KR101231897B1 - 카다베린 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 카다베린의 제조방법 - Google Patents

카다베린 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 카다베린의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 카다베린 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 카다베린의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있는 카다베린 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 호기조건하에서 배양하여 퓨트레신을 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 카다베린 고생성능을 가지는 변이 미생물은 산업적으로 널리 사용되는 카다베린을 고수율로 제조하는데 유용하다.

Description

카다베린 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 카다베린의 제조방법 {Varient Microorganism Having Cadaverine Producing Ability and Method for Preparing Cadaverine Using the Same}
본 발명은 카다베린 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 카다베린의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있는 카다베린 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 호기조건하에서 배양하여 카다베린을 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.
1,5-diaminopentane으로 알려진 카다베린은 많은 산업적 응용에 있어서 중요한 기반 화학물질이다. 카다베린은 폴리아마이드나 폴리우레탄과 같은 고분자의 구성요소, 킬레이팅제 또는 다른 첨가제로 사용될 수 있다. 특히 폴리아마이드-5,4는 카다베린이나 숙신산의 중축합으로써 제조된다. 연간 350만 톤의 세계 시장을 가진 폴리아마이드-5,4는 전통적 석유기반의 폴리아마이드에서 바이오 기반 대체제로부터 생산될 것으로 기대된다(Mimitsuka et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 71:2130-2135, 2007;Kind et al., Met. Eng., 12:341-351, 2010). 이러한 카다베린 생산공정에는 재생산 가능한 바이오매스 기반 탄소공급원이 요구된다.
카다베린은 몇몇 미생물로부터 발견되는 폴리아민이다(Tabor and Tabor, Microbiol Rev., 49:81-99, 1985). 그람음성 박테리아인 대장균에서 카다베린은 L-라이신으로부터 L-라이신 탈탄산효소(decarboxylase)를 이용하여 직접 생합성된다(도 1). L-라이신 탈탄산효소는 유전자 ldcC로 코딩되어 계속적으로 발현되는 효소와 유전자 cadA로 코딩되어 낮은 pH에서만 발현이 유도되는 효소 2종류가 있다. 대장균 내의 카다베린 농도는 카다베린의 생합성과 분해, 흡수와 방출로써 조절된다(Soksawatmaekhin et al., Mol Microbiol., 51:1401-1412, 2004).
이러한 조절을 이유로 야생형 대장균 내에서 카다베린은 검출되지 않고, 단지 폴리아민의 생합성에 결함이 있는 돌연변이 균주 내에서 카다베린이 존재하는 것으로 보고되었다(Hafner et al., J. Biol. Chem., 254: 12419-12426, 1979). 비록 매우 적은 양의 카다베린이 미생물 내에 존재하는 것이 확인되었지만 미생물의 카다베린에 대한 내성은 더욱 높다. 예를 들어, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 비록 카다베린을 생합성 하지는 않지만 약 0.3M의 카다베린이 있는 환경에서 성장할 수 있다(Mimitsuka et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 71:2130-2135, 2007). 이러한 미생물의 카다베린에 대한 높은 내성은 대사공학적으로 산업적으로 이용 가능한 수준까지 카다베린을 과생산할 수 있는 가능성을 보여준다.
값싼 산업 폐기물 또는 단백질과 주요 구성요소를 포함한 원료를 사용한 발효를 통해 카다베린을 생산하는 방법에 관한 유럽 특허 No. 0726240 A1가 공개되었다. 그러나 공개된 원료가 매우 복잡하기 때문에 카다베린과 퓨트레신(putrescine)을 획득하기 위하여 여러 단계의 정제과정을 거쳐야 하는 문제가 있다. 또 재조합 미생물을 이용한 카다베린을 생화학적으로 생산하는 공정에 관한 특허 WO 2007/113127 A1가 공개되었다. 이 특허에 따르면, 라이신에서 카다베린으로 전환을 증가시키기 위해서 이러한 전환에 관여하는 유전자 ldcC로 코딩된 라이신 탈탄산효소를 과발현시킴으로써 라이신 탈탄산 효소의 활성을 증가시켰다. 그러나 이러한 경우 증가된 라이신 탈탄산효소의 결과로써 카다베린 양이 증가되었지만 동시에 카다베린의 분해가 유도된다는 문제점이 있었다.
미생물내에서의 카다베린 분해 및 이용 활성도에 대한 연구는 다음과 같다. Bowman 등은 대장균 내의 카다베린으로부터 아미노프로필 카다베린을 생합성하는 것을 증진시키는 유전자 speE의 생산물인 putrescine/cadaverine aminopropy ltransferase를 보고하였다(Bowman et al., J.Biol.Chem., 248:2480-2486, 1973).
Haywood 등은 효모인 Candida boidinii가 N-acetyltransferase에 의해 acetylates 퓨트레신을 N-acetylputrescine로 아세틸화시킨다고 보고하였다. 대장균에서 speG 유전자 산물인 spermidine acetyltransferase는 효모의 N-acetyltransferase와 상동성(homology)이 매우 높아서 카다베린 acetyltransferase를 소유하는 것으로 판단된다(Haywood and Large, Eur. J. Biochem., 148:277-283, 1985).
Samsonova 등은 대장균에서 γ-glutamylation 없이 YgjG putrescine/cadaverine aminotransferase와 YdcW 탈수소효소를 수반하는 다른 퓨트레신 생분해 경로를 보고했다(Samsonova etal., BMC Microbiol., 3:2, 2003; Samsonova et al., FEBS Lett., 579:4107-4112, 2005).
Kurihara 등은 퓨트레신 분해경로가 대장균 내의 γ-glutamylated metabolites와 밀접한 관련이 있다는 것을 기반으로 퓨트레신 분해경로를 "Puu catabolic pathway"라고 명명하였다. 이러한 경로는 카다베린 분해에도 관여하는 것으로 예상된다. 예를 들어, 이러한 경로에 처음으로 관여하는 효소인 유전자 puuA 가 코딩하고 있는 glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase는 카다베린을 γ-glutamyl-L- γ-glutamyl-L-cadaverine으로 전환할 수 있다. 게다가 유전자 puuP의 생산물인 퓨트레신 유입체(importer)는 이화경로(catabolic pathway)와 주요한 퓨트레신 유입체들과 관련있다(Kurihara et al., J. Biol. Chem., 280: 4602-4608, 2005). 이러한 퓨트레신 유입체는 카다베린이 퓨트레신과 구조적으로 유사하기 때문에 카다베린을 유입하는 것으로 생각할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 카다베린을 생산하는 미생물에서, 카다베린의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG), 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP), 및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 약화 또는 결실시킨 변이균주를 제조하고, 이를 배양한 결과, 카다베린을 고수율로 제조할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있고, 카다베린의 고생산능을 가지는 변이 미생물 및 상기 변이 미생물의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변이 미생물을 배양하여, 카다베린을 고수율로 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG), 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP), 및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG), 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP), 및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있고, 디하이드로디피콜리네이트 합성 효소(dihydrodipicolinate synthase)를 코딩하는 유전자(dapA), 디아미노피멜레이트 디카르복실라아제(diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(lysA) 및 디하이드로디피콜리네이트 환원 효소(dihydrodipicolinate reductase)를 코딩하는 유전자(dapB)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 native promoter가 strong promoter로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG), 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP), 및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)가 약화 또는 결실되어 있고, lac 오페론 억제인자를 코딩하는 유전자(lacI)가 결실되어 있으며, 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 카다베린(cadaverine) 생성 대사경로를 가지는 미생물에서, 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG), 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP), 및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 약화 또는 결실시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 카다베린(cadaverine) 생성 대사경로를 가지는 미생물에서, 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG), 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP), 및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 약화 또는 결실시킨 다음, 상기 카다베린(cadaverine) 생성 대사경로를 가지는 미생물에 존재하는 디하이드로디피콜리네이트 합성 효소(dihydrodipicolinate synthase)를 코딩하는 유전자(dapA), 디아미노피멜레이트 디카르복실라아제(diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(lysA) 및 디하이드로디피콜리네이트 환원 효소(dihydrodipicolinate reductase)를 코딩하는 유전자(dapB)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 native promoter를 strong promoter로 치환시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 카다베린(cadaverine) 생성 대사경로를 가지는 미생물에서, 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG), 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP), 및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)를 약화 또는 결실시키고, lac 오페론 억제인자를 코딩하는 유전자(lacI)를 결실시킨 다음, 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)를 도입 또는 증폭시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 변이 미생물을 배양하여 카다베린을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 카다베린을 회수하는 것을 특징으로 하는 카다베린의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물을 제조하고, 이를 이용함으로써, 산업적으로 널리 사용되는 카다베린을 고수율로 제조하는데 유용하다.
도 1은 포도당으로부터 카다베린의 합성경로를 나타내는 모식도이다.
도2는 WL3110/p15CadA (채워진 직사각형), XQ27/ p15CadA(빈 직사각형), XQ56/ p15CadA (채워진 삼각형), XQ59/p15CadA(빈 삼각형) 및 XQ60/p15CadA (채워진 원) 균주로부터 포도당을 이용한 유가식 발효에서 카다베린의 생산을 나타낸 그래프이다.
도 3은 XQ56/p15CadA 균주로부터 포도당을 이용한 유가식 발효에서 세포질량 (채워진 직사각형) 및 카다베린 (빈 직사각형)의 생산을 나타낸 그래프이다.
본 발명에서 "약화"란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나 일부 염기를 도입시켜 해당유전자에 의해 발현되는 효소의 활성을 감소시키는 것을 포괄하는 개념으로, 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성경로의 일부 또는 상당부분을 차단하는 모든 것을 포함한다.
본 발명에서 '결실'이란 해당 유전자의 일부 또는 전체 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시켜 해당유전자가 발현되지 않도록 하거나 발현되더라도 효소활성을 나타내지 못하도록 하는 것을 포괄하는 개념으로, 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성경로를 차단하는 모든 것을 포함한다.
본 발명에서 "증폭"이란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시키거나, 또는 동일한 효소를 코딩하는 다른 미생물 유래의 유전자를 도입시켜 대응하는 효소의 활성을 증가시키는 것을 포괄하는 개념이다.
도 1은 포도당으로부터 카다베린의 합성경로를 나타내는 모식도이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명에서는 카다베린 생성능을 가지는 미생물에서, 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자(speE, speG, ygjG, puuP, puuA)를 약화 또는 결실시키면 카다베린을 고수율로 제조할 수 있음을 확인하고자 하였다. 상기 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자(speE, speG, ygjG, puuP, puuA)의 감소된 활성도는 각각의 야생형 수준과 비교하여 감소된 전사적, 번역적 효율에 의하여 확인할 수 있었다.
본 발명의 일 실시예에서는 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG), 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP), 및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 결실시킨 변이 미생물을 제조하고, 제조된 변이 미생물의 카다베린 생성능이 향상되었음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG), 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP), 및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 변이 미생물은 또한, 카다베린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 lac 오페론 억제인자를 코딩하는 유전자(lacI)가 추가로 결실될 수 있다. 상기 카다베린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 dapA, dapB, dapD, dapC, dapE, dapF, lysA 등을 예시할 수 있다.
본 발명에서, 상기 변이 미생물은 또한, 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)가 추가로 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입하는 것을 특징으로 하며, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서, 상기 미생물은 글루코즈로부터 카다베린을 생성하는 미생물이면 제한없이 사용할 수 있으며, 바실러스 속(Bacillus sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 피치아 속(Pichia sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.) 등을 예시할 수 있다.
본 발명에서는 또한, 카다베린의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자가 결실되어 있는 변이 미생물에서, 디하이드로디피콜리네이트 합성 효소(dihydrodipicolinate synthase)를 코딩하는 유전자(dapA), 디아미노피멜레이트 디카르복실라아제(diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(lysA) 및 디하이드로디피콜리네이트 환원 효소(dihydrodipicolinate reductase)를 코딩하는 유전자(dapB)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 native promoter가 strong promoter로 치환시키면 카다베린을 더욱 고수율로 제조할 수 있음을 확인하고자 하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자(speE, speG, ygjG, puuP, puuA) 및 lac operon repressor를 코딩하는 유전자(lacI)가 결실된 변이 미생물에서, 디하이드로디피콜리네이트 합성 효소(dihydrodipicolinate synthase)를 코딩하는 유전자(dapA)의 프로모터를 strong promoter인 trc로 치환시킨 변이 미생물(XQ56)을 제조하고, XQ56의 디아미노피멜레이트 디카르복실라아제(diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(lysA)의 프로모터를 strong promoter인 trc로 치환시킨 변이 미생물(XQ59)을 제조한 후, XQ59의 디하이드로디피콜리네이트 환원 효소(dihydrodipicolinate reductase)를 코딩하는 유전자(dapB)의 프로모터를 strong promoter인 trc로 치환시킨 변이 미생물(XQ60)을 제조하였다, 그리고, 이들 변이 미생물에 p15CadA vector를 도입시켜 XQ56/p15CadA, XQ59/p15CadA, XQ60/p15CadA을 제조한 후, 배양함으로써 변이 미생물의 카다베린 생성능이 급격히 증가됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른관점에서, 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG), 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP), 및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있고, 디하이드로디피콜리네이트 합성 효소(dihydrodipicolinate synthase)를 코딩하는 유전자(dapA), 디아미노피멜레이트 디카르복실라아제(diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(lysA) 및 디하이드로디피콜리네이트 환원 효소(dihydrodipicolinate reductase)를 코딩하는 유전자(dapB)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 native promoter가 strong promoter로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
상기 디하이드로디피콜리네이트 합성 효소(dihydrodipicolinate synthase)를 코딩하는 유전자(dapA)의 프로모터는 세포내 DAP 혹은 전구체인 L,L-diaminopimelate에 의해서 억제되기 때문에, dapA 유전자의 promoter를 strong promoter로 치환시키면 lysine에 대한 대사 플럭스를 증가시킬 수 있다. 그리고, 디아미노피멜레이트 디카르복실라아제(diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(lysA)의 프로모터는 lysine에 의해서 억제되기 때문에, 이를 lysA 유전자의 promoter를 strong promoter로 치환시키면 카다베린으로의 흐름을 강화시킬 수 있으며, 디하이드로디피콜리네이트 환원 효소(dihydrodipicolinate reductase)를 코딩하는 유전자(dapB)의 프로모터는 lysine에 의해서 억제되기 때문에, dapB 유전자의 promoter를 strong promoter로 치환시키면 카다베린으로의 흐름을 강화시킬 수 있다.
상기 변이 미생물은 앞서 설명한 바와 같이, 카다베린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 lac 오페론 억제인자를 코딩하는 유전자(lacI)가 추가로 결실될 수 있으며, 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)가 추가로 도입 또는 증폭될 수 있다.
상기 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입하는 것을 특징으로 하며, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에 있어서, 상기 변이 미생물을 배양하여 카다베린을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 카다베린을 회수하는 것을 특징으로 하는 퓨트레신의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 변이 미생물의 배양 및 카다베린의 수득 과정은 종래 발효공정에서 통상적으로 알려진 배양방법(회분식 배양, 유가식 배양) 및 카다베린의 분리 및 정제방법을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 카다베린의 생물공학적 생산은 세포 내 혹은 세포 외(in vivo or in vitro)에서 수행될 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
특히, 하기 실시예에서는 본 발명에 따른 유전자를 제거하기 위하여 특정 벡터와 숙주세포로 카다베린 생성 미생물인 에스케리치아 속(Escherichia sp.) 미생물만을 예시하였으나, 다른 종류의 벡터와 카다베린 생성 미생물들을 사용하는 것 역시 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
실시예 1: 카다베린 분해 또는 이용 경로에 관여하는 유전자가 결실된 변이 균주의 제조 방법
본 발명에서 염색체 상의 일련의 유전자들(speE, speG, ygjG, puuA, puuP)의 결실은 이중 교차 상동 재조합 방법에 의해서 수행되었다(Datsenko, K. A., & Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci., 97:6640-6645, 2000). lox71-chloramphenicol marker (CmR)-lox66 카세트는 타겟 유전자의 상단서열(upstream)과 하단서열(downstream)과 상동하는 50개의 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머들을 사용하여 PCR을 통해 제조하였다. 이때 lox71-CmR-lox66 카세트를 포함하는 pECmulox(Kim, J.M., Lee, K.H. & Lee, S.Y., FEMS Microbiol. Lett., 278: 78-85, 2008)를 PCR의 주형으로 사용하였다.
상기 PCR 산물들은 λ recombinase를 포함하는 전기충격용 대장균 세포(electrocompetent cells)에 트랜스포메이션시켰다. 콜로니들은 클로로암페니콜(Cm; 34μg/ml)을 포함하는 Luria-Bertani (LB) agar (Sambrook, J., Fritsch E. F., & Maniatis, T., Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000) 플레이트에서 선택되었다. CmR 의 성공적인 유전자 대체는 direct colony PCR에 의해서 확인되었다. 상기 항생제 마커는 차후에 temperature-sensitive replication origin과 IPTG-inducible cre recombinase (Palmeros et al., Gene, 247:255-264, 2000)를 포함하는 helper plasmid pJW168(Lucigen Corporation, Middleton,WI, USA)에 의해 제거되었다.
참고로, pECmulox는 서열번호 1 및 2의 프라이머, 주형으로써 플라스미드인 pACYC184 (New England Biolabs, Ipswich, MA,USA)를 사용하여 PCR을 수행하고, 상기 PCR 산물을 HindIII와 SmaI 제한효소로 처리한 후, HindIII와 EcoRV으로 절단한 pUG6 (Guldener, U et al. NucleicAcidsRes., 24:2519~2524, 1996) 플라스미드와 라이게이션하여 제조하였다.
[서열번호 1] : 5'-ATATAAGCTTTACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTGCCCTGAA CCGACGACCG-3'
[서열번호 2] : 5'-AATTCCCGGGTACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCATCACCC GACGCACTTTGC-3'
1-1: WL3110 균주의 제조
서열번호 3 및 4의 프라이머, 주형으로써 플라스미드인 pECmulox를 사용하여 PCR을 수행함으로써, lacI 유전자가 결실된 PCR 산물을 제조하였다. 다음으로, 제조된 PCR 산물을 정제한 후, λ recombinase를 함유하는 전기충격용 대장균(W3110)에 electroporation하여 WL3110(W3110 ΔlacI)를 제조하였다.
[서열번호 3] : 5'-GTGAAACCAGTAACGTTATACGATRTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTAGATT GGCAGCATTACACGTCTTG-3'
[서열번호 4] : 5'-TCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGCACT TAACGGCTGACATGGG-3'
1-2: XQ08 균주의 제조
서열번호 5 및 6의 프라이머, 주형으로써 플라스미드인 pECmulox를 사용하여 PCR을 수행함으로써, speE 유전자가 결실된 PCR 산물을 제조하였다. 다음으로, 제조된 PCR 산물을 정제한 후, 상기 1-1에서 제조된 WL3110 균주에 electroporation하여 XQ08 균주(W3110 ΔlacIΔspeE)를 제조하였다.
[서열번호 5]: 5'-CGCCTGAATAATTTCGGTTGAGAGATGGCGTAAGGCGTCGTTATCTGTCGGAC ACTATAGAACGCGGCCG-3'
[서열번호 6]: 5'-ATGTTGCGCCCTTTTTTTACGGGTGTTAACAAAGGAGGTATCAACCCATGCCG CATAGGCCACTAGTGGA-3'
1-3: XQ11 균주의 제조
서열번호 7 및 8의 프라이머, 주형으로써 플라스미드인 pECmulox를 사용하여 PCR을 수행함으로써, speG 유전자가 결실된 PCR 산물을 제조하였다. 다음으로, 제조된 PCR 산물을 정제한 후, 상기 1-2에서 제조된 XQ08 균주에 electroporation하여 XQ11 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG)를 제조하였다.
[서열번호 7]: 5'-GAATGTAAGGACACGTTATGCCAAGCGCCCACAGTGTTAAGCTACGCCCGGAC ACTATAGAACGCGGCCG-3'
[서열번호 8]: 5'-CTATTGTGCGGTCGGCTTCAGGAGAGTCTGACCCGGTGTTTTGTGCTCTGCCG CATAGGCCACTAGTGGA-3'
1-4: XQ21 균주의 제조
서열번호 9 및 10의 프라이머, 주형으로써 플라스미드인 pECmulox를 사용하여 PCR을 수행함으로써, ygjG 유전자가 결실된 PCR 산물을 제조하였다. 다음으로, 제조된 PCR 산물을 정제한 후, 상기 1-3에서 제조된 XQ11 균주에 electroporation하여 XQ21 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeGΔygjG)를 제조하였다.
[서열번호 9]: 5'-CTGCAATACTTAAATCGGTATCATGTGATACGCGAGCCTCCGGAGCATATGACA CTATAGAACGCGGCCG-3'
[서열번호 10]: 5'-CGTCGTATCGCCATCCGATTTGATATTACGCTTCTTCGACACTTACTCGCCCG CATAGGCCACTAGTGGA-3'
1-5: XQ27 균주 생성
서열번호 11 및 12의 프라이머, 주형으로써 플라스미드 pECmulox를 사용하여 PCR을 수행함으로써, puuA 유전자가 결실된 PCR 산물을 제조하고, 서열번호 12 및 13의 프라이머, 주형으로써 플라스미드 pECmulox를 사용하여 PCR을 수행함으로써, puuP 유전자가 결실된 PCR 산물을 제조하였다. 다음으로, 제조된 PCR 산물을 각각 정제한 후, 상기 1-4에서 제조된 XQ21 균주에 순차적으로 electroporation하여 XQ27 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeGΔygjGΔpuuPΔpuuA)를 제조하였다.
[서열번호 11]: 5'-GATGAAACAACCCCGCAAGGGGTATTACGCGTTTTTCAACATCCACTCAAGAC ACTATAGAACGCGGCCG-3'
[서열번호 12]: 5'-CGAGCGGAAAACAAACCAAAGGCGAAGAATCATGGAAACCAATATCGTTGCC GCATAGGCCACTAGTGGA-3'
[서열번호 13]: 5'-TCACCATCATACAACGGCACTTTGCGATAGCGGCGGATCAGATACCATAAGAC ACTATAGAACGCGGCCG-3'
실시예 2: 프로모터의 치환
카다베린의 생성능을 향상시기키 위하여, 상기 1-5에서 제조된 변이 균주(XQ27)의 프로모터를 strong promoter인 trc promoter로 치환시켰다.
2-1: XQ56 균주의 생성
디하이드로디피콜리네이트 합성 효소(dihydrodipicolinate synthase)를 코딩하는 유전자(dapA) 오페론의 야생형 프로모터(native promoter)에 대한 trc 프로모터로의 교환은 하기의 내용에 따라 수행하였다.
융합된 lox71-클로로암페니콜 항생제 마커-lox66 DNA 절편은 주형으로 pECmulox, 프라이머로 서열번호 14 및 15를 사용하여 첫 번째 PCR을 통해 획득하였다.
[서열번호 14]: 5'-GGTGAGTTGTTCTTAAGGAAAGCATAAAAAAAACATGCATACAACAATCAGA ACGGGACACTATAGAACGCGGCCG-3'
[서열번호 15]: 5'-TATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAC AGCTCCGCATAGGCCACTAGTGGA-3'
trc 프로모터를 도입하기 위하여, 첫번째 PCR산물을 주형으로서 사용하고, 서열번호 16 및 17의 프라이머를 사용하여 두번째 PCR 반응을 수행하였다.
[서열번호 16]: 5'-TCACCAGATAATGTTGCGATGACAGTGTCAAACTGGTTATTCCTTTAAGGGG TGAGTTGTTCTTAAGGAAAG-3'
[서열번호 17]: 5'-GTAACAATCGCGACAATACTTCCCGTGAACATGGTCTGTTTCCTGTGTGAAA TTGTTATCCGCTCACAATTCCACA-3'
최종 PCR 산물을 XQ27 균주 (W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔygjG ΔpuuP ΔpuuA)에 electroporation한 다음 제조된 균주를 클로로암페니콜(chloroamphenicol)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 이중 상동성 재조합(double homologous recombination)이 진행된 세포만을 스크리닝하여 XQ56 균주 (W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔygjG ΔpuuP ΔpuuA PdapA::Ptrc)를 획득하였다. trc 프로모터로의 프로모터 교환은 DNA 서열 분석으로 확인하였다.
2-2: XQ59 균주의 생성
디아미노피멜레이트 디카르복실라아제(diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(lysA) 오페론의 야생형 프로모터(native promoter)에 대한 trc promoter로의 교환은 하기 방식에 따라 수행하였다.
첫 번째 PCR 반응은 주형으로써 플라스미드인 pECmulox와 상기의 서열번호 15와 하기의 서열번호 18 프라이머를 사용하여 수행하였다.
[서열번호 18]: 5'-TAAGTTAACGGCGGCCATTAGCGCTCTCTCGCAATCCGGTAATCCATATCAT TGACACTATAGAACGCGGCCG-3'
두 번째 PCR 반응은 상기 첫 번째 PCR 산물을 주형으로 하고, 하기 서열번호 19 및 20의 프라이머를 사용하여 수행하였다.
[서열번호 19]: 5'-CTCAGTCAGGCTTCCGGCGGTCATTACCGCATGAAAAATTTCAATATGACGTA AGTTAACGGCGGCCATTA-3'
[서열번호 20]: 5'-GATCGGTATCGGTGCTGAACAGTGAATGTGGCATGGTCTGTTTCCTGTGTGAA ATTGTTATCCGCTCACAATTCCACA-3'
최종 PCR 산물을 2-1에서 제조한 XQ56 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔygjG ΔpuuP ΔpuuA PdapA::Ptrc)에 electroporation한 다음 제조된 균주를 클로로암페니콜(chloroamphenicol)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 이중 상동성 재조합(double homologous recombination)이 진행된 세포만을 스크리닝하여 XQ59 균주 (W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔygjG ΔpuuP ΔpuuA PdapA::Ptrc PlysA::Ptrc)를 획득하였다. trc 프로모터로의 프로모터 교환은 DNA 서열 분석으로 확인하였다.
2-3: XQ60 균주의 생성
디하이드로디피콜리네이트 환원 효소(dihydrodipicolinate reductase)를 코딩하는 유전자(dapB) 오페론의 야생형 프로모터(native promoter)에 대한 trc promoter로의 교환은 하기 방식에 따라 수행하였다.
첫 번째 PCR 반응은 주형으로써 플라스미드인 pECmulox와 상기의 서열번호 15와 하기의 서열번호 21 프라이머를 사용하여 수행하였다.
[서열번호 21]: 5'-GTCATTCATCGACTCATGCCTTTCACTGATATCCCTCCCTGTTTGACACTAT AGAACGCGGCCG-3'
두 번째 PCR 반응은 상기 첫 번째 PCR 산물을 주형으로 하고, 하기 서열번호 22 및 23의 프라이머를 사용하여 수행하였다.
[서열번호 22]: 5'-TGGCTCTGGCGTCGTAACCTGTCACATGTTATTGGCATGCAGTCATTCATCG ACTCATGCC-3'
[서열번호 23]: 5'-GGCAACGCGGATGTTTGCATCATGCATGGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTT ATCCGCTCACAATTCCACA-3'
세 번째 PCR 반응은 상기 두 번째 PCR 산물을 주형으로 하고, 하기 서열번호 24 및 25의 프라이머를 사용하여 수행하였다.
[서열번호 24]: 5'-GATGTGAAAGGCTTCCAGCAGTGGGTGGCTGAGGTGCTGGCTCTGGCGTCGT AACCT-3'
[서열번호 25]: 5'-TGAATCAACTGGCGGCCCATACGCCCCCCGGCTCCCGCGATGGCAACGCGGA TGTTTGCAT-3'
최종 PCR 산물을 2-2에서 제조한 XQ59 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔygjG ΔpuuP ΔpuuA PdapA::Ptrc PlysA::Ptrc)에 electroporation한 다음 제조된 균주를 클로로암페니콜(chloroamphenicol)이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하면서 이중 상동성 재조합(double homologous recombination)이 진행된 세포만을 스크리닝하여 XQ60 균주(W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔygjG ΔpuuP ΔpuuA PdapA::Ptrc PlysA::Ptrc PdapB::Ptrc)를 획득하였다. trc 프로모터로의 프로모터 교환은 DNA 서열 분석으로 확인하였다.
실시예 3: cadA 유전자가 도입된 균주의 제조
3-1: p15CadA plasmid 제조
라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)를 증폭하기 위해 E. coli W3110 (E.coli K-12에서 파생, λ-, F-, prototrophic)의 genomic DNA를 주형으로 하고, 하기 서열번호 26 및 27의 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였다.
[서열번호 26]: 5'- CGTCGAATTCATGAACGTTATTGCAATATTG-3'
[서열번호 27]: 5'- GCTCGAGCTCTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTC-3'
다음으로, pTac15K를 EcoRI으로 자르고 Mung Bean Nuclease를 처리한 후에, 이를 다시 SacI으로 잘라 4.0kb의 DNA 단편을 얻었다. 이 단편을 상기의 PCR 산물(2,168bp)을 SacI으로 자른 것과 결합시킨 후에 E. coli TOP 10 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 도입시키고 클로닝하여 p15CadA 플라스미드를 제조하였다.
참고로, pTac15K는 p15A origin과 tac 프로모터, 카나마이신 저항성 유전자를 갖고 있는 플라스미드로서, 다음의 과정을 통하여 제작할 수 있다. 먼저, 플라스미드 pKK223-3 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)를 SphI으로 절단한 후, Klenow 효소 (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)를 처리하고, 다시 EcoRI으로 상기의 효소처리 산물을 절단하여 0.4kb 크기의 DNA 절편을 얻었다. 그다음, 플라스미드 pHNC15K를 NheI으로 절단한 이후, Klenow 효소와 다시 EcoRI을 순차적으로 처리하여 3.5kb 크기의 DNA 절편을 얻었다. 다음으로 이 두 DNA 절편을 라이게이션하여, 플라스미드 pTac15K를 제조하였다. pHNC15K는 pTac15K의 제조방법과 유사한 방법을 통하여, pACYC177 (New England Biolabs, Ipswich, MA,USA), pHCE IIB (TaKaRa Korea Biomedical, Seoul,Korea), pUC4K (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)의 DNA 절편들로부터 만들어진 것이다.
p15CadA는 lacI가 결실된 E. coli에서 강한 tac promoter를 이용해 cadA gene을 constitutive하게 발현시킬 수 있다.
3-2: WL3110/p15CadA 균주 제조
3-1에서 제조된 p15CadA plasmid를 1-1에서 제조한 WL3110 균주에 electroporation하여 WL3110/p15CadA 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 kanamycin이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하여 transformation이 이루어졌는지 유무를 확인하였다.
3-3: XQ27/p15CadA 균주의 제조
3-1에서 제조된 p15CadA plasmid를 1-5에서 제조한 XQ27 균주에 electroporation하여 XQ27/p15CadA 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 kanamycin이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하여 transformation이 이루어졌는지 유무를 확인하였다.
3-4: XQ56/p15CadA 균주의 제조
3-1에서 제조된 p15CadA plasmid를 2-1에서 제조한 XQ56 균주에 electroporation하여 XQ56/p15CadA 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 kanamycin이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하여 transformation이 이루어졌는지 유무를 확인하였다.
3-5: XQ59/p15CadA 균주의 제조
3-1에서 제조된 p15CadA plasmid를 2-2에서 제조한 XQ59 균주에 electroporation하여 XQ59/p15CadA 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 kanamycin이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하여 transformation이 이루어졌는지 유무를 확인하였다.
3-6: XQ60/p15CadA 균주의 제조
3-1에서 제조된 p15CadA plasmid를 2-3에서 제조한 XQ60 균주에 electroporation하여 XQ60/p15CadA 균주를 제조하였다. 다음으로 제조된 균주를 kanamycin이 포함된 아가(agar)고체 배지에서 배양하여 transformation이 이루어졌는지 유무를 확인하였다.
실시예 4: 변이 미생물을 이용한 카다베린 생산
cadaverine 분해와 이용의 활성은 decarboxylase의 활성과 함께 회분식(batch) 배양을 이용하여 측정하였다.
회분식 배양은 6.6L 발효기 (Bioflo 3000; New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)를 이용하였고, 최소배지인 R/2 배지 2L에 글루코오스 10g /L, (NH4)2SO4 3g/L를 첨가하였다. R/2 배지는 (NH4)2HPO4 2g/L, KH2PO4 6.75g/L, citric acid 0.85g/L, MgSO4·7H2O 0.7g/L, 및 0.5% (v/v) trace metal solution (Qian et al., Biotechnol. and Bioeng, 101(3): 587-601, 2008)을 포함한다. Trace metal solution은 1리터당 5M HCl: 10g FeSO4·7H2O, 2.25g ZnSO4·7H2O, 1g CuSO4·5H2O, 0.5g MnSO4·5H2O, 0.23g Na2B4O7·10H2O, 2g CaCl2·2H2O, 및 0.1g (NH4)6Mo7O24을 포함한다.
LB 배지에서 활성화된 100μL 변이 균주(WL3110/pL15CadA 균주, XQ27/p15CadA 균주, XQ56/p15CadA 균주)들을 예비 최소배지로 접종시킨 후, 37℃, 220rpm으로 24시간동안 배양하였다. 그 후, 이들 중 1ml을 동일한 배지 50mL을 포함하는 350-mL baffled flask에 첨가한 후, 37℃, 220rpm으로 14시간 동안 배양하였다. 전 배양액중 200ml은 발효의 접종원으로 사용하고, 발효시 용존산소는 교반속도를 자동적으로 조절함으로써 포화공기 20%로 유지하였고, 6M의 KOH를 이용하여 pH를 6.80로 유지시켰다. 배양액은 샘플링 한 후, 원심분리기를 이용하여 세포를 분리한 후에, 해리된 상등액을 HPLC로 분석하였다. 상등액에 포함된 cadaverine은 C18-reverse phase column이 장착된 휴렛페커드 1100 시리즈 장비(230nm 영역)에서 ophthaldialdehyde(OPA) 유도체로 검출하였다. 이때, 이동상으로는 solvent A (0.1 M의 sodium acetate의 55% methanol)와 solvent B (methanol)를 이용하였다.
분석은 다음의 조건(1-6분: 100% buffer A equilibration, 6-10분: buffer B의 0-30% linear gradient, 10-15분: buffer B의 30-50% gradient, 15-19분 buffer B의 50-100% gradient, 19-23분 buffer B의 100%까지 gradient, 23-25분: buffer B의 100-30% gradient, 25-28분 buffer B의 30%에서 buffer A의 100%까지 0.8ml/min의 흐름 속도 gradient)에서 수행되었다. 이때, 보정을 위하여 표준물질을 사용하였으며, 측정된 카다베린의 농도는 도 2에 나타내었다.
도 2에 도시된 바와 같이, WL3110/pL15CadA 균주는 0.79g/l, Cadaverine의 분해 및 이용 대사경로를 결실시킨 XQ27/p15CadA 균주는 1.19g/l, 디하이드로디피콜리네이트 합성 효소(dihydrodipicolinate synthase)를 코딩하는 유전자(dapA)가 과발현된 XQ56/p15CadA 균주는 1.31g/l의 cadaverine을 생성하였음을 확인할 수 있었다. 또한, 디아미노피멜레이트 디카르복실라아제(diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(lysA) 및 디하이드로디피콜리네이트 환원 효소(dihydrodipicolinate reductase)를 코딩하는 유전자(dapB)가 과발현된 경우에도 cadaverine의 생성량은 비슷한 수준을 보였다.
실시예 5: XQ56/p15CadA 균주의 유가 배양을 통한 카다베린의 생산
실시예 4의 6.6L 발효기에서 XQ56/p15CadA 균주의 유가(fed batch) 배양을 수행하였다. 종균배양(Seed culture)은 실시예 4에 기재한 바와 같이, 약 14시간 동안 220rpm, 37℃에서 50 ml의 R/2 배지를 포함하는 350 mL baffled flask에서 수행하였다. 전 배양액중 200ml은 발효의 접종원으로 사용하고, 발효시 용존산소는 교반속도를 자동적으로 조절함으로써 포화공기 20%로 유지하였다.
글루코오스 소진에 따라 배양액의 pH가 6.8로 고정된 값보다 약 0.01 증가했을 때, 글루코오스 농도를 3g/L 이상으로 증가시키기 위해 공급 용액은 자동적으로 추가되었다. 또한 공급용액은 577g/L의 글루코오스, 8g/L의 MgSO4, 115g/L의 (NH4)2SO4를 포함한다. 글루코오스의 소진에 따른 pH 증가의 짧은시간을 제외하면 대부분 10M KOH를 추가함으로써 pH를 6.8로 유지시켰다. 샘플을 채취하고, 원심분리를 사용하여 세포를 분리한 후에 해리된 상등액을 실시예 4와 동일한 방법으로 HPLC 분석하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, XQ56/p15CadA 균주는 접종 30시간 후, 9.61g/l의 카다베린을 생산하였고, 이때 카다베린의 생산성은 0.32 g L-1h-1이다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Varient Microorganism Having Cadaverine Producing Ability and Method for Preparing Cadaverine Using the Same <160> 27 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 1 atataagctt taccgttcgt atagcataca ttatacgaag ttattgccct gaaccgacga 60 ccg 63 <210> 2 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 2 aattcccggg taccgttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatcatcac ccgacgcact 60 ttgc 64 <210> 3 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 <400> 3 gtgaaaccag taacgttata cgatrtcgca gagtatgccg gtgtctctta gattggcagc 60 attacacgtc ttg 73 <210> 4 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 <400> 4 tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg cacttaacgg 60 ctgacatggg 70 <210> 5 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 5 <400> 5 cgcctgaata atttcggttg agagatggcg taaggcgtcg ttatctgtcg gacactatag 60 aacgcggccg 70 <210> 6 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 6 <400> 6 atgttgcgcc ctttttttac gggtgttaac aaaggaggta tcaacccatg ccgcataggc 60 cactagtgga 70 <210> 7 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 7 <400> 7 gaatgtaagg acacgttatg ccaagcgccc acagtgttaa gctacgcccg gacactatag 60 aacgcggccg 70 <210> 8 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 8 <400> 8 ctattgtgcg gtcggcttca ggagagtctg acccggtgtt ttgtgctctg ccgcataggc 60 cactagtgga 70 <210> 9 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 9 <400> 9 ctgcaatact taaatcggta tcatgtgata cgcgagcctc cggagcatat gacactatag 60 aacgcggccg 70 <210> 10 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 10 <400> 10 cgtcgtatcg ccatccgatt tgatattacg cttcttcgac acttactcgc ccgcataggc 60 cactagtgga 70 <210> 11 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 11 <400> 11 gatgaaacaa ccccgcaagg ggtattacgc gtttttcaac atccactcaa gacactatag 60 aacgcggccg 70 <210> 12 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 12 <400> 12 cgagcggaaa acaaaccaaa ggcgaagaat catggaaacc aatatcgttg ccgcataggc 60 cactagtgga 70 <210> 13 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 13 <400> 13 tcaccatcat acaacggcac tttgcgatag cggcggatca gataccataa gacactatag 60 aacgcggccg 70 <210> 14 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 14 <400> 14 ggtgagttgt tcttaaggaa agcataaaaa aaacatgcat acaacaatca gaacgggaca 60 ctatagaacg cggccg 76 <210> 15 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 15 <400> 15 tatccgctca caattccaca cattatacga gccggatgat taattgtcaa cagctccgca 60 taggccacta gtgga 75 <210> 16 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 16 <400> 16 tcaccagata atgttgcgat gacagtgtca aactggttat tcctttaagg ggtgagttgt 60 tcttaaggaa ag 72 <210> 17 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 17 <400> 17 gtaacaatcg cgacaatact tcccgtgaac atggtctgtt tcctgtgtga aattgttatc 60 cgctcacaat tccaca 76 <210> 18 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 18 <400> 18 taagttaacg gcggccatta gcgctctctc gcaatccggt aatccatatc attgacacta 60 tagaacgcgg ccg 73 <210> 19 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 19 <400> 19 ctcagtcagg cttccggcgg tcattaccgc atgaaaaatt tcaatatgac gtaagttaac 60 ggcggccatt a 71 <210> 20 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 20 <400> 20 gatcggtatc ggtgctgaac agtgaatgtg gcatggtctg tttcctgtgt gaaattgtta 60 tccgctcaca attccaca 78 <210> 21 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 21 <400> 21 gtcattcatc gactcatgcc tttcactgat atccctccct gtttgacact atagaacgcg 60 gccg 64 <210> 22 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 22 <400> 22 tggctctggc gtcgtaacct gtcacatgtt attggcatgc agtcattcat cgactcatgc 60 c 61 <210> 23 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 23 <400> 23 ggcaacgcgg atgtttgcat catgcatggt ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc 60 acaattccac a 71 <210> 24 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 24 <400> 24 gatgtgaaag gcttccagca gtgggtggct gaggtgctgg ctctggcgtc gtaacct 57 <210> 25 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 25 <400> 25 tgaatcaact ggcggcccat acgccccccg gctcccgcga tggcaacgcg gatgtttgca 60 t 61 <210> 26 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 26 <400> 26 cgtcgaattc atgaacgtta ttgcaatatt g 31 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 27 <400> 27 gctcgagctc ttattttttg ctttcttctt tc 32

Claims (35)

  1. 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG), 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP), 및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있고, 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 카다베린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 lac 오페론 억제인자를 코딩하는 유전자(lacI)가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입된 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속(Bacillus sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 피치아 속(Pichia sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 및 사카로마이세스 속( Saccharomyces sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  7. 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG), 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP), 및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있고, 디하이드로디피콜리네이트 합성효소(dihydrodipicolinate synthase)를 코딩하는 유전자(dapA), 디아미노피멜레이트 디카르복실라아제(diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(lysA) 및 디하이드로디피콜리네이트 환원 효소(dihydrodipicolinate reductase)를 코딩하는 유전자(dapB)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 native promoter가 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 strong promoter로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  8. 제7항에 있어서, 카다베린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 lac 오페론 억제인자를 코딩하는 유전자(lacI)가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  9. 제7항에 있어서, 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)가 추가로 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입된 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  11. 삭제
  12. 제7항에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속(Bacillus sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 피치아 속(Pichia sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 및 사카로마이세스 속( Saccharomyces sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  13. 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG), 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP), 및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)가 약화 또는 결실되어 있고, lac 오페론 억제인자를 코딩하는 유전자(lacI)가 결실되어 있으며, 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입된 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  15. 제13항에 있어서, 디하이드로디피콜리네이트 합성 효소(dihydrodipicolinate synthase)를 코딩하는 유전자(dapA), 디아미노피멜레이트 디카르복실라아제(diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(lysA) 및 디하이드로디피콜리네이트 환원 효소(dihydrodipicolinate reductase)를 코딩하는 유전자(dapB)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 native promoter가 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 strong promoter로 추가로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  16. 삭제
  17. 제13항에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속(Bacillus sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 피치아 속(Pichia sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 및 사카로마이세스 속( Saccharomyces sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물.
  18. 카다베린(cadaverine) 생성 대사경로를 가지는 미생물에서, 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG), 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP), 및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 약화 또는 결실시킨 다음, 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)를 도입 또는 증폭시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  19. 제18항에 있어서, 카다베린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 lac 오페론 억제인자를 코딩하는 유전자(lacI)를 추가로 결실시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  20. 삭제
  21. 제18항에 있어서, 상기 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  22. 삭제
  23. 제18항에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속(Bacillus sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 피치아 속(Pichia sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 및 사카로마이세스 속( Saccharomyces sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  24. 카다베린(cadaverine) 생성 대사경로를 가지는 미생물에서, 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG), 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP), 및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 약화 또는 결실시킨 다음, 상기 카다베린(cadaverine) 생성 대사경로를 가지는 미생물에 존재하는 디하이드로디피콜리네이트 합성 효소(dihydrodipicolinate synthase)를 코딩하는 유전자(dapA), 디아미노피멜레이트 디카르복실라아제(diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(lysA) 및 디하이드로디피콜리네이트 환원 효소(dihydrodipicolinate reductase)를 코딩하는 유전자(dapB)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 native promoter를 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 strong promoter로 치환시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  25. 제24항에 있어서, 카다베린 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 lac 오페론 억제인자를 코딩하는 유전자(lacI)를 추가로 결실시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  26. 제24항에 있어서, 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)를 추가로 도입 또는 증폭시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  28. 삭제
  29. 제24항에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속(Bacillus sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 피치아 속(Pichia sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 및 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  30. 카다베린(cadaverine) 생성 대사경로를 가지는 미생물에서, 카다베린(cadaverine)의 분해 또는 이용 경로에 관여하는 퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminopropyl transferase)를 코딩하는 유전자(speE), 스퍼미딘 N-아세틸트랜스퍼라제(spermidine N-acetyltransferase)를 코딩하는 유전자(speG), 퓨트레신/카다베린 아미노트랜스퍼라제(putrescine/cadaverine aminotransferase)를 코딩하는 유전자(ygjG), 퓨트레신 임포터(putrescine importer)를 코딩하는 유전자(puuP), 및 글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가아제(glutamate-putrescine/glutamate-cadaverine ligase)를 코딩하는 유전자(puuA)를 약화 또는 결실시키고, lac 오페론 억제인자를 코딩하는 유전자(lacI)를 결실시킨 다음, 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)를 도입 또는 증폭시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 라이신 디카르복실라제(lysine decarboxylase)를 코딩하는 유전자(cadA)는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 카다베린(cadaverine) 생성 대사경로를 가지는 미생물에 존재하는 디하이드로디피콜리네이트 합성 효소(dihydrodipicolinate synthase)를 코딩하는 유전자(dapA), 디아미노피멜레이트 디카르복실라아제(diaminopimelate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(lysA) 및 디하이드로디피콜리네이트 환원 효소(dihydrodipicolinate reductase)를 코딩하는 유전자(dapB)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 native promoter를 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택되는 strong promoter로 추가로 치환시키는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  33. 삭제
  34. 제30항에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속(Bacillus sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 피치아 속(Pichia sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 및 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 카다베린 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  35. 제1항, 제2항, 제4항, 제6항~제10항, 제12항~제15항 및 제17항중 어느 한 항의 변이 미생물을 배양하여 카다베린을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 카다베린을 회수하는 것을 특징으로 하는 카다베린의 제조방법.
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