CN108473992A

CN108473992A - 生产l-苏氨酸的重组微生物和使用其生产l-苏氨酸的方法

Info

Publication number: CN108473992A
Application number: CN201680061611.4A
Authority: CN
Inventors: 徐昌; 徐昌一; 朴慧珉; 李光镐; 朴相玟; 金径林; 丁起龙
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2015-10-23
Filing date: 2016-10-21
Publication date: 2018-08-31
Also published as: JP2018529354A; US20200248218A1; EP3366776A1; KR20170047642A; KR101804017B1; BR112018008045A2; WO2017069567A1; RU2018117175A; EP3366776A4; RU2018117175A3

Abstract

本申请涉及生产L‑苏氨酸的重组微生物，和使用其生产L‑苏氨酸的方法。

Description

生产L-苏氨酸的重组微生物和使用其生产L-苏氨酸的方法

技术领域

本公开内容涉及生产苏氨酸的重组微生物，和使用其生产L-苏氨酸的方法。

背景技术

苏氨酸——一种必需氨基酸，广泛地用于饲料、食品添加剂和动物生长促进剂中，并且也有效地用于出于医疗和制药用途的补液(rehydration solution)和合成材料中。

关于使用微生物生产苏氨酸的方法，用于增强苏氨酸生物合成基因(例如，ppc、aspC和thrABC)和用于阻断苏氨酸降解途径的方法已知用于增加产量(Kwang-Ho Lee,etal.,Molecular System Biology 2007)。参与苏氨酸降解途径的基因包括tdh、tdcB、glyA、ilvA等，并且在这些之中，苏氨酸脱氨酶(ilvA)已知为最重要的苏氨酸降解基因。在这些降解基因中，ilvA的缺失大大地提高苏氨酸的产量，但是问题是出现了昂贵的异亮氨酸营养缺陷型；因此，众所周知的是应用ilvA活性的减弱和对异亮氨酸的高易感性突变(Akhverdian Valery Z,et al.)。

同时，棒状杆菌属的菌株或埃希氏杆菌属的菌株生产2-丁酮酸并通过ilvA生物合成异亮氨酸，ilvA是参与异亮氨酸降解途径的基因。但是，已知的是微生物比如詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)可以使用乙酰辅酶A和丙酮酸作为底物通过柠苹酸合成酶(cimA)合成2-丁酮酸和异亮氨酸(Atsumi,Liao JC,Appl Environ Microbiol.,2008)。

发明内容

[技术问题]

本发明人已经尝试了研发高效地生产苏氨酸的方法。结果，他们已经确认了通过降低产苏氨酸菌株中苏氨酸脱氨酶(IlvA)的活性的方法和通过引入柠苹酸合成酶(cimA)的基因的方法提高苏氨酸生产的产量，并且也已经确认了现存的问题(Xie X,et al.,JInd Microbiol Biotechnol.2014)——其中由于醋酸的积累延迟了培养——可以被克服，从而完成本公开内容。

[技术方案]

本公开内容的目标是提供以高效率生产苏氨酸的重组微生物。

本公开内容的另一个目标是提供使用上述微生物生产苏氨酸的方法。

[有益效果]

由于通过降低苏氨酸脱氨酶(ilvA)的活性或使其失活和通过引入柠苹酸合成酶(cimA)的活性降低了微生物中醋酸积累的量，所以生产苏氨酸的本公开内容的重组微生物维持或提高其生长能力并且具有优越的苏氨酸生产力。因此，该微生物可以广泛地被用于有效和经济地生产苏氨酸，甚至以工业规模。

附图说明

图1是显示pCJ-MuAB质粒的基因图的示意图，该质粒是在mini-Mu基因插入方法中使用的辅助质粒。

图2是显示pMu-R6K质粒的基因图的示意图，该质粒是在被用于引入苏氨酸生物合成基因的mini-Mu基因插入方法中使用的整合质粒。

[最佳模式]

为了实现上述目标，本公开内容的一方面提供了生产苏氨酸的重组微生物，其中苏氨酸脱氨酶(IlvA)的活性被降低或失活并且柠苹酸合成酶的活性被保留。

如本文所使用，术语“苏氨酸”指的是具有式HO₂CCH(NH₂)CH(OH)CH₃的氨基酸，其是羟基-α-氨基酸，是不在体内生产的必需氨基酸中的一种。在本公开内容中，苏氨酸可以是L-或D-型光学异构体，但是不限于此。

如本文所使用，术语“苏氨酸生产力”指的是在微生物或培养该微生物的培养基中该微生物生产和积累苏氨酸的能力。这样的苏氨酸生产力可以是由野生型菌株保留的性质或者通过菌株的修饰赋予或增强的性质。

如本文所使用，术语“苏氨酸脱氨酶(EC4.3.1.19)”可以被称为苏氨酸氨-裂解酶或苏氨酸脱水酶，并且是催化将苏氨酸转变为α-丁酮酸和氨的反应的酶。由其生产的α-丁酮酸被用作异亮氨酸的前体。因此，当苏氨酸脱氨酶缺陷时，异亮氨酸的生物合成变得异常，并且因而可以减缓微生物的生长。

如本文所使用，术语“苏氨酸脱氨酶”和“编码其的基因”可以包括具有苏氨酸脱氨酶的活性的任何蛋白质和编码其的任何基因，但是这些不限于此。

具体地，苏氨酸脱氨酶可以容易地由已知数据库比如美国国家生物技术信息中心(NCBI)或日本DNA数据库(DDBJ)获得，并且例如，其可以由SEQ ID NO:7的氨基酸序列表示。但是，因为显示活性的蛋白质的氨基酸序列取决于微生物的物种或菌株可能不同，所以蛋白质不限于此。

另外地，如果蛋白质是基本上具有苏氨酸脱氨酶活性的蛋白质，并且如果蛋白质由与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有70％或更多同源性，具体地与其80％或更多同源性，更具体地与其90％或更多同源性，更加具体地与其95％或更多同源性，更加具体地与其98％或更多同源性，和最具体地与其99％或更多同源性的氨基酸序列组成，则该蛋白质可以非限制性地包含在本公开内容的范围内。

进一步，显而易见的是与上述序列具有同源性的氨基酸序列——其部分缺失、修饰、置换或添加，也在本公开内容的范围内，只要所得到的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:7的蛋白质基本上等价或相应的生物学活性。

另外地，编码苏氨酸脱氨酶的基因可以具有编码SEQ ID NO:7的氨基酸序列的核苷酸序列。在多核苷酸中，由于密码子简并性或考虑到蛋白质待表达的生物体中优选的密码子，可以在不改变蛋白质的氨基酸序列的情况下，在编码区中进行各种修饰。多核苷酸序列可以具有例如SEQ ID NO:30的多核苷酸序列并且可以具有如此核苷酸序列：其具有与其80％同源性，具体地与其90％同源性，并且更具体地与其99％同源性，但是不限于此。

如本文所使用，术语“同源性”指的是与给定氨基酸序列或核苷酸序列的匹配度，并且同源性可以表达为百分比。在本公开内容中，具有同一于或类似于给定氨基酸序列或核苷酸序列的活性的同源序列被表达为“同源性％”。例如，同源性％可以使用用于计算参数比如分数、同一性和相似性的标准软件即BLAST 2.0，或通过经由DNA杂交实验比较序列确认同源性％，并且待限定的适合杂交条件可以通过本领域技术人员已知的方法确定(例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 1989)。

如本文所使用，术语“酶活性的降低”意思是相关酶的活性相对于野生型的内源活性或修饰之前的状态降低。

另外地，如本文所使用，术语“失活”意思是编码相关酶的基因与野生型菌株相比以低水平表达或者不表达，或者即使基因表达，但活性被消除或降低。酶活性的降低或失活可以通过本领域中已知的任何方法实现。

具体地，失活可以通过使编码酶的多核苷酸的一部分或全部缺失；用于降低多核苷酸的表达的表达调控序列的修饰；染色体上多核苷酸序列减弱蛋白质活性的修饰进行实施；或通过选自其组合的方法进行实施，但是不具体地限于此。

编码蛋白质的多核苷酸的部分或全部缺失可以通过利用用于染色体基因插入的载体将编码染色体中内源靶蛋白的多核苷酸置换为标记基因或者在其中部分核苷酸序列缺失的多核苷酸来实施。

另外地，为了降低或消除多核苷酸表达，可以通过经由核苷酸序列的缺失、插入、保守或非保守置换或其组合在表达调控序列中引入变异以进一步减弱表达调控序列的活性，或通过将该表达调控序列替换为具有较弱活性的核苷酸序列来修饰表达调控序列，但是不具体地限于此。表达调控序列可以包括编码启动子的序列、操纵序列、核糖体结合位点和控制转录和翻译的终止的序列，但是不限于此。

进一步，可以通过经由多核苷酸序列的缺失、插入、非保守或保守置换或其组合在序列上引入变异从而进一步衰减蛋白质活性，或通过将序列替换为被修饰以具有较弱活性的多核苷酸序列进行染色体上多核苷酸序列的修饰，但是不限于此。

如本文所使用，术语“重组载体”指的是DNA构建体，其包含编码靶蛋白的多核苷酸的核苷酸序列，该靶蛋白可操作地连接至适合的调控序列使得靶蛋白在适合的宿主细胞中表达。调控序列可以包括能够开始转录的启动子、用于调控这种转录的任何操纵序列、编码适合mRNA核糖体结合位点的序列和用于调控转录和翻译的终止的序列。在被转化入适合的宿主细胞之后，重组载体可以不管宿主基因组如何而复制或者执行其功能，或者可以整合入其自身基因组。

在本公开内容中使用的重组载体不被具体地限制，只要其在宿主细胞中是可复制的，并且可以使用本领域中已知的任何载体生产。常用载体的实例包括天然或重组质粒、黏粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A可以被用作噬菌体载体或黏粒载体；并且基于pBR的、基于pUC的、基于pBluescriptII的、基于pGEM的、基于pTZ的、基于pCL的和基于pET的可以被用作质粒载体。可以在本公开内容中使用的载体不被具体地限制，并且可以使用本领域中已知的表达载体。具体地，可以使用pECCG117、pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pUC19、pBR322、pMW118和pCC1BAC载体。

例如，编码靶蛋白的多核苷酸可以通过用于染色体插入宿主细胞的载体被引入染色体。将多核苷酸引入染色体可以通过本领域中已知的任何方法实施，例如，通过同源重组，但是不限于此。

如本文所使用，术语“转化”意思是包含编码靶蛋白的多核苷酸的载体被引入宿主细胞，使得由多核苷酸编码的蛋白质能够在宿主细胞中表达。转化的多核苷酸可以是与位置无关的任一种，只要该多核苷酸能够在宿主细胞中表达，而不管该多核苷酸被插入和位于宿主细胞的染色体内或者位于染色体的外部部分上。

另外，术语“可操作地连接”指的是启动子序列与基因序列之间的功能性连接，该启动子序列开始并介导编码本公开内容的靶蛋白的多核苷酸的转录。

如本文所使用，术语“柠苹酸合成酶(EC2.3.1.182)”指的是催化乙酰辅酶A和丙酮酸转变为柠苹酸和辅酶A的酶。该酶已经在古细菌中发现，比如詹氏甲烷球菌(Howell etal.,J Bacteriol.181:331-333,1999)、肾脏钩端螺旋体(Leptospira interogans)(Xu etal.,J Bacteriol.186:5400-5409,2004)、硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)等，并且参与异亮氨酸生物合成的苏氨酸独立性途径(Risso et al.,J Bacteriol.190:2266-2274,2008)。该酶对于作为底物的丙酮酸是高度特异性的并且通常被异亮氨酸抑制。

如本文所使用，术语“柠苹酸合成酶”和“编码其的基因”非限制性地包括具有柠苹酸合成酶活性的任何蛋白质和编码其的任何基因。酶的序列可以容易地由已知数据库比如美国国家生物技术信息中心(NCBI)或日本DNA数据库(DDBJ)获得。

具体地，柠苹酸合成酶可以是衍生自詹氏甲烷球菌的柠苹酸合成酶并且可以由选自SEQ ID NO:1、2和3的氨基酸序列表示。

另外地，cimA——其是编码柠苹酸合成酶的基因，可以具有编码选自SEQ ID NO:1、2和3的氨基酸序列的核苷酸序列。具体地，多核苷酸序列可以具有例如选自SEQ ID NO:4、5和6的核苷酸序列，并且可以具有如此核苷酸序列：其具有与其80％或更多同源性，具体地与其90％或更多同源性，并且更具体地与其99％或更多同源性，但是不限于此。取决于微生物的物种或菌株，或者由于遗传密码的简并性，在展现活性的蛋白质的氨基酸序列中可能存在差别，大量的功能上等同的核酸可以编码任何给定蛋白质；因此，多核苷酸序列不限于此。

另外地，如果蛋白质是基本上具有柠苹酸合成酶的活性的蛋白质，并且如果蛋白质是如此氨基酸序列：其具有与选自SEQ ID NO:1、2和3的氨基酸序列70％或更多同源性，具体地与其80％或更多同源性，更具体地与其90％或更多同源性，更加具体地与其95％或更多同源性，更加具体地与其98％或更多同源性，并且最具体地与其99％或更多同源性，则该蛋白质可以非限制性地包括在本公开内容的范围内。

进一步，显而易见的是具有与上述序列的同源性的氨基酸序列——其部分内被缺失、修饰、置换或添加，也在本公开内容的范围内，只要得到的氨基酸序列具有与选自SEQID NO:1、2和3的氨基酸的蛋白质基本上等价或对应的生物学活性。

如本文所使用，术语“重组微生物”可以非限制性地包括在其中基因被操作的变体微生物。如果基因操作是可能的，则重组微生物可以是埃希氏杆菌属的微生物、棒状杆菌属的微生物、短杆菌属的微生物、沙雷氏菌属的微生物或普罗维登斯菌属的微生物，但是不限于此。例如，本公开内容的重组微生物可以是棒状杆菌属的微生物或埃希氏杆菌属的微生物，并且具体地，棒状杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌，并且埃希氏杆菌属的微生物可以是大肠杆菌。

在本公开内容中，重组微生物可以具有含有天然苏氨酸生产力的亲本菌株，或者可以具有含有变体菌株的亲本菌株，在该变体菌株中变异被引入以便于增强苏氨酸生产力。增强苏氨酸生产力的变异可以例如通过增强与苏氨酸生物合成相关联的基因或者通过衰减与苏氨酸降解途径相关联的基因来执行。与苏氨酸生物合成相关联的基因可以是选自下列的一种或多种：编码吡啶核苷酸转氢酶的pntAB、编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶的asd，编码天冬氨酸转氨酶的aspC，编码谷氨酸脱氢酶的gdhA，编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc，编码天冬氨酸的aspA、苏氨酸操纵子(thrO)等；并且与苏氨酸降解途径相关联的基因可以是选自下列的一种或多种基因：编码苏氨酸脱氢酶的tdh、编码分解代谢苏氨酸水合酶的tdcB等。

本公开内容的另一方面提供了用于生产苏氨酸的方法，其包括：在培养基中培养本公开内容的重组微生物；和从该微生物或培养过的培养基回收苏氨酸。

具体地，本公开内容提供了用于生产苏氨酸的方法，其包括：在培养基中培养生产苏氨酸的重组微生物，在该微生物中苏氨酸脱氨酶的活性被降低或失活并且柠苹酸合成酶的活性被引入；和从该微生物或培养过的培养基回收苏氨酸。

在本公开内容中，生产苏氨酸脱氨酶、柠苹酸合成酶和苏氨酸的重组微生物如上面所描述。

如本文所使用，术语“培养”指的是在人工控制的环境条件下培养微生物。在本公开内容中，培养微生物例如棒状杆菌属的微生物或埃希氏杆菌属的微生物的步骤可以使用本领域中已知的任何培养条件和培养方法实施。在上述方法中，培养本公开内容的微生物例如棒状杆菌属的微生物或埃希氏杆菌属的微生物可以通过但不具体地限于本领域中已知的分批培养、连续培养和补料分批培养实施。

用于培养的培养基必须以适合方式满足具体菌株的需要，并且可以由本领域技术人员适当地使用。用于棒状杆菌属的菌株或埃希氏杆菌属的菌株的培养基在本领域中是已知的(例如，Manual of Methods for General Bacteriology.American Society forBacteriology.Washington D.C.,USA,1981)。

具体而言，对于培养条件，可以使用碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)调节适合的pH(例如，5至9的pH，优选地6至8的pH，和最优选地6.8的pH)，但是不具体地限于此。此外，气泡形成可以通过使用消泡剂比如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制。

氧或含氧气体混合物可以被引入培养以维持需氧条件，并且培养的温度通常为20℃至45℃，优选地25℃至40℃。培养继续直到获得生产的最大量的苏氨酸，并且通常花费10小时至160小时以实现最大量的苏氨酸。苏氨酸可能释放入培养基或者可能包含在细胞中。

进一步，使用的培养基可以包括糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如，豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如，甘油和乙醇)和有机酸(例如，乙酸)，其单独地或组合地作为碳源，但是培养基不限于此。

此外，培养基可以包括含氮的有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米液(corn solution)、豆粕粉和尿素)，或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)，其单独地或组合地作为氮源，但是培养基不限于此。

此外地，培养基可以包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或与其相应的含钠盐，其单独地或组合地作为磷源，但是培养基不限于此。

另外，培养基可以包括其它必需的生长刺激物质，其包括金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸和维生素，但是培养基不限于此。

另外地，培养基可以包含适合的前体。这些物质可以在培养期间以分批或连续方式被添加至培养基，但是不限于此。

进一步，从微生物或培养过的培养基回收苏氨酸可以通过本领域中已知的适合方法实施，其根据培养方法例如分批、连续或补料分批培养方法进行选择。具体地，本领域中已知的苏氨酸回收方法可以包括离心、过滤、提取、喷雾、干燥、蒸发、沉淀、结晶、电泳、分级溶解(例如，硫酸铵沉淀)、色谱法(例如，HPLC、离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法和尺寸排阻色谱法)等，但是不限于此。

本公开内容的仍另一个方面提供了重组微生物用于生产苏氨酸的用途，在该微生物中苏氨酸脱氨酶(IlvA)的活性被降低或者失活并且柠苹酸合成酶的活性被保留。

在这种用途中，生产苏氨酸的重组微生物如上面所描述，在该微生物中苏氨酸脱氨酶(IlvA)的活性被降低或者失活并且柠苹酸合成酶的活性被保留。

如上面所描述，本公开内容的生产苏氨酸的重组微生物因为通过降低苏氨酸脱氨酶(ilvA)的活性或使其失活并通过引入柠苹酸合成酶(cimA)的活性降低了微生物中醋酸积累的量，因此维持或提高其生长能力并且具有优异的苏氨酸生产力。

具体实施方式

在下文，将伴随示例性实施方式详细地描述本公开内容。但是，本文公开的示例性实施方式仅出于说明性目的并且不应当被解释为限制本公开内容的范围。

实施例1：制备基于野生型大肠杆菌的产苏氨酸的菌株

1-1.制备用于基因插入的质粒和辅助质粒

使用基于mini-Mu转座子的基因组插入方法(Akhverdyan VZ,Gak ER et al.,Appl Microbiol Biotechnol.2011)从野生型大肠杆菌W3110(登录号：ATCC9637)生产苏氨酸。制备pCJ-MuAB(辅助质粒；图1)和pMu-R6K(整合质粒；图2)，以便利用mini-Mu插入方法。在辅助质粒pCJ1-MuAB中，使用阿拉伯糖诱导型ParaB启动子表达转座因子MuA和MuB。此外地，设计辅助质粒以容易地消除质粒——因为其包含温度敏感型复制子。整合质粒pMu-R6K具有包含Mu-attL/R的基因cat——其是mini-Mu单元——和在两端上的loxP66和loxP71(Oleg Tolmachov,et al.,Biotechnol.2006)。此外地，由于整合质粒具有R6K复制子，该质粒具有自杀载体的性质，其中在没有基因pir的正常大肠杆菌中没有出现增殖(Xiao-XingWei,Zhen-Yu Shi.et al.,Appl Microbiol Biotechnol.2010)。

1-2.用于增强苏氨酸生物合成基因的整合质粒的克隆

使用在上面的实施例1-1中制备的质粒制备三种整合质粒以增强苏氨酸生物合成基因的表达。

1-2-1：pMu-R6K_pntAB asd aspC-thrO

将在上面的实施例1-1中制备的整合质粒pMu-R6K利用限制酶SmaI处理，接着进行DNA纯化。其后，制备截短的线性克隆载体。通过使用W3110基因组DNA作为模板和SEQ IDNO:8和9作为引物的PCR扩增基因pntAB。具体地，在94℃下进行变性30秒，在55℃下退火30秒，和使用SolGent^TM Pfu-X DNA聚合酶(SolGent,DNA)在72℃下延伸3分钟；并且这重复30次。

另外地，如上面所描述扩增基因asd；即，使用W3110基因组DNA作为模板和SEQ IDNO:10和11作为引物进行PCR。此外地，通过使用W3110基因组DNA作为模板和SEQ ID NO:12和13作为引物的PCR扩增基因aspC。

通过使用SEQ ID NO:14和15作为引物的PCR从KCCM10541(韩国专利号10-0576342)的基因组DNA扩增苏氨酸操纵子(thrO)。上面制备的四种DNA和载体DNA中的每种经历Gibson装配方法以制备质粒pMu-R6K_pntAB asd aspC-thrO(Daniel G Gibson,etal.,Nature Methods 2009)。

在Gibson装配方法中，使用在下面的表1中示出的组成制备5X ISO缓冲液，并且然后将Gibson装配主混合物(master mix)(15μL)与待克隆的DNA(5μL)在50℃下反应1小时，在该主混合物中使用在下面的表2中示出的组成将5X ISO缓冲液与三种酶(例如，T5外切核酸酶(Epicentre)、Phusion聚合酶(New England Biolabs)和Taq连接酶(New EnglandBiolabs))混合。其后，对TransforMaxTM EC100DTM pir-116Electrocompetent大肠杆菌(Epicentre,USA)的感受态细胞施加电穿孔(2500V)。菌株从其回收，在含有氨苄青霉素(100μg/L)的LB平板培养基上平板接种，然后在37℃下培养过夜。其后，选择显示氨苄青霉素抗性的菌株。从选择的菌株获得质粒，并且通过测序分析确定其是否具有期望的核苷酸序列。

[表1]

5X ISO缓冲液的组成

成分	含量
		1M Tris-HCl pH 7.5	3mL
2M MgCl₂	150μL
		100nM dNTP混合物	240μL
1M DTT	300μL
		PEG-8000	1.5g
100mM NAD	300μL
		总计	dH₂O直到6mL

dH₂O：蒸馏水。

[表2]

Gibson装配主混合物的组成

1-2-2：pMu-R6K_gdhA aspC thrO

将在实施例1-1中制备的整合质粒pMu-R6K利用限制酶SmaI以与实施例1-2-1中相同的方式处理，然后DNA纯化。其后，制备截短的线性克隆载体。从W3110基因组DNA，通过使用SEQ ID NO:18和19作为引物的PCR扩增基因gdhA，并且通过使用SEQ ID NO:20和21作为引物的PCR扩增基因aspC。通过使用SEQ ID NO:14和15作为引物的PCR从KCCM10541基因组DNA扩增苏氨酸操纵子(thrO)。在上面制备的三种DNA和载体DNA中的每种经历Gibson装配方法以制备质粒pMu-R6K_gdhA aspC thrO。

1-2-3：pMu-ppc aspA thrO

将在上面的实施例1-1中制备的整合质粒pMu-R6K利用限制酶SmaI以与实施例1-2-1中相同的方式处理，然后DNA纯化。其后，制备截短的线性克隆载体。从W3110基因组DNA，通过使用SEQ ID NO:22和23作为引物的PCR扩增基因ppc，并且通过使用SEQ ID NO:24和25作为引物的PCR扩增基因aspA。通过使用SEQ ID NO:26和27作为引物的PCR从KCCM10541基因组DNA扩增苏氨酸操纵子(thrO)。在上面制备的三种DNA和载体DNA中的每种经历Gibson装配方法以制备质粒pMu-R6K_ppc aspA thrO。

1-3.制备苏氨酸生物合成增强的野生型大肠杆菌

使用补充有氨苄青霉素(100μg/L)和5mM阿拉伯糖的LB培养基在30℃下培养野生型大肠杆菌W3110直到OD₆₀₀达到0.6，在该大肠杆菌中在上面的实施例1-1中制备的pCJ-MuAB被转化。其后，生成物通过离心机利用无菌蒸馏水洗涤一次并利用10％甘油洗涤两次以制备感受态细胞(Sambrook and Russell 2001)。将整合质粒pMu-R6K_pntAB asd aspC-thrO电穿孔入制备的感受态细胞，向其加入SOC培养基(1mL)，并且然后生成物在37℃下培育1小时。其后，将生成物在含有氯霉素(25μg/L)的LB平板培养基上平板接种，并且然后使用SEQ ID NO:10和15实施氯霉素抗性细菌菌落的菌落PCR以确认基因pntAB asd aspCthrO被引入基因组。其后，将质粒pJW168转化入选择的菌株，并且然后在补充有0.1mM IPTG的LB平板培养基上平板接种以去除氯霉素抗性标记(cat)(Beatri’z Palmeros et al.,2000,Gene)。pMu-R6K_gdhA aspC thrO的引入通过如上面描述的mini-Mu整合方法顺序地实施，并且然后使用SEQ ID NO:18和15执行菌落PCR以确认引入是否成功。此外地，在引入pMu-ppc aspA thrO之后，使用SEQ ID NO:22和27执行菌落PCR以确认这样的引入。如此生产的基于野生型大肠杆菌(W3110)的产苏氨酸菌株被命名为CJT1。

实施例2：制备ilvA基因缺陷型菌株

FRT-一步-PCR缺失方法被用于缺失基因ilvA，其参与苏氨酸降解的代表性途径(Kirill A,et al.,2000,PNAS)。通过使用SEQ ID NO:28和29的引物和载体pKD3作为模板的PCR制备缺失盒。在94℃下进行变性30秒，在55℃下退火30秒，和使用SolGent^TM Pfu-XDNA聚合酶(SolGent,Korea)在72℃下延伸3分钟；并且这重复30次。

所得到的PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，并且ilvA缺陷型盒从具有1.2kbp大小的带纯化。菌株KCCM10541pKD46和CJT1pKD46——载体pKD46被引入其中(Kirill A,etal.,2000,PNAS)——在含有氨苄青霉素(100μg/L)和5mM L-阿拉伯糖的LB培养基上在30℃/200rpm下培养直到OD₆₀₀达到0.6。其后，生成物利用无菌蒸馏水洗涤一次和利用10％甘油洗涤两次以制备感受态细胞。通过电穿孔(2500V)将ilvA缺陷型盒引入制备的感受态细胞。其后，向其添加SOC培养基(1mL)，并且然后在37℃下培养生成物过夜。选择显示抗性的菌株。

使选择的菌株经历使用SEQ ID NO:28和29的引物的菌落PCR，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶上的基因大小为1.2kb确认ilvA基因缺陷。将确认的菌株再次转化入载体pCP20(Kirill A,et al.,2000,PNAS)，并且在相同的条件下通过菌落的菌落PCR制备最终的ilvA基因缺陷型菌株，该菌株在1.0％琼脂糖凝胶上具有150bp的基因大小，所述菌落通过将转化的菌株在含有氨苄青霉素(100μg/L)的LB平板培养基上平板接种获得。从KCCM10541缺失ilvA的菌株被命名为KCCM10541-ilvA；并且从CJT1缺失ilvA的菌株被命名为CJT1-ilvA。

实施例3：制备cimA基因引入的菌株

通过密码子优化基于衍生自包含CJ1启动子的詹氏甲烷球菌的基因cimA(韩国专利号10-0620092)制备DNA Pcj1_cimA、Pcj1_cimA 2.0和Pcj1_cimA 3.7(Atsumi,Liao JC,Appl Environ Microbiol.2008)。当合成基因时将BamHI位点加入至两端，并且然后亚克隆入CopyControl pCC1BAC(BamHI)(Epicentre,USA)以制备最终表达基因cimA的质粒pCC1BAC:Pcj1_cimA、pCC1BAC:Pcj1_cimA 2.0和pCC1BAC:Pcj1_cimA 3.7。此外地，将上述三种质粒和对照质粒pCC1BAC通过电穿孔(2500V)转化入菌株KCCM10541-ilvA和CJT1-ilvA以最终制备待用于实验的菌株。为了比较实验，也制备这样的菌株：在该菌株中以与上面描述的相同方式将pCC1BAC转化入两种菌株KCCM10541和CJT1。

在上文中，基因cimA编码野生型柠苹酸合成酶；和cimA 2.0和cimA 3.7编码突变型柠苹酸合成酶，其中比活性增加并且其中异亮氨酸的反馈抑制被降低(Atsumi,Liao JC,Appl Environ Microbiol.2008)。cimA 2.0和cimA 3.7的氨基酸序列为SEQ ID NO:2和3，并且与其对应的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:5和6。

基于KCCM10541或KCCM10541-ilvA制备KCCM10541pCC1BAC、KCCM10541-ilvApCC1BAC、KCCM10541-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA、KCCM10541-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 2.0和KCCM10541-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 3.7的重组微生物。此外地，基于CJT1或CJT1-ilvA制备CJT1pCC1BAC、CJT1-ilvA pCC1BAC、CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA、CJT1-ilvApCC1BAC:Pcj1_cimA 2.0和CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 3.7的重组微生物。

本发明人分别将‘CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA’、‘CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 2.0’和‘CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 3.7’的重组微生物命名为‘CA03-8303’、‘CA03-8304’和‘CA03-8305’。此外地，于2014年12月5日将这些微生物根据布达佩斯条约在韩国微生物保藏中心(KCCM)进行保藏，并且将这些微生物分别命名为‘KCCM11632P’、‘KCCM11633P’和‘KCCM11634P’。

实施例4：通过ilvA缺陷型菌株和表达cimA的菌株的烧瓶评价确认苏氨酸生产力

为了比较在上面的实施例3中制备的菌株中生产的苏氨酸的量，进行烧瓶评价。在烧瓶测试中，菌株中的每种在含有氯霉素(25μg/L)的LB平板上划线培养并且在培养箱(33℃)中培养16小时。其后，将单菌落接种入LB培养基(2mL)，并且将生成物在培养箱(200rpm/33℃)中培养12小时。此外地，在下面的表3中示出的产苏氨酸的烧瓶培养基(25mL)被添加至烧瓶(250mL)，并且向其加入先前培养的500μL培养基溶液。其后，将烧瓶在培养箱(200rpm/33℃)中培育48小时，并且然后比较从每种菌株获得的苏氨酸的量。结果在下面的表4中示出。

[表3]

产苏氨酸的烧瓶培养基的组成

组成	浓度(每升)
		葡萄糖	70g
硫酸铵	25g
		KH₂PO₄	1g
MgSO₄·7H₂O	0.5g
		FeSO₄·7H₂O	5mg
MnSO₄·8H₂O	5mg
		ZnSO₄	5mg
碳酸钙	30g
		酵母提取物	2g
甲硫氨酸	0.3g
		pH	6.8

[表4]

通过烧瓶培养在生产菌株中生产苏氨酸

如上面的表4中所示出的，观察到ilvA缺失的两种菌株KCCM10541-ilvA pCC1BAC和CJT1-ilvA pCC1BAC与ilvA不缺失的菌株KCCM10541pCC1BAC和CJT1pCC1BAC相比没有良好地生长，这是由于需要异亮氨酸(参见OD值)。但是，确认了在KCCM10541-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA、KCCM10541-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 2.0、KCCM10541-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 3.7、CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA、CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 2.0和CJT1-ilvA pCC1BAC:Pcj1_cimA 3.7——其是被引入三种类型的cimA的变体菌株——中，完全地恢复生长并且生产的苏氨酸的量增加大约10％至30％，同时生产的醋酸的量降低大约30％至60％。

具体而言，确认了当cimA 2.0或cimA 3.7被引入时，与cimA被引入ilvA缺陷型菌株的情况相比，菌株生长能力增加20％或更高并且生产的苏氨酸的量轻微地增加，同时生产的醋酸的量进一步降低。

从上文，本公开内容所属领域的普通技术人员将能够理解本公开内容可以以其它具体的形式体现而不改变本公开内容的技术概念或基本特征。在这方面，本文公开的示例性实施方式仅出于说明性目的并且不应当被解释为限制本公开内容的范围。相反，本公开内容意欲不仅覆盖示例性实施方式而且覆盖各种替代方案、修改、等价物和其它实施方式，其可以包含在由所附权利要求书限定的公开内容的精神和范围内。

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 生产L-苏氨酸的重组微生物和使用其生产L-苏氨酸的方法

<130> OPA16176

<150> KR 10-2015-0148004

<151> 2015-10-23

<160> 30

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 491

<212> PRT

<213> 詹氏甲烷球菌

<400> 1

Met Met Val Arg Ile Phe Asp Thr Thr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Thr

1 5 10 15

Pro Gly Val Ser Leu Thr Pro Asn Asp Lys Leu Glu Ile Ala Lys Lys

20 25 30

Leu Asp Glu Leu Gly Val Asp Val Ile Glu Ala Gly Ser Ala Ile Thr

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50 55 60

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65 70 75 80

Ala Ala Leu Glu Cys Asp Val Asp Ser Val His Leu Val Val Pro Thr

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Ser Pro Ile His Met Lys Tyr Lys Leu Arg Lys Thr Glu Asp Glu Val

100 105 110

Leu Glu Thr Ala Leu Lys Ala Val Glu Tyr Ala Lys Glu His Gly Leu

115 120 125

Ile Val Glu Leu Ser Ala Glu Asp Ala Thr Arg Ser Asp Val Asn Phe

130 135 140

Leu Ile Lys Leu Phe Asn Glu Gly Glu Lys Val Gly Ala Asp Arg Val

145 150 155 160

Cys Val Cys Asp Thr Val Gly Val Leu Thr Pro Gln Lys Ser Gln Glu

165 170 175

Leu Phe Lys Lys Ile Thr Glu Asn Val Asn Leu Pro Val Ser Val His

180 185 190

Cys His Asn Asp Phe Gly Met Ala Thr Ala Asn Thr Cys Ser Ala Val

195 200 205

Leu Gly Gly Ala Val Gln Cys His Val Thr Val Asn Gly Ile Gly Glu

210 215 220

Arg Ala Gly Asn Ala Ser Leu Glu Glu Val Val Ala Ala Leu Lys Ile

225 230 235 240

Leu Tyr Gly Tyr Asp Thr Lys Ile Lys Met Glu Lys Leu Tyr Glu Val

245 250 255

Ser Arg Ile Val Ser Arg Leu Met Lys Leu Pro Val Pro Pro Asn Lys

260 265 270

Ala Ile Val Gly Asp Asn Ala Phe Ala His Glu Ala Gly Ile His Val

275 280 285

Asp Gly Leu Ile Lys Asn Thr Glu Thr Tyr Glu Pro Ile Lys Pro Glu

290 295 300

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Lys Ala Leu Lys Tyr Lys Leu Asp Leu Met Gly Ile Asn Val Ser Asp

325 330 335

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Gly Lys Tyr Ile Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ala Ile Val Arg Glu Val

355 360 365

Thr Gly Lys Leu Val Glu Glu Lys Ile Lys Leu Asp Glu Leu Thr Val

370 375 380

Val Ser Gly Asn Lys Ile Thr Pro Ile Ala Ser Val Lys Leu His Tyr

385 390 395 400

Lys Gly Glu Asp Ile Thr Leu Ile Glu Thr Ala Tyr Gly Val Gly Pro

405 410 415

Val Asp Ala Ala Ile Asn Ala Val Arg Lys Ala Ile Ser Gly Val Ala

420 425 430

Asp Ile Lys Leu Val Glu Tyr Arg Val Glu Ala Ile Gly Gly Gly Thr

435 440 445

Asp Ala Leu Ile Glu Val Val Val Lys Leu Arg Lys Gly Thr Glu Ile

450 455 460

Val Glu Val Arg Lys Ser Asp Ala Asp Ile Ile Arg Ala Ser Val Asp

465 470 475 480

Ala Val Met Glu Gly Ile Asn Met Leu Leu Asn

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<210> 2

<211> 371

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 詹氏甲烷球菌 cimA变体，cimA 2.0 a.a.

<400> 2

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1 5 10 15

Pro Gly Val Ser Leu Thr Pro Asn Asp Lys Leu Glu Ile Ala Lys Lys

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Leu Asp Glu Leu Gly Val Asp Val Ile Glu Ala Gly Ser Ala Val Thr

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85 90 95

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Leu Ile Lys Leu Phe Asn Glu Gly Glu Lys Val Gly Ala Asp Arg Val

145 150 155 160

Cys Val Cys Asp Thr Val Gly Val Leu Thr Pro Gln Lys Ser Gln Glu

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Leu Phe Lys Lys Ile Thr Glu Asn Val Asn Leu Pro Val Ser Val His

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Cys His Asn Asp Phe Gly Met Ala Thr Ala Asn Ala Cys Ser Ala Val

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210 215 220

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225 230 235 240

Leu Tyr Gly Tyr Asp Thr Lys Ile Lys Met Glu Lys Leu Tyr Glu Val

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<210> 3

<211> 371

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 詹氏甲烷球菌 cimA变体，cimA 3.7 a.a.

<400> 3

Met Met Val Arg Ile Phe Asp Thr Thr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Thr

1 5 10 15

Pro Gly Val Ser Leu Thr Pro Asn Asp Lys Leu Glu Ile Ala Lys Lys

20 25 30

Leu Asp Glu Leu Gly Val Asp Val Ile Glu Ala Gly Ser Ala Val Thr

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Ser Lys Gly Glu Arg Glu Gly Ile Lys Leu Ile Thr Lys Glu Gly Leu

50 55 60

Asn Ala Glu Ile Cys Ser Phe Val Arg Ala Leu Pro Val Asp Ile Asp

65 70 75 80

Ala Ala Leu Glu Cys Asp Val Asp Ser Val His Leu Val Val Pro Thr

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100 105 110

Leu Val Thr Ala Leu Lys Ala Val Glu Tyr Ala Lys Glu Gln Gly Leu

115 120 125

Ile Val Glu Leu Ser Ala Glu Asp Ala Thr Arg Ser Asp Val Asn Phe

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Leu Ile Lys Leu Phe Asn Glu Gly Glu Lys Val Gly Ala Asp Arg Val

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Cys Val Cys Asp Thr Val Gly Val Leu Thr Pro Gln Lys Ser Gln Glu

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180 185 190

Cys His Asn Asp Phe Gly Met Ala Thr Ala Asn Ala Cys Ser Ala Val

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Leu Tyr Gly Tyr Asp Thr Lys Ile Lys Met Glu Lys Leu Tyr Glu Val

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Met Val Gly Asn Arg Arg Arg Ile Ile Leu Gly Lys His Ser Gly Arg

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Lys Ala Leu Lys Tyr Lys Leu Asp Leu Met Gly Ile Asn Val Ser Asp

325 330 335

Glu Gln Leu Asn Lys Ile Tyr Glu Arg Val Lys Glu Phe Gly Asp Leu

340 345 350

Gly Lys Tyr Ile Ser Asp Ala Asp Leu Leu Ala Ile Val Arg Glu Val

355 360 365

Thr Gly Lys

370

<210> 4

<211> 1476

<212> DNA

<213> 詹氏甲烷球菌

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ttaacaccaa acgataagct ggagatagct aaaaagttgg atgaacttgg ggttgatgtt 120

atagaggccg gtagcgctat cactagcaag ggagagcgcg aaggaataaa actcattaca 180

aaagaaggtc ttaacgcaga aatctgcagt ttcgtgcgtg cactccctgt agacatagac 240

gctgccttag aatgtgatgt agatagtgtg cacctcgtgg tgcccacatc tccaatacac 300

atgaagtaca aacttcgtaa aacggaggat gaggttctcg agaccgcact taaggctgtg 360

gaatacgcta aagagcatgg cttgatcgtt gagttatcag cggaggatgc gacaagatcc 420

gatgttaatt tcttaataaa actcttcaat gaaggggaaa aggttggagc agaccgtgtt 480

tgtgtttgcg acaccgtagg agttttaacg ccacaaaagt cgcaggaact gtttaagaaa 540

ataaccgaga atgtgaattt accggtctcg gttcattgcc acaacgactt tggaatggct 600

actgctaata cttgctccgc agtgctcggc ggagctgttc agtgccacgt gacagttaac 660

ggtattggcg agcgcgcagg gaatgcctcc ttagaagagg tcgttgccgc gctgaaaatc 720

ctctacggct atgatactaa aataaagatg gaaaagttat acgaggtttc acgcattgtc 780

tcccgcttga tgaaacttcc tgttcccccg aacaaagcga ttgttggcga caatgcgttc 840

gctcacgaag caggtatcca tgtcgatgga ttaattaaaa atactgaaac ctatgagcca 900

atcaaaccag aaatggtggg caaccgccgg cgtatcattc tcggtaagca ctctggtcgg 960

aaagcgttaa agtacaagct tgatctaatg ggcataaacg tgtctgatga gcaattaaac 1020

aaaatttatg aacgcgttaa agaattcggg gacctaggta agtacatttc agatgctgat 1080

ttgctcgcta tagttcgcga agtcacggga aagttggttg aggagaagat caaactggac 1140

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 詹氏甲烷球菌 cimA变体，cimA 2.0

<400> 5

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<210> 6

<211> 1116

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 詹氏甲烷球菌 cimA变体，cimA 3.7

<400> 6

atgatggtaa ggatattcga taccacactt cgcgacggag agcagacacc aggagtttct 60

ttaacaccaa acgataagct ggagatagct aaaaagttgg atgaacttgg ggttgatgtt 120

atagaggccg gtagcgctgt cactagcaag ggagagcgcg aaggaataaa actcattaca 180

aaagaaggtc ttaacgcaga aatctgcagt ttcgtgcgtg cactccctgt agacatagac 240

gctgccttag aatgtgatgt agatagtgtg cacctcgtgg tgcccacatc tccaatacac 300

atgaagtaca aacttcgtaa aacggaggat gaggttctcg tgaccgcact taaggctgtg 360

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ctctacggct atgatactaa aataaagatg gaaaagttat acgaggtttc acgcattgtc 780

tcccgcttga tgaaacttcc tgttcccccg aacaaagcga ttgttggcga caatgcgttc 840

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atcaaaccag aaatggtggg caaccgccgg cgtatcattc tcggtaagca ctctggtcgg 960

aaagcgttaa agtacaagct tgatctaatg ggcataaacg tgtctgatga gcaattaaac 1020

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<210> 7

<211> 514

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 7

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1 5 10 15

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Ile Arg Gly Glu Arg Leu Ala His Ile Leu Ser Gly Ala Asn Val Asn

305 310 315 320

Phe His Gly Leu Arg Tyr Val Ser Glu Arg Cys Glu Leu Gly Glu Gln

325 330 335

Arg Glu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ile Pro Glu Glu Lys Gly Ser Phe

340 345 350

Leu Lys Phe Cys Gln Leu Leu Gly Gly Arg Ser Val Thr Glu Phe Asn

355 360 365

Tyr Arg Phe Ala Asp Ala Lys Asn Ala Cys Ile Phe Val Gly Val Arg

370 375 380

Leu Ser Arg Gly Leu Glu Glu Arg Lys Glu Ile Leu Gln Met Leu Asn

385 390 395 400

Asp Gly Gly Tyr Ser Val Val Asp Leu Ser Asp Asp Glu Met Ala Lys

405 410 415

Leu His Val Arg Tyr Met Val Gly Gly Arg Pro Ser His Pro Leu Gln

420 425 430

Glu Arg Leu Tyr Ser Phe Glu Phe Pro Glu Ser Pro Gly Ala Leu Leu

435 440 445

Arg Phe Leu Asn Thr Leu Gly Thr Tyr Trp Asn Ile Ser Leu Phe His

450 455 460

Tyr Arg Ser His Gly Thr Asp Tyr Gly Arg Val Leu Ala Ala Phe Glu

465 470 475 480

Leu Gly Asp His Glu Pro Asp Phe Glu Thr Arg Leu Asn Glu Leu Gly

485 490 495

Tyr Asp Cys His Asp Glu Thr Asn Asn Pro Ala Phe Arg Phe Phe Leu

500 505 510

Ala Gly

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pMu-pntAB引物F

<400> 8

gtcgactcta gaggatcccc aagtagtgat tcgtgccggg 40

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pMu-pntAB引物R

<400> 9

cccggcacga atcactactt ggggatcctc tagagtcgac 40

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pntAB-asd引物F

<400> 10

gcgcaatttt gacaggatct tgattgcccg ccgtcttttc 40

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pntAB-asd引物R

<400> 11

gaaaagacgg cgggcaatca agatcctgtc aaaattgcgc 40

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> asd-aspC引物F

<400> 12

gagttaaata gagcaagctc gtccacctat gttgactaca 40

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> asd-aspC引物R

<400> 13

tgtagtcaac ataggtggac gagcttgctc tatttaactc 40

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aspC-thrO引物F

<400> 14

gcctgatgcg ctacgcttat agcttttcat tctgactgca 40

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aspC-thrO引物R

<400> 15

tgcagtcaga atgaaaagct ataagcgtag cgcatcaggc 40

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> thrO-pMu引物F

<400> 16

tgatgatgaa tcatcagtaa gggtaccgag ctcgctgttt 40

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> thrO-pMu引物R

<400> 17

aaacagcgag ctcggtaccc ttactgatga ttcatcatca 40

<210> 18

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pMu-gdhA引物F

<400> 18

gtcgactcta gaggatcccc gctactgata acggtagccg 40

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pMu-gdhA引物R

<400> 19

cggctaccgt tatcagtagc ggggatcctc tagagtcgac 40

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gdhA-aspC引物F

<400> 20

tacgctctaa tgtaggccgg gtccacctat gttgactaca t 41

<210> 21

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gdhA-aspC引物R

<400> 21

atgtagtcaa cataggtgga cccggcctac attagagcgt a 41

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pMu-ppc引物F

<400> 22

gtcgactcta gaggatcccc gtaggccgga taaggcgctc 40

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pMu-ppc引物R

<400> 23

gagcgcctta tccggcctac ggggatcctc tagagtcgac 40

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ppc-aspA引物F

<400> 24

ctgtctgcat tttattcaaa ctacctgaat gggttgcgaa 40

<210> 25

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ppc-aspA引物R

<400> 25

ttcgcaaccc attcaggtag tttgaataaa atgcagacag 40

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aspA-thrO引物F

<400> 26

taaaaaacaa ggaaggctaa agcttttcat tctgactgca 40

<210> 27

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aspA-thrO引物R

<400> 27

tgcagtcaga atgaaaagct ttagccttcc ttgtttttta 40

<210> 28

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ilvA缺陷的引物F

<400> 28

gcctgacgga agaacagaaa gcgcacggcg tgatcactgc ttctgcgggt aaccacgcgc 60

agggcgctgg agctgcttcg aagttc 86

<210> 29

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ilvA缺陷的引物R

<400> 29

gatattcata tggaccatgg ccggaaccct ctggcgcgct ggcgctggcg ggaatgaaaa 60

aatatatcgc cctgcacaac attcgc 86

<210> 30

<211> 1545

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 30

atggctgact cgcaacccct gtccggtgct ccggaaggtg ccgaatattt aagagcagtg 60

ctgcgcgcgc cggtttacga ggcggcgcag gttacgccgc tacaaaaaat ggaaaaactg 120

tcgtcgcgtc ttgataacgt cattctggtg aagcgcgaag atcgccagcc agtgcacagc 180

tttaagctgc gcggcgcata cgccatgatg gcgggcctga cggaagaaca gaaagcgcac 240

ggcgtgatca ctgcttctgc gggtaaccac gcgcagggcg tcgcgttttc ttctgcgcgg 300

ttaggcgtga aggccctgat cgttatgcca accgccaccg ccgacatcaa agtcgacgcg 360

gtgcgcggct tcggcggcga agtgctgctc cacggcgcga actttgatga agcgaaagcc 420

aaagcgatcg aactgtcaca gcagcagggg ttcacctggg tgccgccgtt cgaccatccg 480

atggtgattg ccgggcaagg cacgctggcg ctggaactgc tccagcagga cgcccatctc 540

gaccgcgtat ttgtgccagt cggcggcggc ggtctggctg ctggcgtggc ggtgctgatc 600

aaacaactga tgccgcaaat caaagtgatc gccgtagaag cggaagactc cgcctgcctg 660

aaagcagcgc tggatgcggg tcatccggtt gatctgccgc gcgtagggct atttgctgaa 720

ggcgtagcgg taaaacgcat cggtgacgaa accttccgtt tatgccagga gtatctcgac 780

gacatcatca ccgtcgatag cgatgcgatc tgtgcggcga tgaaggattt attcgaagat 840

gtgcgcgcgg tggcggaacc ctctggcgcg ctggcgctgg cgggaatgaa aaaatatatc 900

gccctgcaca acattcgcgg cgaacggctg gcgcatattc tttccggtgc caacgtgaac 960

ttccacggcc tgcgctacgt ctcagaacgc tgcgaactgg gcgaacagcg tgaagcgttg 1020

ttggcggtga ccattccgga agaaaaaggc agcttcctca aattctgcca actgcttggc 1080

gggcgttcgg tcaccgagtt caactaccgt tttgccgatg ccaaaaacgc ctgcatcttt 1140

gtcggtgtgc gcctgagccg cggcctcgaa gagcgcaaag aaattttgca gatgctcaac 1200

gacggcggct acagcgtggt tgatctctcc gacgacgaaa tggcgaagct acacgtgcgc 1260

tatatggtcg gcggacgtcc atcgcatccg ttgcaggaac gcctctacag cttcgaattc 1320

ccggaatcac cgggcgcgct gctgcgcttc ctcaacacgc tgggtacgta ctggaacatt 1380

tctttgttcc actatcgcag ccatggcacc gactacgggc gcgtactggc ggcgttcgaa 1440

cttggcgacc atgaaccgga tttcgaaacc cggctgaatg agctgggcta cgattgccac 1500

gacgaaacca ataacccggc gttcaggttc tttttggcgg gttag 1545

PCT/RO/134表

Claims

1.一种生产苏氨酸的重组微生物，其中苏氨酸脱氨酶(IlvA)的活性被降低或失活并且柠苹酸合成酶的活性被保留。

2.权利要求1所述的重组微生物，其中所述苏氨酸脱氨酶由SEQ ID NO:7的氨基酸序列表示。

3.权利要求1所述的重组微生物，其中所述柠苹酸合成酶是衍生自詹氏甲烷球菌的柠苹酸合成酶。

4.权利要求1所述的重组微生物，其中所述柠苹酸合成酶由选自SEQ IDNO:1、2和3的氨基酸序列表示。

5.权利要求1所述的重组微生物，其中所述重组微生物是棒状杆菌属的微生物或埃希氏杆菌属的微生物。

6.权利要求5所述的重组微生物，其中所述棒状杆菌属的微生物是谷氨酸棒状杆菌，和所述埃希氏杆菌属的微生物是大肠杆菌。

7.一种生产苏氨酸的方法，其包括：

在培养基中培养权利要求1-6中任一项所述的重组微生物；和

从所述微生物或培养过的培养基回收苏氨酸。