KR101804017B1

KR101804017B1 - Ｌ-쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-쓰레오닌을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR101804017B1
Application number: KR1020150148004A
Authority: KR
Inventors: 서창일; 박혜민; 이광호; 박상민; 김경림; 정기용
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2015-10-23
Filing date: 2015-10-23
Publication date: 2017-12-04
Also published as: EP3366776A4; JP2018529354A; CN108473992A; US20200248218A1; KR20170047642A; EP3366776A1; RU2018117175A; RU2018117175A3; WO2017069567A1; BR112018008045A2

Abstract

본 발명은 쓰레오닌 생산하는 재조합 미생물, 및 이를 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

Ｌ-쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용하여 Ｌ-쓰레오닌을 생산하는 방법 {Microorganisms having L-threonine productivity and a process for producing L-threonine using the same}

본 발명은 쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물, 및 이를 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

쓰레오닌은 필수 아미노산의 일종으로 사료, 식품 첨가제 및 동물성장 촉진제로 널리 사용되며 의약용으로 수액제, 의약품의 합성 원료로도 사용된다.

미생물을 이용한 쓰레오닌 생산방법에 있어서, 수율을 향상시키기 위해 쓰레오닌 생합성 유전자(ex. ppc, aspC, thrABC) 강화와 함께 쓰레오닌 분해 경로를 차단하는 방법이 알려져 있다(Kwang-Ho Lee, et al., Molecular System Biology 2007). 쓰레오닌 분해 경로 상의 유전자로는 tdh, tdcB, glyA, ilvA 등이 있는데, 이들 중 ilvA (쓰레오닌 디아미나제, Threonine deaminase)가 가장 주요한 쓰레오닌 분해 유전자로 알려져 있다. 분해 유전자 중 ilvA 유전자를 결손할 경우 쓰레오닌의 수율은 크게 향상하지만 고가의 이소루신(isoleucine)에 대한 요구성이 나타나는 문제가 있으므로 일반적으로는 ilvA 활성 약화 및 isoleucine에 대한 고민감성 변이를 적용하는 것으로 알려져 있다(Akhverdian Valery Z, et al.).

한편, 코리네박테리움 속 균주 또는 에스케리키아 속 균주는 쓰레오닌 분해 경로인 ilvA 유전자를 통해서 2-케토부틸산(2-ketobutyrate)를 생성하고 이소루신을 생합성 한다. 하지만 Methanococcus jannaschii와 같은 미생물은 시트라말레이트 합성효소(citramalate synthase, cimA)를 통해서 아세틸-CoA와 피루베이트를 기질로 하여 2-케토부틸산 및 이소루신을 합성할 수 있다고 알려져 있다 (Atsumi, Liao JC, Appl Environ Microbiol., 2008).

이러한 배경 하에서 본 발명자들은 쓰레오닌을 효과적으로 생산하는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 쓰레오닌 생산 균주에 쓰레오닌 디아미나제(Threonine deaminase, IlvA) 효소의 활성을 감소시키고, 시트라말레이트 합성효소(citramalate synthase, cimA) 유전자를 도입하는 방법으로 쓰레오닌 생산 수율을 향상시키고 아세테이트 축적에 따라 배양이 지연되는 기존 문제점(Xie X, et al., J Ind Microbiol Biotechnol. 2014)을 극복할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 쓰레오닌을 고효율로 생산하는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 미생물을 이용하여 쓰레오닌을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양태는 쓰레오닌 디아미나제 효소(threonine deaminase, IlvA)의 활성이 감소 또는 불활성화되고, 시트라말레이트 신타아제 효소(citramalate synthase)의 활성을 가지는, 쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "쓰레오닌"은 하이드록시-α-아미노산으로 체내에서 생성되지 않는 필수 아미노산의 하나로 화학식 HO₂CCH(NH₂)CH(OH)CH₃인 아미노산을 의미한다. 본 발명에서 쓰레오닌은 광학이성질체 L형 또는 D형일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 "쓰레오닌을 생산하는"은 해당 미생물이 배지에서 배양될 때 미생물 내 또는 상기 배지에 쓰레오닌을 생산 및 축적하는 능력을 나타냄을 의미한다. 이러한 쓰레오닌 생성능은 야생형 균주에 의해 보유된 특성이거나 균주 개량에 의해 부여 또는 증강된 특성일 수 있다.

본 발명에서 용어 "쓰레오닌 디아미나제(EC4.3.1.19)"는 쓰레오닌 암모니아리아제(threonine ammonia-lyase) 또는 쓰레오닌 디하이드라타제(threonine dehydratase) 등으로도 지칭되며, 쓰레오닌을 α-케토부티레이트(α-ketobutyrate)와 암모니아로 전환하는 반응을 촉매하는 효소이다. 이렇게 생성된 α-케토부티레이트는 이소루신의 전구체로 사용되기 때문에, 상기 쓰레오닌 디아미나제를 결손시키는 경우 이소루신의 생합성이 정상적이지 않아서 미생물의 생장이 저해될 수 있다.

본 발명에서 용어 "쓰레오닌 디아미나제 효소" 및 "이를 코딩하는 유전자"에는 상기와 같은 쓰레오닌 디아미나제 활성을 가지는 임의의 단백질 및 이를 코딩하는 임의의 유전자가 제한없이 포함될 수 있다.

구체적으로, 상기 쓰레오닌 디아미나제는 미국 생물공학정보센터(NCBI) 또는 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)와 같은 공지의 데이터베이스로부터 용이하게 얻을 수 있으며, 그 예로 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다. 그러나, 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하는 경우가 있기 때문에, 이에 한정되지 않는다.

또한, 서열번호 7의 아미노산 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더욱더 구체적으로는 98% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 쓰레오닌 디아미나제 활성을 가지는 단백질이라면 제한 없이 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.

나아가, 상기 서열과 상동성을 가지는 서열로서 실질적으로 서열번호 7의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 경우도 역시 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.

또한, 상기 쓰레오닌 디아미나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 가질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들면 서열번호 30의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있으며, 이와 상동성이 80%, 구체적으로는 90% 이상, 더욱 구체적으로는 99% 이상인 염기서열을 가질 수 있다. 그러나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0를 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고(예, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 1989 참고), 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.

본 발명에서 용어 "효소의 활성이 감소"된다는 것은 해당 효소의 활성이 야생형 또는 변이 전 상태의 내재적 활성에 비해 감소되는 것을 의미한다.

또한 본 발명에서 용어 "불활성화"란 해당 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 야생 균주에 비하여 낮은 수준으로 감소하거나 전혀 발현이 되지 않는 경우 및 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미한다. 상기 효소의 활성의 감소 또는 불활성화는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 이루어질 수 있다.

구체적으로 해당 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 결실, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소하도록 발현 조절 서열의 변형, 상기 단백질의 활성이 약화되도록 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 방법에 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

상기에서 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은 세균 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다.

다음으로, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소 또는 결실되도록 발현 조절서열을 변형하는 방법은, 특별히 이에 한정되지 않으나, 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열 상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

아울러, 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법은 상기 단백질의 활성을 더욱 약화하도록 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함으로써 수행할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 용어 "재조합 벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 재조합 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 재조합 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용하여 제작될 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 구체적으로는 pECCG117, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.

일례로 숙주세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 도입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어 "시트라말레이트 신타아제(EC2.3.1.182)"는 아세틸-CoA와 파이루베이트를 시트라말레이트 및 코엔자임 A로 변환하는 과정을 촉매하는 효소이다. 이 효소는 메타노코커스 야나시(Methanococcus jannaschii)(Howell et al., J Bacteriol. 181: 331-333, 1999), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interogans)(Xu et al., J Bacteriol. 186: 5400-5409, 2004), 지오박터 설푸레두센스(Geobacter sulfurreducens) 등의 고세균류에서 발견되었으며, 이소루신 생합성의 쓰레오닌-비의존형 경로에 참여한다(Risso et al., J Bacteriol. 190: 2266-2274, 2008). 상기 효소는 기질로서 파이루베이트에 대한 특이성이 높고, 전형적으로 이소루신에 의해 저해된다.

본 발명에서 용어 "시트라말레이트 신타아제 효소" 및 "이를 코딩하는 유전자"에는 상기와 같은 시트라말레이트 신타아제 활성을 가지는 임의의 단백질 및 이를 코딩하는 임의의 유전자가 제한 없이 포함된다. 상기 효소의 서열은 미국 생물공학정보센터(NCBI) 또는 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)와 같은 공지의 데이터베이스로부터 용이하게 얻을 수 있다.

구체적으로는, 메타노코커스 야나시 유래의 시트라말레이트 신타아제일 수 있으며, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.

또한, 상기 시트라말레이트 신타아제를 코딩하는 유전자(cimA 유전자)는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은, 예를 들면, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 염기 서열을 가질 수 있으며, 이와 상동성이 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 더욱 구체적으로는 99% 이상인 염기서열을 가질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하거나, 또는 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해 기능상 동일한 다수의 핵산이 임의의 소정의 단백질을 코딩할 수 있기 때문에, 이에 한정되지 않는다.

또한, 실질적으로 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더욱 더 구체적으로는 98% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 시트라말레이트 신타아제 활성을 가지는 단백질이라면 제한 없이 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.

나아가, 상기 서열과 상동성을 가지는 서열로서 실질적으로 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 경우도 역시 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.

본 발명에서 용어 "재조합 미생물"은 유전자 조작된 변이 미생물을 제한없이 포함할 수 있으며, 유전자 조작이 가능하다면 에스케리키아 속 미생물(genus Escherichia), 코리네형 미생물(Corynebacterium), 브레비형 미생물(Brevibacterium), 세라티아 속 미생물(genus Serratia), 프로비덴시아 속 미생물(genus Providencia)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 미생물은 코리네박테리움 속 미생물 또는 에스케리키아 속 미생물일 수 있으며, 특히 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있고, 상기 에스케리키아 속 미생물은 대장균(Escherichia coli)일 수 있다.

본 발명에서 상기 재조합 미생물은 천연적으로 쓰레오닌 생산능을 가지는 균주를 모균주로 한 것일 수 있으며, 또는 쓰레오닌 생산능을 강화시키고자 변이가 도입된 변이 균주를 모균주로 한 것일 수도 있다. 상기 쓰레오닌 생산능을 강화시키는 변이는 예를 들어 쓰레오닌 생합성과 관련된 유전자를 강화하거나 쓰레오닌 분해 경로와 관련된 유전자를 약화시키는 것일 수 있다. 상기 쓰레오닌 생합성과 관련된 유전자는 피리딘 뉴클레오티드 트랜스하이드로게나제(Pyridine nucleotide transhydrogenase)를 코딩하는 pntAB 유전자, 아스파르테이트-β-세미알데히드 디하이드로게나아제(aspartate-β-semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 asd 유전자, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(Aspartate aminotransferase)를 코딩하는 aspC 유전자, 글루타메이트 디하이드로게나아제(glutamate dehydrogenase)를 코딩하는 gdhA 유전자, 포스포에놀 피루베이트 카르복실라제(phosphoenol pyruvate carboxylase)를 코딩하는 ppc 유전자, 아스파르타제(aspartase)를 코딩하는 aspA 유전자, 쓰레오닌 오페론(thrO) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자일 수 있으며, 쓰레오닌 분해 경로와 관련된 유전자는 쓰레오닌 디하이드로게나제(threonine dehydrogenase)를 코딩하는 tdh 유전자, 카타볼릭 쓰레오닌 디하이드라타제(catabolic threonine hydratase)를 코딩하는 tdcB 유전자 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자일 수 있다.

본 발명의 다른 양태는, 본 발명의 상기 재조합 미생물을 배지에서 배양하는 단계, 및 상기 미생물 또는 배지로부터 쓰레오닌을 회수하는 단계를 포함하는 쓰레오닌을 생산하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 쓰레오닌 디아미나제 효소의 활성이 감소 또는 불활성화되고, 시트라말레이트 신타아제 효소의 활성이 도입된, 쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물을 배지에서 배양하는 단계, 및 상기 미생물 또는 배지로부터 쓰레오닌을 회수하는 단계를 포함하는 쓰레오닌을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 쓰레오닌 디아미나제, 시트라말레이트 신타아제, 쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물은 상기 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 미생물, 예를 들어 코리네박테리움 속 미생물이나 에스케리키아 속 미생물을 배양하는 단계는 당업계에 알려진 임의의 배양 조건 및 배양 방법을 사용할 수 있다. 상기 방법에 있어서, 본 발명에 따른 미생물, 예를 들어 코리네박테리움 속 미생물이나 에스케리키아 속 미생물을 배양하는 단계을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며 당업자는 공지된 내용에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 코리네박테리아 속 균주나 에스케리키아 속 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다 (예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981).

이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, 바람직하게는 pH 6 내지 8, 가장 바람직하게는 pH 6.8)를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.

산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있으며, 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 쓰레오닌의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다. 쓰레오닌은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.

아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 또한, 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

아울러, 미생물 또는 배지로부터 쓰레오닌을 회수하는 단계는 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당업계에 공지된 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 공지된 쓰레오닌 회수 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 HPLC, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 쓰레오닌을 생산하는 재조합 미생물은 쓰레오닌 디아미나제 효소(threonine deaminase, ilvA)의 활성이 감소 또는 불활성화되고, 시트라말레이트 신타아제 효소(citramalate synthase, cimA)의 활성이 도입됨으로써 미생물 내 아세테이트 축적량이 감소됨에 따라 생장능이 유지되거나 향상되며, 우수한 쓰레오닌 생산능을 가지게 되었다. 이에 따라, 산업적 규모에서도 쓰레오닌의 효율적이고 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 mini-Mu 유전자 삽입 방법에 이용되는 헬퍼 플라스미드인 pCJ-MuAB 플라스미드의 유전자 지도를 나타내는 개요도이다.
도 2는 쓰레오닌 생합성 유전자 도입에 사용되는 mini-Mu 유전자 삽입 방법에 이용되는 도입용 플라스미드 pMu-R6K 플라스미드의 유전자 지도를 나타내는 개요도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 야생형 대장균 기반 쓰레오닌 생산주 제작

1-1. 유전자 도입용 플라스미드와 헬퍼 플라스미드( helper plasmid ) 제작

야생형 대장균 W3110(기탁번호 ATCC9637)으로부터 쓰레오닌을 생산하기 위해서 mini-Mu 트랜스포존 기반의 게놈 삽입 방법(Akhverdyan VZ, Gak ER et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2011)을 사용하였다. mini-Mu 삽입방법을 이용하기 위해서 pCJ-MuAB라고 명명한 헬퍼 플라스미드(helper plasmid, 도 1)와 pMu-R6K라고 명명한 도입용 플라스미드(integrative plasmid, 도 2)를 제작하였다. pCJ1-MuAB, 헬퍼 플라스미드는 아라비노스에 의해 발현이 유도되는(arabinose-inducible) ParaB 프로모터를 이용하여 트랜스포지션 인자, MuA와 MuB가 발현되며 온도 민감성 리플리콘을 포함하여 쉽게 플라스미드를 제거할 수 있도록 제작되었다. pMu-R6K, 도입용 플라스미드는 mini-Mu 유닛인 Mu-attL/R과 양쪽 측면에 loxP66과 loxP71 (Oleg Tolmachov, et al., Biotechnol. 2006)를 포함한 cat 유전자를 가진다. 그리고 R6K 리플리콘을 가지고 있어서 pir 유전자를 갖지 않는 일반 대장균 내에서는 증식이 되지 않는 자살 벡터(suicidal vector)의 특징을 가진다(Xiao-Xing Wei, Zhen-Yu Shi.et al., Appl Microbiol Biotechnol.2010).

1-2. 쓰레오닌 생합성 유전자 강화를 위한 도입용 플라스미드 클로닝

상기 실시예 1-1에서 제작한 플라스미드를 이용하여 쓰레오닌 생합성 유전자 발현 강화를 위해서 3가지 도입용 플라스미드를 제작하였다.

1-2-1 : pMu - R6K _ pntAB asd aspC - thrO

상기 실시예 1-1에서 제조된 도입용 pMu-R6K 플라스미드를 SmaI 제한효소 처리 후 DNA 정제하여 절단된 선형 클로닝 벡터를 준비하였다. W3110 genomic DNA를 주형으로 서열번호 8 및 서열번호 9를 프라이머로 PCR하여 pntAB 유전자를 증폭하였다. 구체적으로 SolGent^TM Pfu-X DNA Polymerase (solgent, DNA)를 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 3분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하였다.

또한, W3110 genomic DNA를 주형으로 서열번호 10 및 서열번호 11을 프라이머로 PCR 하여 asd 유전자를 상기와 같은 방법으로 증폭하였고, 서열번호 12 및 서열번호 13을 프라이머로 PCR 하여 aspC 유전자를 상기와 같은 방법으로 증폭하였다.

KCCM10541 (대한민국 등록특허 제10-0576342호) genomic DNA로부터 서열번호 14 및 서열번호 15를 프라이머로 PCR하여 쓰레오닌 오페론(thrO)을 증폭하였다. 상기에 준비된 각각의 4 종류의 DNA와 벡터 DNA를 Gibson assembly 방법을 통해서 pMu-R6K_pntAB asd aspC-thrO 플라스미드를 제작하였다(Daniel G Gibson, et al., Nature Methods 2009).

상기 Gibson assembly 방법은 먼저 하기 표 1의 조성으로 5X ISO 버퍼를 제조한 후 하기 표 2의 조성으로 5X ISO 버퍼와 T5 exonuclease(Epicentre), phusion polymerase(New England Biolabs), Taq ligase(New England Biolabs) 3종의 효소를 혼합한 Gibson assembly mater mix 15 ㎕와 클로닝을 하고자 하는 DNA들 5 ㎕를 50℃ 1시간 반응시킨다. 이후 TransforMaxTM EC100DTM pir-116 Electrocompetent E.coli(epicentre, USA) 컴피턴드 세포에 전기충격(2500V)을 가하였다. 상기로부터 균주를 회수하여, 100 μg/L 암피실린(ampicillin)을 포함한 LB 평판 배지에 도말하여 37 ℃에서 하룻밤 배양한 후 암피실린 내성을 보이는 균주를 선별하였다. 이렇게 선별된 균주로부터 플라스미드를 획득하여 최종적으로는 원하는 염기서열을 가지는 플라스미드임을 sequencing 분석으로 확인하였다.

5X ISO 버퍼 조성

성분	함유량
1M Tris-HCl pH 7.5	3 mL
2M MgCl₂	150 uL
100nM dNTP mix	240 uL
1M DTT	300 uL
PEG-8000	1.5 g
100 mM NAD	300 uL
총합	dH₂O up to 6 mL

*dH2O : 증류수, distilled water.

Gibson assembly master mix 조성

성분	함유량
5X ISO 버퍼	320 uL
10 U/uL T5 exonuclease	0.64 uL
2 U/uL Phusion polymerase	20 uL
40 U/uL Taq ligase	160 uL
총합	dH₂O up to 1.2 mL

1-2-2 : pMu - R6K _ gdhA aspC thrO

상기 실시예 1-1에서 제조한 도입용 pMu-R6K 플라스미드를 상기 1-2-1과 같은 방법으로 pMu-R6K 플라스미드를 SmaI 제한효소 처리 후 DNA 정제하여 절단된 선형 클로닝 벡터를 준비하였다. W3110 genomic DNA로부터 서열번호 18 및 서열번호 19를 프라이머로 PCR하여 gdhA 유전자를 증폭하였고, 서열번호 20 및 서열번호 21를 프라이머로 PCR하여 aspC 유전자를 증폭하였다. thrO(쓰레오닌 오페론)은 KCCM10541 genomic DNA로부터 서열번호 14 및 서열번호 15를 프라이머로 PCR하여 thrO(쓰레오닌 오페론)을 증폭하였다. 상기에 준비된 각각의 3종류의 DNA와 벡터 DNA를 Gibson assembly 방법을 통해서 pMu-R6K_gdhA aspC thrO 플라스미드를 제작하였다.

1-2-3 : pMu - ppc aspA thrO

상기 실시예 1-1에서 제조한 도입용 pMu-R6K 플라스미드를 상기 1-2-1과 같은 방법으로 pMu-R6K 플라스미드를 SmaI 제한효소 처리 후 DNA 정제하여 절단된 선형 클로닝 벡터를 준비하였다. W3110 genomic DNA로부터 서열번호 22 및 서열번호 23을 프라이머로 PCR하여 ppc 유전자를 증폭하였고, 서열번호 24 및 서열번호 25를 프라이머로 PCR하여 aspA 유전자를 증폭하였다. KCCM10541 genomic DNA로부터 서열번호 26 및 서열번호 27을 프라이머로 PCR하여 thrO(쓰레오닌 오페론)을 증폭하였다. 상기에 준비된 각각의 3종류의 DNA와 벡터 DNA를 Gibson assembly 방법을 통해서 pMu-R6K_ppc aspA thrO 플라스미드를 제작하였다.

1-3. 쓰레오닌 생합성 강화 야생형 대장균 제작

실시예 1-1에서 제작한 pCJ-MuAB를 형질전환한 W3110 야생형 대장균을 100 ug/L 암피실린(Ampicillin)과 5 mM 아라비노스가 첨가된 LB 배지를 이용하여 30 ℃ 에서 OD₆₀₀ 0.6까지 배양시킨 후 원심분리기를 통해서 멸균 증류수로 1회, 10% 글리세롤 (glycerol) 로 2회 세척하여 컴피턴트 세포를 제작하였다(Sambrook and Russell 2001). 준비된 컴피턴트 세포에 도입용 플라스미드, pMu-R6K_pntAB asd aspC-thrO를 전기충격(electroporation)을 가하고, 1 mL SOC 배지를 첨가한 후 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 25 ug/L 클로람페니콜(Chloramphenicol)이 포함된 LB 평판배지에 도말한 후 클로람페니콜 내성균 콜로니를 서열번호 10과 서열번호 15로 colony PCR을 수행하여 pntAB asd aspC thrO 유전자가 genome 상에 도입된 것을 확인하였다. 이후 선별 균주에서 pJW168 플라스미드를 형질전환 후 0.1 mM IPTG 첨가된 LB 평판배지에 도말하여 클로람페니콜 내성마커(cat)를 제거하였다(Beatri'z Palmeros et al., 2000, Gene). 상기와 같은 mini-Mu integration 방법으로 순차적으로 pMu-R6K_gdhA aspC thrO를 도입하고 서열번호 18과 서열번호 15로 colony PCR하여 도입여부를 확인하였고, pMu-ppc aspA thrO 도입 후 서열번호 22와 서열번호 27으로 colony PCR하여 도입여부를 확인하였다. 이렇게 제작된 야생형 대장균(W3110) 기반 쓰레오닌 생산 균주를 CJT1이라고 명명하였다.

실시예 2: ilvA 유전자 결손 균주 제작

쓰레오닌 대표 분해 경로인 ilvA 유전자를 결손시키기 위해서, FRT-one-step-PCR deletion 방법을 사용하였다(Kirill A, et al., 2000, PNAS). pKD3 벡터를 주형으로 서열번호 28과 서열번호 29번의 프라이머를 이용하여 PCR 방법을 통한 결손 카세트 (deletion cassette)를 제작하였다. SolGent^TM Pfu-X DNA Polymerase (solgent, Korea)를 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94 ℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55 ℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72 ℃에서 3분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하였다.

그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0 % 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 1.2 kbp 크기의 밴드로부터 ilvA 결손카세트를 정제하였다. pKD46(Kirill A, et al., 2000, PNAS) 벡터가 도입된 KCCM10541 pKD46과 CJT1 pKD46 균주를 100 ug/L 암피실린(ampicilin)과 5 mM 아라비노스 (L-arabinose)가 포함된 LB 배지에서 30 ℃/200 rpm으로 OD₆₀₀ = 0.6까지 배양한 후, 멸균 증류수로 1회, 10 % 글리세롤(glycerol)로 2회 세척하여 컴피턴트 세포를 제작하였다. 상기 제작된 컴피턴트 세포에 ilvA 결손카세트를 전기충격(2500V)을 통해 도입하였다. 이후 1 mL SOC 배지를 첨가한 후 37 ℃에서 하룻밤 배양한 후 내성을 보이는 균주를 선별하였다.

선별된 균주를 서열번호 28과 서열번호 29의 프라이머로 colony PCR한 후 1.0 % 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 1.2 kb로 관찰되는 것을 확인함으로써 ilvA 유전자 결손을 확인하였다. 확인된 균주는 다시 pCP20 벡터 (Kirill A, et al., 2000, PNAS)로 형질전환시켜 100 ug/L 암피실린(ampicilin) LB 평판 배지에서 도말하여 얻어진 colony에서 다시 동일한 조건의 colony PCR을 통하여 1.0 % 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 150 bp로 작아진 최종 ilvA 유전자 결손 균주를 제작하였고, 클로람페니콜 마커가 제거되었음을 확인하였다. KCCM10541에 ilvA가 결손된 균주를 KCCM10541-ilvA라 명명하고 CJT1에 ilvA가 결손된 균주를 CJT1-ilvA라고 명명하였다.

실시예 3: cimA 유전자 도입 균주의 제작

CJ1 프로모터(대한민국 등록특허 제10-0620092호)가 포함된 Methanococcus jannaschii 유래 cimA 유전자를 기반으로 코돈-최적화(codon-optimization)하여, Pcj1_cimA, Pcj1_cimA 2.0, Pcj1_cimA 3.7(Atsumi, Liao JC, Appl Environ Microbiol. 2008) DNA를 제작하였다. 유전자 합성시 양쪽 측면에 BamHI site를 첨가하여 CopyControl pCC1BAC(BamHI) (Epicentre, USA)에 subcloning하여 최종적으로 cimA 유전자를 발현하는 pCC1BAC: Pcj1_cimA, pCC1BAC: Pcj1_cimA 2.0, pCC1BAC: Pcj1_cimA 3.7 플라스미드를 제작하였다. 그리고 KCCM10541-ilvA, CJT1-ilvA 균주에 상기의 3종 플라스미드와 대조군(Control) 플라스미드인 pCC1BAC을 전기충격(2500V) 방법으로 형질전환하여 최종적으로 실험에 사용할 균주를 제작하였다. 그리고 실험 비교를 위해서 상기와 같은 방법으로 KCCM10541, CJT1 두 균주에 pCC1BAC을 형질전환한 균주도 제작하였다.

상기에서 cimA 유전자는 야생형 시트라말레이트 합성효소(citramalate synthase)를 코딩하며, cimA 2.0 및 cimA 3.7은 특이적 활성이 증가하고 이소루신에 의한 피드백-저해(feedback-inhibition)가 감소한 변이형 시트라말레이트 합성효소를 코딩한다(Atsumi, Liao JC, Appl Environ Microbiol. 2008). cimA 2.0 및 cimA 3.7에 대한 아미노산 서열은 각각 서열번호 2 및 3이고, 염기서열은 서열번호 5 및 6에 해당한다.

상기 KCCM10541 또는 KCCM10541-ilvA를 기반으로 KCCM10541 pCC1BAC, KCCM10541-ilvA pCC1BAC, KCCM10541-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA, KCCM10541-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 2.0, KCCM10541-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 3.7의 재조합 미생물을 제조하였으며, CJT1 또는 CJT1-ilvA를 기반으로 CJT1 pCC1BAC, CJT1-ilvA pCC1BAC, CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA, CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 2.0, CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 3.7의 재조합 미생물을 제조하였다.

본 발명자들은 상기 재조합 미생물 중 'CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA', 'CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 2.0', 'CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 3.7'의 재조합 미생물을 각각 'CA03-8303', 'CA03-8304', 'CA03-8305'로 명명한 후 부다페스트 조약 하에 2014년 12월 5일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 각각 수탁번호 'KCCM11632P', 'KCCM11633P', 'KCCM11634P'를 부여받았다.

실시예 4: ilvA 결손 및 cimA 발현 균주의 플라스크 평가를 통한 쓰레오닌 생산성 확인

상기 실시예 3에서 제작한 균주들의 쓰레오닌 생산량을 비교하기 위해서 플라스크 평가를 수행하였다. 플라스크 테스트는 각각의 균주를 25 ug/L 클로람페니콜(Chloramphenicol) LB 플레이트에 스트리킹(streaking)하고 33 ℃ 배양기에 16시간 동안 배양한 후, 단일 콜로니(colony)를 LB 배지 2 mL에 접종한 후 200 rpm/33 ℃ 배양기에서 12시간 동안 배양하였다. 그리고 250 mL 플라스크에 하기 표 3의 쓰레오닌 생산 플라스크 배지 25 mL를 넣고, 앞서 배양한 배양액을 500 uL씩 투입하였다. 이후, 플라스크를 200 rpm/33 ℃ 배양기에서 48 시간 동안 배양한 후, HPLC를 이용해서 각각 균주에서 얻어진 쓰레오닌 양을 비교하고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

쓰레오닌 생산 플라스크 배지 조성

조성물	농도(리터당)
포도당	70 g
Ammonium Sulfate	25 g
KH₂PO₄	1 g
MgSO₄·7H₂O	0.5 g
FeSO₄·7H₂O	5 mg
MnSO₄·8H₂O	5 mg
ZnSO₄	5 mg
탄산칼슘	30 g
효모 엑기스	2 g
메치오닌	0.3 g
pH	6.8

플라스크 배양을 통한 생산균주의 쓰레오닌 생산

균주	OD	당 소모량 (g/L)	쓰레오닌 생산량 (g/L)	Acetate 생성량 (g/L)
KCCM10541 pCC1BAC	21.6	70	34.7	0.35
KCCM10541-ilvA pCC1BAC	5.5	12.0	6.6	0.11
KCCM10541-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA	18.5	70	37.5	0.15
KCCM10541-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 2.0	22.5	70	38.3	0.10
KCCM10541-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 3.7	23.2	70	37.8	0.08
CJT1 pCC1BAC	35.2	70	11.4	2.15
CJT1-ilvA pCC1BAC	6.4	13.6	3.0	1.24
CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA	30.6	70	14.3	1.42
CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 2.0	36.0	70	14.7	1.32
CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 3.7	37.0	70	14.5	1.34

상기 표 4에서 확인한 바와 같이, ilvA가 결손된 KCCM10541-ilvA pCC1BAC, CJT1-ilvA pCC1BAC 두 균주는 ilvA가 결손되지 않은 KCCM10541 pCC1BAC, CJT1 pCC1BAC 균주에 비해서 이소루신에 대한 요구로 인해서 성장이 잘 일어나지 않는 것을 관찰하였다(OD 값 참고). 그러나, 이에 3 종류의 cimA가 도입된 변이 균주(KCCM10541-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA, KCCM10541-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 2.0, KCCM10541-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 3.7, CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA, CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 2.0 및 CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 3.7)에서 모두 성장이 회복되고, 쓰레오닌 생성량도 약 10 내지 30 % 가량 증가하며, 아세테이트 생성량도 약 30 내지 60 % 감소하는 것을 확인하였다.

특히, ilvA 결손 균주에 cimA를 도입한 경우보다 cimA 2.0 또는 cimA 3.7을 도입한 경우에 균주 성장능이 20 % 이상 우수해지고 쓰레오닌 생성량도 다소 증가하고, 아세테이트 생성량도 더욱 감소하는 것을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11632P

20141205

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11633P

20141205

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11634P

20141205

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Microorganisms having L-threonine productivity and a process for producing L-threonine using the same <130> KPA141304-KR <160> 30 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 491 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 1 Met Met Val Arg Ile Phe Asp Thr Thr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Thr 1 5 10 15 Pro Gly Val Ser Leu Thr Pro Asn Asp Lys Leu Glu Ile Ala Lys Lys 20 25 30 Leu Asp Glu Leu Gly Val Asp Val Ile Glu Ala Gly Ser Ala Ile Thr 35 40 45 Ser Lys Gly Glu Arg Glu Gly Ile Lys Leu Ile Thr Lys Glu Gly Leu 50 55 60 Asn Ala Glu Ile Cys Ser Phe Val Arg Ala Leu Pro Val Asp Ile Asp 65 70 75 80 Ala Ala Leu Glu Cys Asp Val Asp Ser Val His Leu Val Val Pro Thr 85 90 95 Ser Pro Ile His Met Lys Tyr Lys Leu Arg Lys Thr Glu Asp Glu Val 100 105 110 Leu Glu Thr Ala Leu Lys Ala Val Glu Tyr Ala Lys Glu His Gly Leu 115 120 125 Ile Val Glu Leu Ser Ala Glu Asp Ala Thr Arg Ser Asp Val Asn Phe 130 135 140 Leu Ile Lys Leu Phe Asn Glu Gly Glu Lys Val Gly Ala Asp Arg Val 145 150 155 160 Cys Val Cys Asp Thr Val Gly Val Leu Thr Pro Gln Lys Ser Gln Glu 165 170 175 Leu Phe Lys Lys Ile Thr Glu Asn Val Asn Leu Pro Val Ser Val His 180 185 190 Cys His Asn Asp Phe Gly Met Ala Thr Ala Asn Thr Cys Ser Ala Val 195 200 205 Leu Gly Gly Ala Val Gln Cys His Val Thr Val Asn Gly Ile Gly Glu 210 215 220 Arg Ala Gly Asn Ala Ser Leu Glu Glu Val Val Ala Ala Leu Lys Ile 225 230 235 240 Leu Tyr Gly Tyr Asp Thr Lys Ile Lys Met Glu Lys Leu Tyr Glu Val 245 250 255 Ser Arg Ile Val Ser Arg Leu Met Lys Leu Pro Val Pro Pro Asn Lys 260 265 270 Ala Ile Val Gly Asp Asn Ala Phe Ala His Glu Ala Gly Ile His Val 275 280 285 Asp Gly Leu Ile Lys Asn Thr Glu Thr Tyr Glu Pro Ile Lys Pro Glu 290 295 300 Met Val Gly Asn Arg Arg Arg Ile Ile Leu Gly Lys His Ser Gly Arg 305 310 315 320 Lys Ala Leu Lys Tyr Lys Leu Asp Leu Met Gly Ile Asn Val Ser Asp 325 330 335 Glu Gln Leu Asn Lys Ile Tyr Glu Arg Val Lys Glu Phe Gly Asp Leu 340 345 350 Gly Lys Tyr Ile Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ala Ile Val Arg Glu Val 355 360 365 Thr Gly Lys Leu Val Glu Glu Lys Ile Lys Leu Asp Glu Leu Thr Val 370 375 380 Val Ser Gly Asn Lys Ile Thr Pro Ile Ala Ser Val Lys Leu His Tyr 385 390 395 400 Lys Gly Glu Asp Ile Thr Leu Ile Glu Thr Ala Tyr Gly Val Gly Pro 405 410 415 Val Asp Ala Ala Ile Asn Ala Val Arg Lys Ala Ile Ser Gly Val Ala 420 425 430 Asp Ile Lys Leu Val Glu Tyr Arg Val Glu Ala Ile Gly Gly Gly Thr 435 440 445 Asp Ala Leu Ile Glu Val Val Val Lys Leu Arg Lys Gly Thr Glu Ile 450 455 460 Val Glu Val Arg Lys Ser Asp Ala Asp Ile Ile Arg Ala Ser Val Asp 465 470 475 480 Ala Val Met Glu Gly Ile Asn Met Leu Leu Asn 485 490 <210> 2 <211> 371 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Methanococcus jannaschii cimA variant, cimA 2.0 a.a. <400> 2 Met Met Val Arg Ile Phe Asp Thr Thr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Thr 1 5 10 15 Pro Gly Val Ser Leu Thr Pro Asn Asp Lys Leu Glu Ile Ala Lys Lys 20 25 30 Leu Asp Glu Leu Gly Val Asp Val Ile Glu Ala Gly Ser Ala Val Thr 35 40 45 Ser Lys Gly Glu Arg Glu Gly Ile Lys Leu Ile Thr Lys Glu Gly Leu 50 55 60 Asn Ala Glu Ile Cys Ser Phe Val Arg Ala Leu Pro Val Asp Ile Asp 65 70 75 80 Ala Ala Leu Glu Cys Asp Val Asp Ser Val His Leu Val Val Pro Thr 85 90 95 Ser Pro Ile His Met Lys Tyr Lys Leu Arg Lys Thr Glu Asp Glu Val 100 105 110 Leu Glu Thr Ala Leu Lys Ala Val Glu Tyr Ala Lys Glu Gln Gly Leu 115 120 125 Ile Val Glu Leu Ser Ala Glu Asp Ala Thr Arg Ser Asp Val Asn Phe 130 135 140 Leu Ile Lys Leu Phe Asn Glu Gly Glu Lys Val Gly Ala Asp Arg Val 145 150 155 160 Cys Val Cys Asp Thr Val Gly Val Leu Thr Pro Gln Lys Ser Gln Glu 165 170 175 Leu Phe Lys Lys Ile Thr Glu Asn Val Asn Leu Pro Val Ser Val His 180 185 190 Cys His Asn Asp Phe Gly Met Ala Thr Ala Asn Ala Cys Ser Ala Val 195 200 205 Leu Gly Gly Ala Val Gln Cys His Val Thr Val Asn Gly Ile Gly Glu 210 215 220 Arg Ala Gly Asn Ala Ser Leu Glu Glu Val Val Ala Ala Leu Lys Ile 225 230 235 240 Leu Tyr Gly Tyr Asp Thr Lys Ile Lys Met Glu Lys Leu Tyr Glu Val 245 250 255 Ser Arg Ile Val Ser Arg Leu Met Lys Leu Pro Val Pro Pro Asn Lys 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Thr Glu Thr Tyr Glu Pro Ile Lys Pro Glu 290 295 300 Met Val Gly Asn Arg Arg Arg Ile Ile Leu Gly Lys His Ser Gly Arg 305 310 315 320 Lys Ala Leu Lys Tyr Lys Leu Asp Leu Met Gly Ile Asn Val Ser Asp 325 330 335 Glu Gln Leu Asn Lys Ile Tyr Glu Arg Val Lys Glu Phe Gly Asp Leu 340 345 350 Gly Lys Tyr Ile Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ala Ile Val Arg Glu Val 355 360 365 Thr Gly Lys 370 <210> 4 <211> 1476 <212> DNA <213> Methanococcus jannaschii <400> 4 atgatggtaa ggatattcga taccacactt cgcgacggag agcagacacc aggagtttct 60 ttaacaccaa acgataagct ggagatagct aaaaagttgg atgaacttgg ggttgatgtt 120 atagaggccg gtagcgctat cactagcaag ggagagcgcg aaggaataaa actcattaca 180 aaagaaggtc ttaacgcaga aatctgcagt ttcgtgcgtg cactccctgt agacatagac 240 gctgccttag aatgtgatgt agatagtgtg cacctcgtgg tgcccacatc tccaatacac 300 atgaagtaca aacttcgtaa aacggaggat gaggttctcg agaccgcact taaggctgtg 360 gaatacgcta aagagcatgg cttgatcgtt gagttatcag cggaggatgc gacaagatcc 420 gatgttaatt tcttaataaa actcttcaat gaaggggaaa aggttggagc agaccgtgtt 480 tgtgtttgcg acaccgtagg agttttaacg ccacaaaagt cgcaggaact gtttaagaaa 540 ataaccgaga atgtgaattt accggtctcg gttcattgcc acaacgactt tggaatggct 600 actgctaata cttgctccgc agtgctcggc ggagctgttc agtgccacgt gacagttaac 660 ggtattggcg agcgcgcagg gaatgcctcc ttagaagagg tcgttgccgc gctgaaaatc 720 ctctacggct atgatactaa aataaagatg gaaaagttat acgaggtttc acgcattgtc 780 tcccgcttga tgaaacttcc tgttcccccg aacaaagcga ttgttggcga caatgcgttc 840 gctcacgaag caggtatcca tgtcgatgga ttaattaaaa atactgaaac ctatgagcca 900 atcaaaccag aaatggtggg caaccgccgg cgtatcattc tcggtaagca ctctggtcgg 960 aaagcgttaa agtacaagct tgatctaatg ggcataaacg tgtctgatga gcaattaaac 1020 aaaatttatg aacgcgttaa agaattcggg gacctaggta agtacatttc agatgctgat 1080 ttgctcgcta tagttcgcga agtcacggga aagttggttg aggagaagat caaactggac 1140 gaactcacgg tggtaagcgg aaacaagata accccaattg catctgttaa gctccattac 1200 aaaggagagg atatcacttt aatagagact gcttacggtg ttggaccggt cgatgcagca 1260 attaacgccg tgcgtaaagc aatatcggga gttgcagaca ttaagctcgt agagtatcgc 1320 gttgaagcga ttggtggcgg tactgatgcg ttaatagagg ttgtagttaa attacgtaaa 1380 gggactgaaa tagttgaggt tcgcaagtca gacgcggaca taatacgcgc ttctgtggac 1440 gctgtaatgg aaggaatcaa catgttgttg aattaa 1476 <210> 5 <211> 1116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Methanococcus jannaschii cimA variant, cimA 2.0 <400> 5 atgatggtaa ggatattcga taccacactt cgcgacggag agcagacacc aggagtttct 60 ttaacaccaa acgataagct ggagatagct aaaaagttgg atgaacttgg ggttgatgtt 120 atagaggccg gtagcgctgt cactagcaag ggagagcgcg aaggaataaa actcattaca 180 aaagaaggtc ttaacgcaga aatctgcagt ttcgtgcgtg cactccctgt agacatagac 240 gctgccttag aatgtgatgt agatagtgtg cacctcgtgg tgcccacatc tccaatacac 300 atgaagtaca aacttcgtaa aacggaggat gaggttctcg agaccgcact taaggctgtg 360 gaatacgcta aagagcaggg cttgatcgtt gagttatcag cggaggatgc gacaagatcc 420 gatgttaatt tcttaataaa actcttcaat gaaggggaaa aggttggagc agaccgtgtt 480 tgtgtttgcg acaccgtagg agttttaacg ccacaaaagt cgcaggaact gtttaagaaa 540 ataaccgaga atgtgaattt accggtctcg gttcattgcc acaacgactt tggaatggct 600 actgctaatg cttgctccgc agtgctcggc ggagctgttc agtgccacgt gacagttaac 660 ggtattggcg agcgcgcagg gaatgcctcc ttagaagagg tcgttgccgc gctgaaaatc 720 ctctacggct atgatactaa aataaagatg gaaaagttat acgaggtttc acgcattgtc 780 tcccgcttga tgaaacttcc tgttcccccg aacaaagcga ttgttggcga caatgcgttc 840 gctcacgaag caggtatcca tgtcgatgga ttaattaaaa atactgaaac ctatgagcca 900 atcaaaccag aaatggtggg caaccgccgg cgtatcattc tcggtaagca ctctggtcgg 960 aaagcgttaa agtacaagct tgatctaatg ggcataaacg tgtctgatga gcaattaaac 1020 aaaatttatg aacgcgttaa agaattcggg gacctaggta agtacatttc agatgctgat 1080 ttgctcgcta tagttcgcga agtcacggga aagtag 1116 <210> 6 <211> 1116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Methanococcus jannaschii cimA variant, cimA 3.7 <400> 6 atgatggtaa ggatattcga taccacactt cgcgacggag agcagacacc aggagtttct 60 ttaacaccaa acgataagct ggagatagct aaaaagttgg atgaacttgg ggttgatgtt 120 atagaggccg gtagcgctgt cactagcaag ggagagcgcg aaggaataaa actcattaca 180 aaagaaggtc ttaacgcaga aatctgcagt ttcgtgcgtg cactccctgt agacatagac 240 gctgccttag aatgtgatgt agatagtgtg cacctcgtgg tgcccacatc tccaatacac 300 atgaagtaca aacttcgtaa aacggaggat gaggttctcg tgaccgcact taaggctgtg 360 gaatacgcta aagagcaggg cttgatcgtt gagttatcag cggaggatgc gacaagatcc 420 gatgttaatt tcttaataaa actcttcaat gaaggggaaa aggttggagc agaccgtgtt 480 tgtgtttgcg acaccgtagg agttttaacg ccacaaaagt cgcaggaact gtttaagaaa 540 ataaccgaga atgtgaattt accggtctcg gttcattgcc acaacgactt tggaatggct 600 actgctaatg cttgctccgc agtgctcggc ggagctgttc agtgccacgt gacagttaac 660 ggtattggcg agcgcgcagg gaatgcctcc ttagaagagg tcgttgccgc gtcgaaaatc 720 ctctacggct atgatactaa aataaagatg gaaaagttat acgaggtttc acgcattgtc 780 tcccgcttga tgaaacttcc tgttcccccg aacaaagcga ttgttggcga caatgcgttc 840 gctcacgaag caggtatcca tgtcgatgga ttaattaaaa atactgaaac ctatgagcca 900 atcaaaccag aaatggtggg caaccgccgg cgtatcattc tcggtaagca ctctggtcgg 960 aaagcgttaa agtacaagct tgatctaatg ggcataaacg tgtctgatga gcaattaaac 1020 aaaatttatg aacgcgttaa agaattcggg gacctaggta agtacatttc agatgctgat 1080 ttgctcgcta tagttcgcga agtcacggga aagtag 1116 <210> 7 <211> 514 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 7 Met Ala Asp Ser Gln Pro Leu Ser Gly Ala Pro Glu Gly Ala Glu Tyr 1 5 10 15 Leu Arg Ala Val Leu Arg Ala Pro Val Tyr Glu Ala Ala Gln Val Thr 20 25 30 Pro Leu Gln Lys Met Glu Lys Leu Ser Ser Arg Leu Asp Asn Val Ile 35 40 45 Leu Val Lys Arg Glu Asp Arg Gln Pro Val His Ser Phe Lys Leu Arg 50 55 60 Gly Ala Tyr Ala Met Met Ala Gly Leu Thr Glu Glu Gln Lys Ala His 65 70 75 80 Gly Val Ile Thr Ala Ser Ala Gly Asn His Ala Gln Gly Val Ala Phe 85 90 95 Ser Ser Ala Arg Leu Gly Val Lys Ala Leu Ile Val Met Pro Thr Ala 100 105 110 Thr Ala Asp Ile Lys Val Asp Ala Val Arg Gly Phe Gly Gly Glu Val 115 120 125 Leu Leu His Gly Ala Asn Phe Asp Glu Ala Lys Ala Lys Ala Ile Glu 130 135 140 Leu Ser Gln Gln Gln Gly Phe Thr Trp Val Pro Pro Phe Asp His Pro 145 150 155 160 Met Val Ile Ala Gly Gln Gly Thr Leu Ala Leu Glu Leu Leu Gln Gln 165 170 175 Asp Ala His Leu Asp Arg Val Phe Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu 180 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<213> Artificial Sequence <220> <223> pntAB-asd primer R <400> 11 gaaaagacgg cgggcaatca agatcctgtc aaaattgcgc 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asd-aspC primer F <400> 12 gagttaaata gagcaagctc gtccacctat gttgactaca 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> asd-aspC primer R <400> 13 tgtagtcaac ataggtggac gagcttgctc tatttaactc 40 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aspC-thrO primer F <400> 14 gcctgatgcg ctacgcttat agcttttcat tctgactgca 40 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aspC-thrO primer R <400> 15 tgcagtcaga atgaaaagct ataagcgtag cgcatcaggc 40 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> thrO-pMu primer F <400> 16 tgatgatgaa tcatcagtaa gggtaccgag ctcgctgttt 40 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> thrO-pMu primer R <400> 17 aaacagcgag ctcggtaccc ttactgatga ttcatcatca 40 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMu-gdhA primer F <400> 18 gtcgactcta gaggatcccc gctactgata acggtagccg 40 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMu-gdhA primer R <400> 19 cggctaccgt tatcagtagc ggggatcctc tagagtcgac 40 <210> 20 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gdhA-aspC primer F <400> 20 tacgctctaa tgtaggccgg gtccacctat gttgactaca t 41 <210> 21 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gdhA-aspC primer R <400> 21 atgtagtcaa cataggtgga cccggcctac attagagcgt a 41 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMu-ppc primer F <400> 22 gtcgactcta gaggatcccc gtaggccgga taaggcgctc 40 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMu-ppc primer R <400> 23 gagcgcctta tccggcctac ggggatcctc tagagtcgac 40 <210> 24 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ppc-aspA primer F <400> 24 ctgtctgcat tttattcaaa ctacctgaat gggttgcgaa 40 <210> 25 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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cattctggtg aagcgcgaag atcgccagcc agtgcacagc 180 tttaagctgc gcggcgcata cgccatgatg gcgggcctga cggaagaaca gaaagcgcac 240 ggcgtgatca ctgcttctgc gggtaaccac gcgcagggcg tcgcgttttc ttctgcgcgg 300 ttaggcgtga aggccctgat cgttatgcca accgccaccg ccgacatcaa agtcgacgcg 360 gtgcgcggct tcggcggcga agtgctgctc cacggcgcga actttgatga agcgaaagcc 420 aaagcgatcg aactgtcaca gcagcagggg ttcacctggg tgccgccgtt cgaccatccg 480 atggtgattg ccgggcaagg cacgctggcg ctggaactgc tccagcagga cgcccatctc 540 gaccgcgtat ttgtgccagt cggcggcggc ggtctggctg ctggcgtggc ggtgctgatc 600 aaacaactga tgccgcaaat caaagtgatc gccgtagaag cggaagactc cgcctgcctg 660 aaagcagcgc tggatgcggg tcatccggtt gatctgccgc gcgtagggct atttgctgaa 720 ggcgtagcgg taaaacgcat cggtgacgaa accttccgtt tatgccagga gtatctcgac 780 gacatcatca ccgtcgatag cgatgcgatc tgtgcggcga tgaaggattt attcgaagat 840 gtgcgcgcgg tggcggaacc ctctggcgcg ctggcgctgg cgggaatgaa aaaatatatc 900 gccctgcaca acattcgcgg cgaacggctg gcgcatattc tttccggtgc caacgtgaac 960 ttccacggcc tgcgctacgt ctcagaacgc tgcgaactgg gcgaacagcg tgaagcgttg 1020 ttggcggtga ccattccgga agaaaaaggc agcttcctca aattctgcca actgcttggc 1080 gggcgttcgg tcaccgagtt caactaccgt tttgccgatg ccaaaaacgc ctgcatcttt 1140 gtcggtgtgc gcctgagccg cggcctcgaa gagcgcaaag aaattttgca gatgctcaac 1200 gacggcggct acagcgtggt tgatctctcc gacgacgaaa tggcgaagct acacgtgcgc 1260 tatatggtcg gcggacgtcc atcgcatccg ttgcaggaac gcctctacag cttcgaattc 1320 ccggaatcac cgggcgcgct gctgcgcttc ctcaacacgc tgggtacgta ctggaacatt 1380 tctttgttcc actatcgcag ccatggcacc gactacgggc gcgtactggc ggcgttcgaa 1440 cttggcgacc atgaaccgga tttcgaaacc cggctgaatg agctgggcta cgattgccac 1500 gacgaaacca ataacccggc gttcaggttc tttttggcgg gttag 1545

Claims

쓰레오닌 디아미나제 효소(threonine deaminase, IlvA)의 활성이 감소 또는 불활성화되고, 시트라말레이트 신타아제 효소(citramalate synthase)의 활성을 가지는, 쓰레오닌을 생산하는 에스케리키아 속 재조합 미생물.
제1항에 있어서, 상기 쓰레오닌 디아미나제는 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성되는, 쓰레오닌을 생산하는 에스케리키아 속 재조합 미생물.
제1항에 있어서, 상기 시트라말레이트 신타아제는 메타노코커스 야나시(Methanococcus jannaschii) 유래의 시트라말레이트 신타아제인, 쓰레오닌을 생산하는 에스케리키아 속 재조합 미생물.
제1항에 있어서, 상기 시트라말레이트 신타아제는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는, 쓰레오닌을 생산하는 에스케리키아 속 재조합 미생물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 에스케리키아 속 미생물은 대장균(Escherichia coli)인, 쓰레오닌을 생산하는 에스케리키아 속 재조합 미생물.
제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배지에서 배양하는 단계, 및 상기 미생물 또는 배지로부터 쓰레오닌을 회수하는 단계를 포함하는, 쓰레오닌을 생산하는 방법.