KR20090092438A

KR20090092438A - Ｌ-트립토판을 생산하는 미생물 및 이를 이용한ｌ-트립토판 생산 방법

Info

Publication number: KR20090092438A
Application number: KR1020080017681A
Authority: KR
Inventors: 박혜민; 이병호; 이경한; 이효형; 구현민; 양영렬; 최종수; 김철하
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2008-02-27
Filing date: 2008-02-27
Publication date: 2009-09-01

Abstract

본 발명의 목적은 아이소시트레이트 라이아제 억제제를 암호화하는 iclR 유전자의 발현을 약화시켜, 아세트산 생산능이 억제되도록 변형된 L-트립토판을 생산하는 미생물, 및 이러한 미생물을 이용하여 L-트립토판을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

Description

Ｌ-트립토판을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-트립토판 생산 방법 {L-tryptophan producing microorganism and the method for producing L-tryptophan using the same}

본 발명은 L-트립토판을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 L-트립토판 생산방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 아이소시트레이트 라이아제 억제제를 암호화하는 iclR 유전자의 발현을 약화시켜, 아세트산 생산능이 억제되도록 변형된 L-트립토판을 생산하는 미생물 및 그 미생물을 이용하여 L-트립토판을 생산하는 방법에 관한 것이다.

L-트립토판은 필수 아미노산의 일종으로 사료첨가제, 수면효과나 정신 안정효과가 있어 수액제 등의 의약품 원료 및 건강식품소재 등으로 널리 사용되어 왔으며, 화학합성법, 효소반응법, 발효법 등을 이용하여 생산되고 있다.

그러나, 화학합성법의 경우 고온, 고압의 조건이 필요하며 그 산물에 D형과 L형이 혼재하기 때문에 정제과정이 쉽지 않다. 효소반응법의 경우, 대한민국 특허 공고 90-005773에서와 같이 기질로 사용되는 인돌과 세린의 가격이 고가일 뿐만 아니라 사용되는 효소의 안정성에 문제가 있었다. 따라서 현재는 미생물을 이용한 직접 발효법에 의한 생산방법을 주로 사용하고 있다.

한편, 종래의 미생물에 의한 트립토판의 생산은 대장균과 코리네박테리움 등 여러 다양한 미생물의 영양요구성 균주와 조절부위 변이 균주에서 이루어져 왔으며, 1980년대에 들어서면서부터 유전자 재조합 기술이 급격히 발달하여 대사과정과 그 조절 기작들이 자세히 규명됨에 따라 많은 연구자들이 유전자 조작 기법을 이용하여 우수한 재조합 균주들을 개발하는데 큰 성과를 거두었고 고도의 생산성 향상을 가져왔다. 미생물을 이용한 직접 발효법으로 트립토판을 생산하는 국내특허로는 트립토판 유사체 내성을 갖거나 영양 요구성을 갖는 변이 균주를 이용한 경우 (대한민국 특허공고 87-1813, 90-8251, 92-7405)와 재조합 균주를 이용한 경우 (대한민국 특허 공고 90-5772)가 공지되어 있다.

이러한 트립토판 유사체 내성 균주들은 주로 트립토판 생합성 과정에서 효소들의 피드백 저해를 극복하는 것을 주된 목표로 하였고, 재조합 균주들 역시 트립토판 생합성 과정에서 효소들의 클로닝에 목표를 두었으며, 모두 실제로 괄목할 만한 성과를 가져왔다. 그러나 종래의 대장균 인공변이주를 이용한 L-트립토판 생산 방법은 값싼 배양기질을 사용하여 발효법에 의해 L-트립토판을 생산하는 장점은 있었지만, 결정적으로 트립토판의 생산성이 낮다는 문제점이 있었다. 또한, 당사에서 개발하여 보유하고 있는 CJ285 (대한민국 특허공개 10-2005-0059685호) 균주의 경우에도 L-트립토판을 산업적으로 대량생산 하는데 있어서, 생산성이 미흡한 면이 있었다.

한편, 포도당이 함유된 배지를 사용하는 직접 발효법으로 L-트립토판과 같은 아미노산을 생산할 경우, 발효액 중의 용존산소량을 충분히 높여주지 않으면 발효액 중에 부산물로 초산이 축적된다. 초산 축적의 생화학적 메카니즘은 해당작용 또는 PTS(phosphoenolpyruvate : sugar phosphotransferase system)에 의해 생성된 세포내 과량의 피루빈산이 배양액 내 용존산소 제한으로 세포에 정상적으로 산소를 공급할 수 없게 될 경우, TCA 사이클로 유입되어 산화되지 못하고, 아세틸 CoA를 거쳐 효소인 포스포트랜스아세틸라제(phosphotransacetylase)와 아세테이트 키나제(acetate kinase)에 의해 초산으로 전환된 후 세포밖으로 방출되는 것으로 알려져 있다(J. Gen. Microbiol., 135, 2875-2883, 1989). 이렇게 배양액에 축적된 초산은 미생물의 성장을 저해시켜 결과적으로 목적 아미노산의 생산성을 급격히 저하시키는데, 이러한 초산 축적을 방지하기 위하여 발효중에 교반속도를 높이거나, 통기량을 증가시켜 발효를 수행하지만, 이러한 방법은 근본적인 해결책이 될 수 없기 때문에 공업화 과정에서 문제점으로 제시될 수 있다.

초산 축적을 방지하기 위해, 상기와 같은 물리적 방법 외에, 균주 내에서 아세트산 생성에 관여하는 효소를 유전공학적으로 조절시켜, 아세트산 축적 정도를 감소시키려는 시도가 있어 왔다. 아세트산의 생성을 촉매하는 효소의 활성이 감소되거나 제거된 균주를 사용한 발효 방법과 관련된 특허의 예로는, 포스포아세틸트랜스퍼라제(pta) 및 락테이트 데하이드로게나제(ldh)의 활성이 결핍된 에스케리치아 콜리를 사용한 L-아미노산의 생산 방법 (WO99/06532), 피루베이트 옥시다제(poxB) 의 활성이 결핍된 엔테로박테리아세애 과를 사용한 L-아미노산의 생산 방법 및 피루베이트 옥시다제(poxB)의 활성이 결핍된 엔테로박테리아세애를 사용한 D-판토텐산의 생산 방법 (WO02/36797) 등이 있다.

그러나, 현재까지 아이소시트레이트 라이아제 억제제를 암호화하는 iclR 유전자의 발현을 약화시킴으로써, 아세트산의 축적 정도를 감소시켜 L-트립토판의 생산성을 증대시킨 미생물에 대해서는 개시된 바가 없다.

이에, 본 발명자는 대장균 염색체 상의 iclR 유전자를 결손시켜, 아세트산 생산능이 억제되도록 변형되어 L-트립토판을 생산성이 향상된 미생물을 제공할 수 있게 되어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 아이소시트레이트 라이아제 억제제를 암호화하는 iclR 유전자의 발현을 약화시켜, 아세트산 생산능이 억제되도록 변형된 L-트립토판을 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 a) iclR 유전자를 결손시키기 위한 핵산 분자를 제조하는 단계, b) 상기 핵산 분자를 L-트립토판을 생산하는 미생물에 도입시켜 상기 미생물의 염색체 상에 존재하는 iclR 유전자와 상동 재조합시키는 단계, 및 c) iclR 유전자가 약화된 미생물을 선별하는 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는, L-트립토판 생산용 미생물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 L-트립토판을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 아이소시트레이트 라이아제 억제제(repressor of isocitrate lyase)를 암호화하는 iclR 유전자를 약화시켜, 아세트산 생산능이 억제되도록 변형된 L-트립토판을 생산하는 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, iclR 유전자는 글리옥실레이트 회로에 관여하는 효소를 발현하는 aceBA 오페론을 조절하는 인자로서, 아이소시트레이트 라이아제 억제제를 암호화하는 유전자를 말한다. 대장균 (Escherichia coli)에 있어서, 상기 iclR 유전자는 공지되어 있으며, 유전자 서열은 미국생물공학정보센터 데이터베이스(NCBI gene ID: 16131983)로부터 얻을 수 있다. 또한, 상기 iclR 유전자에는 유전코드의 축퇴 또는 기능적으로 중성인 돌연변이로 인하여 발생하는 대립유전자 (allele)도 포함한다.

본 발명에서 사용된 용어 "약화"는 유전자가 코딩하는 효소의 활성이 낮아지거나 제거되는 것을 의미한다. 이는 유전자의 발현 또는 효소 단백질의 촉매적 또는 조절 성질을 감소시키거나 제거함을 통해 달성될 수 있는데, 구체적으로는 염색체상의 효소를 암호화하는 유전자 자체를 붕괴시키거나, 유전자의 프로모터 및 샤인 달가노(shine DArgarno) 같은 발현 조절 서열을 변형시키는 것이 가능하다.

구체적인 양태로서, 본 발명의 iclR 유전자의 약화는 염색체상의 iclR 유전자의 결손을 통해 이루어질 수 있다. 이는 화학물질이나 자외선과 같은 빛을 이용하여 돌연변이를 유발하고, iclR 유전자 부위가 변이되어 결실된 돌연변이체를 얻거나, 유전자 재조합 기술을 통해 유전자 활성이 제거되도록 작제된 뉴클레오타이드를 상동 재조합에 의한 유전자 치환법으로 염색체상의 유전자를 대체시킴으로써 관련 유전자를 결손시킬 수 있으며, 이를 통해 효소 활성을 감소시키거나 제거된 돌연변이체를 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물은 L-트립토판을 생산할 수 있고, iclR 유전자가 결손된 미생물이면 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함된다. 예를 들면, 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있다. 바람직하게는, 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae) 과에 속하는 미생물이며, 더욱 바람직하게는 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물이다. 가장 바람직하게는, 대장균(Escherichia coli) CJ285(KCCM-10534)이다.

본 발명의 상기 아이소시트레이트 라이아제 억제제를 암호화하는 iclR 유전자가 약화된 미생물은 아세트산 생산능이 억제된다. 일반적으로, 미생물 배양 시, 배지 내에 아세트산이 축적되면 미생물의 생장이 저해되는데, 본 발명의 iclR 유전자가 약화된 미생물은 아세트산 생산능이 억제되도록 변형되어 있기 때문에, 배지 내의 아세트산 축적 정도를 낮출 수 있어서 미생물의 생장 속도를 증가시킬 수 있다. 이는 결국, 본 발명의 미생물의 생장 속도를 증가시킴으로써, 미생물이 생산해내는 L-트립토판의 생산능을 증대시킬 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 a) iclR 유전자를 결손시키기 위한 핵산 분자를 제조하는 단계; b) 상기 핵산 분자를 L-트립토판을 생산하는 미생물에 도입시켜 상기 미생물의 염색체 상에 존재하는 iclR 유전자와 재조합시키는 단계; 및 c) iclR 유전자가 약화된 미생물을 선별하는 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는, L-트립토판 생산용 미생물의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 a) iclR 유전자를 결손시키기 위한 핵산 분자를 제조하는 단계는 숙주 세포 게놈상의 iclR 유전자 결손을 위해 사용되는 핵산 분자를 제조하는 단계를 의미한다. 본 발명의 iclR 유전자를 결손시키기 위한 핵산 분자는 결손된 iclR 유전자 서열을 포함한다. 결손된 iclR 유전자 서열은 숙주 세포 내의 iclR 유전자와 서열 상동성을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하나, 결실, 치환, 및 역위와 같은 돌연변이가 도입되어 활성이 있는 iclR 산물을 발현할 수 없는, 즉 활성이 제거되도록 작제된 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.

또한, 상기 핵산 분자는 선별마커 영역을 포함하는 것이 바람직하다. 선별마커(selection marker)란 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 항생제 내성 유전자의 일종인 클로람페니콜 내성 유전자이다.

상기 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 분리 또는 제조할 수 있다. 예를 들어, 적절한 프라이머 서열을 이용하여 PCR을 통해 분리할 수 있다. 또한, 자동화된 DNA 합성기를 이용하는 표준 합성 기술을 이용하여 제조할 수도 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "상동(homologous)"이란 iclR 유전자를 결손시키기 위한 유전자 영역과 이에 해당하는 게놈상의 iclR 유전자의 핵산 서열과의 동일성 정도를 나타내는 것으로, 적어도 90% 이상 동일하고, 바람직하게는 95% 이상 동일하다.

본 발명의 상기 b) 단계는 상기 a) 단계에서 제조한 핵산 분자를 L-트립토판을 생산하는 미생물에 도입시켜 숙주 세포의 염색체상에 존재하는 iclR 유전자와 상동 재조합시킴으로써, 숙주 세포 염색체상의 iclR 유전자를 결손시키는 단계를 의미한다.

상기 a) 단계에서 제조한 핵산 분자를 미생물 내로 도입시키는 방법은 예를 들면, 형질전환(transformation), 접합(conjugation) 및 형질도입(transduction) 방법이 가능하지만, 형질전환 방법이 바람직하다. 본 발명의 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 형질전환은 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함되나, 이들로 제한되지 않는다.

또한, 상기 핵산 분자가 형질전환에 의하여 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 결손 절차는 상기 핵산 분자를 균주의 배양물과 혼합하여 수행할 수 있다. 이 경우, 균주는 천연적으로 DNA 유입에 대해 컴피턴트 (competent)하여 형질전환할 수 있으나, 사전에 균주를 적절한 방법에 의해 DNA 유입을 위해 컴피턴트하도록 만드는 것이 바람직하다 (LeBlanc 등, Plasmid 28, 130-145, 1992; Pozzi 등, J. Bacteriol. 178, 6087-6090, 1996 참조).

본 발명의 상기 c) 단계는 상기 b) 단계를 통해 iclR 유전자가 결손된 변이주를 선별하는 단계를 의미한다.

본 발명에서 iclR 유전자가 결손된 변이주는 상기 a) 단계의 핵산 분자에 포함된 선별 마커가 발현하는 항생제 내성 유전자를 이용하여 선별이 가능하다. 표적 iclR 유전자 부위가 항생제 내성 유전자를 포함하는 핵산 분자로 상동 재조합됨으로써 iclR 유전자가 결손되면, 적절한 항생물질이 함유된 배지에서 균주를 키움으로써 형질전환체를 선별할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 본 발명자는 iclR 유전자 일부 및 클로람페니콜 내성 유전자의 일부 염기서열을 갖도록 프라이머들을 제작하여 iclR 유전자를 결손시키기 위한 핵산 분자를 제조한 후, 람다 레드 리컴비나제(lambda red recombinase)를 이용한 원스텝 인액티베이션(one step inactivation) 방법을 이용하여 대장균 CJ285에 형질전환시키고, 클로람페니콜이 포함된 배지에서 키움으로써, iclR 유전자가 결손된 재조합 균주를 얻었다. 또한, 상기 iclR 유전자가 결손된 재조합 균주는 모균주에 비해 아세트산 생산능이 억제되어 아세트산 생산량이 낮아짐을 확인하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 제작된, iclR 유전자가 결손되어 아세트산 생산능이 억제되고, 모균주에 비해 고농도의 L-트립토판을 생성하는 재조합 균주를 (Escherichia coli) CA04-1001로 명명하였고, 부다페스트협약 하의 국제기관인 한국미생물보존센터에 2008년 2월 18일에 기탁번호 제 KCCM10927P호로 기탁하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 L-트립토판을 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 미생물은 아이소시트레이트 라이아제 억제제를 암호화하는 iclR 유전자가 약화되어, 아세트산 생산능이 억제되도록 변형되어 있으므로, 본 발명의 미생물을 배양시켜 L-트립토판의 생산 효율을 높일 수 있다.

상기 미생물의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 배양 방법은 예를 들면, "Biochemical Engineering" (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176) 에 개시되어 있다.

본 발명에서 미생물의 배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 상기 배양 방법의 예로서, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(cintinuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 공지된 배양 방법은 예를 들면, "Biochemical Engineering" (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176) 에 개시되어 있다.

배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, "Manual of Methods for General Bacteriology" from American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)). 배지 내 탄소 공급원은 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 이용할 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 질소 공급원은 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액(CSL), 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)을 이용할 수 있으며, 이들 물질 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 인 공급원으로서 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨 함유 염을 이용할 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필수적인 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철)을 함유할 수 있으며, 최종적으로, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장-촉진 물질을 상기 언급한 물질 외에 사용할 수 있다. 적합한 전구체를 상기 배양 배지에 추가로 가할 수 있다. 상기 공급 물질은 배양물에 한번에 모두 가하거나, 배양중 적절하게 공급할 수 있다.

배양물의 pH는 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 적절히 사용하여 조절할 수 있다. 발포는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 조절할 수 있다. 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물, 예를 들어 공기를 배양물 중으로 도입시켜 호기성 조건을 유지시킬 수 있다. 배양 온도는 통상적으로 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃이다. 배양은 원하는 L-트립토판의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다. L-트립토판은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.

한편, 본 발명의 상기한 미생물를 배양하는 단계를 포함하는 L-트립토판의 생산 방법은 상기 배양하는 단계에서 생성되는 트립토판을 회수하는 방법을 추가로 포함할 수 있다. L-트립토판을 회수하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법으로 세포 또는 배양 배지로부터 L-트립토판을 분리해낼 수 있다. L-트립토판 회수 방법의 예로서, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등의 방법이 있으며, 구체적으로는 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 아이소시트레이트 라이아제 억제제를 암호화하는 iclR 유전자를 약화시켜, 아세트산 생산능이 억제되도록 변형된 L-트립토판을 생산하는 미생물은, iclR 유전자가 결손되어 미생물 생장을 저해할 수 있는 아세트산 생성이 억제됨으로써, 미생물의 L-트립토판 생산 효율을 높일 수 있다.

실시예 1 : iclR 유전자가 결손된 재조합 L-트립토판 생산 균주의 제작

iclR (NCBI gene ID: 16131983, 서열번호 1) 유전자는 대장균의 glyoxylate shunt 경로의 저해 단백질, 즉 아이소시트레이트 라이아제(isocitrate lyase)의 전사 억제제를 코딩하는 것으로 알려진 유전자인데, 본 실시예에서는 대장균에서 iclR 유전자를 상동 재조합에 의하여 결손시켰다.

이를 위하여, Datsenko KA 등이 개발한 람다 레드 레컴비나제 (lambda Red recombinase) 를 이용한 1단계 불활성화 (one step inactivation) 방법을 사용하였다 (One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Datsenko KA, Wanner BL., Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jun 6;97(12):6640-5).

양쪽에 상기의 yjeO 유전자의 일부를 포함하고, 중간에 클로람페니콜 (chloramphenicol) 내성 유전자를 갖는 DNA 단편을 얻기 위해, pKD3 플라스미드를 주형으로 PCR HL premix kit (BIONEER사 제품)를 사용하여 중합효소 연쇄반응법(polymerase chain reaction, 이하 PCR법이라 칭함) [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories] 을 수행하였다. 이때 사용한 프라이머는 상기 iclR 유전자의 일부분과 pKD3 유전자의 클로람페니컬 내성 유전자의 일부 염기서열을 갖는 표 1의 프라이머 1 및 프라이머 2이며, 조건은 변성 (denaturation) 94℃ 30초, 어닐링 (annealing) 55℃ 30초, 신장 (polymerization) 72℃ 1분을 25회 반복 수행하였다.

프라이머 1	5'-CAATAAAAATGAAAATGATTTCCACGATACAGAAAAAAGAGACTGTCATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC -3'(서열번호 2)
프라이머 2	5'-AGAATATTGCCTCTGCCCGCCAGAAAAAGTCAGCGCATTCCACCGTACGCCATATGAATATCCTCCTTAG -3'(서열번호 3)

이 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 젤 (agarose gel) 에서 전기 영동 후 원하는 크기의 밴드 (약 1100 염기쌍) 를 용리하여 얻었다.

그 다음으로, Datsenko KA 등이 개발한 방법에 따라 pKD46으로 형질 전환된 L-트립토판 생산 대장균 CJ285 (대한민국 특허공개 10-2005-0059685호)를 컴피턴트 상태로 제조한 후, PCR법으로 얻어진 1100 염기쌍 크기의 유전자 단편을 형질 전환시켰다. 클로람페니콜(15mg/L)이 든 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 얻어진 콜로니는 PCR법을 통한 결과물(1400 염기쌍)로 iclR 유전자가 결손되었다는 것을 확인하였다. 이때 사용한 프라이머는 프라이머 3 및 프라이머 4이며, 조건은 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 2분을 25회 반복 수행하였다. 이후 얻어진 재조합 균주를 CA04-1001(기탁번호 KCCM10927P)로 명명하였다.

프라이머 3	5'-TTTGTTCAACATTAACTCAT -3' (서열번호 4)
프라이머 4	5'-TCTCATAATGCAGCCGTAAA -3' (서열번호 5)

실시예 2 : iclR 유전자가 결손된 재조합 미생물의 아세트산 생산능 비교

본 실시예에서는 실시예 1에서 제작된 재조합 균주 CA04-1001의 콜로니를 백금이를 이용하여 LB (Lurina-Bertani. 조성: 박토 트립톤 10g/l, 박토 효모엑기스 5g/l, 염화나트륨 10g/l) 고체 배지에서 밤새 배양한 후, 성장한 균주를 표 3에서와 같은 조성을 갖는 플라스크 역가 배지에 한 백금이 씩 접종하였다. 균주 접종 후 37℃, 200rpm에서 48시간 동안 배양하고, 그로부터 생성된 아세트산 농도와 CJ285에서 얻어진 아세트산 농도를 비교하였다(표 4). 생성된 아세트산 농도는 2개의 플라스크 결과의 평균값을 사용하였다.

플라스크 역가 배지의 조성	농도(g/L)
글루코오스 (glucose)	60
효모 추출물 (Yeast extract)	2.5
암모늄 설페이트 ((NH₄)₂SO₄)	10
마그네슘 설페이트 (MgSO₄ _·7H₂0)	1
구연산 나트륨 (Sodium citrate)	5
소디움 클로라이드 (NaCl)	1
타이로신 (L-tyrosine)	0.1
페닐알라닌 (L-phenylalanine)	0.15
칼슘 카르보네이트 (CaCO₃)	40
포타슘 디히드로겐포스페이트 (K₂HPO₄)	1

균주	아세트산(g/L)
CJ285	4.01
CA04-1001	0.80

그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, 재조합 균주 CA04-1001의 아세트산 농도가 모균주인 대장균 CJ285에서보다 80% 낮아졌음을 확인하였다.

실시예 3 : iclR 유전자가 결손된 재조합 미생물의 L-트립토판 생산능 비교

본 실시예에서는 실시예 1에서 제작된 재조합 균주 CA04-1001의 콜로니를 백금이를 이용하여 LB (Lurina-Bertani. 조성: 박토 트립톤 10g/l, 박토 효모엑기스 5g/l, 염화나트륨 10g/l) 고체 배지에서 밤새 배양한 후, 성장한 균주를 표 3에서와 같은 조성을 갖는 플라스크 역가 배지에 한 백금이 씩 접종하였다. 균주 접종 후 37℃, 200rpm에서 48시간 동안 배양하고, 그로부터 얻어진 트립토판 농도와 모균주인 CJ285에서 얻어진 트립토판 농도를 비교하였다(표 5). 얻어진 L-트립토판 농도는 2개의 플라스크 결과의 평균값을 사용하였다.

균주	L-트립토판(g/L)
CJ285	9.09
CA04 -1001	9.90

그 결과, 표 5에 나타낸 바와 같이, iclR 유전자가 결손된 재조합 균주 CA04-1001의 경우 CJ285균주보다 L-트립토판 농도가 10% 정도 증가되었음을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따른 iclR 유전자를 약화시켜, 아세트산 생산능이 억제되도록 변형된 L-트립토판을 생산하는 미생물은, 미생물 생장을 저해할 수 있는 아세트산 생성이 억제됨으로써, 미생물의 L-트립토판 생산 효율을 높일 수 있다. 이를 통해, 산업에 유용한 L-아미노산의 일종인 L-트립토판을 고수율로 생산해낼 수 있다.

<110> CJ corporation <120> A L-tryptophan producing microorganism and the method for producing L-tryptophan using the same <130> PA070787/KR <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 825 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(825) <223> sequence of iclR gene <400> 1 atggtcgcac ccattcccgc gaaacgcggc agaaaacccg ccgttgccac cgcaccagcg 60 actggacagg ttcagtcttt aacgcgtggc ctgaaattac tggagtggat tgccgaatcc 120 aatggcagtg tggcactcac ggaactggcg caacaagccg ggttacccaa ttccacgacc 180 caccgcctgc taaccacgat gcaacagcag ggtttcgtgc gtcaggttgg cgaactggga 240 cattgggcaa tcggcgcaca tgcctttatg gtcggcagca gctttctcca gagccgtaat 300 ttgttagcga ttgttcaccc tatcctgcgc aatctaatgg aagagtctgg cgaaacggtc 360 aatatggcgg tgcttgatca aagcgatcac gaagcgatta ttatcgacca ggtacagtgt 420 acgcatctga tgcgaatgtc cgcgcctatc ggcggtaaat tgccgatgca cgcttccggt 480 gcgggtaaag cctttttagc ccaactgagc gaagaacagg tgacgaagct gctgcaccgc 540 aaagggttac atgcctatac ccacgcaacg ctggtgtctc ctgtgcattt aaaagaagat 600 ctcgcccaaa cgcgcaaacg gggttattca tttgacgatg aggaacatgc actggggcta 660 cgttgccttg cagcgtgtat tttcgatgag caccgtgaac cgtttgccgc aatttctatt 720 tccggaccga tttcacgtat taccgatgac cgcgtgaccg agtttggcgc gatggtgatt 780 aaagcggcga aggaagtgac gctggcgtac ggtggaatgc gctga 825 <210> 2 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 for one step inactivation of iclR gene <400> 2 caataaaaat gaaaatgatt tccacgatac agaaaaaaga gactgtcatg gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 3 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 for one step inactivation of iclR gene <400> 3 agaatattgc ctctgcccgc cagaaaaagt cagcgcattc caccgtacgc catatgaata 60 tcctccttag 70 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 for identifying defect of iclR gene <400> 4 tttgttcaac attaactcat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 for identifying defect of iclR gene <400> 5 tctcataatg cagccgtaaa 20

Claims

아이소시트레이트 라이아제 억제제를 암호화하는 iclR 유전자를 약화시켜, 아세트산 생산능이 억제되도록 변형된 L-트립토판을 생산하는 미생물.
제1항에 있어서, 상기 약화는 염색체상의 iclR 유전자 결손에 의한 것임을 특징으로 하는 미생물.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 에스케리아 속인 미생물.
제3항에 있어서, 상기 에스케리아 속 미생물은 대장균(Escherichia coli)인 미생물.
제4항에 있어서, 상기 대장균은 대장균 CA04-1001(기탁번호 KCCM10927P)인 것인 미생물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 L-트립토판의 생산 방법.