ES2790661T3

ES2790661T3 - Método para producir una sustancia diana mediante un procedimiento de fermentación

Info

Publication number: ES2790661T3
Application number: ES12744294T
Authority: ES
Inventors: Tetsuro Ujihara; Tetsuya Abe; Makoto Yagasaki
Original assignee: Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Current assignee: Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Priority date: 2011-02-09
Filing date: 2012-02-09
Publication date: 2020-10-28
Anticipated expiration: 2032-02-09
Also published as: US9567616B2; CN103384723A; CN103384723B; EP2674499A1; EP2674499B1; JP2017023147A; US20130323784A1; EP2674499A4; BR112013020216B1; WO2012108493A1; BR112013020216A2; JP6301581B2; JPWO2012108493A1

Abstract

Procedimiento para producir una sustancia diana, que comprende: cultivar, en un medio, una bacteria corineforme en la que la actividad de la proteína FruK y la proteína FruA implicada en el sistema de fosfotransferasa (PTS) en relación con la absorción de la fructosa se ha perdido en comparación con una cepa madre y la bacteria puede producir la sustancia diana, permitiendo que la sustancia diana se forme y acumule en un cultivo; y recoger la sustancia diana a partir del cultivo.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para producir una sustancia diana mediante un procedimiento de fermentación

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir una sustancia diana mediante la utilización de una bacteria corineforme, en la que la actividad de una proteína PTS relacionada con la asimilación de la fructosa se ha perdido en comparación con la cepa madre, y que puede producir la sustancia diana.

Antecedentes de la técnica

Uno de los métodos para mejorar la productividad en un método para producir una sustancia mediante un procedimiento de fermentación incluye un método para modificar la capacidad de incorporación de un azúcar que es un material de partida.

Se ha avanzado en la investigación sobre el mecanismo de asimilación de carbohidratos, tales como azúcares, por un microorganismo, y es conocida la clasificación de los mecanismos en varios tipos. Entre ellos se incluye, en particular, un sistema de fosfoenolpiruvato:sacárido fosfotransferasa (en adelante en la presente memoria asimismo denominado PTS, o sistema de fosfotransferasa), que es un transportador que fosforila y, de esta manera, asimila un azúcar importante (documento no de patente n° 1).

El sistema PTS está compuesto por un sistema común independiente del sustrato EI (codificado por ptsI), Hpr (codificado por ptsH) y un componente específico de sustrato EII (documentos no de patente n° 2 a n° 4).

El componente específico de sustrato EII varía en tipo según el organismo; sin embargo, con respecto a las bacterias entéricas y las bacterias corineformes, con las que ha avanzado la investigación, se están identificando enzimas EII importantes, y entre ellos, es conocido que un EII específico de fructosa está codificado por FruA (PtsF) (documento no de patente n° 5).

Es conocido que la asimilación de la fructosa por el sistema PTS requiere FruA, que externamente asimila la fructosa y la convierte en fructosa-1-fosfato, así como FruK (PfkB), que convierte la fructosa-1-fosfato en fructosa 1,6-bifosfato, sirviendo como un importante intermediario en la glucólisis (documentos no de patente n° 6 y n° 7). Con respecto a la producción de una sustancia, se conocen varios informes en los que se mejora la productividad mediante la modificación del sistema PTS. Por ejemplo, se conoce un procedimiento para producir un aminoácido utilizando una bacteria del género Escherichia con un gen ptsG potenciado (documento de patente n° 1) y un procedimiento para producir un aminoácido utilizando una bacteria del género Escherichia con un gen crr potenciado que funciona de la misma manera que ptsH, ptsI y ptsG (documento de patente n° 2).

Además, se conoce un método para acelerar la asimilación y metabolismo de un azúcar que no pasa por el sistema PTS, tal como una pentosa o similar, mediante la disrupción del sistema PTS, que es el sistema de asimilación del azúcar principal, glucosa o similar (documento de patente n° 3).

Además, es conocido que la productividad de una sustancia diana puede incrementarse mediante disrupción del sistema PTS, que es el sistema de asimilación de la glucosa, que conduce a la asimilación mediante otra ruta, modificando de esta manera la ruta metabólica del azúcar (documento de patente n° 4). Asimismo es conocido que la productividad puede incrementarse mediante la disrupción del sistema de asimilación de la fructosa y la introducción de una fructocinasa foránea, modificando de esta manera la ruta metabólica del azúcar (documento no de patente n° 5).

Sin embargo, no es conocido que pueda producirse eficientemente una sustancia diana mediante la disrupción del sistema de asimilación PTS de un azúcar específico para mejorar la capacidad de la asimilación de otro azúcar mediante el sistema PTS. Además, no se conoce que la capacidad de asimilación de otro azúcar se incremente mediante disrupción simultánea del sistema de asimilación PTS y una ruta metabólica posterior a la asimilación. En particular, debido a que la glucosa desempeña una función central en el control de la asimilación de los azúcares, aunque el sistema de asimilación simplemente se potencie, aparece el problema de que la velocidad de asimilación se reduce a medida que se incrementa la concentración intracelular de glucosa y, por lo tanto, se predice que resultará difícil mejorar la tasa de consumo de la glucosa (documento no de patente n° 8).

Listado de referencias

Documentos de patente

Documento de patente n° 1: documento WO 03/ 04670

Documento de patente n° 2: documento WO 03/ 04674

Documento de patente n° 3: JP-A-5-49441

Documento de patente n° 4: solicitud publicada de patente US n° 2009/0142843

Documentos no de patente

Documento no de patente n° 1 Mol. Microbiol., 35, 699 (2000)

Documento no de patente n° 2 Microbiol. Rev., 57, 543 (1993)

Documento no de patente n° 3 J. Bacteriol., 174, 1433 (1992)

Documento no de patente n° 4 Biochem. Soc. Trans., 33, 220 (2005)

Documento no de patente n° 5 FEMS Microbiol. Lett., 244, 259 (2005)

Documento no de patente n° 6 Advan, Enzyme Regul. 42, 349 (2002)

Documento no de patente n° 7 Eur. J. Biochem., 254, 96 (1998)

Documento no de patente n° 8 FEMS Microbiol. Rev., 32, 891 (2008)

Sumario de la invención

Problemas que debe resolver la invención

Un objetivo de la invención es mejorar la tasa de consumo de azúcares mediante la producción de una sustancia útil mediante un procedimiento de fermentación utilizando una bacteria corineforme.

Medios para resolver los problemas

La presente invención se refiere a (1) a (6) a continuación.

(1) Un procedimiento para producir una sustancia diana, que comprende: cultivar, en un medio, una bacteria corineforme en la que la actividad de la proteína FruK y la proteína FruA implicada en el sistema de fosfotransferasa (PTS) relacionado con la asimilación de la fructosa se ha perdido en comparación con la cepa madre, y la bacteria puede producir la sustancia diana, permitiendo que la sustancia diana se forme y se acumule en un cultivo, y recoger la sustancia diana a partir del cultivo.

(2) El procedimiento descrito en (1), anteriormente, en el que la bacteria corineforme en la que se ha perdido la actividad de la proteína Fruk y de la proteína FruA, se compara con una cepa madre y la bacteria que puede producir la sustancia diana es una bacteria corineforme en la que la actividad de la proteína FruK y la proteína FruA se ha perdido en comparación con la cepa madre mediante la introducción de una eliminación, una sustitución o una adición de una base en un gen codificante de la proteína en el ADN cromosómico de la cadena parental.

(3) El procedimiento descrito en (1) o (2), anteriormente, en el que la bacteria corineforme es Corynebacterium glutamicum.

(4) El procedimiento descrito en cualquiera de (1) a (3), anteriormente, en el que la sustancia diana es un aminoácido, un péptido o una proteína.

(5) El procedimiento descrito en cualquiera de (1) a (4), anteriormente, en el que el aminoácido es un aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en L-lisina, L-arginina, L-histidina, L-isoleucina, L-valina, L-leucina, L-treonina, L-fenilalanina, L-tirosina, L-triptófano, L-cisteína, ácido L-glutámico, L-citrulina, L-glutamina, L-prolina, L-serina, L-ornitina, L-metionina, ácido L-aspártico, L-asparagina y glicina.

Efectos de la invención

Según la presente invención, puede producirse eficientemente una sustancia diana mediante la utilización de un procedimiento de fermentación.

Formas de realización para poner en práctica la invención

1. Bacteria corineforme para la utilización en la invención

La bacteria corineforme para la utilización en la invención es una bacteria corineforme en la que la actividad de la proteína FruK y la proteína FruA implicadas en el sistema de fosfotransferasa (PTS) relacionada con la asimilación de la fructosa se ha perdido en comparación con una cepa madre y la bacteria puede producir una sustancia diana. Se obtiene una bacteria en la que la actividad de una proteína de PTS relacionada con la asimilación de la fructosa está reducida o se ha perdido en comparación con una cepa madre mediante la introducción de una eliminación, una sustitución o una adición de una base a una secuencia de bases de un gen codificante de la proteína PTS de tipo salvaje relacionada con la asimilación de la fructosa, que se encuentra presente en el ADN cromosómico y no presenta ninguna mutación, y entre los ejemplos del mismo pueden incluirse: (a) una bacteria cometerme en la que la actividad de la proteína de PTS relacionada con la asimilación de la fructosa se ha reducido a 80% o menos, preferentemente a 50% o menos, más preferentemente a 30% o menos, todavía más preferentemente a 20% o menos, particularmente preferentemente a 10% o menos, y todavía más preferentemente a 0%, en comparación con una cepa madre, y (b) una bacteria corineforme en la que la cantidad de transcripción del gen o la cantidad producida de la proteína del PTS relacionada con la asimilación de la fructosa se reduce a 80% o menos, preferentemente a 50% o menos, más preferentemente a 30% o menos, todavía más preferentemente a 20% o menos, particularmente preferentemente a 10% o menos, y todavía más preferentemente, a 0% en comparación con la cepa madre. Entre los ejemplos más preferidos de los mismos pueden incluirse una bacteria corineforme en la que el gen codificante de la proteína Fruk o proteína FruA se encuentra parcial o completamente eliminado.

El gen codificante de la proteína FruA puede ser cualquier gen con la condición de que codifique un polipéptido con actividad de FruA implicada en la asimilación de la fructosa y una reacción de conversión de la fructosa en fructosa 1-fosfato. El gen codificante de la proteína FruK puede ser cualquier gen con la condición de que un ADN codificante de un polipéptido con actividad de FruK implicado en una reacción de conversión de fructosa 1-fosfato en fructosa 1,6-bisfosfato. Entre los ejemplos específicos pueden incluirse los genes siguientes:

[1] un gen codificante de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 1;

[2] un gen codificante de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 2;

[3] un gen codificante de una proteína con una identidad de 80% o más, preferentemente de 90% o más, más preferentemente de 95% o más, todavía más preferentemente de 97% o más, particularmente preferentemente de 98% o más, y todavía más preferentemente de 99% o más respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 1 y muestra actividad de asimilación de la fructosa junto con una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 2;

[4] un gen codificante de una proteína con una identidad de 80% o más, preferentemente de 90% o más, más preferentemente de 95% o más, todavía más preferentemente de 97% o más, particularmente preferentemente de 98% o más, y todavía más preferentemente de 99% o más respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 2 y muestra actividad de asimilación de la fructosa junto con una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 1;

[5] un gen que comprende la secuencia de bases representada por SEC ID n° 3;

[6] un gen que comprende la secuencia de bases representada por SEC ID n° 4;

[7] un gen que se hibrida con un ADN que consiste en una secuencia de bases complementaria a la secuencia de bases representada por la SEC ID n° 3 bajo condiciones restrictivas, y codifica una proteína que muestra actividad de asimilación de la fructosa junto con una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 2, y

[8] un gen que se hibrida con un ADN que consiste en una secuencia de bases complementaria a la secuencia de bases representada por la SEC ID n° 2 bajo condiciones restrictivas, y codifica una proteína que muestra actividad de asimilación de la fructosa junto con una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 1.

El gen tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un ADN que puede contener una región reguladora de la transcripción, una región promotora y similar además de una región codificante de una proteína.

La región reguladora de la transcripción puede incluir un ADN que consiste en 100 bases, preferentemente 50 bases cadena arriba del extremo 5' de una región codificante en un ADN cromosómico. La región del promotor puede incluir una región que corresponde a la región -10 y -35.

En la introducción de una eliminación, una sustitución o una adición de una base a un gen codificante de una proteína de PTS relacionada con la asimilación de la fructosa, el tipo de base y el número de bases no se encuentran limitados con la condición de que la eliminación, sustitución o adición de una base cause la pérdida de la actividad en comparación con una cepa madre. La eliminación de una base puede incluir, en el caso de un promotor o una región reguladora de la transcripción, una eliminación de preferentemente 10 bases o más, más preferentemente de 20 bases o más, y todavía más preferentemente toda la región, y en el caso de una región codificante, una eliminación de preferentemente 10 bases o más, más preferentemente de 20 bases o más, todavía más preferentemente de 100 bases o más, particularmente preferentemente de 200 bases o más, y todavía más preferentemente la totalidad de la región codificante.

La sustitución de una base puede incluir una sustitución de una base dentro de las 150 bases, preferentemente una base dentro de las 100 bases, más preferentemente una base dentro de las 50 bases, particularmente preferentemente una base dentro de las 30 bases, y todavía más preferentemente una base dentro de las 20 bases desde el extremo 5' de una región codificante para introducir un codón sin sentido [An Introduction to Genetic Analysis, 7a edición, W. H. Freeman, 2000].

La adición de una base puede incluir una adición de un fragmento de ADN de 50 bases o más, preferentemente de 100 bases o más, más preferentemente de 200 bases o más, todavía más preferentemente de 500 bases o más, y particularmente preferentemente de 1 kb o más, a un sitio inmediatamente cadena abajo de una base dentro de las 150 bases, preferentemente una base dentro de las 100 bases, más preferentemente una base dentro de las 50 bases, particularmente preferentemente una base dentro de las 30 bases, y todavía más preferentemente una base dentro de las 20 bases desde el extremo 5' de una región codificante. Entre los ejemplos particularmente preferidos puede incluirse una inserción de un gen de resistencia al cloranfenicol, un gen de resistencia a la canamicina o similares.

La identidad de las secuencias de aminoácidos y de las secuencias de bases puede determinarse utilizando el algoritmo BLAST de Karlin y Altschul [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993] o FASTA [Methods Enzymol., 183, 63, 1990]. Basándose en el algoritmo BLAST, se han desarrollado los programas BLASt N y BLASTX [J. Mol. Biol., 215, 403, 1990]. En el caso de que se analice una secuencia de bases utilizando BLASTN basado en BLAST, los parámetros se fijan, por ejemplo, de la manera siguiente, puntuación=100 y longitud de palabra=12. En el caso de que se analice una secuencia de aminoácidos utilizando BLASTX basado en BLAST, los parámetros se fijan, por ejemplo, de la manera siguiente, puntuación=50 y longitud de palabra=3. En el caso de que se utilicen los programas BLAST y BLAST con huecos, se utilizan los parámetros por defecto para cada uno de los programas. Los métodos específicos para dichos métodos analíticos son bien conocidos.

Puede confirmarse si la bacteria es o no una bacteria corineforme en la que la actividad de una proteína del PTS relacionada con la asimilación de la fructosa se encuentra reducida o se ha perdido en comparación con la cepa madre mediante, por ejemplo, la comparación entre la bacteria y la cepa madre de la cantidad transcrita de un gen codificante de la proteína de PTS relacionada con la asimilación de la fructosa utilizando transferencia northern, o de la cantidad producida de la proteína del PTS relacionada con la asimilación de la fructosa utilizando transferencia western.

Además, puede confirmarse si la bacteria es o no una bacteria corineforme en la que la actividad de una proteína del PTS relacionada con la asimilación de la fructosa se encuentra reducida o se perdido en comparación con la cepa madre, observando si al cultivar la bacteria en un medio que contiene fructosa como única fuente de carbono, la bacteria no crece o crece poco en comparación con la cepa madre.

El término “hibridación” tal como se ha utilizado anteriormente se refiere a la hibridación de un ADN con un ADN que presenta una secuencia de bases específica o una parte del ADN. Por lo tanto, el ADN que comprende una secuencia de bases específica o una parte de la misma es un ADN que puede utilizarse como una sonda en un análisis de transferencia northern o southern, y asimismo puede utilizarse como un cebador oligonucleótido en un análisis de PCR. El ADN que debe utilizarse como una sonda puede incluir un ADN de por lo menos 100 bases o más, preferentemente de 200 bases o más, y más preferentemente de 500 bases o más. El ADN para la utilización como cebador puede incluir un ADN de por lo menos 10 bases o más, y preferentemente de 15 bases o más.

El método para el experimento de hibridación del ADN es bien conocido y, por ejemplo, según la descripción de la presente solicitud, el experto en la materia podrá determinar las condiciones de hibridación. Las condiciones de hibridación se describen en Molecular Cloning, 2a y 3a ed. (2001), Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press (1994), o Immunology Methods Manual, Academic Press (1996), y asimismo la hibridación puede llevarse a cabo según cualquiera de entre varios otros libros de texto estándares.

Además, asimismo según el manual de instrucciones que acompaña a un kit de hibridación disponible comercialmente, puede obtenerse un ADN que se hibrida bajo condiciones restrictivas. El kit de hibridación disponible comercialmente puede incluir, por ejemplo, un kit con el que se produce una sonda mediante un método de cebado aleatorio y se lleva a cabo la hibridación bajo condiciones restrictivas.

Las condiciones restrictivas mencionadas anteriormente preferentemente son condiciones bajo las que un filtro sobre el que se ha inmovilizado un ADN y un ADN sonda se incuban durante la noche a 42°C en una solución que contiene formamida al 50%, 5x SSC (cloruro sódico 750 mM y citrato sódico 75 mmoles/l), fosfato sódico 50 mmoles/l (pH 7.6), 5x solución de Denhardt, dextrán sulfato al 10% y 20 pg/l de un ADN de esperma de salmón desnaturalizado y después se lava el filtro en, por ejemplo, una solución 0.2x SSC a aproximadamente 65°C; sin embargo, asimismo pueden utilizarse condiciones menos restrictivas. Las condiciones restrictivas pueden modificarse mediante el ajuste de la concentración de formamida (a medida que la concentración de formamida se reduce, se reduce la restrictividad) o mediante la modificación de la concentración salina y las condiciones de temperatura. Entre las condiciones de baja restrictividad pueden incluirse, por ejemplo, condiciones en las que la incubación se lleva a cabo durante la noche a 37°C en una solución que contiene 6x SSCE (20x SSCE contiene 3 moles/l de cloruro sódico, 0.2 moles/l de dihidrogenofosfato sódico y 0.02 moles/l de EDTA a pH 7.4), SDS al 0.5%, formamida al 30% y 100 pg/l de un ADN de esperma de salmón desnaturalizado y después se lleva a cabo el lavado utilizando una solución que contiene 1x SSC y SDS al 0.1% a 50°C. Además, las condiciones de menor restrictividad pueden incluir condiciones en las que, en las condiciones de baja restrictividad mencionadas anteriormente, se lleva a cabo la hibridación utilizando una solución con una elevada concentración salina (por ejemplo, 5x SSC) y después se lleva a cabo el lavado.

Las diversas condiciones mencionadas anteriormente asimismo pueden fijarse mediante adición o modificación de un reactivo de bloqueo que debe utilizarse para suprimir el fondo en el experimento de hibridación. La adición del reactivo de bloqueo puede acompañarse de un cambio en las condiciones de hibridación para adaptar las condiciones.

El ADN que puede hibridarse bajo las condiciones restrictivas mencionadas anteriormente puede incluir un ADN que presenta una identidad de por lo menos 90% o más, preferentemente 95% o más, más preferentemente 97% o más, todavía más preferentemente 98% o más, y particularmente preferentemente 99% o más respecto a un ADN que consiste en una secuencia de bases representada por SEC ID n° 3 o n° 4 al llevar a cabo el cálculo basándose en los parámetros mencionados anteriormente y similares utilizando, por ejemplo, BLAST FASTA o similares.

La expresión “puede producir una sustancia diana” se refiere a la capacidad de producir una sustancia diana en el caso de que una bacteria corineforme para la utilización en la invención se cultive en un medio en la medida en que la sustancia diana puede recogerse de las células o del medio.

La bacteria corineforme que puede producir una sustancia diana puede incluir, en el caso de que una cepa madre originalmente presente una propiedad capaz de producir una sustancia diana, una bacteria corineforme en la que se ha potenciado la propiedad, y en el caso de que una cepa madre no presente la propiedad, una bacteria corineforme a la que se ha proporcionado artificialmente la propiedad.

La bacteria corineforme para la utilización en la invención puede incluir una bacteria corineforme perteneciente al género Corynebacterium, el género Brevibacterium o el género Microbacterium.

Entre los ejemplos de un microorganismo perteneciente al género Corynebacterium puede incluirse Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium herculis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium melassecola, Corynebacterium thermoaminogenes y similares, y entre los ejemplos específicos de los mismos puede incluirse Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 13060, Corynebacterium glutamicum ATCC 13826 (nombre anterior: Brevibacterium flavum), Corynebacterium glutamicum ATCC 14020 (nombre anterior: Brevibacterium divaricatum), Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 (nombre anterior: Brevibacterium lactofermentum), Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium callunae ATCC 15991, Corynebacterium herculis ATCC 13868, Corynebacterium lilium ATCC 15990, Corynebacterium melassecola ATCC 17965, Corynebacterium thermoaminogenes ATCC 9244 y similares.

Entre los ejemplos de un microorganismo pertenecientes al género Brevibacterium puede incluirse Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium immariophilum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium thiogenitalis y similares, y entre los ejemplos específicos de los mismos puede incluirse Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066, Brevibacterium immariophilum ATCC 14068, Brevibacterium roseum ATCC 13825, Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 y similares.

Entre los ejemplos de un microorganismo pertenecientes al género Microbacterium puede incluirse Microbacterium ammoniaphilum y similares, y entre los ejemplos específicos de los mismos puede incluirse Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354 y similares.

2. Procedimiento para producir la bacteria corineforme de la invención

La bacteria corineforme de la invención puede obtenerse mediante la utilización de una bacteria corineforme que puede producir una sustancia diana y presenta la actividad de la proteína FruK y la proteína FruA (en adelante en la presente memoria asimismo denominada actividad de FruKA) como cepa madre, y

eliminar la actividad de FruKA de la cepa madre mediante la utilización de un método capaz de introducir una mutación en una bacteria corineforme, tal como un método habitual de tratamiento de mutaciones, un método de sustitución génica mediante una técnica de ADN recombinante o similar, un método de fusión similar, o un método de transducción; un método capaz de suprimir la expresión de un gen codificante de la proteína FruK y de la proteína FruA, tal como un método antisentido o similar.

La cepa madre puede ser una cepa de tipo salvaje o una cepa reproductiva que ha sido artificialmente cruzada a partir de la cepa de tipo salvaje, con la condición de que sea una bacteria corineforme que presente la capacidad de producir una sustancia diana y asimismo actividad de FruKA.

Entre los ejemplos del método para proporcionar artificialmente una capacidad de producir una sustancia diana a una bacteria corineforme puede incluirse:

(a) un método para aliviar o cancelar por lo menos un mecanismo de control de la biosíntesis de la sustancia diana,

(b) un método para potenciar la expresión de por lo menos un enzima que participa en la biosíntesis de la sustancia diana,

(c) un método para incrementar el número de copias de por lo menos un gen codificante de un enzima que participa en la biosíntesis de la sustancia diana,

(d) un método para atenuar o bloquear por lo menos una de las rutas metabólicas que se ramifican en la ruta de biosíntesis de la sustancia diana en un metabolito diferente de la sustancia diana, y

(e) un método para seleccionar una estirpe celular que presenta un grado más elevado de resistencia a un análogo de la sustancia diana que la cepa de tipo salvaje.

Los métodos mencionados anteriormente pueden utilizarse individualmente o en combinación de unos con otros.

Como método para preparar una bacteria corineforme que presenta la capacidad de producir una sustancia diana, en particular en el caso de que la sustancia diana sea un aminoácido, un método para preparar una bacteria corineforme que presenta la capacidad de producir el aminoácido, utilizando cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, (a) a (e), o un método de combinación de los mismos, se describe una gran cantidad de ejemplos en Biotechnology 2a ed., vol. 6, Products of Primary Metabolism (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1996) sección 14a, 14b o Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology, 79, 1-35, 2003; Agric. Biol. Chem., 51, 2089-2094, 1987 y Amino Acid Fermentation, Gakkai Shuppan Center, Hiroshi Aida, et al., 1986. Además, además de las publicaciones mencionadas anteriormente, se ha informado de un método específico para preparar una bacteria corineforme que presenta la capacidad de producir un aminoácido en un gran número de publicaciones, tales como JP-A-2003-164297, Agric. Biol. Chem., 39, 153-160, 1975; Agric. Biol. Chem., 39, 1149 1153, 1975; JP-A-58-13599, J. Gen. US Microbiol., 4, 272-283, 1958; JP-A-63-94985, Agric. Biol. Chem., 37, 2013 2023 (1973); documentos WO 97/15673, JP-A-56-18596, JP-A-56-144092, JP-A-2003-511086 y WO 2006/001380, y una bacteria corineforme que presenta la capacidad de producir un aminoácido puede prepararse haciendo referencia a cualquiera de las publicaciones mencionadas anteriormente, etc.

Entre los ejemplos de la bacteria corineforme que presenta la capacidad de producir L-arginina preparada mediante el método mencionado anteriormente puede incluirse Corynebacterium glutamicum RB2631 (documento WO 2006/035831) y entre los ejemplos de la bacteria corineforme que presenta la capacidad de producir L-lisina preparada mediante el método mencionado anteriormente puede incluirse Corynebacterium glutamicum AHP-3 (FERM n° BP-7382).

Una bacteria corineforme que puede utilizarse para preparar la bacteria corineforme mencionada anteriormente con una capacidad de producir una sustancia diana puede ser cualquier bacteria con la condición de que sea una bacteria corineforme en la que puedan aplicarse los métodos mencionados anteriormente, (a) a (e), o una bacteria corineforme que presente las características genéticas mencionadas anteriormente, y entre los ejemplos preferidos de la misma puede incluirse la bacteria corineforme mencionada anteriormente perteneciente al género Corynebacterium, al género Brevibacterium o al género Microbacterium.

Entre los ejemplos del método de tratamiento de mutaciones puede incluirse un método utilizando N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) (Microorganism Experiment Manual, 1986, p. 131, Kodansha Scientific, Ltd.) y un método de irradiación UV y similares.

Entre los ejemplos de un método de sustitución génica mediante una técnica de ADN recombinante puede incluirse un método en el que se introduce una sustitución, una eliminación o una adición de una o más bases en un gen codificante de la proteína FruK y de la proteína FruA (en adelante en la presente memoria asimismo denominado gen FruKA) in vitro, el gen se integra en el cromosoma de una cepa madre mediante recombinación homóloga o similar, y además, el gen FruKA originalmente presente en el cromosoma se sustituye mediante recombinación homóloga o similar.

Entre los ejemplos del método para introducir una sustitución, una eliminación o una adición de una o más bases en el gen FruKA pueden incluirse un método según un método de mutagénesis específica de sitio descrita en, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 (en adelante en la presente memoria abreviadamente “Molecular Cloning 3a ed.”), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (en adelante en la presente memoria abreviadamente “Current Protocols in Molecular Biology”), Nucleic Acids Research, 10, 6487, 1982; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409, 1982; Gene, 34, 315, 1985; Nucleic Acids Research, 13, 4431, 1985; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488, 1985, o similares.

La sustitución génica mediante una técnica de ADN recombinante puede llevarse a cabo mediante la introducción de una mutación en el gen FruKA según el método descrito en J. Bacteriol. 182, 6884, 2000, o similares.

El gen FruKA puede obtenerse mediante el método de PCR o similares basado en la información conocida de la secuencia de bases del gen FruKA derivada de Corynebacterium glutamicum [por ejemplo, los números de acceso del National Center for Biotechnology Information (NCBI) NC_006958 REGION: 2012568 a 2013560, NC_006958 REGION: 2013557 a 2015623].

Mediante la inserción del gen FruKA en el que se ha introducido la mutación (en adelante en la presente memoria denominado 'gen mutante') en un vector plásmido apropiado o similar, se produce un plásmido recombinante.

Como vector plásmido puede utilizarse, por ejemplo, un plásmido que no puede replicarse autónomamente en la cepa madre, y presenta un gen marcador de resistencia a antibióticos y un gen de leván sucrasa sacB de Bacillus subtilus [Mol. Microbiol., 6, 1195, 1992].

Como método para introducir el plásmido recombinante que presenta el ADN mutante en la cepa madre, puede utilizarse cualquier método con la condición de que sea un método capaz de introducir un ADN en una bacteria corineforme, y entre los ejemplos de la misma pueden incluirse un método de electroporación [Appl. Microbiol. Biotech., 52, 541, 1999], un método de protoplasto [J. Bacteriol., 159, 306, 1984] y similares.

Debido a que el plásmido recombinante no puede replicarse autónomamente en la cepa madre, mediante la obtención de una cepa que muestra resistencia a un antibiótico correspondiente al marcador de resistencia a los antibióticos contenido en el plásmido recombinante, puede obtenerse una cepa transformante en la que se ha integrado el plásmido recombinante en el cromosoma.

Además, mediante un método de selección que utiliza el hecho de que la leván sucrasa de Bacillus subtilis integrada en el cromosoma junto con el gen mutante produce un sustrato suicida [J. Bacteriol. 174, 5462, 1992], puede obtenerse una cepa en la que el gen FruKA en el cromosoma de la cepa madre ha sido sustituido por el gen mutante.

Mediante el método anteriormente descrito, puede llevarse a cabo la sustitución de un gen en el cromosoma de una cepa madre; sin embargo, no se encuentra limitado al método anteriormente descrito y asimismo puede utilizarse otro método de sustitución génica con la condición de que sea un método capaz de sustituir un gen en el cromosoma de una bacteria corineforme.

Entre los ejemplos del método para introducir una sustitución, una eliminación o una adición en el gen FruKA en el cromosoma de la cepa madre puede incluirse un método de fusión y un método de transducción diferente de los métodos mencionados anteriormente, y por ejemplo, el método descrito en Amino Acid Fermentation, Gakkai Shuppan Center, editado por Hiroshi Aida, et al., 1986.

El número de bases para introducir una mutación no se encuentra limitado con la condición de que sea un número capaz de eliminar la actividad de FruKA mediante la introducción de una sustitución, una eliminación o una adición de bases en el gen FruKA. El sitio en que se introduce la mutación no se encuentra necesariamente limitado a un sitio en la secuencia de bases de una región codificante del gen FruKA con la condición de que sea un sitio capaz de eliminar la actividad de FruKA debido a la mutación, y puede encontrarse en una región reguladora de la transcripción/traducción del gen FruKA, aunque preferentemente es una región codificante del gen FruKA.

Entre los ejemplos del método de pérdida de la actividad de FruKA mediante la introducción de una sustitución de una base puede incluirse un método para introducir una mutación sin sentido.

Entre los métodos para introducir una mutación sin sentido puede incluirse, por ejemplo, un método en el que se lleva a cabo una p Cr utilizando un cebador que contiene un codón de parada y el gen FruKA, y el gen FruKA en el cromosoma de una cepa madre se sustituye, utilizando el gen FruKA obtenido en el que se ha introducido una mutación sin sentido.

Entre los ejemplos del método para eliminar la actividad de FruKA mediante la introducción de una eliminación de una secuencia de bases puede incluirse un método en el que un gen FruKA mutante obtenido mediante escisión del gen FruK y del gen FruA con un enzima de restricción o similar, eliminación de una secuencia de bases compuesta por un número apropiado de bases y después ligación de los fragmentos resultantes nuevamente, se integra en el cromosoma.

Puede obtenerse una cepa en la que se ha perdido la actividad de FruKA mediante la utilización del hecho de que la cepa en la que se ha perdido la actividad de FruKA crece lentamente o no puede crecer en un medio que contiene fructosa como única fuente de carbono, obteniendo por lo tanto una cepa que crece de la misma manera que la cepa madre en el caso de que se utilice glucosa como única fuente de carbono pero que no crece, o crece extremadamente mal, en comparación con la cepa madre en un medio en el que se utiliza fructosa como única fuente de carbono entre las bacterias corineformes en las que se ha introducido la mutación.

El método para seleccionar una bacteria corineforme en la que se ha perdido la actividad de FruKA asimismo puede utilizarse como un método para seleccionar una bacteria corineforme que presenta una tasa de consumo de azúcar mejorada en comparación con la cepa madre y, por lo tanto, resulta más adecuada para producir una sustancia útil.

Mediante el cultivo de la bacteria corineforme obtenida de esta manera, en la que la bacteria presenta la capacidad de producir una sustancia diana y se ha perdido la actividad de FruKA en comparación con la cepa madre, permitiendo la producción y acumulación en el cultivo de la sustancia diana y la recolección de la misma, puede producirse la sustancia diana. La bacteria corineforme para la utilización en la invención asimismo es una bacteria corineforme cuya tasa de consumo de azúcar se ha mejorado y, por lo tanto, la sustancia diana puede producirse eficientemente.

El cultivo de la bacteria corineforme puede llevarse a cabo mediante un método convencional de cultivo de bacterias con la capacidad de producir una sustancia diana.

Como medio, puede utilizarse un medio sintético o un medio natural, con la condición de que sea un medio que contenga cantidades apropiadas de una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, sales inorgánicas y similares.

Como fuente de carbono, puede utilizarse principalmente glucosa. Asimismo puede utilizarse una azúcar que resulta asimilado mediante el sistema de PTS diferente de la glucosa; sin embargo, debido a que se ha perdido la actividad de FruKA, no resulta preferente utilizar sacarosa o fructosa.

Como fuente de nitrógeno, puede utilizarse amonio, cualquiera de entre una diversidad de sales inorgánicas y orgánicas de amonio, tales como cloruro amónico, sulfato amónico, carbonato amónico y acetato amónico, urea, otro compuesto nitrogenado o una sustancia orgánica nitrogenada, tal como extracto de carne, extracto de levadura, licor de maceración del maíz o hidrolizado de soja.

Como sal inorgánica, puede utilizarse fosfato monopotásico, fosfato secundario de potasio, sulfato amónico, cloruro sódico, sulfato de magnesio, carbonato de calcio o similares.

Además de los mencionados anteriormente, puede añadirse según resulte necesario una fuente menor de nutrientes, tal como biotina, tiamina, nicotinamida o ácido nicotínico. Dicha fuente menor de nutrientes asimismo puede sustituirse por un aditivo al medio, tal como extracto de carne, extracto de levadura, licor de maceración del maíz, casaminoácido o similares.

El cultivo se lleva a cabo bajo condiciones aeróbicas, tales como el cultivo de agitación o el cultivo de centrífuga sumergido bajo aireación. En general, la temperatura de cultivo es preferentemente de 20°C a 42°C, y más preferentemente de 30°C a 40°C. El pH del medio se mantiene preferentemente en torno a un pH neutro, en un intervalo de 5 a 9. El pH del medio se ajusta con un ácido inorgánico u orgánico, una solución alcalina, urea, carbonato cálcico, amonio, un amortiguador del pH o similar.

El periodo de cultivo es generalmente de 1 a 6 días.

La recolección de la sustancia diana a partir del cultivo después de completar el cultivo no requiere un método especial. Es decir, la sustancia diana acumulada extracelularmente puede recogerse mediante combinación de un método de resina de intercambio iónico convencionalmente conocida y otros métodos según el tipo de sustancia diana. Además, la sustancia diana acumulada intracelularmente puede recogerse mediante disrupción física o enzimática de las células bacterianas, y la recolección de la sustancia diana a partir del homogeneizado de células bacterianas o fracción de membranas según el tipo de sustancia diana. Incidentalmente, dependiendo de la sustancia diana, asimismo resulta posible utilizar la sustancia diana en un estado de presencia en las células bacterianas como catalizador microbiano o similar.

La sustancia útil que puede producirse según la invención no se encuentra particularmente limitada, aunque entre los ejemplos de la misma pueden incluirse aminoácidos, péptidos y proteínas.

Entre los ejemplos del aminoácido pueden incluirse L-lisina, L-arginina, L-histidina, L-isoleucina, L-valina, L-leucina, L-treonina, L-fenilalanina, L-tirosina, L-triptófano, L-cisteína, ácido L-glutámico, L-citrulina, L-glutamina, L-prolina, L-serina, L-ornitina, L-metionina, ácido L-aspártico, L-asparagina y glicina, y entre los ejemplos preferidos pueden incluirse ácido L-aspártico, ácido L-glutámico y L-aminoácidos obtenidos mediante biosíntesis pasando por ácido L-aspártico, ácido L-glutámico o ácido pirúvico en una ruta metabólica microbiana.

Entre los ejemplos de los L-aminoácidos obtenidos mediante biosíntesis pasando por ácido L-aspártico pueden incluirse L-metionina, L-lisina, L-treonina, L-asparagina y similares, y entre los ejemplos del L-aminoácido obtenido mediante biosíntesis pasando por ácido L-glutámico pueden incluirse L-glutamina, L-arginina, L-ornitina, L-prolina y similares. Entre los ejemplos del L-aminoácido obtenidos mediante biosíntesis pasando por ácido pirúvico pueden incluirse L-alanina, L-valina, L-leucina, L-isoleucina y similares.

Entre los ejemplos del péptido pueden incluirse dipéptidos, tales como alanil-glutamina y carnosina, y tripéptidos, tales como glutatión y ejemplos de la proteína pueden incluirse polipéptidos biológicamente activos, tales como G-CSF, eritropoyetina y HGF.

A continuación en la presente memoria, se describen ejemplos de la invención; sin embargo, la presente invención no se encuentra limitada a estos ejemplos.

Ejemplo 1

(1) Construcción de plásmido para la disrupción génica

El plásmido pHSG299 [Gene 61, 63, 1987] con un gen que proporcionaba resistencia a la canamicina se trató con PstI. A continuación, se ligó un fragmento de ADN de 2,6 pares de kilobases (en adelante en la presente memoria abreviadamente 'kb') que contenía un gen de leván sucrasa sacB derivado de Bacillus subtilis [Mol. Microbiol., 6, 1195, 1992] se ligó con el plásmido en el sitio de corte, de manera que se obtuvo el plásmido pESB30.

(2) Construcción de plásmido para crear la cepa de disrupción del gen fruKA

Según el método de Saito et al. [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619, 1963], se preparó el ADN cromosómico de la cepa Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. Mediante la utilización del a Dn cromosómico como molde y asimismo utilizando cada uno de: una combinación de un ADN que consistía en una secuencia de bases representada por SEC ID n° 5 con un ADN que consistía en una secuencia de bases representada por la SEC ID n° 6, y una combinación de un ADN que consistía en una secuencia de bases representada por la SEC ID n° 7 con un a Dn que consistía en una secuencia de bases representada por la SEC ID n° 8 como un conjunto de cebadores; se llevaron a cabo 2 tipos de reacciones de PCR utilizando la ADN polimerasa PrimeSTAR Max (fabricada por Takara Bio, Inc.) y un amortiguador acompañante. Se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa dos productos de PCR de aproximadamente 0,5 kb obtenidos mediante PCR, respectivamente, y se extrajeron utilizando gel Wizard(R) SV y un sistema PCR Clean-Up (fabricado por Promega Co., Ltd.) y se purificaron.

Además, mediante la utilización de cada uno de los dos productos purificados como molde, se llevó a cabo una PCR utilizando un ADN que consistía en una secuencia de bases representada por la SEC ID n° 5 y un ADN compuesto por una secuencia de bases representada por la SEC ID n° 8 como conjunto de cebadores. El producto de PCR obtenido se sometió a electroforesis en un gel de agarosa y se extrajo utilizando gel Wizard(R) SV y el sistema PCR Clean-Up, y se purificó, de manera que se obtuvo un fragmento de ADN de aproximadamente 1,0 kb. El fragmento de ADN obtenido se trató con un enzima de restricción utilizando el enzima de restricción Sse8378l (fabricado por Takara Bio, Inc.) y un amortiguador acompañante. El fragmento obtenido tratado con el enzima de restricción se extrajo utilizando gel Wizard(R) SV y el sistema PCR Clean-Up, y se purificó.

Simultáneamente, el pESB30 creado anteriormente se trató con Sse8387l y se mezcló con el fragmento obtenido tratado con el enzima de restricción y después, se llevó a cabo una reacción de ligasa utilizando un kit de ligación Ver.1 (fabricado por Takara Bio, Inc.). Mediante la utilización del producto de reacción, se transformó la cepa Escherichia coli Dh5a (preparada por Toyo Co., Ltd.) siguiendo un procedimiento común. La cepa se cultivó en un medio de agar LB [un medio que contenía 10 g de triptona Bacto (fabricada por Difco Co., Ltd.), 5 g de extracto de levadura (fabricado por Difo Co., Ltd.), 10 g de cloruro sódico y 16 g de agar Bacto (fabricado por Difco Co., Ltd.) en 1 l de agua y se ajustó a pH 7.0] que contenía 20 pg/ml de canamicina y se seleccionó una cepa transformante. La cepa transformante se cultivó durante la noche con un medio LB que contenía 20 pg/ml de canamicina y se preparó el plásmido mediante el método de álcali-SDS (Molecular Cloning 3a ed.) a partir del caldo de cultivo obtenido. El plásmido obtenido de esta manera se denominó pDfruKA.

(3) Creación de cepa de disrupción del gen FruKA

Mediante la utilización del plásmido pDfruKA preparado en (2), se transformó una cepa de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 mediante el método de electroporación según el método de Rest et al. [Appl. Microbiol. Biotech., 52, 541, 1999] y se seleccionaron las cepas resistentes a la canamicina. Se presume que, en las cepas resistentes a la canamicina, pDfruKA se ha integrado en el cromosoma de cada una de las cepas mediante recombinación homóloga de tipo Campbell. En dichas cepas, el ADN codificante de fruKA originalmente presente en el cromosoma y un ADN con una estructura en la que fruKA en pDfruKA se ha interrumpido, se encuentran presentes próximos entre sí, y la segunda recombinación homóloga resulta fácil que se produzca entre ellos.

Debido a que la leván sacarosa codificada por sacB convierte la sacarosa en un sustrato suicida, un microorganismo con sacB no puede crecer en un medio que contiene sacarosa. Sin embargo, una cepa en la que se ha producido la segunda recombinación homóloga entre un ADN en una región en torno al gen fruKA originalmente presente en el cromosoma y un ADN con una estructura en la que el gen fruKA en pDfruKA se ha interrumpido, se ha eliminado cualquiera de los ADN junto con sacB y, por lo tanto, la cepa puede crecer incluso en un medio que contiene sacarosa. De esta manera, puede obtenerse un microorganismo en el que el gen fruKA originalmente presente en el cromosoma de un microorganismo huésped se encuentra eliminado.

Mediante la utilización de lo anterior, la cepa transformante mencionada anteriormente se aplicó sobre un medio de agar Suc [un medio que contiene 100 g de sacarosa, 7 g de extracto de carne, 10 g de peptona, 3 g de cloruro sódico, 5 g de extracto de levadura (fabricado por Difco Co., Ltd.) y 15 g de agar Bacto (fabricado por Difco Co., Ltd.) en 1 l de agua y se ajustó a pH 7.2] y se cultivó a 30°C durante 1 día y después se seleccionaron las colonias que crecieron.

Cada una de las colonias obtenidas de esta manera se inoculó en un medio que contenía fructosa como única fuente de carbono [un medio que contenía 4 g de cloruro amónico, 1 g de fosfato monopotásico, 3 g de fosfato dipotásico, 2 g de urea, 100 mg de biotina, 5 mg de hidrocloruro de tiamina, 5 mg de ácido nicotínico, 10 mg de heptahidrato de sulfato de hierro, 1 mg de heptahidrato de sulfato de cinc, 0,2 mg de pentahidrato de sulfato de cobre, 1 mg de pentahidrato de sulfato de manganeso, 10 mg de cloruro de calcio, 10 g de fructosa, 0,4 g de sulfato de magnesio y 15 g de agar Bacto (fabricado por Difco Co., Ltd.) en 1 l de agua y se ajustó a pH 7.2] y se obtuvo una colonia que crecía poco o no podía crecer y se denominó cepa WTAfruKA.

(4) Creación de cepa de disrupción del gen FruA

Mediante la utilización del mismo método que en el caso de la disrupción del gen FruKA, asimismo se creó a modo de control una cepa en la que únicamente el gen FruA de la cepa Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (en adelante en la presente memoria denominada cepa WT) se había interrumpido.

La creación de un plásmido para la disrupción del gen FruA se llevó a cabo de la misma manera que en el caso de la cepa de disrupción del gen FruKA, excepto en que se utilizaron los ADN que consistían en las secuencias de bases representadas por SEC ID n° 9 y SEC ID n° 10 como un conjunto de cebadores de los ADN que consistían en las secuencias de bases representadas por SEC ID n° 6 y SEC ID n° 7.

La cepa creada de esta manera se inoculó en un medio que contenía fructosa como única fuente de carbono y una colonia que crecía mal o que no podía crecer se denominó cepa WTAfruA.

(5) Evaluación de la cepa WTAfruKA y de la cepa WTAfruA

Cada una de las cepas WT obtenidas, cepa WTAfruKA y cepa WTAfruA, se inoculó en un matraz Erlenmeyer de 2 l que contenía 6 g de carbonato cálcico en 300 ml de un medio de inoculación (un medio que contenía 60 g de glucosa, 5 g de licor de maceración del maíz, 80 g de sulfato amónico, 12 g de monohidrogenofosfato potásico, 4 g de heptahidrato de sulfato de magnesio, 40 mg de heptahidrato de sulfato de hierro, 20 mg de pentahidrato de sulfato de manganeso, 2 mg de sulfato de cobre, 2 mg de hexahidrato de cloruro de níquel, 2 mg de hexahidrato de cloruro de cobalto, 200 mg de dihidrato de cloruro de calcio, 40 mg de tetrahidrato de heptamolibdato de Hexa-amonio, 40 mg de p-alanina, 40 mg de ácido nicotínico, 40 mg de hidrocloruro de tiamina y 0.4 mg de biotina en 1 l de agua y se ajustó el pH a 7.2) y se cultivó a 28°C durante 24 horas. Se inocularon 100 ml de dicho cultivo inóculo en un fermentador de jarra que contenía 1150 ml de un medio de cultivo principal (un medio que contenía 60 g de glucosa, 5 g de licor de maceración del maíz, 80 g de sulfato amónico, 12 g de monohidrogenofosfato potásico, 4 g de heptahidrato de sulfato de magnesio, 40 mg de heptahidrato de sulfato de hierro, 20 mg de pentahidrato de sulfato de manganeso, 2 mg de sulfato de cobre, 2 mg de hexahidrato de cloruro de níquel, 2 mg de hexahidrato de cloruro de cobalto, 200 mg de dihidrato de cloruro de calcio, 40 mg de heptamolibdato de Hexa-amonio, 40 mg de p-alanina, 40 mg de ácido nicotínico, 40 mg de hidrocloruro de tiamina y 0.4 mg de biotina en 1 l de agua) y cada cepa se cultivó a 37°C. El cultivo se llevó a cabo ajustando simultáneamente el pH con una solución acuosa de amonio a fin de mantener el pH a 6.7. Se completó el cultivo en el momento en que se había consumido por completo la glucosa en el medio y se midió el tiempo de cultivo en ese momento.

En consecuencia, tal como se muestra en la tabla 1, la tasa de consumo de azúcar era elevada en el caso de la cepa WTAfruKA, en la que se había interrumpido el gen FruKA.

[Tabla 1]

Ejemplo 2

Producción de L-arginina

Tal como se muestra en la tabla 1, se obtuvo un efecto de mejora del consumo de azúcar mediante disrupción del gen FruKA de la cepa de tipo salvaje y, por lo tanto, con el fin de confirmar la aplicación de la misma a la producción de una sustancia útil, se creó un acepa de eliminación del gen FruKA de una cepa RB2631, que es una cepa productora de L-arginina (documento n° WO 2006/035831) y se examinó la capacidad de producir arginina de la cepa.

Mediante el mismo método descrito en el ejemplo 1, se creó una cepa RB2631AfruKA, que es una cepa de eliminación del gen FruKA de la cepa RB2631 y una cepa RB2631AfruA, que es una cepa de eliminación del gen FruA de la cepa RB2631.

Se cultivó cada una de dichas cepas en un fermentador de jarra bajo las mismas condiciones que las indicadas en el ejemplo 1. Sin embargo, la temperatura de cultivo se fijó en 37°C.

En consecuencia, tal como se muestra en la tabla 2, se demostró que la tasa de consumo de azúcar y la productividad de L-arginina eran elevadas en el caso de la cepa RB2631 AfruKA en la que se había interrumpido el gen FruKA.

[Tabla 2]

Ejemplo 3

Examen utilizando la cepa productora de L-lisina

Se creó una cepa de eliminación del gen FruKA y una cepa de eliminación del gen FruA de una cepa AHP-3 (FERM BP-7382), que es una cepa productora de L-lisina, en la que la L-lisina es un aminoácido cuya ruta biosintética es diferente de la ruta de la L-arginina, y se examinó la productividad de la L-lisina de la misma.

Mediante el mismo método descrito en el ejemplo 1, se creó una cepa AHP-3 AfruKA, que es una cepa de eliminación del gen FruKA de la cepa RB2631 y una cepa RB2631AfruA, que es una cepa de eliminación del gen FruA de la cepa AHP-3.

Se cultivó cada una de dichas cepas en un fermentador de jarra bajo las mismas condiciones que las indicadas en el ejemplo 1.

En consecuencia, tal como se muestra en la tabla 3, se demostró que la tasa de consumo de azúcar y la productividad de la L-lisina eran elevadas en el caso de la cepa AHP-3AfruKA en la que se había interrumpido el gen FruKA.

[Tabla 3]

Aplicabilidad industrial

Listado de secuencias

SEC ID n° 5 - Descripción de secuencia artificial ADN sintético SEC ID n° 6 - Descripción de secuencia artificial ADN sintético SEC ID n° 7 - Descripción de secuencia artificial ADN sintético SEC ID n° 8 - Descripción de secuencia artificial ADN sintético SEC ID n° 9 - Descripción de secuencia artificial ADN sintético SEC ID n° 10 - Descripción de secuencia artificial ADN sintético

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para producir una sustancia diana, que comprende: cultivar, en un medio, una bacteria corineforme en la que la actividad de la proteína FruKy la proteína FruA implicada en el sistema de fosfotransferasa (PTS) en relación con la absorción de la fructosa se ha perdido en comparación con una cepa madre y la bacteria puede producir la sustancia diana, permitiendo que la sustancia diana se forme y acumule en un cultivo; y recoger la sustancia diana a partir del cultivo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la bacteria corineforme, en la que la actividad de la proteína FruK y la proteína FruA se ha perdido en comparación con la cepa madre y la bacteria puede producir la sustancia diana es una bacteria corineforme en la que la actividad de la proteína Fruk y la proteína FruA se ha perdido en comparación con la cepa madre introduciendo una eliminación, una sustitución o una adición de una base en un gen que codifica la proteína en el ADN cromosómico de la cepa madre.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la bacteria corineforme es Corynebacterium glutamicum.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la sustancia diana es un aminoácido, un péptido o una proteína.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el aminoácido es un aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste en L-lisina, L-arginina, L-histidina, L-isoleucina, L-valina, L-leucina, L-treonina, L-fenilalanina, L-tirosina, L-triptófano, L-cisteína, ácido L-glutámico, L-citrulina, L-glutamina, L-prolina, L-serina, L-ornitina, L-metionina, ácido L-aspártico, L-asparagina y glicina.