TWI736816B

TWI736816B - 產生ｌ-精胺酸之棒狀桿菌屬之微生物及使用該微生物產生ｌ-精胺酸之方法

Info

Publication number: TWI736816B
Application number: TW107145903A
Authority: TW
Inventors: 金善慧; 金亨俊; 歐哈耶納; 尹炳勳; 姜旼暻
Original assignee: 南韓商Ｃｊ第一製糖股份有限公司
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2021-08-21
Also published as: CN110234767B; PE20191702A1; CN110234767A; PH12019500940A1; WO2019124932A2; EP3546581A2; BR112019015993B1; AU2018353929B2; US11345940B2; MX2019009383A; CL2019002319A1; IL266290B2; EP3546581A4; TW201940699A; JP6806895B2; KR101999454B1; JP2020504598A; IL266290A; AU2018353929A1; WO2019124932A3

Abstract

本揭示內容係有關產生L-精胺酸之棒狀桿菌屬之微生物及使用該微生物產生L-精胺酸之方法。

Description

產生L-精胺酸之棒狀桿菌屬之微生物及使用該微生物產生L-精胺酸之方法

L-精胺酸以其游離形式包含於植物種子或大蒜中，且除了用於胺基酸強化膳食補充劑之外，還廣泛用於藥劑、食品等。L-精胺酸醫藥應用之實例包括肝功能增強劑、腦功能增強劑、男性不孕症治療劑與一般胺基酸調配劑。應用L-精胺酸之食品之代表為魚醬添加劑、健康飲料添加劑、與高血壓病患之鹽代用品。因此，L-精胺酸為近來極受矚目之物料。

棒狀桿菌屬微生物，特別是麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)，為廣泛用於產生L-胺基酸之革蘭氏陽性微生物。對於L-精胺酸之生產，主要使用特定目標物料之方法，例如在棒狀桿菌屬菌株中增加編碼主要參與L-精胺酸合成酵素基因表現之方法，或刪除對L-精胺酸生合成不必要基因之方法(韓國專利案No.10-1102263)。然而，對於能高產量有效生產L-精胺酸方法之研究仍存在不斷增長之需求。

於此情況下，本發明人等已進行密集努力以開發能高效率生產L-精胺酸之微生物，結果，申請人等經由確認棒狀桿菌屬之微生物在刪除編碼蛋白質(其功能未知)基因下可增加L-精胺酸生產量，而完成本揭示內容。

本揭示內容之目的在於提供產生L-精胺酸之棒狀桿菌屬之微生物，其中包含SEQ ID NO：1胺基酸序列之蛋白質係經去活化。

本揭示內容之另一目的在於提供經由使用該微生物產生L-精胺酸之方法。

下文中，將詳細說明本揭示內容。同時，本文揭示之各個說明與例示具體例可應用於其他說明與例示具體例。亦即，本文揭示之各種因素之所有組合均隸屬本揭示內容之範圍。再者，本揭示內容之範圍不應被下文中所提供之特定揭示內容所侷限。

為了達成上述目的，本揭示內容之一態樣提供產生L-精胺酸之棒狀桿菌屬之微生物，其中包含SEQ ID NO：1胺基酸序列之蛋白質係經去活化。

本文所用之“L-精胺酸”一詞係指具有化學式C₆H₁₄N₄O₂之L-胺基酸，其為存在所有生物中之半必需胺基酸。已知L-精胺酸主要由棒狀桿菌屬之微生物產生，惟一般已知此等受細胞內精胺酸回饋抑制之支配(Vehary Sakanyan,et al.,Microbiology,142：9-108,1996)。因此，已知此等微生物在高產量產生L-精胺酸上有所侷限。本發明人等意外地發現，當包含SEQ ID NO：1胺基酸序列之蛋白質(其功能未知)係經去活化時，L-精胺酸之產量增加，從而提供用於產生L-精胺酸之新穎微生物。

本文所用之“包含SEQ ID NO：1胺基酸序列之蛋白質”一詞係指原本存在於棒狀桿菌屬微生物中之蛋白質或假定蛋白質，其功能未知。舉例而言，該包含SEQ ID NO：1胺基酸序列之蛋白質可為(本質上)由SEQ ID NO：1胺基酸序列所構成之蛋白質，惟不受此限。

此外，雖然於本揭示內容中被述為“由特定SEQ ID NO構成之蛋白質”，惟此類表示法不排除蛋白質中可能發生之突變，其可經由對應SEQ ID NO胺基酸序列上游或下游之無意義序列之加成、或其中自然發生之突變、或其中之緘默突變，只要具有此類突變之蛋白質係與由對應SEQ ID NO胺基酸序列構成之蛋白質具有相同或對應之活性即可。即使序列加成或突變存在時，其顯然亦隸屬本揭示內容之範圍。

於一例示具體例中，包含SEQ ID NO：1胺基酸序列之蛋白質可包含與SEQ ID NO：1具有至少80%相同性之胺基酸序列。包含與SEQ ID NO：1具有至少80%相同性胺基酸序列之蛋白質，可包括包含與SEQ ID NO：1胺基酸序列具有至少80%，具體而言，至少83%、至少84%、至少88%、至少90%、至少93%、至少95%、或至少97%相同性胺基酸序列之蛋白質。顯而易見的是，具有其中序列係經部分刪除、修飾、置換、或嵌入之胺基酸序列之蛋白質亦涵蓋於本揭示內容之範圍內，只要與序列具有相同性之序列顯示與SEQ ID NO：1胺基酸序列實際上等同或對應之生物活性即可。

另外，包含SEQ ID NO：1胺基酸序列之蛋白質可由包含SEQ ID NO：2多核苷酸序列之基因編碼。此外，該蛋白質可由SEQ ID NO：2多核苷酸序列構成或本質上由其構成之基因編碼，惟不受此限。

另外，本揭示內容之蛋白質不僅可由包含SEQ ID NO：2多核苷酸序列之基因編碼，惟亦可由包含與SEQ ID NO：2具有至少80%相同性之多核苷酸之基因編碼。

具體而言，能編碼包含與上述SEQ ID NO：1具有至少80%相同性胺基酸序列之蛋白質之多核苷酸序列可涵蓋於本揭示內容範圍之內，惟該蛋白質可由包含與上述SEQ ID NO：2多核苷酸序列具有至少80%，具體而言，至少83%、至少84%、至少88%、至少90%、至少93%、至少95%、或至少97%相同性之多核苷酸序列之基因編碼。此外，根據遺傳密碼之簡併性，編碼相同胺基酸序列之序列變異體亦可涵蓋於本揭示內容範圍之內。

本文所用之“相同性”一詞係指與給定胺基酸序列或核苷酸序列之同一性，且相同性可表示為百分比。於本揭示內容中，與給定胺基酸序列或多核苷酸序列具有完全相同或類似活性之相似序列表示為“%相同性”。

與胺基酸序列或核苷酸序列之相同性，可例如經由使用演算法BLAST[參見Karlin and Altschul,Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993)]或FASTA[參見Pearson,Methods Enzymol.,183,63,1990)]決定。根據演算法BLAST，稱為BLASTN或BLASTX之程式已被開發(參見http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)。

本文所用之“去活化”一詞意指蛋白質完全不表現，或蛋白質表現，惟相較於母株、原生菌株、或修飾前菌株，則展現無活性或活性下降。下降係指包括由於編碼該蛋白質基因之修飾、刪除等而相較於微生物中原來擁有的蛋白質，蛋白質活性下降之情況；由於編碼相同蛋白質基因之表現抑制或轉譯抑制，使細胞中整體蛋白質活性程度比原生菌株或修飾前菌株低之情況；或其組合；之概念。

於本揭示內容中，首次確認蛋白質之去活化與L-精胺酸之生產力有關。

於本揭示內容中，去活化可經由此項技藝中悉知之各種方法完成。該方法之實例可包括1)刪除全部或部分編碼蛋白質基因之方法；2)修飾表現控制序列以減少編碼蛋白質基因表現之方法；3)修飾編碼蛋白質基因之序列以移除或減弱蛋白質活性之方法；4)引入與編碼蛋白質基因之轉錄本互補結合之反義寡核苷酸(例如反義RNA)之方法；5)經由在編碼蛋白質基因之夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno)序列前端添加夏因-達爾加諾序列與其互補序列，形成二級結構，使與核醣體之連接變不可能之方法；6)在編碼蛋白質基因之多核苷酸序列開放閱讀框架(ORF)之3'端添加反轉錄啟動子之反轉錄工程(RTE)之方法等；以及亦可包括其組合，惟不特別限於此。

具體而言，修飾表現控制序列之方法可經由應用此項技藝中悉知之多種方法完成。舉例而言，該方法可經由刪除、嵌入、非保守性或保守性置換、或其組合，誘發多核苷酸序列中表現控制序列之修飾，以進一步減弱表現控制序列之活性，或經由以具有較弱活性之多核苷酸序列置換表現控制序列進行。表現控制序列可包括啟動子、操作子序列、編碼核醣體結合區之序列、及控制轉錄與轉譯終止之序列，惟不受此限。

再者，修飾核苷酸序列之方法可經由核苷酸序列中之刪除、嵌入、非保守性或保守性置換、或其組合，誘發序列修飾，以進一步減弱酵素活性，或經由以經改進之具有較弱活性之核苷酸序列或經改進之不具活性之核苷酸序列置換核苷酸序列而進行，惟不受此限。

此外，刪除編碼蛋白質基因之部分或全部之方法，可經由染色體嵌入微生物用之載體，以刪除部分核苷酸序列之多核苷酸或標記基因，置換染色體內編碼內源目標蛋白質之多核苷酸而進行。於一刪除部分或全部多核苷酸方法之例示具體例中，可使用經由同源重組刪除多核苷酸之方法，惟不受此限。

此外，刪除部分或全部基因之方法可經由使用光線(例如UV)或化學藥品誘發突變，然後從所得突變體中挑選具有刪除目標基因之菌株而進行。刪除基因之方法可包括使用基因重組技術之方法。舉例而言，將包含與目標基因具有相同性之核苷酸序列之核苷酸序列或載體引入微生物中以發生同源重組。進一步地，待引入之核苷酸序列或載體可包含顯性挑選標記。

本文所用之“產生L-精胺酸之微生物”或“具有L-精胺酸生產力之微生物”一詞係指天然具有產生L-精胺酸能力之微生物，或經由將產生L-精胺酸能力賦予未具產生L-精胺酸能力之母株所製備之微生物。舉例而言，經由去活化包含SEQ ID NO：1胺基酸序列之蛋白質活性及/或經由增強編碼生合成L-精胺酸酵素基因之表現，可賦予產生L-精胺酸之能力。

於此，生合成L-精胺酸酵素之實例包括N-乙醯麩胺醯磷酸還原酶(ArgC)、鳥胺酸乙醯轉移酶(ArgJ)、N-乙醯麩胺酸激酶(ArgB)、乙醯鳥胺酸轉胺酶(ArgD)、鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(ArgF)、精胺琥珀酸合成酶(ArgG)、精胺琥珀酸裂解酶(argH)、與胺甲醯磷酸合成酶。此等酵素被安置於Arg操縱組(argCJBDFRGH)中並受argR編碼之精胺酸抑制子所調控[J Bacteriol.2002Dec；184(23)：6602-14]。因此，經由減弱精胺酸抑制子(US2002-0045223)或至少過度表現一種生合成基因，將可賦予產生L-精胺酸之能力。

於本揭示內容中，產生L-精胺酸之微生物為其中包含SEQ ID NO：1胺基酸序列之蛋白質係經去活化之微生物。另外，為了本揭示內容之目的，微生物可為能經由將包含SEQ ID NO：1胺基酸序列之蛋白質去活化而產生L-精胺酸之任何微生物；其具體例可包括微生物菌株例如大腸桿菌屬之微生物、沙雷氏菌屬(Serratia)之微生物、伊文氏桿菌屬(Erwinia)之微生物、腸內細菌屬(Enterobacteria)之微生物、沙門氏桿菌屬 (Salmonella)之微生物、鏈黴菌屬(Streptomyces)之微生物、假單胞菌屬(Pseudomonas)之微生物、短桿菌屬(Brevibacterium)之微生物、或棒狀桿菌屬之微生物，具體而言可為棒狀桿菌屬之微生物。為了本揭示內容之目的，該微生物可為產生L-精胺酸之棒狀桿菌屬微生物。

“產生L-精胺酸之棒狀桿菌屬微生物”係指具有天然或由於修飾而產生L-精胺酸能力之棒狀桿菌屬微生物。一般已知，棒狀桿菌屬微生物能產生L-精胺酸。然而，其L-精胺酸產生能力非常低，且生產中所涉及之基因或機制尚未被揭露。因此，於本揭示內容中，產生L-精胺酸之棒狀桿菌屬微生物係指原生微生物本身或棒狀桿菌屬之微生物，其中涉及L-精胺酸生產機制之外來基因之活性被增強或去活化俾使具有增進之L-精胺酸產生能力。

於本揭示內容中，“棒狀桿菌屬之微生物”可包括棒狀桿菌屬之所有微生物。具體而言，該微生物可為麩胺酸棒狀桿菌、產氨棒狀桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)、嗜熱產胺棒狀桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、有效棒狀桿菌(Corynebacterium efficiens)、馬里斯棒狀桿菌(Corynebacterium maris)、潤滑劑棒狀桿菌(Corynebacterium lubricantis)、斗山棒狀桿菌(Corynebacterium doosanense)、多毛棒狀桿菌(Corynebacterium pilosum)、膀胱炎棒狀桿菌(Corynebacterium cystitidis)、尤特利棒狀桿菌(Corynebacterium uterequi)、腎棒狀桿菌(Corynebacterium renale)、或乳酸發酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)，更具體而言可為麩胺酸棒狀桿菌。

本揭示內容提供用於產生L-精胺酸之方法，該方法包括：於培養基中培養根據本揭示內容之微生物。

根據本揭示內容之微生物如上文所述。

於本揭示內容之方法中，可使用此項技藝中已知之任何培養條件與培養方法進行棒狀桿菌屬微生物之培養。

本文所用之“培養”一詞意指微生物於適當人為控制之環境條件下生長。於本揭示內容中，培養產生L-精胺酸之棒狀桿菌屬微生物之方法可使用此項技藝中廣泛已知之方法進行。具體而言，可使用批次程序或連續程序(例如饋料批次程序或重覆饋料批次程序)培養，惟培養不在此限。

為了於培養中使用，培養基必須滿足所使用菌株之需求。適合於培養棒狀桿菌屬菌株中使用之培養基為此項技藝中悉知(例如，Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology,Washington D.C.,USA,1981)。

可於培養基中使用之糖源包括糖與碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖(saccharose)、乳糖、果糖、麥芽糖、澱粉、或纖維素；油與脂肪例如大豆油、葵花油、蓖麻油、或椰子油；脂肪酸例如棕櫚酸、硬脂酸、或亞麻油酸；醇例如甘油或乙醇；及有機酸例如乙酸。此等物質可單獨或混合使用，惟不受此限。

可使用之氮源包括含有機氮之化合物，例如蛋白腖、酵母萃取物、肉萃取物、麥芽萃取物、玉米浸液、大豆粉、與尿素，或無機化合物例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨、與硝酸銨。氮源亦可單獨或呈混合物使用，惟不受此限。

可使用之磷源包括磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或對應之鈉鹽。再者，培養基可含生長必需之金屬鹽例如硫酸鎂或硫酸鐵。最後，除了上述物質之外，可使用生長必需物質例如胺基酸與維生素。此外，可添加適當前驅物於培養基。該等物質可於培養期間經由適當方法以分批或連續方式添加於培養物。

培養產物之pH可使用鹼性化合物例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水，或酸性化合物例如磷酸或硫酸，以適當方式控制。起泡可使用消泡劑(例如脂肪酸聚乙二醇酯)控制。需氧條件可經由引入氧氣或含氧氣體混合物(例如空氣)至培養物中維持。培養溫度通常可為20℃至45℃，特別是25℃至40℃。培養可持續進行直到已產生期望量之L-胺基酸。具體而言，培養時間可為10小時至160小時。

於本揭示內容之方法中，培養可連續或以批次程序或以饋料批次或重複饋料批次程序進行。此培養可使用此項技藝中悉知之任何方法進行。

從培養產物中分離L-精胺酸可利用此項技藝中已知之習用方法進行。關於上述分離方法，可使用例如離心、過濾、離子交換層析、結晶等方法。舉例而言，可將培養產物低速離心並移除生物質所得之上清液，利用離子交換層析法分離，惟該方法不在此限。

於本揭示內容之方法中，可進一步包括於培養後從微生物或培養基中回收L-精胺酸。

該回收可包括純化程序。

產生L-精胺酸之本揭示內容之微生物可以高效率產生L-精胺酸。此外，所生產之L-精胺酸不僅可應用於動物飼料或動物飼料添加物，還可應用於例如人類食品或食品添加物、藥物等各種產品。

下文中，將以隨附之例示具體例詳細說明本揭示內容。然而，本文揭示之例示具體例僅供說明之目的，不應被解釋為對本揭示內容之範圍有所局限。

實施例1：使用轉位子建構隨機突變體庫

欲得到具有增加L-精胺酸生產力之菌株，乃以下述方式建構載體庫。

首先，使用麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P(韓國專利案No.0791659)作為母株，將使用EZ-Tn5^TM<R6Kγori/KAN-2>Tnp Transposome^TM套組(Epicentre)所得之質體經由電脈衝法轉形入母株中[Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541-545]。然後，將菌株塗佈於含康黴素(kanamycin)(25mg/L)之複合培養基平板上，從而得到約20,000個菌落。

<複合培養基平板(pH 7.0)>

10g葡萄糖、10g蛋白腖、5g牛肉萃取物、5g酵母萃取物、18.5g腦心浸液、2.5g NaCl、2g尿素、91g山梨糖醇、20g瓊脂(每公升蒸餾水)

實施例2：使用轉位子之隨機突變體庫篩選

將實施例1中所得約20,000個菌落之每一個接種至含300μL下述選擇性培養基之96深槽培養盤中，並於30℃，1,000rpm，培養約24小時。

{選擇性培養基(pH 8.0)>

10g葡萄糖、5.5g硫酸銨、1.2g MgSO₄7H₂O、0.8g KH₂PO₄、16.4g K₂HPO₄、100μg生物素、1mg硫胺素HCl、2mg泛酸鈣、2mg菸鹼醯胺(每公升蒸餾水)

使用茚三酮測定法，分析培養液中產生之L-精胺酸量(Moore,S.,Stein,W.H.,Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids.J.Biol.Chem.1948,176,367-388)。

培養結束後，使10μL培養上清液與190μL茚三酮反應液於65℃反應30分鐘，然後以分光光度計測量波長570nm處之吸光度。根據測量結果，挑選顯示比作為對照用之麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P株更高吸光度之約60個菌落作為突變菌株。已證實其他菌落顯示與作為對照用之麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P株類似或更低之吸光度。

以與上述相同方式再次培養如上述所挑選之約60個菌株，然後進行茚三酮反應。結果，挑選相較於作為母株用之麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P株具有增加之L-精胺酸生產力之前10株突變株。

實施例3：經挑選之隨機突變株之L-精胺酸生產力分析

為了從實施例2挑選出之10株突變株中最後挑選其L-精胺酸生產力可再現地增加之菌株，乃使用下述培養基進行三角瓶培養。培養結束後，利用HPLC分析培養液中之L-精胺酸濃度。由每一突變株所產生之L-精胺酸濃度示於下述表1。

<生產培養基(pH 7.0)>

6%葡萄糖、3%硫酸銨、0.1%磷酸二氫鉀、0.2%硫酸鎂七水合物、1.5%玉米浸液(CSL)、1%NaCl、0.5%酵母萃取物、100mg/L生物素、3%CaCO₃(每公升蒸餾水)

於10株挑選之突變株中，最後挑選KCCM10741P/mt-10作為L-精胺酸生產力顯著增加之菌株。

實施例4：最終挑選菌株之L-精胺酸生產力增加原因之鑑定

於此實施例中，針對實施例3中最終挑選之突變株進行實驗，以鑑定經由隨機嵌入轉位子而被刪除之基因。

從KCCM10741P/mt-10萃取基因體DNA，切割，然後連接，並將連接產物轉形入大腸桿菌DH5α中。將經轉形之大腸桿菌細胞平板接種於含康黴素(25mg/L)之LB固態培養基上。挑選20個轉形菌落，然後得到含未知基因部分之質體。使用EZ-Tn5^TM<R6Kγori/KAN-2>Tnp Transposome^TM套組之引子1(SEQ ID NO：3)與引子2(SEQ ID NO：4)分析其核苷酸序列。結果已證實經刪除與去活化之基因具有編碼SEQ ID NO：1胺基酸序列之SEQ ID NO：2核苷酸序列。

引子1(SEQ ID NO：3)：ACCTACAACAAAGCTCTCATCAACC

引子2(SEQ ID NO：4)：CTACCCTGTGGAACACCTACATCT

因此，為了確認包含SEQ ID NO：1胺基酸序列之蛋白質是否對蛋白質去活化後產生L-精胺酸的能力有影響，乃挑選上述基因作為刪除之候選基因。

實施例5：刪除包含SEQ ID NO：2核苷酸序列基因用之重組載體之建構

於此實施例中，為了確認包含SEQ ID NO：2核苷酸序列之基因之去活化及產生L-精胺酸之影響，乃將實施例4中所挑選刪除該基因用之重組質體建構於棒狀桿菌屬之L-精胺酸產生菌株之染色體上。

首先，合成表2所示之引子3至6，以製備能刪除棒狀桿菌屬微生物染色體上之基因之重組載體。

具體而言，為了刪除該基因之ORF區(SEQ ID NO：2)，乃合成引子3(SEQ ID NO：5)、引子4(SEQ ID NO：6)、引子5(SEQ ID NO：7)、與引子6(SEQ ID NO：8)，俾使XhoI限制酶切割位點存在5'端以及3'端。以麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P之染色體DNA作為模板，使用上述引子3至6進行PCR。結果證實，對應於編碼由該基因所編碼之蛋白質部分之前面與後面部分之各個DNA片段，分別被擴增500bp。於此，在95℃下變性5分鐘後，於下述條件下進行總數30個循環之PCR：於94℃變性30秒，於56℃降溫貼合30秒，及於72℃聚合1分鐘。之後，於72℃下進行聚合反應7分鐘。其次，以XhoI限制酶處理不能在麩胺酸棒狀桿菌中複製之pDZ載體(韓國專利案No.10-0924065)，然後融合選殖所得之PCR產物。使用In-Fusion® HD選殖套組(Clontech)進行融合選殖。之後，將生成物轉形入大腸桿菌DH5α中，然後平板接種於含康黴素(25mg/L)之LB固態培養基上。

經由PCR挑選經轉形而具有期望基因嵌入其中之質體之菌落，然後使用質體萃取技術單離質體。將該質體命名為“pDZ-△RS1”。

實施例6：建構攜帶包含SEQ ID NO：2核苷酸序列之基因刪除之麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P，及評估所建構菌株之L-精胺酸生產力

根據產生L-精胺酸之棒狀桿菌屬菌株(KCCM10741P菌株)，建構包含SEQ ID NO：2核苷酸序列之基因刪除之菌株並評估所建構菌株之L-精胺酸生產力。

具體而言，經由染色體上之同源重組，將實施例5中製備之重組質體pDZ-△RS1轉形入L-精胺酸產生菌株之麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P中(van der Rest et al.,Appl Microbiol Biotechnol 52：541-545,1999)。

接著，使轉形株於含4%蔗糖之固態培養基平板上生長，以容許發生第二次重組。於第二次重組結束後，使用引子3與引子6利用PCR確認在該轉形之麩胺酸棒狀桿菌菌株染色體上之基因刪除。將重組菌株命名為“麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P-RS1”。

為了分析L-精胺酸生產力，以下述方式培養建構之麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P-RS1菌株與母株麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P。

將母株麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P與實施例6中所建構之麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P-RS1菌株，各自接種到含有25mL下述種培養基之250mL角擋板培養瓶中，並於30℃，200rpm，震動培養20小時。其次，將1mL之各個種培養液接種到含有24mL下述生產培養基之250mL角擋板培養瓶中，並於30℃，200rpm，震動培養72小時。種培養基之組成與生產培養基之組成如下。

<種培養基(pH 7.0)>

20g葡萄糖、10g蛋白腖、5g酵母萃取物、1.5g尿素、4g KH₂PO₄、8g K₂HPO₄、0.5g MgSO₄．7H₂O、100μg生物素、1mg硫胺素HCl、2mg泛酸鈣、2mg菸鹼醯胺(每公升蒸餾水)

<生產培養基(pH 7.0)>

6%葡萄糖、3%硫酸銨、0.1%磷酸二氫鉀、0.2%硫酸鎂七水合物、1.5%玉米浸液(CSL)、1%NaCl、0.5%酵母萃取物、100mg/L生物素(每公升蒸餾水)

培養結束後，利用HPLC測量產生之L-精胺酸量，所分析之L-精胺酸濃度示於下文表3中。

根據以上結果，證實KCCM10741P-RS1係從麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P(即產生L-精胺酸之菌株)中刪除基因，具有相較於母較平均增加25%之L-精胺酸生產力。

該KCCM10741P-RS1菌株命名“CA06-2830”，並於2017年12月15日寄存於韓國微生物菌種中心(KCCM)，其為布達佩斯條約下之國際寄存機構，指派之登錄編號為KCCM12187P。

因此，證實經由從棒狀桿菌屬微生物刪除包含SEQ ID NO：2核苷酸序列之基因，可增進L-精胺酸之生產力。

實施例7：建構用於減弱包含SEQ ID NO：2核苷酸序列之基因之重組載體

為了建構能在棒狀桿菌屬菌株之染色體上減弱包含SEQ ID NO：2核苷酸序列之基因之重組載體，乃將該基因之起始密碼子從GTG替換為TTG以減弱該基因。進一步地，為了建構其片段，乃合成下文表4中所示之引子3與引子7至9。

為了擴增該基因之ORF區(SEQ ID NO：2)，乃合成引子3(SEQ ID NO：5)、引子7(SEQ ID NO：9)、引子8(SEQ ID NO：10)、與引子9(SEQ ID NO：11)，俾使XhoI限制酶切割位點存在5'端與3'端。以麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P之染色體DNA作為模板，使用引子3、引子7、引子8、與引子9進行PCR。於此，在95℃下變性5分鐘後，於下述條件下進行總數30個循環之PCR：於94℃變性30秒，於56℃降溫貼合30秒，及於72℃聚合1分鐘。之後，於72℃下進行聚合反應7分鐘。其次，以XhoI限制酶處理不能在麩胺酸棒狀桿菌中複製之pDZ載體(韓國專利案No.10-0924065)，然後融合選殖所得之PCR產物。使用In-Fusion® HD選殖套組(Clontech)進行融合選殖。之後，將生成物轉形入大腸桿菌DH5α中，然後平板接種於含康黴素(25mg/L)之LB固態培養基上。

經由PCR挑選經轉形而具有期望基因嵌入其中之質體之菌落，然後使用質體萃取技術單離質體。將該質體命名為“pDZ-△RS2”。

實施例8：建構包含SEQ ID NO：2核苷酸序列之基因被減弱之麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P，及評估所建構菌株之L-精胺酸生產力

經由染色體上之同源重組，將實施例7所製備之重組質體pDZ-△RS2轉形入L-精胺酸產生菌株之麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P中(van der Rest et al.,Appl Microbiol Biotechnol 52：541-545,1999)。

其次，使轉形株於含4%蔗糖之固態培養基平板上生長，以容許發生第二次重組。使用引子3與引子9分析第二次重組後所得經轉形之麩胺酸棒狀桿菌菌株之核苷酸序列，以鑑定其中包含SEQ ID NO：2核苷酸序列基因之起始密碼子被TTG置換之菌株。將重組菌株命名為“麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P-RS2”。

將母株麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P與上面所建構之麩胺酸棒狀桿菌KCCM10741P-RS2菌株，各自以與實施例6相同之方式培養，以分析L-精胺酸生產力。之後，利用HPLC測量產生之L-精胺酸量，所分析之L-精胺酸濃度示於下述表5中。

如上面結果所示，證實在L-精胺酸產生菌株KCCM10741P中，當包含SEQ ID NO：2核苷酸序列之基因被減弱時，該菌株之L-精胺酸生產力平均增加12%。

因此證實，經由減弱棒狀桿菌屬微生物中包含SEQ ID NO：2核苷酸序列之基因之表現，可增進L-精胺酸之生產力。

從上面結果可看出，於包含SEQ ID NO：2核苷酸序列之基因被刪除或減弱之菌株中，L-精胺酸生產力增加，此表明當由該基因所編碼之蛋白質之活性係經去活化時，L-精胺酸可於該微生物中大量生產。

雖然已參照特定例示具體例敘述本揭示內容，惟熟習本揭示內容所屬技藝者將理解，本揭示內容可於不離開本揭示內容之技術精神或必要特徵下，以其他特定形式具體化。因此，上述具體例在各方面是被視為例示性而非限制性的。再者，本揭示內容之範圍係由附加之申請專利範圍而非由詳細之說明界定，應理解的是，從本揭示內容與其等效物之含義與範圍所衍生之所有修飾與變動均涵蓋於隨附之申請專利範圍內。

[登錄編號]

寄存機構：韓國微生物菌種中心(KCCM)(國際寄存機構)

登錄編號：KCCM12187P

寄存日期：2017年12月15日

<110> CJ第一製糖股份有限公司

<120> 產生L-精胺酸之棒狀桿菌屬之微生物及使用該微生物產生L-精胺酸之方法

<150> KR 10-2017-0175046

<151> 2017-12-19

<160> 11

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 356

<212> PRT

<213> 麩胺酸棒狀桿菌

<400> 1

<210> 2

<211> 1071

<212> DNA

<213> 麩胺酸棒狀桿菌

<400> 2

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子1

<400> 3

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子2

<400> 4

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子3

<400> 5

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子4

<400> 6

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子5

<400> 7

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子6

<400> 8

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子7

<400> 9

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子8

<400> 10

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子9

<400> 11

Claims

一種產生L-精胺酸之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾之微生物，其中包含由SEQ ID NO：2之核苷酸序列所編碼之胺基酸序列的蛋白質係原本存在於該經修飾之微生物之產生L-精胺酸之母體微生物中，且其中該蛋白質係經去活化。
如申請專利範圍第1項所述之麩胺酸棒狀桿菌之經修飾之微生物，其中，該蛋白質係由該SEQ ID NO：2之核苷酸序列構成之基因所編碼。
一種用於產生L-精胺酸之方法，該方法包括於培養基中培養如申請專利範圍第1或2項中任一項所述之微生物。
如申請專利範圍第3項所述之用於產生L-精胺酸之方法，係進一步包括從該微生物或培養基回收L-精胺酸。