366L, Y368L, D372N und E408Q.
Weiter bevorzugt umfassen die Lysin/Cadaverin-Antiporter-Polypeptide eine Aminosäuresequenz, welche mindestens 80% oder mindestens 85% oder mindestens 90% oder mindestens 95% oder mindestens 98% identisch zu SEQ ID NR.: 9 ist und eine oder mehrere der folgenden Mutationen umfasst: W411, W43L, Y57L, Y107L, Y174L, D185N, Y366L, Y368L und E408Q.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung einen Mikroorganismus bereit, der eine intrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität und eine gesteigerte Lysin-Import-Aktivität umfasst oder eine intrazelluläre und eine extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität umfasst oder eine intrazelluläre und eine extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität und eine gesteigerte Lysin-Import-Aktivität umfasst und eine hohe Lysinproduktions-Kapazität aufweist. Ein Mikroorganismus mit einer hohen Lysinproduktions-Kapazität ist in der Lage, Lysin z. B. innerhalb der Zelle oder im umgebenden Medium anzureichern, wenn das Lysin nicht weiter z. B. zu Cadaverin metabolisiert wird.
Vorzugsweise weist der Mikroorganismus mit einer hohen Lysinproduktionskapazität mindestens ein dereguliertes Gen auf, das aus der Gruppe (i) gewählt ist. Die Gruppe (i) ist eine Gruppe von Genen, welche eine Schlüsselrolle in der Biosynthese von Lysin spielen, und besteht aus den Genen von Aspartokinase, Aspartatsemialdehyd-Dehydrogenase, Dihydrodipicolinat-Synthase, Dihydrodipicolinat-Reductase, Tetrahydrodipicolinat-Succinylase, Succinyl-amino-ketopimelat-Transaminase, Succinyl-Diaminopimelat-Desuccinylase, Diaminopimelat-Epimerase, Diaminopimelat-Dehydrogenase, Arginyl-tRNA-Synthetase, Diaminopimelat-Decarboxylase, Pyruvatcarboxylase, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Transketolase, Transaldolase, 6-Phosphogluconolactonase, Fructose-1,6-biphosphatase, Homoserin-Dehydrogenase, Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase, Succinyl-CoA-Synthetase, Methylmalonyl-CoA-Mutase, Diaminacetyltransferase.
Mindestens ein Gen der Gruppe (i) muss gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens dereguliert werden. Vorzugsweise sind mehr als ein Gen der Gruppe (i), z. B. zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn Gene, in dem Mikroorganismus gemäß der Erfindung dereguliert.
Bevorzugte Gene der Gruppe (i), die dereguliert werden sollen, sind: Aspartokinase, Aspartatsemialdehyd-Dehydrogenase, Dihydrodipicolinat-Synthase, Dihydrodipicolinat-Reductase, Diaminopimelat-Dehydrogenase, Diaminopimelat-Decarboxylase, Pyruvatcarboxylase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Transketolase, Transaldolase, 6-Phosphogluconolactonase, Fructose-1,6-biphosphatase, Homoserin-Dehydrogenase, Succinyl-CoA-Synthetase, Diaminacetyltransferase.
Die Gene und Genprodukte der Gruppe (i) sind im Fachgebiet bekannt. EP 1108790 offenbart Mutationen in den Genen von Homoserindehydrogenase und Pyruvatcarboxylase, welche einen vorteilhaften Effekt auf die Produktivität von rekombinanten Corynebacteria in der Herstellung von Lysin aufweisen. Die WO 00/63388 offenbart Mutationen in dem Gen für Aspartokinase, welche einen vorteilhaften Effekt auf die Produktivität von rekombinanten Corynebacteria in der Herstellung von Lysin aufweisen. EP 1108790 und WO 00/63388 sind in Hinsicht auf die oben beschriebenen Mutationen in diesen Genen durch den Bezug darauf einbezogen.

In der nachstehenden Tabelle sind für jedes Gen/Genprodukt mögliche Wege der Deregulation des jeweiligen Gens erwähnt. Die in der Spalte ”Deregulation” der Tabelle zitierte(n) Literatur und Dokumente sind hiermit in Hinblick auf Gen-Deregulation durch den Bezug darauf einbezogen. Die in der Tabelle erwähnten Wege sind bevorzugte Ausführungsformen einer Deregulation des betreffenden Gens. Tabelle. 1

Enzym (Genprodukt)	Gen	Deregulation
Aspartokinase	ask	Aufheben der Rückkopplungs-Inhibition durch Punktmutation (Eggeling et al., (Hrsg.), Handbook of Cognebacterium glutamicum, Seiten 20.2.2 (CRC press, 2005)) und Verstärkung)
Aspartatsemialdehyd-Dehydrogenase	asd	Verstärkung
Dihydrodipicolinat-Synthase	dapA	Verstärkung
Dihydrodipicolinat-Reductase	dapB	Verstärkung
Tetrahydrodipicolinat-Succinylase	dapD	Verstärkung
Succinyl-amino-ketopimelat-Transaminase	dapC	Verstärkung
Succinyl-diamino-pimelat-Desuccinylase	dapE	Verstärkung
Diaminopimelat-Dehydrogenase	ddh	Verstärkung
Diaminopimelat-Epimerase	dapF	Verstärkung
Arginyl-tRNA-Synthetase	argS	Verstärkung
Diaminopimelat-Decarboxylase	lysA	Verstärkung
Pyruvat-Carboxylase	pycA	Aufheben der Rückkopplungs-Inhibition durch Punktmutation ( EP1108790 ) und Verstärkung
Phosphoenolpyruvat-Carboxylase	ppc	Verstärkung
Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase	G6PDH zwf	Aufheben der Rückkopplungs-Inhibition durch Punktmutation ( US2003/0175911 ) und Verstärkung
Transketolase	tkt	Verstärkung
Transaldolase	tal	Verstärkung
6-Phosphogluconolactonase	pgl	Verstärkung
6-Phosphogluconat-Dehydrogenase		Punktmutation und Verstärkung
Fructose 1,6-biphosphatase	fbp	Verstärkung
Homoserin-Dehydrogenase	hom	Abschwächen durch Punktmutation ( EP1108790 ), Senken der Genaktivität, Knock-out oder Silencing durch Mutation
Phophoenolpyruvat-Carboxykinase	pck	Knock-out oder Silencing durch Mutation, Senken der Genaktivität oder sonstige
Succinyl-CoA-Synthetase	sucC	Abschwächen durch Punktmutation ( WO 05/58945 ) Senken der Genaktivität, Silencing durch Mutation
Methylmalonyl-CoA-Mutase	MMCM	Abschwächen durch Punktmutation ( WO 05/58945 ), Senken der Genaktivität, Knock-out oder silencing durch Mutation
Diamin-Acetyltransferase	RXA2240	Schwächung durch Senken der Genaktivität, Knock-out oder Silencing durch Mutation, Deletion

Ein bevorzugter Weg der Deregulation der Gene von Aspartokinase, Aspartatsemialdehyd-Dehydrogenase, Dihydrodipicolinat-Synthase, Dihydrodipicolinat-Reductase, Tetrahydrodipicolinat-Succinylase, Succinyl-amino-ketopimelat-Transaminase, Succinyldiamino-pimelat-Desuccinylase, Diaminopimelat-Epimerase, Diaminopimelat-Dehydrogenase, Arginyl-tRNA-Synthetase, Diaminopimelat-Ddecarboxylase, Pyruvat-Carboxylase, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Transketolase, Transaldolase, 6-Phosphogluconolactonase, Fructose 1,6-biphosphatase ist eine ”Hoch”-Mutation, welche die Genaktivität z. B. durch Gen-Verstärkung unter Verwendung starker Expressionssignale und/oder Punktmutationen, welche die enzymatische Aktivität steigern, erhöht.
Ein bevorzugter Weg der Deregulation der Gene von Homoserin-Dehydrogenase, Phophoenolpyruvat-Carboxykinase, Succinyl-CoA-Synthetase, Methylmalonyl-CoA-Mutase, Acetyltransferase ist eine ”Herunter”-Mutation, welche die Genaktivität z. B. durch Gendeletion oder -disruption, Verwendung schwacher Expressionssignale und/oder Punktmutationen, welche die enzymatische Aktivität zerstören oder verringern, senkt.
Wenn Aspartokinase, als ein Vertreter der Gen(i)-Gruppe, dereguliert ist, muss mindestens ein zweiter Gen(i)-Vertreter – der von Aspartokinase verschieden ist – ebenfalls dereguliert werden.
Es ist beobachtet worden, dass ein signifikanter Teil des in dem Mikroorganismus gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Cadaverins später acetyliert werden könnte ( WO 2007/113127 ). Zum Blockieren der Acetylierungsreaktion, welche auf ein Acetylcadaverinbildendes Polypeptid zurückzuführen ist, das als ein enzymatisch aktives Polypeptid definiert ist, das zum Herstellen von Acetylcadaverin in der Lage ist. Zum Erhöhen der Ausbeute an Cadaverin ist es eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, die Diamin-Acetyltransferase des produzierenden Mikroorganismus zu deregulieren, speziell deren Aktivität z. B. durch Deletion oder Disruption des Gens zu senken.
Ein Beispiel für ein Acetylcadaverin bildendes Polypeptid ist die Acetyl-CoA-abhängige Diamin-Acetyltransferase von Corynebacterium glutamicum (NP_600742-Protein), zum Beispiel wie sie in SEQ ID NR.: 10 und SEQ ID NR.: 11 offenbart ist.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Acetylcadaverin-bildende Aktivität verringert durch Senken der Aktivität von mindestens einem Acetylcadaverin-bildenden Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80%, oder mindestens 85%, oder mindestens 90%, oder mindestens 95%, oder mindestens 98% identisch zu SEQ ID NR.: 11 ist und Acetylcadaverin bildende Aktivität aufweist. Eine Actylcadaverin bildende Aktivität kann, wie in WO 2007/113127 beschrieben, getestet werden.
Es ist beobachtet worden, dass ein signifikanter Teil des in dem Mikroorganismus gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Cadaverins durch ein Aminopropylcadaverinbildendes Polypeptid in Aminopropylcadaverin umgewandelt werden kann. Zum Blockieren dieser Reaktion und zum Erhöhen der Ausbeute an Cadaverin ist es eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, das Aminopropylcadaverin-bildende Polypeptid des produzierenden Mikroorganismus zu deregulieren, speziell dessen Aktivität z. B. durch Deletion oder Disruption des Gens zu verringern.
Ein Beispiel für ein Aminopropylcadaverin-bildendes Polypeptid ist die Spermidin-Synthase von Escherichia coli, wie in Soksawatmaekhin W. et al; Molecular Microbiology; (2004) Bd. 51,5; Seiten 1401 bis 1412) beschrieben.
Folglich wird, in einer Ausführungsform der Erfindung, die Aminopropylcadaverin-bildende Aktivität verringert durch Senken der Aktivität von mindestens einem Aminopropylcadaverinbildenden Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 80%, oder mindestens 85%, oder mindestens 90%, oder mindestens 95%, oder mindestens 98% identisch mit SEQ ID NR.: 12 ist.
Es ist beobachtet worden, dass die Produktionskapazität eines Mikroorganismus für Lysin durch Deregulieren der Aktivität eines Homoserin-Dehydrogenase-Polypeptids des Cadaverin produzierenden Mikroorganismus, wie in JP 2004222569 beschrieben, vorzugsweise durch Verringern seiner Aktivität durch Deletion oder Disruption des für die Homoserin-Dehydrogenase-Polypeptid codierenden Gens, verbessert werden kann.
Beispiele für ein Homoserin-Dehydrogenase-Polypeptid sind die Homoserin-Dehydrogenase von Corynebacterium glutamicum, die hierin als SEQ ID NR.: 13 offenbart ist, oder Homoserin-Dehydrogenasen von Escherichia coli, die hierin als SEQ ID NR.: 14 und SEQ ID NR.: 15 offenbart sind.
Demzufolge wird, in einer Ausführungsform der Erfindung, die Homoserin-Dehydrogenase-Aktivität durch Senken der Aktivität eines Homoserin-Dehydrogenase-Polypeptids, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80%, oder mindestens 85%, oder mindestens 90%, oder mindestens 95%, oder mindestens 98% identisch zu SEQ ID NR.: 13, 14 oder 15 ist, verringert.
Verfahren für die Bestimmung von Homoserin-Dehydrogenase-Aktivität können in M. B. Jenkins, V. W. Woodward, Biochimica et Biophysica Acta, 1970, 212, 21–32 gefunden werden.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung besitzt der Mikroorganismus eine reduzierte Kapazität zum Abbauen von Lysin, die von einer Decarboxylierung verschieden ist, z. B. durch Aufweisen einer verringerten Lysin-Hydroxylase-Aktivität.
Ein Lysin-Hydroxylase-Polypeptid ist ein Polypeptid mit Lysin-Hydroxylase-Aktivität, das ebenfalls als Lysin-N6-Hydroxylase [EC: 1.14.13.59] beschrieben wird. Tests bezüglich des Vorliegens von Lysin-Hydroxylase-Aktivität können in Meneely KM, und Lamb AL BIOCHEMISTRY 46, Seiten: 11930–11937 2007, und in IJ, Hsueh LC, Baldwin JE, et al. EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY 268, Seiten: 6625–6636, gefunden werden.
Ein Beispiel ist die Lysin-Hydroxylase iucD von Escherichia coli CFT073 (SEQ ID NR.: 16).
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Lysin-Abbau-Aktivität durch Senken der Aktivität von mindestens einem Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80%, oder mindestens 85%, oder mindestens 90%, oder mindestens 95%, oder mindestens 98% identisch ist zu SEQ ID NR.: 16 Lysin-Hydroxylase, die Lysin-Hydroxylase-Aktivität aufweist, verringert.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weist der Mikroorganismus eine deregulierte Spermidin bildende oder -Aufnahme-Aktivität oder Putrescin bildende oder -Aufnahme-Aktivität oder eine Kombination davon auf.
Eine Spermidin bildende Aktivität wird durch ein Polypeptid herbeigeführt, das in der Lage ist, Spermidin zu synthetisieren. Ein Beispiel für ein Spermidin bildendes Polypeptid ist die Spermidin-Synthase von SEQ ID NR.: 12.
Eine Putrescin bildende Aktivität wird durch ein Polypeptid herbeigeführt, das in der Lage ist, Putrescin zu synthetisieren. Ein Beispiel für ein Putrescin bildendes Polypeptid sind die Putrescin-Synthase von E. coli-speE (z. B. wie in SEQ ID NR.: 17 offenbart) oder die Ornithin-Decarboxylasen von E. coli speF (z. B. wie in SEQ ID NR.: 18 offenbart).
Ein Polypeptid mit Spermidin- oder Putrescin-Aufnahme-Aktivität ist ein Polypeptid, das in der Lage ist, Spermidin oder Putrescin oder beides in die Zelle hinein zu transportieren. Ein Beispiel für ein Spermidin- und/oder ein Putrescin-Aufnahmepolypeptid ist potE von E. coli (z. B. wie in SEQ ID NR.: 19 offenbart), welches als ein Putrescin/Ornithin-Antiporter fungiert.
In einer Ausführungsform der Erfindung besitzt der Mikroorganismus eine verringerte Spermidin bildende oder -Aufnahme-Aktivität oder Putrescin bildende oder -Aufnahme-Aktivität, wobei

a) die Spermidin bildende Aktivität dereguliert wird durch Senken der Aktivität eines Spermidin bildenden Polypeptids, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80%, oder mindestens 85%, oder mindestens 90%, oder mindestens 95%, oder mindestens 98% identisch zu SEQ ID NR.: 12 ist, oder,
b) die Putrescin bildende Aktivität dereguliert wird durch Senken der Aktivität eines Putrescin bildenden Polypeptids, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80%, oder mindestens 85%, oder mindestens 90%, oder mindestens 95%, oder mindestens 98% identisch zu SEQ ID NR.: 17 ist, oder
c) die Putrescin bildende Aktivität dereguliert wird durch Senken der Aktivität eines Ornithin-Decarboxylase-Polypeptids, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80%, oder mindestens 85%, oder mindestens 90%, oder mindestens 95%, oder mindestens 98% identisch zu SEQ ID NR.: 18 ist, oder
d) die Spermidin- oder Putrescin- oder Spermidin- und Putrescin-Aufnahme-Aktivität dereguliert wird durch Senken der Aktivität von einem Spermidin- oder Putrescin- oder Spermidin- und Putrescin-Aufnahme-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 80%, oder mindestens 85%, oder mindestens 90%, oder mindestens 95%, oder mindestens 98% identisch zu SEQ ID NR.: 19 ist, oder
e) wobei die Spermidin bildende oder -Aufnahme-Aktivität oder die Putrescin bildende oder -Aufnahme-Aktivität oder eine Kombination davon verringert wird durch Senken der Aktivität von einer Kombination von a), b), c) oder d).

Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung beinhaltet das Kultivieren oder die Kultivierung der hierin beschriebenen rekombinanten Mikroorganismen, so dass die gewünschte Verbindung Cadaverin produziert wird.
Folglich ist eine Ausführungsform der Erfindung ein Cadaverin-Produktionssystem, umfassend einen Mikroorganismus, umfassend eine intrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität und eine gesteigerte Lysin-Import-Aktivität oder umfassend eine intrazelluläre und eine extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität oder umfassend eine intrazelluläre und eine extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität und eine gesteigerte Lysin-Import-Aktivität, und ein zum Kultivieren dieses Mikroorganismus geeignetes Fermentationsmedium, wobei das Fermentationsmedium vorzugsweise Lysin umfasst.
Ein Cadaverin-Produktionssystem ist ein technisches System für die Herstellung von Cadaverin, z. B. ein Kulturmedium, umfassend einen Cadaverin produzierenden Mikroorganismus, oder ein(e) Lysin-umfassendes) Lösung oder Kulturmedium und einen Lysin-Decarboxylase produzierenden Mikroorganismus. In der Regel umfasst das Cadaverin-Produktionssystem technische Systeme zur Unterstützung der Produktion von Cadaverin, z. B. einen Fermenter.
Der Begriff ”Kultivieren” beinhaltet das Halten und/oder Wachsenlassen eines lebenden Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung (z. B. Halten und/oder Wachsenlassen einer Kultur oder eines Stamms). In einer Ausführungsform wird ein Mikroorganismus der Erfindung in Flüssigmedien kultiviert. In einer anderen Ausführungsform wird ein Mikroorganismus der Erfindung auf Festmedien oder halbfesten Medien kultiviert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Mikroorganismus der Erfindung in Medien (z. B. einem sterilen, Flüssigmedium) kultiviert, welche Nährstoffe umfassen, die essentiell oder vorteilhaft für das Halten und/oder Wachstum des Mikroorganismus sind.
Kohlenstoffquellen, welche verwendet werden können, schließen Zucker und Kohlenhydrate, wie zum Beispiel Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosnussöl, Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole, wie zum Beispiel Glycerol und Ethanol, und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure, ein. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Glucose, Fructose oder Saccharose als Kohlenstoffquellen verwendet. Diese Substanzen können einzeln oder als eine Mischung verwendet werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die hierin beschriebenen Mikroorganismen in oder auf flüssigen, festen oder halb- festen Medien kultiviert, welche Xylose, Arabinose, Cellobiose oder Mischungen davon umfassen, wobei solche Medien andere Kohlenstoffquellen, wie diejenigen, die oben beschrieben sind, umfassen können, oder nicht. Medien zum Kultivieren von Mikroorganismen der Erfindung können nur eine begrenzte Anzahl von verschiedenen Kohlenstoffquellen, z. B. 1, 2, 3, 4, 5 oder mehr Kohlenstoffquellen. umfassen, oder könnten sehr komplexe Mischungen von Kohlenstoffquellen, Hydrolysate von Lignocellulose-Substraten oder landwirtschaftlichen Rückständen, z. B. Hydrolysate von Stärken aus Quellen, wie, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Mais, Weizen, Roggen, Gerste, Reis, Cassava, oder Hydrolysate von Stroh, Holz, Papier, oder sonstiges Material von pflanzlichem Ursprung, umfassen.
Bevorzugte Kombinationen von Kohlenstoffquellen sind Medien, die einen hohen Gehalt von Glucose und Xylose, Fructose und Xylose, Saccharose und Xylose, oder Saccharose und Glucose, oder Saccharose und Fructose, oder Saccharose, Glucose und Fructose und Saccharose, Glucose, Fructose und Xylose, oder Glucose, Fructose und Xylose, oder Glucose, Fructose, Xylose und Arabinose oder Saccharose, Xylose und Arabinose, oder Glucose, Xylose und Arabinose und von anderen Kombination der erwähnten Zucker umfassen.
Falls das Medium Xylose umfasst, ist es von Vorteil, einen Mikroorganismus der Erfindung zu verwenden, der Gene des Xylose-Stoffwechsels exprimiert oder überexprimiert.
Genes des Xylose-Stoffwechsels sind zum Beispiel die Gene des xylABFGHR-Locus von E. coli umfassend Gene für (ein) Xylose-Transportsysteme (xylE, xylT und die xylFGH-Gene), Gene für Xylose-Verwertung (xylA- und xylB-Gen) und Gene für den Xylose-Transkriptionsaktivator (xylR-Gen).
Mikroorganismen, die Gene von dem xylABFGHR-Locus überexprimieren, sind in EP 1577396 und EP 1577369 beschrieben. Corynebacteria, die Gene von dem xylA allein oder mit dem xylB-Gen von E. coli, codierend eine Xylose-Isomerase, und xylB, das eine Xylulokinase codiert, überexprimieren, sind z. B. beschrieben worden (Kawaguchi, et al. Engineering of a xylose metabolic pathway in Corynebacterium glutamicum, Applied and Environmental Microbiology, 2006, Bd. 72, 5, Seiten 3418 bis 3428).
In einer bevorzugten Ausführungsform exprimiert oder überexprimiert der Mikroorganismus der Erfindung zumindest das xylA- oder das xylB-Gen oder noch bevorzugter das xylA- und das xylB-Gen.
Falls das Medium Arabinose umfasst, ist es von Vorteil, einen Mikroorganismus der Erfindung zu verwenden, der Gene des Arabinose-Stoffwechsels exprimiert oder überexprimiert. Gene des Arabinose-Stoffwechsels sind zum Beispiel Gene des araBAD-Operons, z. B. die araA-, araB-, araD- und areE-Gene von E. coli, die für L-Arabinose-Isomerase (araA), L-Ribolokinase (araB) und L-Ribulose-5-phosphat-4-Epimerase (araD) codieren, oder die Gene des araBDA-Operons von Corynebacterium gluctamicum, umfassend Homologe der araA-, araB- und araD-Gene, und das araE, das eine L-Arabinose-Isomerase codiert, das araR-Gen, das einen transkriptionalen Regulator codiert, und das galM-Gen, das eine putative Aldose 1-Epimerase codiert. Vorzugsweise exprimiert oder überexprimiert der Mikroorganismus der Erfindung zumindest das araA-, araB- und araD-Gen, weiter bevorzugt zumindest das araA-, araB-, araD- und das araE-Gen. Kawaguchi et al. Identification and Functional Analysis of the Gene Cluster for L-Arabinose Utilization in Corynebacterium glutamicum, Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75, Bd. 11, Seiten 3419–3429).
Die E. coli-Homologe der Gene des Arabinose-Metabolismus können auch in heterologen Mikroorganismen, wie Corynebacterium glutamicum, verwendet werden (Kawaguchi et al. Engineering of an L-arabinose metabolic pathway in Corynebacterium glutamicum, Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 77, Bd. 5, Seiten 1053 bis 1062).
Falls das Medium Cellobiose umfasst, ist es von Vorteil, einen Mikroorganismus der Erfindung zu verwenden, der Gene des Cellobiose-Stoffwechsels exprimiert oder überexprimiert. Gene des Cellobiose-Stoffwechsels sind zum Beispiel die bglA-Gene von Corynebacterium glutamicum, codierend Phosphenolpyruvat: Kohlenhydrat-Phosphotransferase-System (PTS) beta-Glucosid-spezifisches Enzym IIBCA-Komponente und Phosphor-beta-Glucosidase.
Beispiele für diese Gene, und die jeweiligen Proteine aus dem Corynebacterium-R-Stamm können unter der Zugangsnummer AF508972 gefunden werden.
Falls das Medium Kombinationen von Xylose, Arabinose, Cellobiose oder anderen Kohlenstoffquellen umfasst, ist es von Vorteil, Mikroorganismen der Erfindung zu verwenden, welche Gene des Xylose-Stoffwechsels, Arabinose-Stoffwechsels oder Cellobiose-Stoffwechsels exprimieren oder überexprimieren. Falls das Medium zum Beispiel einen hohen Gehalt von Xylose und Arabinose besitzt, ist es von Vorteil, Mikroorganismen zu verwenden, die Gene des Xylose- und Arabinose-Stoffwechsels exprimieren oder überexprimieren, zum Beispiel die xylA- und xylB-Gene und die araA-, araB-, araD-Gene, vorzugsweise das xylA- und xylB- araA-, araB-, araD- und araE-Gen, exprimieren.
Falls das Medium einen hohen Gehalt an Xylose und Cellubiose hat, ist es von Vorteil, Mikroorganismen zu verwenden, welche Gene des Xylose- und Cellobiose-Stoffwechsels exprimieren oder überexprimieren, zum Beispiel die xylA- und xylB- und die bglA-Gene exprimieren (Sasaki et al. Simultaneous utilization of D-cellobiose, D-glucose, and D-xylose by recombinant Corynebacterium glutamicum under Oxygen-deprived conditions, Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, Bd. 81, 4, Seiten 691 bis 699).
Stickstoffquellen, welche verwendet werden können, umfassen organische Verbindungen, die Stickstoff enthalten, wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojamehl und Harnstoff, oder anorganische Verbindungen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Phosphorquellen, welche verwendet werden können, sind Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze. Das Kulturmedium muss ferner Metallsalze enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, welche für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können auch essentielle Wachstums-fördernde Substanzen, wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Substanzen verwendet werden. Darüber hinaus können dem Kulturmedium geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die aufgeführten Zufuhrsubstanzen können der Kultur als ein einziger Ansatz zugesetzt werden oder in geeigneter Weise während der Kultivierung eingespeist werden.
Vorzugsweise werden Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung unter kontrolliertem pH-Wert kultiviert. Der Begriff ”kontrollierter pH” schließt einen beliebigen pH-Wert ein, welcher zur Herstellung der gewünschten Feinchemikalie, z. B. Cadaverin, führt. In einer Ausführungsform werden Mikroorganismen bei einem pH von etwa 7 kultiviert. In einer anderen Ausführungsform werden Mikroorganismen bei einem pH von zwischen 6,0 und 8,5 kultiviert. Der gewünschte pH kann durch eine beliebige Anzahl von dem Fachmann auf dem Gebiet bekannten Verfahren aufrecht erhalten werden. Zum Beispiel werden basische Verbindungen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder Ammoniak-Wasser, oder saure Verbindungen, wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure verwendet, um den pH-Wert der Kultur geeignet zu steuern.
Ebenfalls bevorzugt werden Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung unter kontrollierter Belüftung kultiviert. Der Begriff ”kontrollierte Belüftung” beinhaltet eine ausreichende Belüftung (z. B. Sauerstoff), um zur Produktion der gewünschten Feinchemikalie, z. B. Cadaverin, zu führen. In einer Ausführungsform wird die Belüftung durch Regulieren der Sauerstoffspiegel in der Kultur gesteuert, zum Beispiel durch Regulieren der Menge von Sauerstoff, die im Kulturmedium gelöst ist. Vorzugsweise wird die Belüftung der Kultur durch Bewegen der Kultur gesteuert. Die Bewegung kann durch einen Propellor oder eine ähnliche mechanische Bewegungseinrichtung, durch Drehen oder Schütteln des Wachstumsgefäßes (z. B. Fermenter) oder durch diverse Pumpgerätschaften vorgesehen werden. Die Belüftung kann ferner mittels der Passage von steriler Luft oder Sauerstoff durch das Medium (z. B. durch die Fermentations-Mischung) gesteuert werden. Ebenfalls in bevorzugter Weise werden Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung ohne übermäßige Schaumbildung kultiviert (z. B. durch Zusetzen von Antischaummitteln, wie etwa Fettsäurepolyglycolestern).
Außerem können Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung unter kontrollierten Temperaturen kultiviert werden. Der Begriff ”kontrollierte Temperatur” beinhaltet jegliche Temperatur, die zur Produktion der gewünschten Feinchemikalie, z. B. Cadaverin, führt. In einer Ausführungsform schließen kontrollierte Temperaturen Temperaturen zwischen 15°C und 95°C ein. In einer anderen Ausführungsform schließen kontrollierte Temperaturen Temperaturen zwischen 15°C und 70°C ein. Bevorzugte Temperaturen liegen zwischen 20°C und 55°C, weiter bevorzugt zwischen 30°C und 45°C oder zwischen 30°C und 50°C.
Mikroorganismen können in flüssigen Medien kultiviert (z. B. gehalten und/oder wachsen gelassen) werden und werden vorzugsweise, entweder kontinuierlich oder unterbrochen, durch herkömmliche Kultivierungsmethoden kultiviert, wie etwa Stehkultur, Reagenzglaskultur, Schüttelkultur (z. B. Rotationsschüttelkultur, Schüttelkolbenkultur, etc.), Belüftungs-Spinnerkultur oder Fermentation. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Mikroorganismen in Schüttelkolben kultiviert. In einer bevorzugteren Ausführungsform werden die Mikroorganismen in einem Fermenter (z. B. einem Fermentations-Prozess) kultiviert. Fermentations-Verfahren der vorliegenden Erfindung schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Batch- bzw. Satz-, Fed-Batch- und kontinuierliche Verfahren der Fermentation ein. Der Ausdruck ”Batch-Verfahren” oder ”Batchfermentation” bezieht sich auf ein geschlossenes System, in welchem die Zusammensetzung von Medien, Nährstoffen, zusätzlichen Additiven und dergleichen am Beginn der Fermentation eingestellt und während der Fermentation keiner Veränderung unterzogen wird, wobei jedoch Versuche unternommen werden können, um solche Faktoren wie pH und Sauerstoffkonzentration, zu steuern, um eine übermäßige Mediumansäuerung und/oder Mikroorganismus-Tod zu verhindern. Der Ausdruck ”Fed-Batch-Prozess” oder ”Fed-Batch”-Fermentation bezieht sich auf eine Batchfermentation mit der Ausnahme, dass ein oder mehrere Substrate oder Ergänzungen zugesetzt (z. B. in Zuwächsen oder kontinuierlich zugesetzt) werden, während die Fermentation voranschreitet. Der Ausdruck ”kontinuierliches Verfahren ”oder” kontinuierliche Fermentation” bezieht sich auf ein System, in welchem ein definiertes Fermentationsmedium kontinuierlich in einen Fermentor zugesetzt wird und eine gleiche Menge an verbrauchtem oder ”konditioniertem” Medium simultan entfernt wird, vorzugsweise zur Rückgewinnung des gewünschten Cadaverins. Eine Vielzahl von solchen Verfahren ist entwickelt worden und im Fachgebiet allgemein bekannt.
Die Methodik der vorliegenden Erfindung kann ferner einen Schritt des Gewinnens von Cadaverin einschließen. Der Begriff ”Gewinnen” von Cadaverin schließt das Extrahieren, Ernten, Isolieren oder Reinigen der Verbindung aus Kulturmedien ein. Ein Gewinnen der Verbindung kann durchgeführt werden gemäß einer beliebigen im Fachgebiet bekannten herkömmlichen Isolierungs- oder Reinigungsmethodik, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Behandlung mit einem herkömmlichen Harz (z. B. Anionen- oder Kationenaustauscherharz, nicht-ionisches Adsorptionsharz, etc.), Behandlung mit einem herkömmlichen Adsorbens (z. B. aktivierte Kohle, Kieselsäure, Siliciumdioxidgel, Cellulose, Aluminiomoxid, etc.), Veränderung des pH, Lösungsmittelextraktion (z. B. mit einem herkömmlichen Lösungsmittel, wie einem Alkohol, Ethylacetat, Hexan und dergleichen), Destillation, Dialyse, Filtration, Konzentrierung, Kristallisation, Umkristallisation, pH-Einstellung, Lyophilisieren und dergleichen. Zum Beispiel kann Cadaverin aus Kulturmedien gewonnen werden, indem zunächst die Mikroorganismen entfernt werden. Die Kulturbrühe, aus der Biomasse entfernt wurde, wird dann durch oder über ein Kationenaustauschharz geleitet, um unerwünschte Kationen zu entfernen, und dann durch oder über ein Anionenaustauschharz, um unerwünschte anorganische Anionen und organische Säuren mit stärkeren Aziditäten als Cadaverin zu entfernen. Darüber hinaus kann die Kulturbrühe mit ätzenden Mitteln behandelt werden, und das Cadaverin kann mit organischen Lösungsmitteln, wie Alkoholen, durch Phasentrennung extrahiert werden. Das Cadaverin kann aus der extrahierten Phase durch Destillation bis zu ausreichender Reinheit für diverse Anwendungen rückgewonnen werden. Mögliche Anwendungen schließen die Produktion von Polyamiden durch Polykondensation mit organischen Dicarbonsäuren ein.
Demzufolge sieht die vorliegende Erfindung, in einem anderen Aspekt, ein Verfahren für die Herstellung von Polyamiden (z. B. Nylon^®) vor, das einen Schritt, wie oben erwähnt, für die Produktion von Cadaverin umfasst. Das Cadaverin wird in einer bekannten Weise mit Di-, Tri- oder Polycarbonsäuren umgesetzt, um Polyamide zu erhalten. Vorzugsweise wird das Cadaverin mit Dicarbonsäuren mit 4 bis 10 Kohlenstoffen, wie etwa Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Pimelinsäure, Suberinsäure, Azelainsäure, Sebacinsäure, und so weiter, umgesetzt. Die Dicarbonsäure ist vorzugsweise eine freie Säure.
Der Mikroorganismus der Erfindung ist/sind nützlich zur Produktion von Cadaverin durch Fermentieren dieses Mikroorganismus, wobei es sich um das Wachsenlassen des Mikroorganismus in Kultur, vorzugsweise Wachsenlassen des Mikroorganismus unter Kulturbedingungen, wie oben beschrieben, handelt.
Folglich beinhaltet die Erfindung ein Verfahren für die Produktion von Cadaverin, umfassend das Fermentieren eines Mikroorganismus, der eine intrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität und eine gesteigerte Lysin-Import-Aktivität umfasst oder eine intrazelluläre und eine extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität umfasst oder eine intrazelluläre und eine extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität und eine gesteigerte Lysin-Import-Aktivität umfasst. Vorzugsweise schließt das Verfahren das Gewinnen von Cadaverin aus dem Kulturmedium ein.
In einer Ausführungsform umfasst der Mikroorganismus eine gesteigerte Lysin/Cadaverin-Antiporter-Aktivität, z. B. ein Mikroorganismus, der ein Polypeptid überexprimiert, das mindestens 80% oder mindestens 85% oder mindestens 90% oder mindestens 95% oder mindestens 98% identisch zu SEQ ID NR.: 9 ist und Lysin/Cadaverin-Antiporter-Aktivität besitzt, z. B. Homologe oder Mutanten mit Lysin/Cadaverin-Antiporter-Aktivität, und das Verfahren schließt das Fermentieren des Mikroorganismus in einem Medium ein, das Lysin umfasst. Vorzugsweise umfasst das Kulturmedium mehr als 0,1 mM, oder mehr als 0,5 mM, oder mehr als 1 mM, oder mehr als 3 mM, oder mehr als 5 mM, oder mehr als 7 mM, oder mehr als 8 mM, oder mehr als 9 mM oder mehr als 10 mM Lysin. Weiter bevorzugt umfasst das Kulturmedium mehr als 15 mM Lysin. Noch bevorzugter umfasst das Kulturmedium mehr als 20 mM Lysin. Am meisten bevorzugt umfasst das Kulturmedium mehr als 30 mM Lysin.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Mikroorganismus eine extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität oder umfasst eine extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität und eine gesteigerte Lysin/Cadaverin-Antiporter-Aktivität.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung soll ein Verfahren Cadaverin herstellen, wobei die Konzentration (mol/l) an Cadaverin im Kulturmedium mindestens 1,2-fach höher, oder mehr als 1,3-fach höher, oder mehr als 1,4-fach, oder mehr als 1,5-fach, oder mehr als 1,6-fach, oder mehr als 1,7-fach, oder mehr als 1,8-fach, oder mehr als 1,9-fach oder mehr als 2-fach, 3-fach, 4-fach, 5-fach, 6-fach, 7-fach, 8-fach, 9-fach höher ist als die Konzentration (mol/l) von Acetylcadaverin oder Aminopropylcadaverin oder von beidem. Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist das Kulturmedium, das in dem Verfahren hergestellt wird.
Vorzugsweise umfasst das Kulturmedium Cadaverin und eine sehr geringe Konzentration an Acetylcadaverin oder Aminopropylcadaverin. Weiter bevorzugt ist die Konzentration von Acetylcadaverin oder Aminopropylcadaverin oder beidem geringer als 0,2, oder 0,1, oder 0,05, oder 0,03, oder 0,01 mol/l, oder 0,005 mol/l oder 0,001 mol/l. Vorzugsweise werden die Konzentrationen von Cadaverin, Acetylcadaverin oder Aminopropylcaderin ermittelt, nachdem das Verfahren für die Produktion beendet worden ist, z. B. nachdem die Mikroorganismen, welche das Cadaverin produzieren, von dem Kulturmedium abgetrennt worden sind.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Produktion von Cadaverin, wobei die Konzentration (mol/l) von Cadaverin in dem Kulturmedium mindestens 1,2-fach höher, oder mehr als 1,3-fach höher, oder mehr als 1,4-fach, oder mehr als 1,5-fach, oder mehr als 1,6-fach, oder mehr als 1,7-fach, oder mehr als 1,8-fach, oder mehr als 1,9-fach oder mehr als 2-fach, 3-fach, 4-fach, 5-fach, 6-fach, 7-fach, 8-fach, 9-fach, 10-fach, 11-fach höher ist als die Konzentration (mol/l) von Acetylcadaverin. Eine andere Ausführungsform ist das Kulturmedium, das in dem Verfahren hergestellt wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Produktion von Cadaverin, wobei die Konzentration (mol/l) an Cadaverin im Kulturmedium mindestens 1,2-fach höher, oder mehr als 1,3-fach höher, oder mehr als 1,4-fach, oder mehr als 1,5-fach, oder mehr als 1,6-fach, oder mehr als 1,7-fach, oder mehr als 1,8-fach, oder mehr als 1,9-fach oder mehr als 2-fach, 3-fach, 4-fach, 5-fach, 6-fach, 7-fach, 8-fach, 9-fach, 10-fach, 11-fach höher als die Konzentration (mol/l) von Aminopropylcadaverin ist. Eine andere Ausführungsform ist das Kulturmedium, das in dem Verfahren hergestellt wird.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Kulturmedium, umfassend mindestens 0,25 mol/l, oder mindestens 0,3, oder mindestens 0,35, oder mindestens 0,4, oder mindestens 0,45, oder mindestens 0,5, oder mindestens 0,6, oder mindestens 0,7, oder mindestens 0,8, oder mindestens 0,9 mol/l Cadaverin und nicht mehr als 0,2 mol/l, oder nicht mehr als 0,15 mol/l, oder nicht mehr als 0,1 mol/l, oder nicht mehr als 0,05, oder nicht mehr als 0,045, oder nicht mehr als 0,04 oder nicht mehr als 0,03 mol/l Acetylcadaverin, oder nicht mehr als 0,05, oder nicht mehr als 0,045, oder nicht mehr als 0,04 oder nicht mehr als 0,03 mol/l Aminopropylcadaverin, oder nicht mehr als 0,05, oder nicht mehr als 0,045, oder nicht mehr als 0,04 oder nicht mehr als 0,03 mol/l jeweils von Acetylcadaverin und Aminopropylcadaverin.
Das durch die oben beschriebenen Verfahren hergestellte Cadaverin kann gewonnen oder gereinigt werden durch eine Aufarbeitung der Cadaverin (DAP) umfassenden Fermentationsbrühe, d. h. des Kulturmediums in seinem Zustand, nachdem das Verfahren zur Herstellung von Cadaverin beendet ist oder terminiert worden ist.
Das Verfahren zum Gewinnen oder Reinigen des Cadaverin aus der Fermentationsbrühe, wie im folgenden Medium beschrieben, ist lediglich exemplarisch. Der Fachmann kennt alternative Methoden oder Varianten des nachstehend beschriebenen Verfahrens, welche ebenfalls erfolgreich angewandt werden können.
Zum Gewinnen des hergestellten Cadaverins ist es von Vorteil, die Fermentationsbrühe einzudicken oder zu konzentrieren. Die Fermentationsbrühe kann durch bekannte Verfahren eingedickt oder konzentriert werden, wie zum Beispiel mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dünnfilmverdampfers, Fall-Film-Verdampfers, durch reverse Osmose oder durch Nanofiltration. Falls notwendig, können Salze, welche wegen der Konzentrierungsprozedur ausgefallen sein könnten, zum Beispiel durch Filtration oder Zentrifugation entfernt werden. Diese konzentrierte Fermentationsbrühe kann dann in der Weise der Erfindung aufgearbeitet werden, um Cadaverin zu erhalten. Für die Aufarbeitung gemäß der vorliegenden Erfindung, ist eine solche Konzentrationsprozedur anwendbar, aber nicht absolut notwendig.
Gemäß der Erfindung wird Cadaverin mit Hilfe eines organischen Extraktionsmittels aus der Fermentationsbrühe extrahiert. Genauer gesagt wird hierbei Gebrauch von einem organischen Lösungsmittel mit einer Mischbarkeits-Lücke mit Wasser gemacht, das so polar wie möglich und bei alkalischem pH stabil ist, wie insbesondere einem polaren, dipolar-protischen, organischem Lösungsmittel. Geeignete Lösungsmittel sind insbesondere zyklische oder offenkettige, wahlweise verzweigte Alkanole mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen, insbesondere n- und iso-Propanol, n-, sec- und iso-Butanol, oder Cyclohexanol, und auch n-Pentanol, n-Hexanol- n-Heptanol, n-Octanol, 2-Octanol und die einfach oder mehrfach verzweigten isomeren Formen davon. Besondere Erwähnung muss hier von n-Butanol gemacht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Extraktion und/oder die anschließende Phasentrennung satzweise bei einer erhöhten Temperatur durchgeführt, welche durch die Siedepunkte von Wasser und von dem Extraktionsmittel oder von möglicherweise entstehenden Azeotropen begrenzt ist. Unter Verwendung des Extraktionsmittels n-Butanol könnten Extraktion und Phasentrennung, zum Beispiel bei etwa 25–90°C oder, vorzugsweise, bei 40–70°C, durchgeführt werden. Für die Extraktion werden die zwei Phasen gerührt, bis sich das Teilungs-Gleichgewicht etabliert hat, zum Beispiel über eine Zeitdauer von 10 Sekunden bis 2 Stunden, vorzugsweise 5 bis 15 Minuten. Die Phasen werden sich dann absetzen gelassen, bis sie sich vollständig getrennt haben; dies dauert vorzugsweise 10 Sekunden bis 5 Stunden, zum Beispiel 15 bis 120 oder 30 bis 90 Minuten, insbesondere ebenfalls bei einer Temperatur im Bereich von etwa 25–90°C oder 40–70°C im Fall von n-Butanol.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen wird Cadaverin kontinuierlich aus der Fermentationsbrühe in einem mehrstufigen Verfahren (zum Beispiel in Mischer-Absetzer-Kombinationen) oder kontinuierlich in einer Extraktionssäule extrahiert.
Der Fachmann kann die Konfiguration der Extraktionssäulen bestimmen, welche gemäß der Erfindung für die zu trennenden Phasen in jedem Fall als Teil von Optimierungsroutinen angewandt werden kann. Geeignete Extraktionssäulen sind im Prinzip diejenigen ohne Energieeintrag oder diejenigen mit Energieeintrag, zum Beispiel gepulste Säulen oder Säulen mit rotierenden Innenteilen. Der Fachmann kann, als Teil der Routinearbeit, in einer geeigneten Weise auch die Typen und Materialien von Innenteilen, wie Siebböden und Kolonnenböden, auswählen, um die Phasentrennung zu optimieren. Die grundlegenden Theorien der Flüssigkeit-Flüssigkeit-Extraktion von kleinen Molekülen sind allgemein bekannt (vgl. z. B. H.-J. Rehm und G. Reed, Hrsg., (1993), Biotechology, Band 3 Bioprocessing, Kapitel 21, VCH, Weinheim). Die Konfiguration von industriell anwendbaren Extraktionssäulen ist zum Beispiel in Lo et al., Hrsg., (1983) Handbook of Solvent Extraktion, John Wiley & Sons, New York, beschrieben. Es wird expliziter Bezug auf die Offenbarung der oben genannten Lehrbücher genommen.
Nach der Phasentrennung wird Cadaverin aus der Cadaverin-umfassenden Extraktphase in einer per se bekannten Weise isoliert und gereinigt. Mögliche Maßnahmen zum Gewinnen von Cadaverin sind im Besonderen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Destillation, Präzipitation als Salz mit geeigneten organischen oder anorganischen Säuren, oder Kombinationen von solchen geeigneten Maßnahmen.
Die Destillation kann kontinuierlich oder satzweise durchgeführt werden. Eine einzelne Destillationskolonne oder eine Vielzahl von aneinander gekoppelten Destillationskolonnen kann verwendet werden. Das Konfigurieren des Destillationskolonnen-Apparats und das Festlegen der Betriebsparameter liegen im Verantwortlichkeitsbereich des Fachmanns. Die in jedem Fall verwendeten Destillationssäulen können in einer per se bekannten Weise entworfen sein (siehe z. B. Sattler, Thermische Trennverfahren [Thermal separation methods], 2. Auflage 1995, Weinheim, S. 135 ff; Perry's Chemical Engineers Handbook, 7. Auflage 1997, New York, Kapitel 13). Daher können die verwendeten Destillationskolonnen trennungswirksame Innenbauteile, wie Trenntröge, z. B. perforierte Tröge bzw. Böden, Glockenboden-Tröge oder Ventilböden, angeordnete Packungen, z. B. Blechmetall- oder Textilpackungen, oder statistische Betten von Packungen umfassen. Die verwendete Anzahl von in den Kolonne(n) erforderlichen Platten und das Reflux-Verhältnis werden im Wesentlichen von den Reinheitserfordernissen und der relativen Siedeposition der zu trennenden Flüssigkeiten beherrscht, wobei der Fachmann in der Lage ist, die spezifischen Design- und Betriebsdaten durch bekannte Verfahren festzustellen.
Eine Präzipitation als Salz kann durch Zusetzen geeigneter organischer oder anorganischer Säuren, zum Beispiel Schwefelsäure, Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Kohlensäure, Oxalsäure, etc. erreicht werden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird eine organische Dicarbonsäure verwendet, die ein Salz bildet, welches entweder direkt oder nach einer Reinigung, zum Beispiel durch Umkristallisierung, in einer anschließenden Polykondensation verwendet werden kann, um das Polyamid zu ergeben. Im Genaueren sind derartige Dicarbonsäuren C₄-C₁₂-Dicarbonsäuren.
Die in der Extraktionsprozedur hergestellte organische Cadaverinphase kann auch chromatographisch aufgearbeitet werden. Für die Chromatographie wird die Cadaverinphase auf ein geeignetes Harz, zum Beispiel einen stark oder schwach sauren Ionenaustauscher (wie Lewatit 1468 S, Dowex Marathon C, Amberlyst 119 Wet oder sonstige), aufgetragen, wobei das gewünschte Produkt oder die Kontaminanten auf dem chromatographischen Harz partiell oder vollständig zurückgehalten wird/werden. Diese chromatographischen Schritte können nach Bedarf wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere chromatographische Harze verwendet werden. Der Fachmann ist mit dem Auswählen passender chromatographischer Harze und ihrer effektivsten Anwendung vertraut. Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration aufkonzentriert und bei einer passenden Temperatur aufbewahrt werden.
Die Identität und Reinheit der isolierten Verbindung(en) kann durch Technologien des Stands der Technik bestimmt werden. Diese umfassen Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC), Gaschromatographie (GC), spektroskopische Methoden, Färbemethoden, Dünnschicht-Chromatographie, NIRS, Enzym-Assay oder mikrobiologische Assays. Diese analytischen Methoden sind zusammengefasst in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133–140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27–32; und Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19: 67–70. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S. 89–90, S. 521–540, S. 540–547, S. 559–566, 575–581 und S. 581–587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A., et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17.
Das das durch die oben beschriebenen Verfahren produzierte und gewonnene oder gereinigte Cadaverin kann verwendet werden, um Polyamide durch bekannte Techniken herzustellen. Diese Polyamide repräsentieren eine andere Ausführungsform der Erfindung.
Die Erfindung wird nun genauer auf der Basis der folgenden nicht-einschränkenden Beispiele und unter Bezug auf die beigefügten Figuren beschrieben.
Beispiel 1
Stamm-Konstruktion von LU11697
Der C. glutamicum-Stamm ATCC 13032 wurde mit DNA A (ebenfalls bezeichnet als pInt sacB delta PEPCK) (SEQ ID NR.: 20) transformiert und ”einge-Campbell-t” bzw. ”Campbelled in”, wodurch ein ”Campbell in”-Stamm erhalten wird. Der ”Campbell in”-Stamm wurde dann ”Campbelled out” unter Erhalt eines ”Campbell out”-Stamms, LU11031, welcher ein modifiziertes Phosphoenolpyuvat-Carboxykinase-Gen (pepck) enthält, das ein defektes Phosphoenolpyuvat-Carboxykinase-Enzym codiert (Delta PEPCK).
Der Stamm 11301 wurde anschließend mit DNA B (ebenfalls bezeichnet als pInt sacB 2x ddh) (SEQ ID NR.: 21) unter Erhalt eines ”Campbell in”-Stamms transformiert. Der ”Campbell in”-Stamm wurde dann ”Campbelled out”, wodurch man einen ”Campbell out”-Stamm, LU11100, erhält, der ein Gen enthält, das ein dupliziertes ddh-Gen mit dessen nativen Promotoren codiert (2*ddh).
Der Stamm LU11100 wurde mit DNA C (ebenfalls bezeichnet als pInt sacB LysC T311l) (SEQ ID NR.: 22) unter Erhalt eines ”Campbell in”-Stamms transformiert, welcher dann ”Campbelled out” wurde, um einen ”Campbell out”-Stamm, LU11271, zu ergeben. Der LU11271-Stamm enthielt was ein Gen enthält, das ein Rückkopplungs-resistentes Aspartatkinase-Enzym codiert (Ask^fbr) (codiert durch lysC). In dem resultierenden Aspartatkinase-Protein war T311 zu I311 verändert (bezeichnet als LysC T311l). Darüber hinaus wird ein PSOD-Promotor hinzugefügt, um die Expression des ask-lysC-Gens anzutreiben.
Der Stamm LU11271 wurde mit DNA D (ebenfalls bezeichnet als pK19 PSOD dapB rxb2957) (SEQ ID NR.: 23) unter Erhalt eines ”Campbell in”-Stamms transformiert, welcher dann ”Campbelled out” wurde, wodurch ein ”Campbell out”-Stamm, LU11269, erhalten wurde. Der LU11269-Stamm enthielt einen PSOD-Promotor stromaufwärts des dapB-Gens zum Antreiben der Expression von dapB.
Der Stamm LU11269 wurde mit DNA E (ebenfalls bezeichnet als pK19 sacB 2x argS lysA) (SEQ ID NR.: 24) unter Erhalt eines ”Campbell in”-Stamms transformiert, welcher dann ”Campbelled out” wurde unter Erhalt eines ”Campbell out”-Stamms, LU11275. Der LU11275-Stamm enthielt welche enthält einen duplizierten genetischen Locus, der das argS- und das lysA-Gen enthielt.
Der Stamm LU11275 wurde mit DNA F (ebenfalls bezeichnet als pInt sacB delta hom) (SEQ ID NR.: 25) unter Erhalt eines ”Campbell in”-Stamms transformiert, welcher dann ”Campbelled out” wurde, um einen ”Campbell out”-Stamm, LU11368, zu erhalten. Der LU11368-Stamm enthält eine Deletion des hsdh/hom-Gens.
Der Stamm LU11368 wurde mit DNA G (ebenfalls bezeichnet als pK19 delta pycA,) (SEQ ID NR.: 26) unter Erhalt eines ”Campbell in”-Stamms transformiert, welcher dann ”Campbelled out” wurde, wodurch ein ”Campbell out”-Stamm, LU11374, erhalten wurde. Der Stamm LU11374 enthält ein deletiertes Pyruvatcarboxylase-Gen, pycA-Gen.
Der Stamm LU11374 wurde mit DNA H (ebenfalls bezeichnet als pCLIk Int sacB hsdh replacement) (SEQ ID NR.: 27) unter Erhalt eines ”Campbell in”-Stamms transformiert, welcher dann ”Campbelled out” wurde, um einen ”Campbell out”-Stamm, LU11401, zu erhalten. Der Stamm enthält mutiertes hom-Gen mit der Mutation V59 nach A.
Der Stamm LU11401 wurde mit DNA I (ebenfalls bezeichnet als pInt sacB pycA*) (SEQ ID NR.: 28) unter Erhalt eines ”Campbell in”-Stamms transformiert, welcher dann ”Campbelled out” wurde, um einen ”Campbell out”-Stamm, LU11414, zu erhalten. Der Stamm enthält ein mutiertes Pyruvatcarboxylase-Gen mit der Mutation P458 nach S.
Der Stamm LU11414 wurde mit DNA J (ebenfalls bezeichnet als pInt sacB PSOD pycA) (SEQ ID NR.: 28) unter Erhalt eines ”Campbell in”-Stamms transformiert, welcher dann ”Campbelled out” wurde, um einen ”Campbell out”-Stamm, 11424, zu erhalten. Der Stamm enthält einen PSOD-Promotor stromaufwärts des pycA-Gen.
Der Stamm LU11424 wurde mit DNA K (ebenfalls bezeichnet als pInt sacB delta G6PDH) (SEQ ID NR.: 28) unter Erhalt eines ”Campbell in”-Stamms transformiert, welcher dann ”Campbelled out” wurde, um einen ”Campbell out”-Stamm, 11436, zu erhalten, der eine Deletion des Glucose-6-P-Dehydrogenase-Gens (G6PDH) enthält.
Der Stamm LU11436 wurde mit DNA L (ebenfalls bezeichnet als pInt sacB G6PDH*) (SEQ ID NR.: 29) unter Erhalt eines ”Campbell in”-Stamms transformiert, welcher dann ”Campbelled out” wurde, um einen ”Campbell out”-Stamm, LU11443, zu erhalten, welcher ein mutiertes Glucose-6-P-Dehydrogenase-Gen (G6PDH) enthält. In diesem Gen war die Sequenz so mutiert, dass die Aminosäure 234 zu einem Threonin mutiert wurde, während das Wildtypprotein ein Alanin trug.
Der Stamm LU11443 wurde mit DNA M (ebenfalls bezeichnet als pK19 sacB delta-Succinyl-CoA-Synthetase)) (SEQ ID NR.: 30) unter Erhalt eines ”Campbell in”-Stamms transformiert, welcher dann ”Campbelled out” wurde, wodurch man einen ”Campbell out”-Stamm, LU11600, erhielt, der eine deletierte Succinyl-CoA-Synthase-beta-Kette enthält.
Der Stamm LU11600 wurde mit DNA N (ebenfalls bezeichnet als pK19 sacB-Succinyl-COA-Synthetase replacement) (SEQ ID NR.: 31) unter Erhalt eines ”Campbell in”-Stamms transformiert, welcher dann ”Campbelled out” wurde, um einen ”Campbell out”-Stamm, LU11601, zu erhalten, der ein mutiertes Succinyl-CoA-Synthase-Beta-Kette-Gen enthält. In diesem Gen war die Sequenz so mutiert, dass die Aminosäure mutiert wurde, während das Wildtypprotein die folgenden Mutationen trug: P17 nach S, G39 nach E, A165 nach T.
Der Stamm LU11601 wurde mit DNA O (ebenfalls bezeichnet als pCLIK Int sacB delta MMCM) (SEQ ID NR.: 32) unter Erhalt eines ”Campbell in”-Stamms transformiert, welcher dann ”Campbelled out” wurde, wodurch man einen ”Campbell out”-Stamm, LU11606, erhielt, der ein deletiertes Methyl malonyl-CoA-Mutase-Gen enthielt.
Der Stamm LU11606 wurde mit DNA P (ebenfalls bezeichnet als pCLIK Int sacB MMCM replacement) (SEQ ID NR.: 33) unter Erhalt eines ”Campbell in”-Stamms transformiert, welcher dann ”Campbelled out” wurde, um einen ”Campbell out”-Stamm, LU11696, zu ergeben, enthaltend ein mutiertes Methylmalonyl-CoA-Mutase-Gen mit den folgenden Mutationen: P75 nach S, G413 nach E, A417 nach V.
Der Stamm LU11696 wurde mit DNA Q (ebenfalls bezeichnet als pInt sacB PSOD G6PDH) (SEQ ID NR.: 34) unter Erhalt eines ”Campbell in”-Stamms transformiert, welcher dann ”Campbelled out” wurde, um einen ”Campbell out”-Stamm, LU11697, zu erhalten, der einen PSOD-Promotor vor dem G6PDH-Gen enthält.
Beispiel 2
Stamm-Konstruktion von LU14105
Der Stamm LU11697 wurde mit DNA R (ebenfalls bezeichnet als pInt sacB Idc bioD) (SEQ ID NR.: 35) unter Erhalt eines ”Campbell in”-Stamms transformiert, welcher dann ”Campbelled out” wurde, um einen ”Campbell out”-Stamm, LU14105, zu erhalten, der ein aus E. coli abgeleitetes Lysin-Decarboxylase-Gen unter der transkriptionellen Steuerung seines nativen Promotors (Idc), integriert in den bioD-Locus von C. glutamicum, enthielt.
Beispiel 3
Stamm-Konstruktion von LU14635
Der Stamm LU14105 wurde mit DNA S (ebenfalls bezeichnet als pInt sacB delta RXA02214) (SEQ ID NR.: 36) transformiert, um einen ”Campbell in”-Stamm zu erhalten, der dann ”Campbelled out” wurde, um einen ”Campbell out”-Stamm, LU14635, zu erhalten, der eine Deletion des Acetyltransferase-Gens enthielt.
Beispiel 4
Stamm-Konstruktion von LU14646 und LU14646-delta-Acetyltransferase
Der Stamm LU14105 wurde mit DNA T (ebenfalls bezeichnet als pInt sacB delta lysE) (SEQ ID NR.: 37) unter Erhalt eines ”Campbell in”-Stamms transformiert, welcher dann ”Campbelled out” wurde, um einen ”Campbell out”-Stamm, LU14646, zu erhalten, der eine Deletion des Lysinexporter-lysE-Gens enthielt.
Der Stamm LU14646 wurde mit DNA R (ebenfalls bezeichnet als pInt sacB delta RXA02214) (SEQ ID NR.: 38) unter Erhalt eines ”Campbell in”-Stamms transformiert, welcher dann ”Campbelled out” wurde, um einen ”Campbell out”-Stamm, LU14646-delta-Acetyltransferase, zu erhalten, der eine Deletion des identifizierten Acetyltransferase-Gens enthielt.
Cadaverinproduktion in Schüttelkolben-Kultur
Schüttelkolben-Experimente wurden an den rekombinanten Stämmen durchgeführt, um die Cadaverinproduktion zu testen. Das gleiche Kulturmedium und die gleichen Bedingungen wie bei der Lysinproduktion wurden verwendet, wie in WO 2005059139 beschrieben. Für die Kontrolle wurden der Wirtsstamm und der rekombinante Stamm, der pClikSaMCS aufwies, parallel getestet. Die Stämme wurden über Nacht auf CM-Agar bei 30°C vorkultiviert. Kultivierte Zellen wurden in einem Mikroröhrchen, das 1,5 ml an 0,9% NaCl enthielt, geerntet, und die Zelldichte wurde durch die Extinktion bei 610 nm im Anschluß an eine Vortex-Behandlung bestimmt. Für die Hauptkultur wurden suspendierte Zellen zum Erreichen einer Anfangs-OD 1,5 in 10 ml des in einem autoklavierten 100-ml-Erlenmeyerkolben enthaltenen Produktionsmediums inokuliert, welches 0,5 g von CaCO3 aufwies. Die Hauptkultur wurde auf einem Rotationsschüttler (Infors AJ118, Bottmingen, Schweiz) mit 200 U/min während 48–78 Stunden bei 30°C durchgeführt. Die Konzentrationen von Cadaverin und Lysin wurden mit Hilfe von HPLC (Agilent 1100 Series IC-System) bestimmt.
In der kultivierten Nährbrühe wurde mit allen rekombinanten Stämmen, die die Lysin-Decarboxylase-Gene enthielten, eine signifikante Menge an Cadaverin akkumuliert.
Demgegenüber wurde eine erhebliche Verringerung der Lysinproduktivität beobachtet. Unter Inbetrachtziehung einer kompletten Umwandlung von Lysin in Cadaverin muss die gleiche Anzahl von Cadaverin-Molekülen wie Lysin hergestellt werden. Jedoch war die akkumulierte Menge von Cadaverin geringer als jene des vom Wirtsstamm produzierten Lysins, wobei andererseits gleichzeitig eine erhebliche Menge an Nebenprodukt, Acetylcadaverin, akkumuliert wurde, was zu einer Verringerung des Zuckerertrags führte.
Zusätzlich zur HPLC-Analyse wurden Cadaverin und Acetylcadaverin durch massenspektrometrische Methoden identifiziert.
Plasmidkonstruktion und Disruption des lysE-Gens
Für die chromosomale Disruption des für den Lysinexporter codierenden Gens wurde ein rekombinantes Plasmid konstruiert, welches die Marker-freie Manipulation durch zwei aufeinanderfolgende homologe Rekombinationsereignisse gestattet. Die DNA-Fragmente, welche die Regionen von dem Stromauf- und dem Stromabwärtigen des lysE-Gens enthielten, wurden aus chromosomaler Wildtyp-ATCC13032-C. glutamicum-DNA unter Verwendung eines Satzes von PCR-Primern (WJK199, WJK200, WJK201 und WJK202), für stromaufwärts und für stromabwärts, amplifiziert und als eine Matrize für eine Fusions-PCR mit PCR-Primern verwendet, um ein fusioniertes Fragment zu erzeugen, worin die mittlere Region des Gens entfernt ist. Das Produkt der Fusions-PCR mit der Größe von 1039 Basenpaaren wurde gereinigt, mit SpeI und XbaI verdaut, und in den pInt-sacB-Vektor inseriert, welcher die Integration von Sequenzen an dem genomischen Lokus von C. glutamicum bewerkstelligt (Becker et al. (2005), Applied and Environmental Microbiology, 71 (12), S. 8587–8596), der mit den gleichen Restriktionsenzymen verdaut wurde. Oligonukleotide für die Amplifikation von lysE
Das Plasmid wurde dann verwendet, um die native codierende Region des lysE-Gens zu disruptieren. Der verwendete Stamm war LU14105, in welchem das IdcC-Gen in den bioD-Locus des Chromosoms integriert worden war, welcher Cadaverin und Lysin produziert. Zwei aufeinanderfolgende Rekombinationsereignisse, eines in jeweils der Stromauf- bzw. der Stromabwärtsregion, sind notwendig, um die Mittensequenz des Gens zu disruptieren. Die disruptierten Mutanten wurden durch PCR mit Primern und Southern-Hybridisierungsanalyse bestätigt.
Beispiel 5
Cadaverinproduktion in Schüttelkolben-Kultur
Cadaverinproduktion in Schüttelkolben-Kultur der oben erwähnten Stämme.
Die Stämme LU1105, LU14635, LU14646 und LU14646-delta-Acetyltransferase wurden hinsichtlich der Cadaverinproduktion analysiert. Schüttelkolbenexperimente wurden an den oben erwähnten rekombinanten Stämmen durchgeführt, welche Deletionen des lysE-Gens und des Acetyltransferase-Gens tragen, um die Cadaverinproduktion zu testen. Das gleiche Kulturmedium und die gleichen Bedingungen wie bei der Lysinproduktion wurden angewandt, wie in WO 2005059139 beschrieben. Für die Kontrolle wurden Wirtsstamm und rekombinanter Stamm, welche das deletierte/disruptierte lysE-Gen tragen, parallel getestet. Die Stämme wurden auf CM-Agar über Nacht bei 30°C vorkultiviert. Kultivierte Zellen wurden in einem Mikroröhrchen, das 1,5 ml an 0,9% NaCl enthielt, geerntet, und die Zelldichte wurde durch die Extinktion bei 610 nm im Anschluß an eine Vortexbehandlung bestimmt. Für die Hauptkultur wurden suspendierte Zellen zum Erreichen einer Anfangs-OD von 1,5 in 10 ml des in einem autoklavierten 100-ml-Erlenmeyerkolben enthaltenen Produktionsmediums inokuliert, welches 0,5 g CaCO3 aufwies. Die Hauptkultur wurde auf einem Rotationsschüttler (Infors AJ118, Bottmingen, Schweiz) mit 200 U/min während 48–78 Stunden bei 30°C durchgeführt. Die Konzentrationen von Cadaverin und Lysin wurden mit Hilfe von HPLC (Agilent 1100 Series LC-System) bestimmt.

Es wurde festgestellt, dass in der Nährbrühe, die mit dem rekombinanten Stamm LU14646 kultiviert wurde, der ein deletiertes/disruptiertes lysE-Gen trägt, die Menge von Cadaverin von 6,6 g/l auf 9,9 g/l gegenüber dem isogenen Stamm LU14105, der ein Wildtyp-lysE-Gen trug, erhöht war. Zudem war die Lysinproduktivität von 8,3 g/auf 0,3 g/l verringert. Die Deletion der Acetyltransferase erhöhte ebenfalls die Cadaverinproduktion von 6,6 g/l auf 10,2 g/l, während sich 11,8 g/l Lysin im Überstand akkumulierte. Als die zuvor erwähnte Acetyltransferase in dem Stamm 114635 und LU14646-delta-Acetyltransferase deletiert wurde, konnte kein Acetyl-Cadaverin nachgewiesen werden. In der Kombination der Deletion des lysE-Gens und der Acetyltransferase war die Cadaverin-Konzentration auf 14,9 g/l erhöht, was eine Synergie zwischen der Deletion des lysE-Gens und der Deletion des Acetyltransferase-Gens zeigt. Tabelle 2:

	Produkt g/l Cadaverin	Lysin HCl	Acetyl-cadaverin
LU14105	6,6	8,5	1,2
LU14646 delta lysE	9,9	0,3	0,6
LU 14635 (delta – Acetyltransferase)	10,2	11,8	0
LU 14646 delta – Acetyltransferase	14,9	0,2	0

In einer anderen Ausführungsform wird eine Lysin-Decarboxylase in einer Fusion mit einem starken, in Corynebacterium glutamicum aktiven Promotor und einer Sequenz, die eine in C. glutamicum aktive Translokations- und Sekretionssequenz bildet, kloniert. Sequenzen für die Translokation und Sekretion können durch Identifizieren von sezernierten Proteinen in Actinobacteria, wie Streptomyces, und Corynebacteria mittels Gelelektrophorese-Trennung und N-terminaler Sequenzierung durch Edman-Abbau gefunden werden. Die für sezernierte Proteine codierende DNA-Sequenz wird eine 5'-Verlängerung mit 1–100 bp zusätzlicher Sequenz vor dem ersten Codon, codierend für die erste Aminosäure, die in einem sezerniertem Protein gefunden wird, zeigen. Diese zusätzliche Sequenz nach einem Startcodon wird eine Peptidsignalsequenz codieren, welche das Protein für die Translokation und Sekretion kennzeichnet bzw. zielsteuert. Diese Signalsequenz kann fusioniert werden vor einem Gen, wie etwa Lysin-Decarboxylase IdC oder cadA, das zu mRNA exprimiert werden soll, um als ein Fusionsprotein von Signalsequenz und Proteinsequenz produziert zu werden. Das Fusionsprotein wird in die Zellwandmatrix und in den Zellkultur-Überstand transloziert und sezerniert, woraufhin die Signalsequenz abgespalten und das Protein sezerniert wird. Das sezernierte Protein, eine aktive Lysin-Decarboxylase, wie LDC und CADA, kann im Zellüberstand aktiv sein, wo es in der Lage ist, Lysin durch eine Decarboxylierungsreaktion in Cadaverin umzuwandeln. Hierdurch kann die Menge von durch den zellulären Metabolismus produziertem Lysin zu Cadaverin umgewandelt werden, und die Kohlenstoffquelle kann, ohne einhergehende Produktion von Nebenprodukten, in Cadaverin umgewandelt werden.
Höchstwahrscheinlich wird die Expression einer sezernierten Lysin-Decarboxylase in einem Stamm durchgeführt, der ebenfalls eine intrazelluläre Lysin-Decarboxylase exprimiert, sowie in einem Stamm mit einer Deletion in einer Cadaverin-Acetyltransferase.
Beispiel 6
Stamm-Konstruktion eines Lysin-Decarboxylase sezemierenden Organismus Für die Konstruktion eines zum Sezernieren einer funktionalen Lysin-Decarboxylase fähigen Stammes werden der PSOD-Promotor, wie oben beschrieben, die Signalsequenz der alpha-Amylase aus Streptomyces coelicolor und das LDC-Gen durch PCR-Primerverlängerung fusioniert und unter Erhalt des Vektors pCLIK5A PSOD Idc sigseq alpha-Amylase SEQ ID NR. 41 kloniert. Der resultierende Vektor wird in den Stamm LU14635 transformiert. Nach Wachstum und Inkubation im Schüttelkolben, wie oben beschrieben, wird festgestellt, dass die Menge an Lysin im Kulturüberstand im Vergleich zur Kontrolle, die IdC ohne Translokation/Sekretionssignalsequenz exprimierte, verringert ist.
Beispiel 7
Stamm-Konstruktion für die Verwertung von C5-Zuckern für die Produktion von DAP Die E. coli-Gene für die Verwertung von Xylose (die Xyloseisomerase und die Xylulosekinase xylAB) wurden durch das PCR-Fusionsverfahren an den Pgro-Promotor von C. glutamicum fusioniert, durch PCR amplifiziert und in den Vektor pG in die Restriktionsstelle XhoI und MluI inseriert, um den Vektor pG Pgro xylAB SEQ ID NR. 39 zu ergeben. Das Plasmid wurde in den Stamm LU14635 transformiert, ebenso wie das leere Kontrollplasmid pG, das die Xylose-Verwertungs-Gene nicht enthielt, wodurch man die Stämme LU14635 pG und den Stamm LU14635 pG Pgro xylAB erhielt.
Cadaverinproduktion in Schüttelkolben-Kultur
Schüttelkolbenexperimente wurden wie folgend durchgeführt:
Cadaverinproduktion in Schüttelkolben-Kultur der oben erwähnten Stämme. Der Stamm LU14635 pG und pG Pgro Xyl AB wurde(n) hinsichtlich der Cadaverinproduktion analysiert. Schüttelkolbenexperimente wurden mit den rekombinanten Stämmen mit dem Plasmid zum Überexprimieren der Xylose-Operon-Gene durchgeführt, um die Cadaverinproduktion zu testen. Die Stämme wurden auf CM-Agar mit Kanamycin 25 μg/ml über Nacht bei 30°C vorkultiviert. Kultivierte Zellen wurden in einem Mikroröhrchen geerntet, das 1,5 ml an 0,9% NaCl enthielt, und die Zelldichte wurde durch die Extinktion bei 610 nm im Anschluß an eine Vortexbehandlung bestimmt. Für die Hauptkultur wurden suspendierte Zellen zum Erreichen einer Anfangs-OD von 1,5 in 10 ml des MDAP-Mediums mit zugesetztem Kanamycin bei einer Konzentration von 25 μg/ml, enthalten in einem autoklavierten 100-ml-Erlenmeyerkolben, inokuliert. Die Hauptkultur wurde auf einem Rotationsschüttler (Infors AJ118, Bottmingen, Schweiz) mit 200 U/min während 48–78 Stunden bei 30°C durchgeführt. Die Konzentrationen von Cadaverin und Lysin und restlichen Zuckern wurden unter Verwendung von HPLC (Agilent 1100 Series LC-System) bestimmt.
MDAP-Batch-Medium – Rezept
Das MDAP-Medium besteht aus den folgenden Komponenten

Ammoniumsulfat 25 g/l
Hefeextrakt Difco 15 g/l
Vitamin-Stammlösung 15 ml/l
Salzlösung MDAP 100 ml/l
Spurenelementlösung: 15 ml/l
Pyridoxin 1 mg/ml 1 ml/l
Zucker (Glucose oder Xylose) 60–50 g/l
ACES 78 g/l
MOPS 21 g/l
CaCO3 15 g/l

Vitamin-Stammlösung

Biotin 300 mg/l
Thiamin 500 mg/l
Nicotinamid 600 mg/l
Pantothensäure 2000 mg/l
Zugabe von Vitaminlösung 15 ml/l

Salzlösung MDAP

Zitronensäure 2 g/l
Calciumsulfat 1,5 g/l
Kaliumphosphat 25 g/l
Magnesiumsulfat 12,5 g/l
Eisen(II)-sulfat 700 mg/l
Zinksulfat 300 mg/l
Mangansulfat 150 mg/l

Spurenelement-Lösung

Zitronensäure 2,1 g/l
Borsäure 300 mg/l
Cobaltsulfat 240 mg/l
Kupfersulfat 300 mg/l
Nickelsulfat 200 mg/l
Natriummolybdat 50 mg/l

Ergebnisse:

Stamm	OD 600 nm	Cadaverin g/l	Restlicher Zucker	Ausbeute g Cadaverin pro g verwertetem Zucker	Lysin g/l
LU14635 delta pG 60	25,50	8,04	6,85	0,15	0,93
g/l Glucose
LU14635 pG 50 g/l Xylose	6,29	1,23	46,87	0,09	0,41
LU14635 pG Xyl-Operon E. coli 60 g/l Glucose	27,50	8,76	6,75	0,18	0,76
LU14635 pG Xyl-Operon E. coli 50 g/l Xylose	48,40	10,67	0,21	0,22	0,23

Tabelle 3. Wachstum und Produktion von Cadaverin durch den Stamm LU14635 ohne und mit Überexpression der Xylose-Verwertunge-Gene

Das Experiment zeigte, dass die Expression der Xylose-Verwertungs-Gene zu einem guten Wachstum auf Xylose führte, während der Kontrollstamm LU14635 pG, welcher auf Glucose gut wuchs und Cadaverin bei Zugabe von 50 g/l Xylose produzierte, kaum wuchs oder Cadaverin produzierte. Dies zeigt, dass Xylose durch den C. glutamicum-Stamm in Abwesenheit von den heterologen Genen nicht umgewandelt werden kann. Die OD als ein Maß des Zellwachstums zeigte die höchsten Werte, als Xylose in das Medium zugesetzt wurde, wobei im Vergleich zur Glucosezusetzung in das Medium sogar höhere Werte und daher Zellzahlen erreicht wurden. Auch die Cadaverinkonzentration war die höchste in dem Experiment, bei dem die Xylose-Verwertungs-Gene auf dem Plasmid-pG-Xylose-Operon getrugen wurden. Der aus diesem Experiment erhaltene Ausbeutewert (g von Cadaverin pro g an verwertetem Zucker) war ebenfalls über die Ausbeute im Fall von zugesetzter Glucose erhöht. Diese Daten zeigen, dass der Ertrag für die Cadaverinproduktion sowie das Wachstum verbessert werden können, wenn die Gene für Xyloseverwertung in einem Cadaverin produzierenden Stamm exprimiert werden. Diese Daten zeigen auch, dass C. glutamicum erfolgreich als ein Stamm zum Umwandeln von Pentosen verwendet werden kann, um Feinchemikalien, wie Cadaverin, herzustellen.
Beispiel 8
Stamm-Konstruktion für die Verwertung von C5-Zuckern (Pentosen) für die Produktion von DAP mit den aus Bacillus subtilis abgeleitetn Xylose-Verwertungs-Genen.
Die Bacillus subtilis-Gene für die Verwertung von Xylose, d. h. die Xylose-Isomerase und die Xylulose-Kinase, wurden mittels PCR-Reaktion an den PSOD-Promotor aus C. glutamicum fusioniert, durch PCR amplifiziert und in den Vektor pG in die Restriktionsstelle XhoI und MluI inseriert, um den Vektor pG PSOD xyl AB B. subtilis zu ergeben. Die Sequenz des Vektors ist die SEQ ID NR.: 40. Das Plasmid wurde in den Stamm LU14635 transformiert, ebenso wie das leere Kontrollplasmid pG, welches die Xylose-Verwertungs-Gene nicht enthält, wodurch man die Stämme LU14635 pG und den Stamm LU14635 pG Pgro xylAB B.subtilis erhält.
Cadaverinproduktion in Schüttelkolben-Kultur
Schüttelkolbenexperimente wurden wie folgend durchgeführt:
Die Cadaverinproduktion in Schüttelkolben-Kultur der zuvor erwähnten Stämme. Der Stamm LU14635 pG und pG Pgro xylAB B. subtilis wurde(n) hinsichtlich der Cadaverinproduktion analysiert. Schüttelkolbenexperimente wurden mit den rekombinanten Stämmen mit dem Plasmid zum Überexprimieren der Xylose-Operon-Gene durchgeführt, um die Cadaverinproduktion zu testen. Die Stämme wurden auf CM-Agar mit Kanamycin 25 μg/ml über Nacht bei 30°C vorkultiviert. Kultivierte Zellen wurden in einem Mikroröhrchen, das 1,5 ml 0,9% NaCl enthielt, geerntet, und die Zelldichte wurde durch die Extinktion bei 610 nm im Anschluß an eine Vortex-Behandlung bestimmt. Für die Hauptkultur wurden suspendierte Zellen zum Erreichen einer Anfangs-OD von 1,5 in 10 ml des MDAP-Mediums mit zugesetztem Kanamycin bei einer Konzentration von 25 μg/ml, enthalten in einem autoklavierten 100 ml-Erlenmeyerkolben, inokuliert. Die Hauptkultur wurde auf einem Rotationsschüttler (Infors AJ118, Bottmingen, Schweiz) mit 200 U/min während 48–78 Stunden bei 30°C durchgeführt. Die Konzentrationen von Cadaverin und Lysin und restlichen Zuckern wurden mit Hilfe von HPLC (Agilent 1100 Series LC-System) bestimmt.
Es wurde festgestellt, dass der Stamm LU14635 pG Pgro xylAB B. subtilis, aber nicht der Stamm LU14635 pG, gut auf Xylose als der einzigen Kohlenstoffquelle wuchs. Der Stamm LU14635 pG Pgro xylAB B. subtilis produziert bei Wachstum auf Xylose als einziger Kohlenstoffquelle signifikante Mengen an Cadaverin, wohingegen die Kontrolle LU14635 pG kein Cadaverin in einem signifikanten Ausmaß produziert.
Beispiel 9

Stamm-Konstruktion Sekretion einer Lysin-Decarboxylase. Das E. coli-Idc-Gen für die Decarboxylierung wird durch PCR-Fusion an den PSOD-Promotor aus C. glutamicum und an die Signalsequenz der Alpha-Amylase von Streptomyces coelicolor fusioniert. Dieses fusionierte Gen wird dann in den pCLIK-Vektor kloniert, wodurch man pCLIK PSOD Idc alpha-amylase sigseq (SEQ ID Nr. 41) erhält. Dieses Plasmid wird eintransformiert, um den Stamm LU14635 pCLIK PSOD Idc alpha amy sigseq zu erhalten. Cadaverinproduktion in Schüttelkolben-Kultur der oben erwähnten Stämme. Der Stamm LU14635 pCLIK und pCLIK PSOD Idc apha amy sigseq werden bezüglich der Cadaverinproduktion analysiert. Schüttelkolbenexperimente werden mit den rekombinanten Stämmen mit dem Plasmid zum Überexprimieren der der Idc, welche von C. glutamicum sezerniert wird, durchgeführt, um die Cadaverinproduktion zu testen. Die Stämme werden auf CM-Agar mit Kanamycin 25 μg/ml über Nacht bei 30°C vorkultiviert. Kultivierte Zellen werden in einem Mikroröhrchen geerntet, das 1,5 ml an 0,9% NaCl enthielt, und die Zelldichte wird mit Hilfe der Extinktion bei 610 nm im Anschluß an eine Vortex-Behandlung bestimmt. Für die Hauptkultur werden suspendierte Zellen zum Erreichen einer Anfangs-OD von 1,5 in 10 ml des MDAP-Mediums mit zugesetztem Kanamycin bei einer Konzentration von 25 μg/ml, enthalten in einem autoklavierten 100 ml-Erlenmeyerkolben, inokuliert. Die Hauptkultur wird auf einem Rotationsschüttler (Infors AJ118, Bottmingen, Schweiz) mit 200 U/min während 48–78 Stunden bei 30°C durchgeführt. Die Konzentrationen von Cadaverin und Lysin und restlichen Zuckern werden mit Hilfe von HPLC (Agilent 1100 Series LC-System) bestimmt. Es wird festgestellt, dass der Stamm LU14635 pCLIK PSOD Idc alpha amy sigseq, aber nicht der Stamm LU14635 pCLIK, kein Lysin im Zellüberstand hervorbringt, und dass der Stamm LU14635 pCLIK PSOD Idc alpha-amy sigseq mehr Cadaverin produziert als der Stamm LU14635 pCLIK. Tabelle 4 Gen/Protein-Beschreibungen und Kommentierungsinformation, Mutationsinformation

Genbeschreibung	Zugangsnummer Gensequenz	Zugangsnummer Proteinsequenz	Potentielle Mutation in der Proteinsequenz
PEPCK	AJ269506	NP_602055	keine
ddh	AAD09519	AAE04861	keine
dapB	AAT49281	AAW06582	keine
argS	AAT49283	AAW06588	keine
lysA	AAD09520	AAE04862	keine
Apartokinase ask, lysC	X57226.1	CAA40502.1	T311 nach I
Homoserin-Dehydrogenase	Cgl1183	BAB98576.1	V59 nach A
Pyruvat-Carboxylase pycA	AF038548	AAB92588.1	P458 nach S
Succinyl-CoA-Synthase	BX927152	A4QGW4_CORGB	P17 nach S G39 nach E A165 nach T
G6PDH	Gen-ID: 1019544	NP_600790	A243 nach T
MMCM	Gen-ID: 1019502	NC_003450.3	P75 nach S G413 nach E A417 nach V
Idc	FB656638	CAR96105.1	keine
Acetyltransferase	BX927152	NP_600742	keine
lysE		CAA65324.2	keine

Tabelle 5: Plasmidliste

Plasmid	Plasmidname	Verwendung/Insertbeschreibung
A	pInt sacB delta PEPCK	Deletion von PEPCK
B	pInt sacB 2x ddh	Duplikation von ddh
C	pInt sacB LysC T311l	Einführung von der 311l-Mutation
D	pInt sacB PSOD dapB	PSOD-Promotor zum Exprimieren von dapB
E	pK19 sacB 2x argS lysA	Genduplikation von argS dem lysA-Gen
F	pInt sacB delta hom	Deletion von hom/hsdh
G	pInt sacB delta pycA	Deletiertes Pyruvatecarboxylase-Gen pycA
H	pInt sacB hom*	Einführung von mutiertem hom-Gen
I	pInt sacB pycA*	Einführung von mutiertem Pyruvatcarboxylase-Gen
J	pInt sacB PSOD pycA	PSOD-Promotor zum Exprimieren von pycA
K	pInt sacB delta G6PDH	Deletion des Glucose-6-P-dehydrogenase–Gens (G6PDH)
L	pInt sacB G6PDH*	Einführung von mutiertem G6PDH-Gen
M	pInt sacB delta succ syn	Deletierte Succinyl-CoA-Synthase beta-Kette
N	pInt sacB succ syn*	Einführung von mutiertem Succinyl CoA-Synthase beta-Ketten-Gen
O	pInt sacB delta MMCM	Deletion von Methylmalonyl CoA-Mutase
P	pInt sacB MMCM*	Einführung von mutiertem Methylmalonyl CoA-Mutase-Gen
Q	pInt sacB PSOD G6PDH	PSOD-Promotor zum Exprimieren des G6PDH-Gens
R	pInt sacB Idc bioD	Einbringen des E. coli Idc-Gen mit nativem Promotor in den bioD-Locus
S	pInt sacB delta RXA02214	Deletion von Acetyltransferase
T	pInt sacB delta lysE	Deletion des Lysin-Exporter lysE
U	pCKLIK SOD Idc sec	Sekretion des Lysindecarboxylase-Gens

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

JP 2002223770 [0002]
JP 2004222569 [0003, 0109]
WO 2007113127 [0004, 0066]
WO 2008092720 [0005]
WO 2005059144 [0038, 0039]
WO 2007011939 [0038, 0039]
WO 2007012078 [0038, 0039]
WO 2005059093 [0038, 0039]
WO 2008049782 [0038, 0039, 0040]
WO 2006069711 [0038, 0039]
WO 2007020295 [0038, 0039]
WO 97/23597 [0077]
WO 2005073390 [0077, 0080]
US 7435584 [0077]
DE 95-01048222 [0079]
EP 1108790 [0098, 0098, 0099, 0099]
WO 00/63388 [0098, 0098]
US 2003/0175911 [0099]
WO 05/58945 [0099, 0099]
WO 2007/113127 [0103, 0105]
EP 1577396 [0131]
EP 1577369 [0131]
WO 2005059139 [0190, 0197]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) [”Sambrook”] [0029]
Eikmanns et al (Gene. (1991) 102, 93–8 [0033]
Glick, J. Ind. Microbiol. 1: 277 (1987); Watson et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, 4. Aufl., Benjamin Cummins (1987); Ausubel et al., siehe oben, und Sambrook et al. [0038]
Williams et al., ”Expression of foreign Proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies,” [0040]
DNA CLONING 2: EXPRESSION SYSTEMS, 2. Auflage, Glover et al. (Hrsg.), Seiten 15-58 (Oxford University Press 1995) [0040]
Ward et al., ”Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,” in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Seiten 137–185 (Wiley-Liss, Inc. 1995) [0040]
Georgiou, ”Expression of Proteins in Bacteria,” in PROTEIN ENGINEERING: PRINCIPLES AND PRACTICE, Cleland et al. (Hrsg.), Seiten 101–127 (John Wiley & Sons, Inc. 1996 [0040]
Ausubel et al. (Hrsg.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3. Auflage, Seiten 1-1 bis 1-24 (John Wiley & Sons, Inc. 1995) [0041]
”ARS cultures collection Northern Regional Research Laboratory”, Peorea, IL, USA [0048]
”Handbook of Corynebacetrium glutamicum 2005, Eggeling, Borth, Hrsg., CRC Press Boca Raton USA, und den Referenzen darin) oder in Methods in Enzymology, Band 17, Teil 1, S. 3–1098 (1970), Band 17, Teil 2, S. 3–961 (1971) Band 41, S. 3–564 (1975), Band 42, S. 3–537 (1975), Band 63, S. 3–547 (1979), Band 64, S. 3–418 (1980), Band 89, S. 3–656 (1982), Band 90 S. 3–602 (1982), Band 142, S. 3–732 (1987), Band 143 S. 3–582 (1987) [0054]
Ausubel et al., (Hrsg.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Seiten 8.2.8 bis 8.2.13 (1990) [0057]
Wosnick et al., Gene 60: 115 (1987) [0057]
Ausubel et al. (Hrsg.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3. Auflage, Seiten 8-8 bis 8-9 (John Wiley & Sons, Inc. 1995) [0057]
Adang et al., Plant Molec. Biol. 21: 1131 (1993) [0057]
Bambot et al., PCR Methods and Applications 2: 266 (1993) [0057]
Dillon et al., ”Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes,” in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Bd. 15: PCR PROTOCOLS: CURRENT METHODS AND APPLICATIONS, White (Hrsg.), Seiten 263–268, (Humana Press, Inc. 1993) [0057]
Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4: 299 (1995) [0057]
Ausubel et al., siehe oben, auf Seiten 8.0.3–8.5.9 [0060]
Ausubel et al., (Hrsg.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3. Auflage, Seiten 8-10 bis 8-22 (John Wiley & Sons, Inc. 1995) [0060]
McPherson (Hrsg.), DIRECTED MUTAGENESIS: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1991) [0060]
Choi und Lee, Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 64: 625–635 [0065]
Current Opinion in Biotechnology 2005, 16: 538–545 [0065]
Trends in Biotechnology 2007, 16, 73–79 [0065]
Bellmann, A, Vrljic, M, Patek, M, et al., MICROBIOLOGY-SGM 147, S. 1765–1774, 2001 [0074]
Burkovski, A, Kramer, R., APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY 58, S. 265–274, 2002 [0074]
Eggeling, L, Sahm, H JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING 92, 3 201–213 [0079]
Eggeling, L, Sahm, H ARCHIVES OF MICROBIOLOGY 180, 3 155–160 2003 [0079]
Bellmann, A, Vrljic, M, Patek, M, et al. MICROBIOLOGY-SGM 147, S. 1765–1774, 2001 [0084]
Burkovski, A, Kramer, R, APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY 58, S. 265–274, 2002 [0084]
Fujii, T., et al., sowie in BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY 66, S. 1981–1984, 2002 [0084]
Soksawatmaekhin W. et al.; Excretion and uptake of cadaverine by CadB and its physiological functions in Escherichia coli; Molecular Microbiology; 2004,; Band 51,5; Seiten 1401 bis 1412 [0089]
Soksawatmaekhin W. et al.; Identification of the Cadaverine Recognition Site on the Cadaverine-Lysine Antiporter CadB; The Journal of Biological Chemistry; 2006; Band 281, 39; Seiten 29213 bis 29220 [0090]
M. B. Jenkins, V. W. Woodward, Biochimica et Biophysica Acta, 1970, 212, 21–32 [0112]
Meneely KM, und Lamb AL BIOCHEMISTRY 46, Seiten: 11930–11937 2007 [0114]
IJ, Hsueh LC, Baldwin JE, et al. EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY 268, Seiten: 6625–6636 [0114]
Kawaguchi, et al. Engineering of a xylose metabolic pathway in Corynebacterium glutamicum, Applied and Environmental Microbiology, 2006, Bd. 72, 5, Seiten 3418 bis 3428 [0131]
Kawaguchi et al. Identification and Functional Analysis of the Gene Cluster for L-Arabinose Utilization in Corynebacterium glutamicum, Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75, Bd. 11, Seiten 3419–3429 [0133]
Kawaguchi et al. Engineering of an L-arabinose metabolic pathway in Corynebacterium glutamicum, Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 77, Bd. 5, Seiten 1053 bis 1062 [0134]
Sasaki et al. Simultaneous utilization of D-cellobiose, D-glucose, and D-xylose by recombinant Corynebacterium glutamicum under Oxygen-deprived conditions, Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, Bd. 81, 4, Seiten 691 bis 699 [0138]
H.-J. Rehm und G. Reed, Hrsg., (1993), Biotechology, Band 3 Bioprocessing, Kapitel 21, VCH, Weinheim [0161]
Lo et al., Hrsg., (1983) Handbook of Solvent Extraktion, John Wiley & Sons, New York [0161]
Sattler, Thermische Trennverfahren [Thermal separation methods], 2. Auflage 1995, Weinheim, S. 135 ff; Perry's Chemical Engineers Handbook, 7. Auflage 1997, New York, Kapitel 13 [0163]
Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133–140 [0166]
Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27–32 [0166]
Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19: 67–70 [0166]
Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S. 89–90, S. 521–540, S. 540–547, S. 559–566, 575–581 und S. 581–587 [0166]
Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A., et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17 [0166]
Becker et al. (2005), Applied and Environmental Microbiology, 71 (12), S. 8587–8596 [0194]

Claims

Mikroorganismus, umfassend eine intrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität und eine erhöhte Lysin-Import-Aktivität, oder umfassend eine intrazelluläre und eine extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität, oder umfassend eine intrazelluläre und eine extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität und eine erhöhte Lysin-Import-Aktivität.
Mikroorganismus, wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die intrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität oder die extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität oder die intrazelluläre und die extrazelluläre Decarboxylase-Aktivität zumindest teilweise auf die Expression von einem oder mehreren Lysin-Decarboxylase-Polypeptiden zurückzuführen ist, welche eine Aminosäuresequenz umfassen, die zumindest zu 80% mit SEQ ID NR.: 1 oder 2 identisch ist.
Mikroorganismus, wie in den Ansprüchen 1 oder 2 beansprucht, wobei die Lysin-Decarboxylase-Aktivität oder die extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität oder die intrazelluläre und die extrazelluläre Decarboxylase-Aktivität zumindest teilweise auf die Expression von einem oder mehreren Lysin-Decarboxylase-Polypeptiden zurückzuführen ist, welche eine Aminosäuresequenz umfassen, die zumindest zu 80% mit SEQ ID NR.: 1 identisch ist.
Mikroorganismus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, wobei die extrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität und die intrazelluläre Lysin-Decarboxylase-Aktivität zumindest teilweise auf die Expression von einem oder mehreren Lysin-Decarboxylase-Polypeptiden zurückzuführen ist, welche eine Aminosäuresequenz umfassen, die zumindest zu 80% mit SEQ ID NR.: 1 identisch ist.
Mikroorganismus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 beansprucht, wobei die erhöhte Lysin-Import-Aktivität auf eine verringerte Lysin-Exporter-Aktivität oder eine erhöhte Lysin-Permease-Aktivität oder eine erhöhte Lysin/Cadaverin-Antiporter-Aktivität oder jegliche Kombination davon zurückzuführen ist.
Mikroorganismus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 beansprucht, wobei die erhöhte Lysin-Import-Aktivität auf eine verringerte Aktivität eines Lysin-Exporter-Polypeptids zurückzuführen ist, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die zumindest zu 80% mit SEQ ID NR.: 3 oder 4 identisch ist.
Mikroorganismus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 beansprucht, wobei die erhöhte Lysin-Import-Aktivität auf eine erhöhte Lysin-Permease-Aktivität oder auf eine erhöhte Lysin/Cadaverin-Antiporter-Aktivität oder eine Kombination von beiden zurückzuführen ist.
Mikroorganismus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 beansprucht, wobei die erhöhte Lysin-Import-Aktivität zurückzuführen ist auf eine rekombinante Expression von a. mindestens einem Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80% mit SEQ ID NR.: 8 identisch ist und Lysin-Permease-Aktivität besitzt, oder b. mindestens einem Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80% mit SEQ ID NR.: 9 identisch ist und Lysin/Cadaverin-Antiporter-Aktivität besitzt, oder c. mindestens einem Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80% mit SEQ ID NR.: 8 identisch ist und Lysin-Permease-Aktivität besitzt, und mindestens einem Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80% mit SEQ ID NR.: 9 identisch ist und Lysin/Cadaverin-Antiporter-Aktivität besitzt.
Mikroorganismus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 beansprucht, mit einer hohen Lysin-Produktionskapazität.
Mikroorganismus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht, wobei der Mikroorganismus keine oder eine verringerte Acetylcadaverin bildende Aktivität besitzt.
Mikroorganismus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 beansprucht, wobei die Acetylcadaverin bildende Aktivität durch Verringern der Aktivität eines Acetylcadaverin bildenden Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens zu 80% mit SEQ ID NR.: 11 identisch ist, verringert wird.
Mikroorganismus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 11 beansprucht, wobei der Mikroorganismus keine oder eine verringerte Aminopropylcadaverin bildende Aktivität besitzt.
Mikroorganismus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 12 beansprucht, wobei die Aminopropylcadaverin bildende Aktivität durch Verringern der Aktivität eines Aminopropylcadaverin bildenden Polypeptids, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu mindestens 80% mit SEQ ID NR.: 12 identisch ist, verringert wird.
Mikroorganismus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 13 beansprucht, wobei der Mikroorganismus keine oder eine verringerte Homoserin-Dehydrogenase-Aktivität besitzt.
Mikroorganismus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht, wobei die Homoserin-Dehydrogenase-Aktivität durch Verringern der Aktivität eines Homoserin-Dehydrogenase-Polypeptids, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu mindestens 80% mit SEQ ID NR.: 13, 14 oder 15 identisch ist, verringert wird.
Mikroorganismus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 15 beansprucht, wobei der Mikroorganismus keine oder eine verringerte Lysin-Abbauaktivität besitzt.
Mikroorganismus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 16 beansprucht, wobei die Lysin-Abbauaktivität durch Verringern der Aktivität von mindestens einem Lysin-Hydroxylase-Polypeptid, welches eine Aminosäuresquenz umfasst, die zu mindestens 80% mit SEQ ID NR.: 16 identisch ist, verringert wird.
Mikroorganismus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 17 beansprucht, wobei der Mikroorganismus eine deregulierte Spermidin bildende oder -Aufnahme-Aktivität oder Putrescin bildende oder -Aufnahme-Aktivität oder beides besitzt.
Mikroorganismus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 18 beansprucht, wobei die Spermidin bildende oder -Aufnahme-Aktivität oder eine Putrescin bildende oder -Aufnahme-Aktivität verringert wird durch Verringern der Aktivität von a. mindestens einem Spermidin bildenden Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80% mit SEQ ID NR.: 12 identisch ist, oder b. mindestens einem Putrescin bildenden Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80% mit SEQ ID NR.: 17 identisch ist, oder c. mindestens einem Putrescin bildenden Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80% mit SEQ ID NR.: 18 identisch ist, oder d. mindestens einem Spermidin/Putrescin transportierenden Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80% mit SEQ ID NR.: 19 identisch ist, oder e. jeglicher Kombination von a, b, c oder d.
Mikroorganismus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 19 beansprucht, wobei der Mikroorganismus zu der Klade Eubacteria gehört.
Mikroorganismus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 20 beansprucht, wobei der Mikroorganismus zu der Gattung Corynebacterium oder Escherichia gehört.
Mikroorganismus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 21 beansprucht, wobei der Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum oder Escherichia coli ist.
Mikroorganismus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 22 beansprucht, wobei der Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum ist.
Cadaverin-Produktionssystem, umfassend einen Mikroorganismus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 23 beansprucht, und ein Kulturmedium, das zum Züchten des Mikroorganismus geeignet ist.
Cadaverin-Produktionssystem, wie in Anspruch 24 beansprucht, wobei das Kulturmedium Lysin umfasst.
Verfahren für die Produktion von Cadaverin, umfassend das Fermentieren eines Mikroorganismus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 23 beansprucht.
Verfahren, wie in Anspruch 26 beansprucht, wobei das Kulturmedium Lysin umfasst.
Verfahren, wie in Anspruch 26 oder Anspruch 27 beansprucht, wobei die Konzentration (mol/l) von Cadaverin im Kulturmedium a. mindestens 1,2-fach höher als die Konzentration (mol/l) von Acetylcadaverin ist, oder b. mindestens 1,2-fach höher als die Konzentration (mol/l) von Aminopropylcadaverin ist.
Verfahren, wie in einem der Ansprüche 26 bis 28 beansprucht, wobei die Konzentration (mol/l) von Cadaverin in dem Kulturmedium mindestens 1,2-fach höher als die Konzentration (mol/l) von Acetylcadaverin ist.
Kulturmedium, wobei die Konzentration (mol/l) von Cadaverin a. mindestens 1,2-fach höher als die Konzentration (mol/l) von Acetylcadaverin ist oder b. mindestens 1,2-fach höher als die Konzentration (mol/l) von Aminopropylcadaverin ist.
Kulturmedium, wie in Anspruch 30 beansprucht, wobei die Konzentration (mol/l) von Cadaverin mindestens 1,2-fach höher als die Konzentration (mol/l) von Acetylcadaverin ist.
Kulturmedium, umfassend mindestens 0,25 mol/l Cadaverin, aber umfassend a. nicht mehr als 0,1 mol/l Acetylcadaverin oder b. nicht mehr als 0,1 mol/l Aminopropylcadaverin.
Kulturmedium, umfassend mindestens 0,25 mol/l Cadaverin, aber umfassend nicht mehr als 0,1 mol/l Acetylcadaverin.
Verwendung eines Mikroorganismus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 23 beansprucht, oder eines Cadaverin-Produktionssystems, wie in einem der Ansprüche 24 bis 25 beansprucht, für die Produktion von Cadaverin.
Verwendung eines Mikroorganismus, wie in einem der Ansprüche 1 bis 23 beansprucht, oder eines Cadaverin-Produktionssystems, wie in einem der Ansprüche 24 bis 25 beansprucht, in einem Verfahren, wie in einem der Ansprüche 26 bis 29 beansprucht.
Verwendung eines Kulturmediums, wie in einem der Ansprüche 30 bis 33 beansprucht, zur Gewinnung von Cadaverin.
Verwendung eines Kulturmediums, hergestellt in einem Verfahren, wie es in einem der Ansprüche 26 bis 29 beansprucht ist, zur Reinigung von Cadaverin.