KR20090005099A

KR20090005099A - 카다베린의 제조 방법

Info

Publication number: KR20090005099A
Application number: KR1020087026451A
Authority: KR
Inventors: 오스카 첼더; 월규 정; 코린나 클로프로게; 안드레아 해롤드; 하르트비크 슈뢰더
Original assignee: 바스프 에스이
Priority date: 2006-03-30
Filing date: 2007-03-23
Publication date: 2009-01-12
Also published as: HUE030521T2; JP5745552B2; EP2013353A1; CN102732578B; CN102732578A; JP5210295B2; BRPI0709628A2; CN101389765A; JP2013146269A; WO2007113127A1; JP2009531042A; CN101389765B; US20090246838A1; US8741623B2; KR101457229B1; ES2592887T3; EP2013353B1

Abstract

본 발명은 조절해제된 라이신 데카르복실라제 유전자, 및 아스파르토키나제, 아스파르테이트세미알데하이드 데하이드로제나제, 디하이드로디피콜리네이트 신타제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제, 테트라하이드로디피콜리네이트 숙시닐라제, 숙시닐-아미노-케토피멜레이트 트랜스아미나제, 숙시닐-디아미노-피멜레이트 데숙시닐라제, 디아미노피멜레이트 에피머라제, 디아미노피멜레이트 데하이드로제나제, 아르기닐-tRNA 신테타제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로제나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 6-포스포글루코노락토나제, 프럭토스 1,6-비포스파타제, 호모세린 데하이드로제나제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 메틸말로닐-CoA 뮤타제로 구성되는 군 (i)에서 선택되는 1종 이상의 조절해제된 유전자를 가지는 재조합 미생물을 구성하는 것 (단, 유전자 (i)로서 아스파르토키나제가 조절해제되는 경우, 1종 이상의 아스파르토키나제가 아닌 다른 제2의 유전자 (i)이 조절해제되어야 함), 및 상기 미생물을 배양하는 것에 의한, 카다베린의 제조 방법에 관한 것이다.

카다베린, 조절해제, 라이신, 아세틸트랜스퍼라제, 디카르복실산, 폴리아미드

Description

카다베린의 제조 방법{PROCESS FOR THE PRODUCTION OF CADAVERINE}

본 발명은 카다베린(cadaverine)의 제조 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 카다베린을 제조하는 데에 필수적인 DNA 분자를 조절해제된(deregulated) 형태로 포함하는 재조합 미생물의 용도에 관한 것이다.

JP 2002223770호는 라이신 탈카르복실화 유전자 및/또는 라이신-카다베린 역운반체(antiporter) 유전자를 라이신 생성 미생물에 도입하는 것에 의해 카다베린을 제조하는 방법에 대해 개시하고 있다.

JP 2004222569호는 L-라이신 데카르복실라제 활성 및 호모세린 영양요구성을 가지는 재조합 코리네포름(coryneform) 세균을 배양하는 것에 의해 카다베린을 제조하는 방법에 대해 개시하고 있다.

<발명의 개요>

일 양태에서, 본 발명은 조절해제된 라이신 데카르복실라제, 및 라이신 생합성 경로에 필수적인 유전자들에서 선택되는 1종 이상의 조절해제된 유전자를 가지는 재조합 미생물을 구성하는 것, 및 상기 미생물을 배양하는 것에 의한 카다베린의 제조 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 카다베린의 제조에 대하여 상기 언급한 것과 같은 단계, 및 그 카다베린을 디카르복실산과 반응시키는 것을 포함하는 폴리아미드의 제조 방법을 제공한다.

하기의 상세한 설명에서는 수많은 용어들이 집중적으로 이용된다. 본 발명의 이해를 돕기 위하여 여기에 그 정의를 제공한다.

카다베린이라는 용어는 1,5-디아미노펜탄을 의미한다.

프로모터. 구조 유전자의 전사를 유도하여 mRNA를 생성시키는 DNA 서열. 통상적으로, 프로모터는 유전자 5' 영역의 구조 유전자 개시 코돈에 인접하여 위치한다. 프로모터가 유도가능(inducible) 프로모터인 경우에는, 전사의 속도가 유도제에 응답하여 증가한다. 반면, 프로모터가 구성성(constitutive) 프로모터인 경우, 전사의 속도는 유도제에 의해 조절되지 않는다.

인핸서(enhancer). 프로모터 요소. 인핸서는 전사 개시 부위에 대한 인핸서의 거리 또는 방향에 관계없이 특정 유전자가 mRNA로 전사되는 효율을 증가시킬 수 있다.

발현. 발현은 구조 유전자로부터 폴리펩티드가 생성되는 과정이다. 상기 과정은 유전자의 mRNA로의 전사 및 해당 mRNA의 폴리펩티드(들)로의 번역을 포함한다.

클로닝 벡터. 숙주 세포에서 자가 복제의 능력을 가지며 유전자 조작을 위하여 세포를 형질전환시키는 데에 사용되는 플라스미드, 코스미드, 파지미드 또는 박테리오파지와 같은 DNA 분자. 클로닝 벡터는 통상적으로 벡터의 필수적인 생물학적 기능의 소실 없이도 확인가능한 방식으로 외래 DNA 서열이 삽입될 수 있는 하나 또는 소수의 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위는 물론, 클로닝 벡터에 의해 형질전환된 세포의 식별 및 선택에 사용하기에 적합한 표식 유전자를 포함한다. 표식 유전자는 통상적으로 테트라싸이클린 내성 또는 암피실린 내성을 제공하는 유전자를 포함한다.

발현 벡터. 재조합 숙주에서 외래 단백질의 발현을 제공하는, 외래 단백질을 코딩하는 클로닝된 구조 유전자를 포함하는 DNA 분자. 통상적으로, 클로닝된 유전자의 발현은 프로모터 및 인핸서 서열과 같은 소정 조절 서열의 제어 하에 있다 (즉, 작용가능하게 연결되어 있다). 프로모터 서열은 구성성이거나 유도가능한 것 중 어느 것일 수 있다.

재조합 숙주. 재조합 숙주는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터 중 어느 것을 포함하는 소정의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 이 용어는 또한, 숙주 세포의 염색체 또는 게놈에 클로닝된 유전자(들)을 포함하도록 유전적으로 조작된 원핵 또는 진핵 세포를 포함하여 의미한다. 적합한 숙주의 예에 대해서는, 문헌 [Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] (["Sambrook"])를 참조하라.

여기에서 사용될 때, 실직적으로 순수한 단백질은, 폴리아크릴아미드-나트륨 도데실 술페이트 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 단일 밴드로서 증명된 바 원하는 정제 단백질에 본질적으로 오염성 세포 성분이 없다는 것을 의미한다. "실질적으로 순수한"이라는 용어는 또한, 업계 숙련자에 의해 사용되는 1종 이상의 순도 또는 균질성 특성에서 균일한 분자를 기술하여 의미한다. 예를 들어, 실질적으로 순수한 라이신 데카르복실라제는 하기와 같은 파라미터에 있어서 실험적 표준 편차 이내의 일정하고 재현가능한 특성을 나타낼 것이다: 분자량, 그로마토그래피 이동, 아미노산 조성, 아미노산 서열, 차단 또는 비차단 N-말단, HPLC 용리 프로파일, 생물학적 활성, 및 기타 해당 파라미터. 그러나, 이 용어가 라이신 데카르복실라제의 다른 화합물과의 인공 또는 합성 혼합물을 배제하여 의미하는 것은 아니다. 또한, 이 용어가 재조합 숙주에서 분리되는 라이신 데카르복실라제 융합 단백질을 배제하여 의미하는 것은 아니다.

제1 양태에서, 본 발명은 조절해제된 라이신 데카르복실라제 유전자, 및 아스파르토키나제, 아스파르테이트세미알데하이드 데하이드로제나제, 디하이드로디피콜리네이트 신타제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제, 테트라하이드로디피콜리네이트 숙시닐라제, 숙시닐-아미노-케토피멜레이트 트랜스아미나제, 숙시닐-디아미노-피멜레이트 데숙시닐라제, 디아미노피멜레이트 에피머라제, 디아미노피멜레이트 데하이드로제나제, 아르기닐-tRNA 신테타제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로제나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 6-포스포글루코노락토나제, 프럭토스 1,6-비포스파타제, 호모세린 데하이드로제나제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 메틸말로닐-CoA 뮤타제로 구성되는 군 (i)에서 선택되는 1종 이상의 조절해제된 유전자를 가지는 재조합 미생물을 구성하는 것 (단, 유전자 (i)로서 아스파르토키나제가 조절해제되는 경우, 1종 이상의 아스파르토키나제가 아닌 다른 제2의 유전자 (i)이 조절해제되어야 함), 및 상기 미생물을 배양하는 것에 의한, 카다베린의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법론은 바람직하게는 여기에서 개시되는 바와 같은 벡터 또는 유전자 (예, 야생형 및/또는 돌연변이된 유전자)를 포함하거나, 및/또는 카다베린의 생성으로 귀결되는 방식으로 배양되는 재조합 미생물을 특징으로 한다.

"재조합" 미생물이라는 용어에는 그것이 유래하는 자연-발생 미생물과 비교할 때 변화, 변형 또는 달라진 유전형 및/또는 표현형 (예, 유전적 변형이 미생물 핵산의 코딩 서열에 영향을 주는 경우)을 나타내도록 유전적으로 변화, 변형 또는 조작된 (예, 유전적으로 조작된) 미생물 (예, 세균, 효모 세포, 균류 세포 등)이 포함된다.

"조절해제된"이라는 용어에는 미생물의 조작 전에 또는 조작되지 않은 상응 미생물에서 발현되던 것에 비해, 더 낮거나 더 높은 수준에서 유전자 산물 (예, 라이신 데카르복실라제)을 발현하는 것이 포함된다. 일 구현예에서, 미생물은 미생물의 조작 전에 또는 조작되지 않은 상응 미생물에서 발현되던 것에 비해 더 덜하거나 더 높은 수준에서 소정 수준의 유전자 산물을 발현하도록 유전적으로 조작 (예, 유전자 조작)될 수 있다. 유전자 조작에는 특정 유전자의 조절 서열 또는 그의 발현과 관련된 부위를 변화 또는 변형시키는 것 (예컨대 강력 프로모터, 유도가능 프로모터 또는 다중 프로모터를 제거하는 것에 의해), 특정 유전자의 염색체좌를 변형시키는 것, 리보좀 결합 부위 또는 전사 종결인자와 같은 특정 유전자에 인접한 핵산 서열을 변화시키는 것, 특정 유전자의 카피 수를 감소시키는 것, 특정 유전자의 전사 및/또는 특정 유전자 산물의 번역에 관련된 단백질 (예, 조절 단백질, 억제인자, 인핸서, 전사 활성화인자 등)을 변형시키는 것, 또는 특정 유전자의 발현을 조절해제하는 업계에 알려져 있는 모든 기타 통상적 수단 (그에 제한되는 것은 아니나, 안티센스(antisense) 핵산 분자를 사용하는 것, 또는 표적 단백질의 발현을 손상시키거나 차단하는 다른 방법 포함)이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

"조절해제된 유전자 활성", 예컨대 조절해제된 라이신 데카르복실라제라는 용어 또한, 예를 들어 바람직하게는 유전자 조작을 이용하여 미생물에 1개 이상 카피의 이종유래 유전자, 예컨대 라이신 데카르복실라제 유전자를 도입하는 것에 의해, 각각의 유전자 활성, 예컨대 라이신 데카르복실라제 활성이 전에는 관찰되지 않았던 미생물에 유전자 활성, 예컨대 라이신 데카르복실라제 활성이 도입되는 것을 의미한다.

라이신 데카르복실라제는 L-라이신의 카다베린으로의 탈카르복실화를 매촉(catalyze)한다. 상기 효소는 E.C. 4.1.1.18로 분류되어 있다. 라이신 데카르복실라제 활성을 가지는 에셔리키아 콜리(Escherichia coli)로부터 분리되는 상기 효소는 cadA 유전자 산물 (문헌 [Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Entry b4131]) 및 ldcC 유전자 산물 (문헌 [Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Entry JW0181])이다.

E. 콜리 cadA의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1에 개시되어 있으며, E. 콜리 ldcC의 것은 SEQ ID NO:2에 개시되어 있다.

E. 콜리 라이신 데카르복실라제 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 SEQ ID NO:1 또는 2의 아미노산 서열로부터 역-번역된 뉴클레오티드 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하여 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝(screening)함으로써 수득될 수 있다.

다르게는, E. 콜리 라이신 데카르복실라제 유전자는 공통적으로 프라이밍(priming)하는 긴 올리고뉴클레오티드를 사용하여 DNA 분자를 합성함으로써 수득될 수 있다. 예컨대, 문헌 [Ausubel et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, pages 8.2.8 to 8.2.13 (1990)] (["Ausubel"])을 참조하라. 또한, 문헌 [Wosnick et al., Gene 60:115 (1987)]; 및 [Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, pages 8-8 to 8-9 (John Wiley & Sons, Inc. 1995)]을 참조하라. 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하는 확립된 기술은 2 킬로베이스 이상 길이의 DNA 분자를 합성하는 능력을 제공한다 (문헌 [Adang et al., Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993)]; [Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266 (1993)]; [Dillon et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes," in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 15: PCR PROTOCOLS: CURRENT METHODS AND APPLICATIONS, White (ed.), pages 263-268, (Humana Press, Inc. 1993)]; [Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299 (1995)]).

모 효소와 비교할 때 보존적인 아미노산 변화를 포함하는 E. 콜리 라이신 데카르복실라제의 변이체가 제조될 수 있다. 다시 말하면, SEQ ID NO:1 또는 2의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체가 수득될 수 있으며, 여기에서는 라이신 데카르복실라제 아미노산 서열의 알킬 아미노산 대신 알킬 아미노산이 치환되거나, E. 콜리 라이신 데카르복실라제 아미노산 서열의 방향족 아미노산 대신 방향족의 아미노산이 치환되거나, E. 콜리 라이신 데카르복실라제 아미노산 서열의 황-함유 아미노산 대신 황-함유 아미노산이 치환되거나, E. 콜리 라이신 데카르복실라제 아미노산 서열의 하이드록시-함유 아미노산 대신 하이드록시-함유 아미노산이 치환되거나, E. 콜리 라이신 데카르복실라제 아미노산 서열의 산성 아미노산 대신 산성의 아미노산이 치환되거나, E. 콜리 라이신 데카르복실라제 아미노산 서열의 염기성 아미노산 대신 염기성의 아미노산이 치환된다.

예를 들어, 공통 아미노산들 중에서의 "보존적인 아미노산 치환"은 하기의 군들 각각 내에서의 아미노산 간 치환으로 설명된다: (1) 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신, (2) 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판, (3) 시스테인 및 메티오닌, (4) 세린 및 트레오닌, (5) 아스파르테이트 및 글루타메이트, (6) 글루타민 및 아스파라긴, 및 (7) 라이신, 아르기닌 및 히스티딘.

E. 콜리 라이신 데카르복실라제의 보존적인 아미노산 변화는 SEQ ID NO:1 또는 NO:2에 열거된 뉴클레오티드 대신 뉴클레오티드를 치환하는 것에 의해 도입될 수 있다. 이와 같은 "보존적 아미노산" 변이는, 예컨대 올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이(oligonucleotide directed mutagenesis), 링커-스캐닝 돌연변이(linker-scanning mutagenesis), 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하는 돌연변이 등에 의해 수득될 수 있다 (전기한 문헌 [Ausubel et al., pages 8.0.3-8.5.9]; 문헌 [Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, pages 8-10 to 8-22 (John Wiley & Sons, Inc. 1995)]). 또한 일반적으로, 문헌 [McPherson (ed.), DIRECTED MUTAGENESIS: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1991)]를 참조하라. L-라이신을 카다베린으로 전환하는 그러한 변이체의 능력은 여기에서 기술되는 분석과 같은 표준의 효소 활성 분석을 사용하여 확인될 수 있다.

본 발명에 따른 바람직한 라이신 데카르복실라제는 E. 콜리 및 그의 등가의 유전자 유래의 라이신 데카르복실라제로서, 상응하는 "원래의" 유전자 산물과 80 % 이하, 바람직하게는 90 % 이하, 가장 바람직하게는 95 % 내지 98 %의 서열 동일성 (아미노산 서열 기준)을 가지며, 여전히 라이신 데카르복실라제의 생물학적 활성을 가지고 있다. 이와 같은 등가의 유전자는 업계 공지의 방법에 의해 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 삽입을 도입함으로써 용이하게 구성될 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 코돈 이용법(codon usage)를 적용하여 DNA로 역번역되는(retranslated) E. 콜리의 라이신 데카르복실라제 (SEQ ID NO:1 및 NO:2)이다. 이러한 라이신 데카르복실라제 폴리뉴클레오티드 서열은 코리네박테리움 속의 미생물, 특히 C. 글루타미쿰에서 라이신 데카르복실라제를 발현하는 데에 유용하다.

조절해제된 라이신 데카르복실라제 유전자 이외에, 본 발명에 따른 미생물은 군 (i)에서 선택되는 1종 이상의 조절해제된 유전자를 가져야 한다. 상기 군 (i)은 라이신의 생합성에서 중요한 역할을 하는 유전자의 군으로서, 아스파르토키나제, 아스파르테이트세미알데하이드 데하이드로제나제, 디하이드로디피콜리네이트 신타제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제, 테트라하이드로디피콜리네이트 숙시닐라제, 숙시닐-아미노-케토피멜레이트 트랜스아미나제, 숙시닐-디아미노-피멜레이트 데숙시닐라제, 디아미노피멜레이트 에피머라제, 디아미노피멜레이트 데하이드로제나제, 아르기닐-tRNA 신테타제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로제나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 6-포스포글루코노락토나제, 프럭토스 1,6-비포스파타제, 호모세린 데하이드로제나제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 메틸말로닐-CoA 뮤타제의 유전자들로 구성된다.

군 (i)의 유전자 하나 이상은 본 발명의 방법에 따라 조절해제되어야 한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 미생물에서 하나를 초과하는 군 (i)의 유전자, 예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 유전자가 조절해제된다.

군 (i)의 유전자 및 유전자 산물은 업계에 알려져 있다. EP 1108790호는 라이신 생성에서 재조합 코리네박테리아의 생산성에 유익한 효과를 주는 호모세린데하이드로제나제 및 피루베이트카르복실라제 유전자의 돌연변이에 대해 개시하고 있다. WO 00/63388호는 라이신 생성에서 재조합 코리네박테리아의 생산성에 유익한 효과를 주는 아스파르토키나제 유전자의 돌연변이에 대해 개시하고 있다. EP 1108790호 및 WO 00/63388호는 이러한 유전자에서의 상기한 바와 같은 돌연변이와 관련하여 참조로써 개재된다.

모든 유전자/유전자 산물에 대한 하기의 표에서, 각각의 유전자를 조절해제하는 가능한 방법을 설명한다. 표의 "조절해제" 열에 인용되어 있는 문헌 및 서류들은 유전자 조절해제와 관련하여 참조로써 여기에 개재된다. 표에 언급되어 있는 방법들은 각 유전자 조절해제의 바람직한 구현예이다.

효소 (유전자 산물)	유전자	조절해제
아스파르토키나제	ask	점 돌연변이에 의한 되먹임 억제의 해제 (문헌 [Eggeling et al., (eds.), Handbook of Corynebacterium glutamicum, pages 20.2.2 (CRC press, 2005)]) 및 증폭
아스파르테이트세미알데하이드 데하이드로제나제	asd	증폭
디하이드로디피콜리네이트 신타제	dapA	증폭
디하이드로디피콜리네이트 리덕타제	dapB	증폭
테트라하이드로디피콜리네이트 숙시닐라제	dapD	증폭
숙시닐-아미노-케토피멜레이트 트랜스아미나제	dapC	증폭
숙시닐-디아미노-피멜레이트 데숙시닐라제	dapE	증폭
디아미노피멜레이트 데하이드로제나제	ddh	증폭
디아미노피멜레이트 에피머라제	dapF	증폭
아르기닐-tRNA 신테타제	argS	증폭
디아미노피멜레이트 데카르복실라제	lysA	증폭
피루베이트 카르복실라제	pycA	점 돌연변이에 의한 되먹임 억제의 해제 (EP 1108790호) 및 증폭
포스포에놀피루베이트 카르복실라제	ppc	증폭
글루코스-6-포스페이트 데하이드로제나제	zwf	점 돌연변이에 의한 되먹임 억제의 해제 (US2003/0175911호) 및 증폭
트랜스케톨라제	tkt	증폭
트랜스알돌라제	tal	증폭
6-포스포글루코노락토나제	pgl	증폭
프럭토스 1,6-비포스파타제	fbp	증폭
호모세린 데하이드로제나제	hom	점 돌연변이에 의한 약독화 (EP 1108790호)
포스포에놀피루베이트 카르복시키나제	pck	돌연변이 또는 다른 것에 의한 손상 또는 잠복화
숙시닐-CoA 신테타제	sucC	점 돌연변이에 의한 약독화 (WO 05/58945호)
메틸말로닐-CoA 뮤타제		점 돌연변이에 의한 약독화 (WO 05/58945호)

아스파르토키나제, 아스파르테이트세미알데하이드 데하이드로제나제, 디하이드로디피콜리네이트 신타제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제, 테트라하이드로디피콜리네이트 숙시닐라제, 숙시닐-아미노-케토피멜레이트 트랜스아미나제, 숙시닐-디아미노-피멜레이트 데숙시닐라제, 디아미노피멜레이트 에피머라제, 디아미노피멜레이트 데하이드로제나제, 아르기닐-tRNA 신테타제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로제나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 6-포스포글루코노락토나제, 프럭토스 1,6-비포스파타제 유전자의 바람직한 조절해제 방법은 예컨대 강력한 발현 신호를 사용한 유전자 증폭 및/또는 효소 활성을 증강시키는 점 돌연변이에 의해 유전자 활성을 증가시키는 "상향(up)"-돌연변이이다.

호모세린 데하이드로제나제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 메틸말로닐-CoA 뮤타제 유전자의 바람직한 조절해제 방법은 예컨대 약한 발현 신호를 사용한 유전자 결실 또는 붕괴, 및/또는 효소 활성을 파괴 또는 감소시키는 점 돌연변이에 의해 유전자 활성을 감소시키는 "하향(down)"-돌연변이이다.

아스파르토키나제가 유전자 (i) 군의 구성원으로서 조절해제되는 경우에는, 아스파르토키나제가 아닌 다른 제2의 유전자 (i) 구성원 하나 이상이 함께 조절해제되어야 한다.

본 발명의 방법에 따른 미생물에서 생성되는 카다베린의 상당 부분이 아세틸화되는 것으로 관찰되었다. 아세틸-CoA 의존성 디아민 아세틸트랜스퍼라제에 기인하는 이러한 아세틸화 반응을 차단하고 카다베린의 수율을 증가시키기 위해서는, 예컨대 유전자의 결실 또는 붕괴에 의해 생성되는 미생물의 디아민 아세틸트랜스퍼라제를 조절해제하여 특히 그의 활성을 감소시키는 것이 본 발명의 바람직한 구현예이다.

본 발명에 따라 조절해제된 유전자를 발현시키기 위해서는, 효소를 코딩하는 DNA 서열이 발현 벡터에서의 전사 발현을 제어하는 조절 서열에 작용가능하게 연결된 다음, 원핵 또는 진핵 숙주 세포 중 어느 것으로 도입되어야 한다. 프로모터 및 인핸서와 같은 전사 조절 서열 이외에도, 발현 벡터는 번역 조절 서열 및 발현 벡터를 보유하는 세포의 선택에 적합한 표식 유전자를 포함할 수 있다.

원핵 숙주에서의 발현에 적합한 프로모터는 억제성이거나(repressible), 구성성이거나 또는 유도가능성일 수 있다. 적합한 프로모터는 업계 숙련자에게 잘 알려져 있으며, 여기에는 T4, T3, Sp6 및 T7 폴리머라제를 인식할 수 있는 프로모터, 박테리오파지 람다의 P_R 및 P_L 프로모터, E. 콜리의 trp, recA, 열 충격(heat shock), lacUV5, tac, lpp-lacλpr, phoA, gal, trc 및 lacZ 프로모터, B. 서브틸리스(subtilis)의 α-아밀라제 및 σ²⁸-특이적 프로모터, 바실루스(Bacillus) 박테리오파지의 프로모터, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 프로모터, 박테리오파지 람다의 int 프로모터, pBR322의 β-락타마제 유전자의 bla 프로모터, 및 클로르암페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자의 CAT 프로모터가 포함된다. 원핵 프로모터에 대해서는 문헌 [Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987)]; [Watson et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, 4th Ed., Benjamin Cummins (1987)]; 전기한 문헌 [Ausubel et al.] 및 전기한 문헌 [Sambrook et al.]에 고찰되어 있다.

E. 콜리 라이신 데카르복실라제의 발현을 위하여 바람직한 프로모터는 C. 글루타미쿰의 sodA 프로모터이다.

원핵 숙주에서 단백질을 발현시키기 위한 방법은 업계 숙련자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies," in DNA CLONING 2: EXPRESSION SYSTEMS, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), pages 15-58 (Oxford University Press 1995)]를 참조하라. 또한, 문헌 [Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, pages 137-185 (Wiley-Liss, Inc. 1995)]; 및 [Georgiou, "Expression of Proteins in Bacteria," in PROTEIN ENGINEERING: PRINCIPLES AND PRACTICE, Cleland et al. (eds.), pages 101 -127 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)]도 참조하라.

발현 벡터는 염화 칼슘 형질전환, 전기천공(electroporation) 등을 포함한 다양한 기술을 사용하여 세균 숙주 세포로 도입될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, pages 1-1 to 1-24 (John Wiley & Sons, Inc. 1995)]를 참조하라.

본 발명의 중요한 양태는 원하는 화합물인 카다베린이 생성되도록 여기에서 기술되는 재조합 미생물을 배양하는 것(cultivating 또는 culturing)을 포함한다. "배양"이라는 용어에는 본 발명의 살아있는 미생물을 유지 및/또는 생육하는 것 (예, 배양체 또는 균주를 유지 및/또는 생육하는 것)이 포함된다. 일 구현예에서, 본 발명의 미생물은 액체 배지에서 배양된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 미생물은 고체 배지 또는 반-고체 배지에서 배양된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 미생물은 미생물의 유지 및/또는 생장에 필수적이거나 유익한 영양소를 포함하는 배지 (예, 살균된 액제 배지)에서 배양된다.

사용될 수 있는 탄소 공급원에는 예컨대 글루코스, 슈크로스, 락토스, 프럭토스, 말토스, 당밀, 전분 및 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 예컨대 콩 오일, 해바라기 오일, 땅콩 오일 및 코코넛 오일과 같은 오일 및 지방, 예컨대 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산과 같은 지방산, 예컨대 글리세롤 및 에탄올과 같은 알콜, 및 예컨대 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 바람직한 구현예에서는, 글루코스, 프럭토스 또는 슈크로스가 탄소 공급원으로서 사용된다. 이러한 물질들은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

사용될 수 있는 질소 공급원에는 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(corn steep liquor), 대두분(soya flour) 및 요소와 같이 질소를 함유하는 유기 화합물, 또는 황산 암모늄, 염화 암모늄, 인산 암모늄, 탄산 암모늄 및 질산 암모늄과 같은 무기 화합물이 포함된다. 상기 질소 공급원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 인 공급원은 인산, 인산 2수소 칼륨 또는 인산 수소 2칼륨, 또는 상응하는 나트륨 함유 염이다. 배양 배지는 예컨대 황산 마그네슘 또는 황산 철과 같이 생장을 위하여 필요한 금속염을 추가적으로 함유해야 한다. 마지막으로, 상기-언급된 물질 이외에, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 생장-촉진 물질 역시 사용될 수 있다. 적합한 전구체가 배양 배지에 첨가될 수도 있다. 언급된 공급 물질들은 단일 배치로서 배양체에 첨가되거나, 또는 배양 중에 적절하게 공급될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 미생물은 제어되는 pH 하에서 배양된다. "제어되는 pH"라는 용어에는 원하는 정제 화학물질, 예컨대 카다베린의 생성으로 귀결되는 소정의 pH가 포함된다. 일 구현예에서, 미생물은 약 7의 pH에서 배양된다. 또 다른 구현예에서, 미생물은 6.0 내지 8.5 사이의 pH에서 배양된다. 원하는 pH는 업계 숙련자에게 알려져 있는 모든 경우의 방법에 의해 유지될 수 있다. 예를 들면, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 암모니아 또는 암모니아수와 같은 염기성 화합물, 또는 인산 또는 황산과 같은 산성 화합물이 사용되어 배양체의 pH를 적절하게 제어한다.

역시 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 제어되는 환기 하에서 배양된다. "제어되는 환기"라는 용어에는 원하는 정제 화학물질, 예컨대 카다베린의 생성으로 귀결되는 충분한 환기 (예, 산소)가 포함된다. 일 구현예에서, 환기는 예컨대 배양 배지에 용해되는 산소의 양을 조절함으로써 배양체 중 산소의 농도를 조절하는 것에 제어된다. 바람직하게는, 배양체의 환기는 배양체를 교반하는 것에 의해 제어된다. 환기는 프로펠러 또는 유사한 기계적 교반 장치에 의해, 생장 용기 (예, 발효기)의 회전 또는 진탕에 의해, 또는 다양한 펌핑 장치에 의해 제공될 수 있다. 환기는 또한, 살균된 공기 또는 산소를 배지로 (예, 발효 혼합물로) 통과시키는 것에 의해서도 제어될 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 과도한 거품발생 없이 (예, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제의 첨가를 통하여) 배양된다.

또한, 본 발명의 미생물은 제어되는 온도 하에서 배양될 수 있다. "제어되는 온도"라는 용어에는 원하는 정제 화학물질, 예컨대 카다베린의 생성으로 귀결되는 소정의 온도가 포함된다. 일 구현예에서, 제어되는 온도는 15 ℃ 내지 95 ℃ 사이의 온도를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제어되는 온도는 15 ℃ 내지 70 ℃ 사이의 온도를 포함한다. 바람직한 온도는 20 ℃ 내지 55 ℃ 사이, 더욱 바람직하게는 30 ℃ 내지 45 ℃ 사이 또는 30 ℃ 내지 50 ℃ 사이이다.

미생물은 액체 배지에서 배양 (예, 유지 및/또는 생육)될 수 있으며, 바람직하게는, 정치 배양, 시험관 배양, 진탕 배양 (예, 회전 진탕 배양, 진탕 플라스크 배양 등), 환기 스피너 배양, 또는 발효와 같은 통상적인 배양 방법에 의해, 연속식 또는 간헐식 중 어느 것으로 배양된다. 바람직한 구현예에서, 미생물은 진탕 플라스크에서 배양된다. 더욱 바람직한 구현예에서, 미생물은 발효기에서 배양된다 (예, 발효 공정). 본 발명의 발효 공정에는 배치식, 공급-배치식(fed-batch) 및 연속식 방법의 발효가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. "배치 공정" 또는 "배치 발효"라는 구는 배지, 영양소, 보충 첨가제 등의 조성이 발효 개시 시에 설정되어 발효 도중에 변경되지 않으나, 과도한 배지 산성화 및/또는 미생물 사멸을 방지하기 위하여 pH 및 산소 농도와 같은 요인을 조정하는 시도는 이루어질 수 있는 폐쇄 시스템을 지칭한다. "공급-배치 공정" 또는 "공급-배치" 발효라는 구는 발효가 진행되는 동안 1종 이상의 기질 또는 보충물이 첨가 (예, 증분식으로 또는 연속적으로 첨가)되는 것 이외에는 배치 발효와 동일한 것을 지칭한다. "연속식 공정" 또는 "연속식 발효"라는 구는 규정된 발효 배지가 연속적으로 발효기에 첨가되며, 동시에, 바람직하게는 원하는 카다베린의 회수를 위하여 동일한 양의 사용된, 또는 "적절화된(conditioned)" 배지가 제거되는 시스템을 지칭한다. 다양한 그러한 공정들이 개발되어 있으며, 업계에 잘 알려져 있다.

본 발명의 방법론은 카다베린을 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다. 카다베린을 "회수하는 것"이라는 용어에는 배양 배지로부터 화합물을 추출, 수확, 단리 또는 정제하는 것이 포함된다. 화합물을 회수하는 것은 그에 제한되는 것은 아니나 통상적인 수지 (예, 음이온 또는 양이온 교환 수지, 비-이온 흡착 수지 등)를 사용한 처리, 통상적인 흡착제 (예, 활성탄, 규산, 실리카 겔, 셀룰로스, 알루미나 등)을 사용한 처리, pH의 변경, 용매 추출 (예, 알콜, 에틸 아세테이트, 헥산 등과 같은 통상적인 용매 사용), 증류, 투석, 여과, 농축, 결정화, 재결정화, pH 조정, 동결건조 등을 포함한, 업계 공지의 통상적인 소정 단리 또는 정제 방법론에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 카다베린은 우선 미생물을 제거하는 것에 의해 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 다음에, 바이오매쓰가 제거된 배지(broth)는 원치 않는 양이온을 제거하기 위하여 양이온 교환 수지를 통하여 또는 수지 상으로, 이후 카다베린보다 더 강한 산성을 가지는 원치 않는 무기 음이온 및 유기산을 제거하기 위하여 음이온 교환 수지를 통하여 또는 수지 상으로 통과된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 카다베린의 제조에 대하여 상기 언급한 것과 같은 단계를 포함하는 폴리아미드 (예, 나일론®)의 제조 방법을 제공한다. 폴리아미드를 수득하기 위하여, 카다베린은 알려져 있는 방식으로 디-, 트리- 또는 폴리카르복실산과 반응된다. 바람직하게는, 카다베린은 숙신산, 글루타르산, 아디프산, 피멜산, 수베르산, 아젤라산, 세바크산 등과 같이 4 내지 10 탄소를 함유하는 디카르복실산과 반응된다. 상기 디카르복실산은 바람직하게는 유리 산이다.

1. 라이신 데카르복실라제 유전자의 클로닝

PCR 프라이머인 WKJ12/WKJ13 및 WKJ35/WKJ34를 주형으로서의 E. 콜리 염색체 DNA와 함께 사용하여, 각각 cadA 및 ldcC 유전자를 포함하는 DNA 단편을 증폭하였다. 증폭된 DNA 단편을 정제하여, cadA에 대하여 Asp718/Ndel, 및 ldcC에 대하여 Xhol/Spel의 제한 효소로 분해한 후, 동일한 제한 효소로 분해된 pClik5aMCS 벡터에 결찰시킴으로써, 각각 pClik5aMCS cadA 및 pClik5aMCS ldcC를 생성시켰다.

ldcC 유전자의 발현을 증가시키기 위하여, 유전자의 개시 코돈 앞에 C. 글루타미쿰 sodA 프로모터 (Psod)를 치환시켰다. Psod에 대하여 WKJ31/OLD47, 및 ldcC에 대하여 WKJ33/WKJ34의 PCR 프라이머를 사용하여, 각 염색체 DNA로부터 sodA 프로모터 및 ldcC 유전자의 코딩 영역을 포함하는 DNA 단편을 증폭하고, 프라이머 WKJ31/WKJ34를 이용한 융합 PCR을 위한 주형으로서 사용하였다. 융합된 PCR 단편을 정제하여, Xhol 및 Spel로 분해한 후, pClik5aMCS 벡터의 Xhol 및 Spel 분열 부위 사이에 삽입하여 pClik5aMCS Psod-ldcC를 구성하였다.

사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머:

2. 카다베린 생산 균주의 구성

카다베린 생산 균주를 구성하기 위하여, 아스파르토키나제 유전자로의 점 돌연변이 T311I의 도입, 디아미노피멜레이트 데하이드로제나제 유전자의 이중화 및 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 유전자의 붕괴에 의해 C. 글루타미쿰 야생형 균주 ATCC13032로부터 유래한 라이신 생산주인 LU11271을 라이신 데카르복실라제 유전자를 가지는 재조합 플라스미드로 형질전환시켰다.

3. 진탕 플라스크 배양에서의 카다베린 생산

재조합 균주 상에서 진탕 플라스크 실험을 수행하여 카다베린 생성을 시험하였다. WO2005059139호에 기술되어 있는 바와 같이, 라이신 생성과 동일한 배양 배지 및 조건을 사용하였다. 대조를 위하여, 숙주 균주 및 pClik5aMCS를 가지는 재조합 균주를 동시에 시험하였다. 균주들을 CM 아가 상에서 30 ℃로 밤새 예비-배양하였다. 배양된 세포를 1.5 ml의 0.9 % NaCl을 포함하는 마이크로튜브에 수확하고, 와동(vortex) 후 610 nm에서의 흡광도에 의해 세포 밀도를 측정하였다. 주 배 양으로써, 0.5 g의 CaCO₃를 포함하는 오토클레이빙된 100 ml 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask)에 담긴 10 ml의 생산 배지에 1.5의 개시 OD에 달하도록 현탁된 세포를 접종하였다. 주 배양은 회전 진탕기 (스위스 보트밍겐 소재 인포르스(Infors) 사의 AJ118) 상에서 200 rpm, 30 ℃로 48-78시간 동안 수행되었다. 카다베린 및 라이신의 농도는 HPLC (아질렌트(Agilent) 사의 1100 시리즈 LC 시스템)를 사용하여 측정되었다.

라이신 데카르복실라제 유전자를 함유하는 모든 재조합 균주로 배양된 배지에는 상당량의 카다베린이 축적되었다. 반대로, 라이신 생산성에서는 현저한 감소가 관찰되었다. 라이신이 카다베린으로 완전히 전환된다고 간주하면, 라이신과 동일한 수의 카다베린 분자가 생성되어야 한다. 그러나, 축적되는 카다베린의 양은 숙주 균주에 의해 생성되는 라이신의 그것에 비해 적은 반면, 상당량의 부산물인 아세틸카다베린이 부수적으로 축적됨으로써, 당 수율의 감소를 초래한다.

HPLC 분석 이외에도, 카다베린과 아세틸카다베린은 질량 분광측정법에 의해 식별된다.

4. 아세틸카다베린-형성 효소의 식별

아세틸카다베린-형성 효소를 식별하기 위하여, 단백질 정제를 수행하였다. CM 액체에서 배양된 C. 글루타미쿰 균주 ATCC13032 또는 소정 유도체를 수확하여, 세척하고, 50 mM의 Tris-HCl (pH 7.8), 0.02 % Brij 35, 단백질 억제제 혼합물 (로체(Roche) 사의 콤플리트(Complete)) 및 20 % 글리세롤로 구성되는 표준 버퍼 0.5 부피에 현탁하였다. 마이크로플루이다이저(Microfluidizer) (마이크로플루이딕스 코.(Microfluidics Co.) 사의 M-110EH)를 사용하여 세포 현탁액을 붕괴시키고, 이어서 마이크로필트레이터(Microfiltrater) (사토리우스(Satorius) 사의 MF42)를 사용하여 여과하였다.

Q 세파로스(Q Sepharose) (아머샴 바이오사이언스(Amersham Bioscience) 사, 50 × 300 mm, 10 mM Tris (pH 7.5) 버퍼 중 0.0-0.5 M-NaCl의 선형 구배, 10 ml/분의 유량), 페닐 세파로스(Phenyl Sepharose) (아머샴 바이오사이언스 사, 50 × 300 mm, 10 mM Tris (pH 7.5) 버퍼 중 1.5-0.0 M-암모늄 아세테이트의 선형 구배, 10 ml/분의 유량), 수퍼덱스(Superdex) (아머샴 바이오사이언스 사, 26 × 600 mm, 10 mM의 Tris (pH 7.5) 버퍼, 4 ml/분의 유량), 모노-Q(Mono-Q) (아머샴 바이오사이언스 사, 5 × 50 mm, 10 mM Tris (pH 7.5) 버퍼 중 0.0-0.5 M-NaCl의 선형 구배, 1 ml/분의 유량), 및 수퍼로스(Superose) (아머샴 바이오사이언스 사, 15 × 300 mm, 10 mM의 Tris (pH 7.5) 버퍼, 0.3 ml/분의 유량)의 일련 컬럼에 적용함으로써 여과액 중의 효소를 정제하였다. 정제 단계 전체를 통하여, 분획 중 아세틸트랜스퍼라제의 효소 활성 및 효소 반응 혼합물 중의 아세틸카다베린의 존재를 모니터링하였다. 하기의 조건 하에서, 1 ml의 총 부피 중에서 TNB (티오니트로벤조산)의 생성에 기인하는 412 nm에서의 흡광도 증가를 모니터링함으로써, 효소 활성을 측정하였다:

10 mM의 Tris-HCl (pH 7.8), 0.1 mM의 DTNB (5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산)), 0.25 mM의 아세틸 CoA, 5 mM의 카다베린, 효소 용액.

TNB에 대한 13.6 mM^-1×cm^-1의 몰 흡광 계수(molar extinction coefficient)를 사용하여 비활성을 계산하였다.

수퍼로스 컬럼으로부터의 효소 활성을 포함하는 분획을 SDS-PAGE 겔에 적재하였다. 쿠마시(Coomassie)-염색된 겔로부터 절제한 후, 헤르만(Hermann) 등 (문헌 [Electrophoresis (2001), 22, 1712-1723])에 의해 기술된 바와 같이 변형된 트립신 (맨하임 소재 로체 사)을 사용하여 단백질 스폿(spot)을 분해시켰다. 펩티드의 나노-HPLC 분리 (LC 충전, RP18 컬럼, 길이 15 cm, i.d. 75 ㎛) 후, 마스코트(MASCOT) 소프트웨어를 사용하여 (문헌 [David et al. (1999) Electrophoresis, 20, 3551-3567]) LCQ 어드밴티지(LCQ advantage) (써모 일렉트론(Thermo Electron) 사) 상에서 질량 분광측정 식별을 수행하였다. 그 결과, 아세틸트랜스퍼라제 (유전자은행 수납 번호: NP_600742)가 잠재적인 아세틸카다베린-형성 효소로서 식별되었다.

5. 플라스미드 구성 및 아세틸트랜스퍼라제 유전자의 붕괴

식별된 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자의 염색체 붕괴를 위하여, 2회의 연이은 동종유래 재조합 실행에 의해 무-표식자 조작을 가능케 하는 재조합 플라스미드를 구성하였다. 상류에 대하여 WKJ203/WKJ205, 하류에 대하여 WKJ206/WKJ204의 PCR 프라이머 세트를 사용하여, C. 글루타미쿰 염색체 DNA로부터 유전자의 상류 및 하류 영역을 포함하는 DNA 단편을 증폭하고, PCR 프라이머 WKJ203/WKJ204를 이용한 융합 PCR을 위한 주형으로서 사용하여 유전자의 중앙 영역 이 제거된 융합 단편을 제조하였다. 융합 PCR의 생성물을 정제하고, Xhol 및 Spel로 분해하여, 동일한 제한 효소에 의해 분해된 C. 글루타미쿰의 게놈상 위치 (문헌 [Becker et al (2005), Applied and Environmental Microbiology, 71 (12), p.8587-8596])에 서열을 통합시키는 pClikintsacB 벡터에 삽입하였다.

다음에, 플라스미드를 아세틸트랜스퍼라제 유전자의 천연 코딩 영역을 붕괴시키는 데에 사용하였다. 사용된 균주는 염색체의 bioD 위치로 ldcC 유전자가 통합됨으로써 카다베린과 아세틸카다베린 모두를 생산하는 LU11271 LdcC이었다. 유전자의 중앙 서열을 붕괴시키는 데에는 상류 및 하류 영역마다 각각 하나씩 2회의 연이은 재조합 실행이 필요하였다. 붕괴된 돌연변이는 프라이머 WKJ203/WKJ204를 사용한 PCR 및 서던 하이브리드화 분석에 의해 확인되었다.

사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머:

6. 아세틸카다베린 형성 및 카다베린 생산성에 대한 효과

아세틸카다베린 형성 및 카다베린 생산성에 대한 아세틸트랜스퍼라제 유전자 붕괴의 효과를 분석하기 위하여, 붕괴된 돌연변이 상에서 진탕 플라스크 실험을 수행하였다. 카다베린 생산과 동일한 배양 배지 및 조건이 사용되었다 (전기 참조). 붕되된 돌연변이는 아세틸카다베린의 축적을 나타내지 않았다. 이는 오직 식별된 아세틸트랜스퍼라제 만이 아세틸카다베린 형성의 원인이라는 것을 나타낸다. 따라 서, 아세틸카다베린 형성의 제거를 초래하는 유전자 붕괴에 의해 카다베린의 생산성은 향상되었다.

아세틸트랜스퍼라제의 유전자 서열 및 폴리펩티드 서열을 하기에 개시한다:

아세틸트랜스퍼라제 유전자 서열

단백질 서열

SEQUENCE LISTING <110> BASF Aktiengesellschaft <120> Process for the production of cadaverine <130> PF57813 <160> 2 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 715 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu 1 5 10 15 Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln 20 25 30 Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn 35 40 45 Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu 50 55 60 Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr 65 70 75 80 Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp 100 105 110 Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile 115 120 125 Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys 130 135 140 Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys 145 150 155 160 Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met 165 170 175 Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp 180 185 190 His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe 195 200 205 Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn 210 215 220 Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile 225 230 235 240 Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp 245 250 255 Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu 260 265 270 Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg 275 280 285 Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys 305 310 315 320 Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr 325 330 335 Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly 340 345 350 Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu 355 360 365 Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val 370 375 380 Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser 385 390 395 400 Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met 405 410 415 Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala 420 425 430 Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly 435 440 445 Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys 450 455 460 Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp 465 470 475 480 Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro 485 490 495 Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser 500 505 510 Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr 515 520 525 Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr 530 535 540 Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe 545 550 555 560 Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu 565 570 575 Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu 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Leu Asn Glu Tyr Leu Pro Leu Tyr 65 70 75 80 Ala Phe Ile Asn Thr His Ser Thr Met Asp Val Ser Val Gln Asp Met 85 90 95 Arg Met Ala Leu Trp Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Gln Ala Glu Asp 100 105 110 Ile Ala Ile Arg Met Arg Gln Tyr Thr Asp Glu Tyr Leu Asp Asn Ile 115 120 125 Thr Pro Pro Phe Thr Lys Ala Leu Phe Thr Tyr Val Lys Glu Arg Lys 130 135 140 Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Tyr Gln Lys 145 150 155 160 Ser Pro Val Gly Cys Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Gly Asn Thr Leu 165 170 175 Lys Ala Asp Val Ser Ile Ser Val Thr Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp 180 185 190 His Thr Gly Pro His Leu Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Ala Arg Thr Phe 195 200 205 Gly Ala Glu Gln Ser Tyr Ile Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ser Asn 210 215 220 Lys Ile Val Gly Met Tyr Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr Leu Leu Ile 225 230 235 240 Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Ala His Leu Leu Met Met Asn Asp 245 250 255 Val Val Pro Val Trp Leu Lys Pro Thr Arg Asn Ala Leu Gly Ile Leu 260 265 270 Gly Gly Ile Pro Arg Arg Glu Phe Thr Arg Asp Ser Ile Glu Glu Lys 275 280 285 Val Ala Ala Thr Thr Gln Ala Gln Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Trp Ile Lys Gln 305 310 315 320 Thr Leu Asp Val Pro Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr 325 330 335 Thr His Phe His Pro Ile Tyr Gln Gly Lys Ser Gly Met Ser Gly Glu 340 345 350 Arg Val Ala Gly Lys Val Ile Phe Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Met 355 360 365 Leu Ala Ala Leu Ser Gln Ala Ser Leu Ile His Ile Lys Gly Glu Tyr 370 375 380 Asp Glu Glu Ala Phe Asn Glu Ala Phe Met Met His Thr Thr Thr Ser 385 390 395 400 Pro Ser Tyr Pro Ile Val Ala Ser Val Glu Thr Ala Ala Ala Met Leu 405 410 415 Arg Gly Asn Pro Gly Lys Arg Leu Ile Asn Arg Ser Val Glu Arg Ala 420 425 430 Leu His Phe Arg Lys Glu Val Gln Arg Leu Arg Glu Glu Ser Asp Gly 435 440 445 Trp Phe Phe Asp Ile Trp Gln Pro Pro Gln Val Asp Glu Ala Glu Cys 450 455 460 Trp Pro Val Ala Pro Gly Glu Gln Trp His Gly Phe Asn Asp Ala Asp 465 470 475 480 Ala Asp His Met Phe Leu Asp Pro Val Lys 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Glu Asp Gly Val Tyr 690 695 700 Arg Val Arg Val Leu Lys Met Ala Gly 705 710

Claims

조절해제된 라이신 데카르복실라제 유전자, 및 아스파르토키나제, 아스파르테이트세미알데하이드 데하이드로제나제, 디하이드로디피콜리네이트 신타제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제, 테트라하이드로디피콜리네이트 숙시닐라제, 숙시닐-아미노-케토피멜레이트 트랜스아미나제, 숙시닐-디아미노-피멜레이트 데숙시닐라제, 디아미노피멜레이트 에피머라제, 디아미노피멜레이트 데하이드로제나제, 아르기닐-tRNA 신테타제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로제나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 6-포스포글루코노락토나제, 프럭토스 1,6-비포스파타제, 호모세린 데하이드로제나제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 메틸말로닐-CoA 뮤타제로 구성되는 군 (i)에서 선택되는 1종 이상의 조절해제된 유전자를 가지는 재조합 미생물을 구성하는 것 (단, 유전자 (i)로서 아스파르토키나제가 조절해제되는 경우, 1종 이상의 아스파르토키나제가 아닌 다른 제2의 유전자 (i)이 조절해제되어야 함), 및 상기 미생물을 배양하는 것에 의한, 카다베린의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 미생물은 코리네박테리움 속에 속하는 방법.
제 1항에 있어서, 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 방법.
제 1항에 있어서, 조절해제된 라이신 데카르복실라제는 그 미생물에 대하여 이종유래의 것인 방법.
제 1항에 있어서, 재조합 미생물은 에셔리키아로부터의 라이신 데카르복실라제를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 라이신 데카르복실라제는 SEQ ID NO:1 또는 2의 폴리펩티드 서열, 또는 라이신 데카르복실라제 활성을 가지며 SEQ ID NO:1 또는 2와 80 % 이상 동일한 폴리펩티드 서열을 가지는 방법.
제 1항에 있어서, MO의 디아민 아세틸트랜스퍼라제 활성이 조절해제되는 방법.
제 1항에 따른 카다베린의 제조, 및 그 카다베린의 디카르복실산과의 반응을 포함하는, 폴리아미드의 제조 방법.