CN103384723A - 利用发酵法制造目标物质的方法 - Google Patents

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Abstract

根据本发明，通过在培养基中培养与果糖摄取相关的PTS系统蛋白的活性低于亲本株或丧失、并且能够生产目标物质的棒状杆菌，使该目标物质在培养物中生成并蓄积，并从该培养物中收集该目标物质，从而能够高效地制造该目标物质。

Description

利用发酵法制造目标物质的方法
技术领域
本发明涉及目标物质的制造方法，其使用与果糖摄取相关的PTS系统蛋白的活性低于亲本株或丧失、并且能够生产该目标物质的棒状杆菌。
背景技术
在利用发酵法制造目标物质的方法中，作为提高其生产率的方法之一，可以列举改变作为原料的糖的摄取能力的方法。
对于微生物的以糖为代表的碳水化合物的摄取机制的研究不断取得进展，已知其分为几种，其中，作为特别主要的使糖磷酸化而进行摄取的转运蛋白，可以列举磷酸烯醇丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(以下也称为PTS或磷酸转移酶系统)(非专利文献1)。
PTS系统包括不依赖于底物的通用体系EI(由ptsI编码)、HPr(由ptsH编码)和底物特异性构成成分EII(非专利文献2～4)。
底物特异性EII的种类根据生物的种类而不同，对于研究取得了进展的肠内细菌、棒状杆菌中主要的EII正在进行鉴定，其中，已知果糖特异性的EII由FruA(PtsF)编码(非专利文献5)。
已知果糖的通过PTS系统的摄取需要将果糖从外部摄取并将其转变为果糖-1-磷酸的FruA、以及将果糖-1-磷酸转变为作为醣酵解的重要中间产物的果糖-1,6-双磷酸的FruK(PfkB)(非专利文献6和7)。
在物质生产中，已知多个通过改变PTS系统来提高生产率的例子。例如已知，使用将ptsG基因增强后的埃希氏菌属细菌的氨基酸制造方法(专利文献1)、使用将与ptsH、ptsI和ptsG发挥相同作用的crr基因增强后的埃希氏菌属细菌的氨基酸的制造方法(专利文献2)。
另外已知，通过将作为主要的糖即葡萄糖等的摄取系统的PTS系统破坏，从而促进戊糖等不经由PTS系统的糖的摄取、代谢的方法(专利文献3)。
另外还已知，通过将作为葡萄糖的摄取系统的PTS系统破坏，并由其它途径进行摄取，从而改变糖的代谢途径，由此能够提高目标物质的生产率(专利文献4)。另外，通过破坏果糖的摄取系统并引入外源果糖激酶，从而改变糖的代谢途径，由此能够提高目标物质的生产率(非专利文献5)。
但是，对于通过破坏特定的糖的PTS摄取系统来提高其它糖的通过PTS系统的摄取能力，从而能够高效地制造目标物质，尚且未知。另外，对于在将PTS摄取系统和摄取后的代谢系统同时破坏时，其它的糖的摄取能力上升，尚且未知。特别是由于葡萄糖是控制糖摄取的核心，因此，存在即使单纯地增强摄取系统，摄取速度也会随着细胞内葡萄糖浓度的上升而降低等问题，因此预想难以提高葡萄糖的消耗速度(非专利文献8)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第03/04670号
专利文献2：国际公开第03/04674号
专利文献3：日本特开平5-49441号公报
专利文献4：美国专利申请公开第2009/0142843号说明书
非专利文献
非专利文献1：Mol.Microbiol.,35,699(2000)
非专利文献2：Microbiol.Rev.,57,543(1993)
非专利文献3：J.Bacteriol.,174,1433(1992)
非专利文献4：Biochem.Soc.Trans,33,220(2005)
非专利文献5：FEMS Microbiol.Lett.,244,259(2005)
非专利文献6：Advan,Enzyme Regul.42,349,(2002)
非专利文献7：Eur.J.Biochem.,254,96(1998)
非专利文献8：FEMS Microbiol.Rev.,32,891(2008)
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题在于，在使用棒状杆菌通过发酵法生产有用物质时提高糖消耗速度。
用于解决问题的手段
本发明涉及以下的(1)～(6)。
(1)一种目标物质的制造方法，其特征在于，在培养基中培养与果糖摄取相关的PTS系统蛋白的活性低于亲本株或丧失、并且能够生产目标物质的棒状杆菌(Coryneform bacterium)，使该目标物质在培养物中生成并蓄积，并从该培养物中收集该目标物质。
(2)如上述(1)的制造方法，其特征在于，与果糖摄取相关的PTS系统蛋白的活性低于亲本株或丧失、并且能够生产目标物质的棒状杆菌，是通过在位于亲本株的染色体DNA上的编码该蛋白质的基因中引入碱基的缺失、置换或添加从而该蛋白质的活性低于亲本株或丧失的棒状杆菌。
(3)如上述(1)或(2)所述的制造方法，其特征在于，与果糖摄取相关的PTS系统蛋白是包含FruK蛋白和FruA蛋白的蛋白质。
(4)如上述(1)～(3)中任一项所述的制造方法，其特征在于，棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
(5)如上述(1)～(4)中任一项所述的制造方法，其特征在于，目标物质为氨基酸、肽或蛋白质。
(6)如上述(1)～(5)中任一项所述的制造方法，其特征在于，氨基酸为选自由L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-苏氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-瓜氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-鸟氨酸、L-甲硫氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺和甘氨酸构成的组的氨基酸。
发明效果
根据本发明能够利用发酵法高效地制造目标物质。
具体实施方式
1.本发明中使用的棒状杆菌
本发明中使用的棒状杆菌是与果糖摄取相关的PTS系统蛋白的活性低于亲本株或丧失的棒状杆菌，并且是能够生产目标物质的棒状杆菌。
作为与果糖摄取相关的PTS系统蛋白的活性低于亲本株或丧失的棒状杆菌，可以列举：通过在存在于染色体DNA上的没有发生突变的编码野生型与果糖摄取相关的PTS系统蛋白的基因的碱基序列中引入碱基的缺失、置换或添加而得到的、(a)与果糖摄取相关的PTS系统蛋白的活性与亲本株相比降低至80%以下、优选50%以下、更优选30%以下、进一步优选20%以下、特别优选10%以下、最优选0%的棒状杆菌、和(b)该基因的转录量或与果糖摄取相关的PTS系统蛋白的生产量与亲本株相比降低至80%以下、优选50%以下、更优选30%以下、进一步优选20%以下、特别优选10%以下、最优选0%的棒状杆菌。更优选编码FruK蛋白或FruA蛋白的基因部分或完全缺陷的棒状杆菌。
作为编码FruA蛋白的基因，只要是编码具有摄取果糖并且使果糖反应为果糖-1-磷酸的FruA活性的多肽的基因，则可以为任意一种，作为编码FruK蛋白的基因，只要是编码具有使果糖-1-磷酸反应为果糖-1,6-双磷酸的FruK活性的多肽的DNA，则可以为任意一种，具体而言可以列举以下基因：
[1]编码具有序列号1所示的氨基酸序列的蛋白质的基因、
[2]编码具有序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质的基因、
[3]编码与序列号1所示的氨基酸序列具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、进一步优选97%以上、特别优选98%以上、最优选99%以上的同源性、并且与具有序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质一起显示出果糖摄取活性的蛋白质的基因、
[4]编码与序列号2所示的氨基酸序列具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、进一步优选97%以上、特别优选98%以上、最优选99%以上的同源性、并且与具有序列号1所示的氨基酸序列的蛋白一起显示出果糖摄取活性的蛋白质的基因、
[5]具有序列号3所示的碱基序列的基因、
[6]具有序列号4所示的碱基序列的基因、
[7]在严格条件下与由序列号3所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交、并且编码与具有序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质一起显示出果糖摄取活性的蛋白质的基因、和
[8]在严格条件下与由序列号2所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA杂交、并且编码与具有序列号1所示的氨基酸序列的蛋白质一起显示出果糖摄取活性的蛋白质的基因等。
在本说明书中，基因是指除蛋白质的编码区之外还可以包含转录调控区和启动子区等的DNA。
作为转录调控区，可以列举由染色体DNA上编码区的5’末端上游侧100个碱基、优选50个碱基构成的DNA，作为启动子区，可以列举与-10及-35区域相当的区域。
向编码与果糖摄取相关的PTS系统蛋白的基因中的碱基的缺失、置换或添加的引入，只要是使该蛋白质的活性低于亲本株或丧失的碱基的缺失、置换或添加，则碱基的种类及数量没有限制，作为碱基的缺失，可以列举：启动子及转录调控区优选10个碱基以上、更优选20个碱基以上、进一步优选全部区域缺失；编码区优选10个碱基以上、更优选20个碱基以上、进一步优选100个碱基以上、特别优选200个碱基以上、最优选编码区全部缺失。
作为碱基的置换，可以列举：置换编码区的5’末端起第150个以内的碱基、优选第100个以内的碱基、更优选第50个以内的碱基、特别优选第30个以内的碱基、最优选第20个以内的碱基来引入无义密码子[An Introduction to Genetic Analysis7th edition,W.H.Freeman(2000)]。
作为碱基的添加，可以列举：紧接编码区的5’末端起第150个以内的碱基、优选第100个以内的碱基、更优选第50个以内的碱基、特别优选第30个以内的碱基、最优选第20个以内的碱基之后，添加50个碱基以上、优选100个碱基以上、更优选200个碱基以上、进一步优选500个碱基以上、特别优选1kb以上的DNA片段，可以特别优选列举插入氯霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因等。
氨基酸序列、碱基序列的同源性，可以使用Karlin和Altschul的BLAST算法[Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993)]或FASTA算法[Methods Enzymol.,183,63(1990)]来确定。基于该BLAST算法，开发了称为BLASTN和BLASTX的程序[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]。基于BLAST通过BLASTN来分析碱基序列时，例如将参数设定为：分数(Score)=100、字长(wordlength)=12。另外，基于BLAST通过BLASTX来分析氨基酸序列时，例如将参数设定为：分数(score)=50、字长(wordlength)=3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体方法已众所周知。
对于是否为与果糖摄取相关的PTS系统蛋白的活性比亲本株低或丧失的棒状杆菌，例如可以通过Northern印迹法将其编码与果糖摄取相关的PTS系统蛋白的基因的转录量与亲本株相比来确认，或者通过蛋白印迹法将其与果糖摄取相关的PTS系统蛋白的生产量与亲本株相比来确认。
另外，在含有果糖作为单一碳源的培养基中进行培养时，与亲本株相比生长差或者不生长，可以确认为与果糖摄取相关的PTS系统蛋白的活性与亲本株相比降低或丧失的棒状杆菌。
上述中所说的“杂交”是指，DNA与具有特定碱基序列的DNA或该DNA的一部分杂交。因此，该具有特定碱基序列的DNA或其一部分是能够用作Northern或Southern印记分析的探针、或者能够用作PCR分析的寡核苷酸引物的DNA。作为用作探针的DNA，可以列举至少100个碱基以上、优选200个碱基以上、更优选500个碱基以上的DNA；作为用作引物的DNA，可以列举至少10个碱基以上、优选15个碱基以上的DNA。
DNA杂交实验的方法已经熟知，例如如果是本领域技术人员，则可以根据本说明书确定杂交的条件。该杂交条件除根据分子克隆第2版、第3版(2001年)、Methods for General and Molecular Bacteriology,ASM出版社(1994)、Immunology methods manual,美国学术出版社(1996)的记载之外，还可以根据多种其它标准教科书的记载来进行。
另外，通过根据市售的杂交试剂盒中附带的说明书，也可以获得在严格条件下杂交的DNA。作为市售的杂交试剂盒，可以列举例如通过随机引物法制作探针、并在严格条件下进行杂交的试剂盒。
上述严格条件优选为如下条件：在含有50%甲酰胺、5×SSC(750mmol/l氯化钠、75mmol/l柠檬酸钠)、50mmol/l磷酸钠(pH7.6)、5×邓哈特(Denhardt's)溶液、10%硫酸葡聚糖及20μg/l变性鲑鱼精DNA的溶液中，将固定有DNA的滤膜和探针DNA在42℃下孵育一夜后，在例如约65℃的0.2×SSC溶液中清洗该滤膜，但也可以使用严格度更低的条件。严格条件的改变可以通过调节甲酰胺的浓度(甲酰胺的浓度越低则严格度越低)、改变盐浓度及温度条件来实现。作为低严格条件，可以列举例如：在含有6×SSCE(20×SSCE为3mol/l氯化钠、0.2mol/l磷酸二氢钠、0.02mol/l EDTA、pH7.4)、0.5%SDS、30%甲酰胺、100μg/l变性鲑鱼精DNA的溶液中，在37℃下孵育一夜后，使用50℃的1×SSC、0.1%SDS溶液进行清洗的条件。另外，作为严格度更低的条件，可以列举在上述低严格度条件中，使用高盐浓度(例如5×SSC)的溶液进行杂交后进行清洗的条件。
上述各种条件也可以通过添加或改变用于抑制杂交实验的背景的封闭试剂来进行设定。为了使条件合适，上述封闭试剂的添加也可以伴有杂交条件的改变。
作为在上述严格条件下能够杂交的DNA，可以列举例如：使用BLAST、FASTA等基于上述参数等进行计算时，与由序列号3或4所示的碱基序列构成的DNA具有至少90%以上、优选95%以上、更优选97%以上、进一步优选98%以上、特别优选99%以上的同源性的DNA。
能够生产目标物质是指，在培养基中培养本发明中使用的棒状杆菌时，以能够从细胞或培养基回收目标物质的程度进行生产的能力。
作为能够生产目标物质的棒状杆菌，在亲本株本身具有该性质的情况下，可以列举该性质增强后的棒状杆菌；在亲本株不具有该性质的情况下，可以列举人工赋予该性质后的棒状杆菌。
作为本发明中使用的棒状杆菌，可以列举属于棒状杆菌(Corynebacterium)属、短杆菌(Brevibacterium)属、或微杆菌(Microbacterium)属的棒状杆菌。
作为属于棒状杆菌属的微生物，可以列举：谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、嗜乙酰乙酸棒状杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)、醋谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)、帚石南棒状杆菌(Corynebacterium callunae)、力士棒状杆菌(Corynebacterium herculis)、百合棒状杆菌(Corynebacteriumlilium)、栖糖蜜棒状杆菌(Corynebacterium melassecola)、热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)等，具体而言可以列举：谷氨酸棒状杆菌ATCC13032、谷氨酸棒状杆菌ATCC13060、谷氨酸棒状杆菌ATCC13826(旧称黄色短杆菌(Brevibacterium flavum))、谷氨酸棒状杆菌ATCC14020(旧称Brevibacterium divaricatum)、谷氨酸棒状杆菌ATCC13869(旧称乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum))、嗜乙酰乙酸棒状杆菌ATCC13870、醋谷氨酸棒状杆菌ATCC15806、帚石南棒状杆菌ATCC15991、力士棒状杆菌ATCC13868、百合棒状杆菌ATCC15990、栖糖蜜棒状杆菌ATCC17965、热产氨棒状杆菌ATCC9244等。
作为属于短杆菌属的微生物，可以列举：解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)、乳发酵短杆菌(Brevibacteriumimmariophilum)、玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)、生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)等，具体而言可以列举：解糖短杆菌ATCC14066、乳发酵短杆菌ATCC14068、玫瑰色短杆菌ATCC13825、生硫短杆菌ATCC19240等。
作为属于微杆菌属的微生物，可以列举：嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)等，具体而言可以列举：嗜氨微杆菌ATCC15354等。
2.本发明的棒状杆菌的制造方法
本发明的棒状杆菌能够通过如下方法得到：以能够生产目标物质并且具有FruK蛋白和FruA蛋白的活性(以下也有时称为FruKA活性)的棒状杆菌作为亲本株，使用常规突变处理法、基于重组DNA技术等的基因置换法、细胞融合法或转导法等能够向棒状杆菌中引入突变的方法、或者反义法等能够抑制编码FruK蛋白和FruA蛋白的基因的表达的方法等，使该亲本株的FruKA活性降低或丧失。
亲本株只要是具有生产目标物质的能力、并且具有FruKA活性的棒状杆菌，则可以是野生株，也可以是由该野生株经过人工选育而得到的选育株。
作为对棒状杆菌人工赋予生成目标物质的能力的方法，可以列举如下方法，这些公知的方法可以单独或组合使用：
(a)削弱或消除至少一种调控目标物质的生物合成的机制的方法；
(b)增强表达至少一种参与目标物质的生物合成的酶的方法；
(c)增加至少一种参与目标物质的生物合成的酶基因的拷贝数的方法；
(d)削弱或阻断至少一条从目标物质的生物合成途径分出的、生成该目标物质以外的代谢产物的代谢途径的方法；和
(e)筛选与野生株相比对目标物质的类似物的抗性高的细胞系的方法等。
关于利用上述(a)～(e)中的任何一种方法或组合方法制备具有生产目标物质、特别是在目标物质为氨基酸的情况下为生产该氨基酸的能力的棒状杆菌的方法，在Biotechnology2nd ed.,Vol.6,Products ofPrimary Metabolism(VCH Verlagsgesellschaft mbH,Weinheim,1996)section14a,14b、Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,79,1-35(2003)、Agric.Biol.Chem.,51,2089-2094(1987)以及氨基酸发酵、学会出版中心、相田浩等(1986)中记载了多例，另外，除上述以外，具体的具有生产氨基酸能力的棒状杆菌的制备方法，已有日本特开2003-164297、Agric.Biol.Chem.,39,153-160(1975)、Agric.Biol.Chem.,39,1149-1153(1975)、日本特开昭58-13599、J.Gen.Appl.Microbiol.,4,272-283(1958)、日本特开昭63-94985、Agric.Biol.Chem.,37,2013-2023(1973)、WO97/15673、日本特开昭56-18596、日本特开昭56-144092、日本特表2003-511086以及WO2006/001380等很多报道，通过参考上述文献等，能够制备具有生产氨基酸的能力的棒状杆菌。
作为能够利用上述方法制备的具有生产L-精氨酸的能力的棒状杆菌，可以列举例如谷氨酸棒状杆菌RB2631(WO2006/035831)等；作为具有生产L-赖氨酸的能力的棒状杆菌，可以列举谷氨酸棒状杆菌AHP-3(FERM BP-7382)等。
作为上述的具有生产目标物质的能力的棒状杆菌的制备中能够使用的棒状杆菌，只要是能够应用上述(a)～(e)方法的棒状杆菌或具有上述遗传特性的棒状杆菌，则可以使用任意一种，可以优选列举上述属于棒状杆菌(Corynebacterium)属、短杆菌(Brevibacterium)属或微杆菌(Microbacterium)属的棒状杆菌。
作为突变处理法，可以列举例如：使用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)的方法(微生物実験マニュアル(微生物实验手册)、1986年、第131页、講談社サイエンティフィック社(讲谈社科学社))、紫外线照射法等。
作为基于重组DNA技术等的基因置换法，可以列举：体外在编码FruK蛋白和FruA蛋白的基因(以下也称为FruKA基因)中引入一个以上的碱基的置换、缺失、或添加，通过同源重组等将该基因整合到亲本株的染色体中，并通过同源重组等将本来存在于染色体上的FruKA基因置换的方法。
作为在FruKA基因中引入一个以上的碱基的置换、缺失、或添加的方法，可以列举例如：基于Molecular cloning:a laboratory manual、第三版、Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)[以下简称为分子克隆第3版]、Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons(1987-1997)(以下简称为现代分子生物学实验技术)、Nucleic AcidsResearch,10,6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)等中记载的定点突变法的方法。
基于重组DNA技术的基因置换，可以根据J.Bacteriol.,182,6884(2000)等中记载的方法，通过在FruKA基因中引入突变来进行。
FruKA基因可以基于公知的来源于谷氨酸棒状杆菌的FruKA基因的碱基序列信息[例如，美国国立生物技术信息中心(NCBI)登录号NC_006958REGION:2012568..2013560、NC_006958REGION:2013557..2015623]通过PCR法等获得。
通过将该引入了突变的FruKA基因(以下称为突变基因)插入适当的质粒载体等中，可以制作重组质粒。
作为质粒载体，可以使用例如：在亲本株中无法进行自主复制、并且具有抗生素抗性标记基因和枯草芽孢杆菌的果聚糖蔗糖酶基因sacB[Mol.Microbiol.,6,1195(1992)]的质粒。
作为将具有突变DNA的重组质粒导入亲本株的方法，只要是能够将DNA导入棒状杆菌的方法，则可以使用任意一种，可以列举例如：电穿孔法[Appl.Microbiol.Biotech.,52,541(1999)]、原生质体法[J.Bacteriol.,159,306(1984)]等。
由于该重组质粒在亲本株中无法进行自主复制，因此，通过获得对与该重组质粒所具有的抗生素抗性标记相对应的抗生素显示出抗性的菌株，能够获得该重组质粒整合到染色体中的转化株。
另外，通过利用与突变基因一同整合到染色体中的枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶产生自杀底物的性质的选择法[J.Bacteriol.,174,5462(1992)]，能够获得亲本株的染色体上的FruKA基因被突变基因置换的菌株。
通过以上的方法，能够进行亲本株的染色体上的基因置换，但不限于上述的方法，只要是能够置换棒状杆菌的染色体上的基因的方法，则也可以使用其它的基因置换法。
作为在亲本株的染色体上的FruKA基因中引入置换、缺失或添加的方法，还可以列举细胞融合法、转导法，例如，相田浩等编著的氨基酸发酵(1986年、学会出版中心)中记载的方法等。
关于引入突变的碱基的数目，只要是能够通过FruKA基因的碱基的置换、缺失、或添加使FruKA活性降低或丧失的数目，则没有限定。关于引入突变的位点，只要是能够通过该突变使FruKA活性降低或丧失的位点，则不必限定在FruKA基因的编码区的碱基序列中，也可以在FruKA基因的转录、翻译调控区中，但优选FruKA基因的编码区。
作为通过引入碱基置换而使FruKA活性降低或丧失的方法，可以列举例如基于引入无义突变的方法。
作为引入无义突变的方法，可以列举例如：使用包含终止密码子的引物和FruKA基因进行PCR，并使用所得的引入无义突变后的FruKA基因来置换亲本株的染色体上的FruKA基因的方法。
作为通过引入碱基序列的缺失使FruKA活性降低或丧失的方法，可以列举例如：将分别用限制性内切酶等切割FruK和FruA基因并在删除适当数目的碱基序列后再进行连接而得到突变FruKA基因整合到染色体中的方法等。
FruKA活性降低或丧失的菌株在含有果糖作为单一碳源的培养基中生长缓慢或无法生长，利用该性质，通过从引入突变后的棒状杆菌中获得以葡萄糖为单一碳源时与亲本株同样地进行生长，但在以果糖为单一碳源的培养基中不生长、或者生长情况与亲本株相比变得极差的菌株，由此能够得到FruKA活性降低或丧失的菌株。
FruKA活性降低或丧失的棒状杆菌的选择方法，也可以用作糖消耗速度高于亲本株的更适于有用物质的制造的棒状杆菌的选择方法。
将如上得到的、具有生产目标物质的能力、并且FruKA活性低于亲本株或丧失的棒状杆菌在培养基中进行培养，使该目标物质在培养物中生成并蓄积，收集该目标物质，由此能够制造该目标物质。本发明中使用的棒状杆菌也是糖消耗速度提高的棒状杆菌，能够高效地制造目标物质。
棒状杆菌的培养，能够通过具有生产目标物质的能力的细菌的通常的培养方法来进行。
作为培养基，只要是适量含有碳源、氮源、无机盐类等的培养基，则可以使用合成培养基或天然培养基中的任意一种。
作为碳源，可以主要使用葡萄糖。虽然也可以使用葡萄糖以外的经由PTS系统的糖，但由于FruKA活性降低或丧失，因此不优选使用蔗糖、果糖。
作为氮源，可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、碳酸铵、乙酸铵等各种无机和有机铵盐类、尿素、其它含氮化合物以及肉浸膏、酵母浸膏、玉米浆、大豆水解物等含氮有机物。
作为无机盐，可以使用磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、氯化钠、硫酸镁、碳酸钙等。
另外，可以根据需要加入生物素、硫胺素、烟酰胺、烟酸等微量营养源。这些微量营养源也可以用肉浸膏、酵母浸膏、玉米浆、酪蛋白水解物等培养基添加物代替。
培养在振荡培养、深层通气搅拌培养等有氧条件下进行。培养温度一般优选为20～42℃，进一步优选30℃～40℃。培养基的pH为5～9的范围，优选保持在中性附近。对于培养基的pH的调节，使用无机酸或者有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨水、pH缓冲液等来进行。
培养时间通常为1～6天。
对于从培养结束后的培养物收集目标物质，不需要特别的方法。即，对于蓄积在菌体外的目标物质，可以通过根据目标物质的种类将以往公知的离子交换树脂法、沉淀法以及其它方法组合来收集。另外，对于蓄积在菌体内的目标物质，可以将菌体以物理方式或酶方式破坏、并根据目标物质的种类从菌体破碎液或膜组分中进行收集。另外，根据目标物质，也可以将目标物质以原样存在于菌体中的状态作为微生物催化剂等利用。
可以利用本发明制造的有用物质没有特别限定，可以列举氨基酸、肽和蛋白质等。
作为氨基酸，可以列举：L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-苏氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-瓜氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-鸟氨酸、L-甲硫氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺和甘氨酸等，可以优选列举：L-天冬氨酸、L-谷氨酸、在微生物的代谢途径中经由L-天冬氨酸、L-谷氨酸或丙酮酸而生物合成的L-氨基酸等。
作为经由L-天冬氨酸而生物合成的L-氨基酸，可以列举：L-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、和L-天冬酰胺等；作为经由L-谷氨酸而生物合成的L-氨基酸，可以列举：L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-鸟氨酸、和L-脯氨酸等。作为经由丙酮酸而生物合成的L-氨基酸，可以列举：L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、和L-异亮氨酸等。
作为肽，可以列举：丙氨酰谷氨酰胺和肌肽等二肽、谷胱甘肽等三肽；作为蛋白质，可以列举：G-CSF、促红细胞生成素和HGF等生理活性多肽。
以下示出本发明的实施例，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
(1)基因破坏用质粒的构建
将具有赋予卡那霉素抗性的基因的质粒pHSG299[Gene,61,63(1987)]用PstI进行处理，在切割位点连接2.6千个碱基对(以下简称为kb)的含有来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的果聚糖蔗糖酶基因sacB的DNA片段[Mol.Microbiol.,6,1195(1992)]，得到质粒pESB30。
(2)用于建立fruKA基因破坏株的质粒的构建
按照斋藤等的方法[Biochim.Biophys.Acta,72,619(1963)]制备谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株的染色体DNA，将该染色体DNA作为模板，将由序列号5所示的碱基序列构成的DNA与由序列号6所示的碱基序列构成的DNA的组合、以及由序列号7所示的碱基序列构成的DNA与由序列号8所示的碱基序列构成的DNA的组合分别作为引物对，使用PrimeStarMaxDNA聚合酶(宝生物工程公司制造)和附带的缓冲液分别进行PCR。将由该PCR得到的两个约0.5kb的PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，并使用Wizard(R)SV Gel and PCR Clean-UpSystem(普洛麦格公司制造)进行提取、纯化。
然后，将两纯化产物作为模板，将由序列号5所示的碱基序列构成的DNA与由序列号8所示的碱基序列构成的DNA作为引物对进行PCR。将所得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，使用Wizard(R)SVGel and PCR Clean-Up System进行提取、纯化，得到约1.0kb的DNA片段。使用限制性内切酶Sse8387I(宝生物工程公司制造)和附带的缓冲液对该DNA片段进行限制性内切酶处理。使用Wizard(R)SV Gel andPCR Clean-Up System对所得到的限制性内切酶处理片段进行提取、纯化。
同时，将之前建立的pESB30事先用Sse8387I进行处理，并与所得到的限制性内切酶处理片段混和，使用连接试剂盒Ver.1(宝生物工程公司制造)进行连接酶反应。利用常规方法用反应产物转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株(东洋纺公司制造)。在含有20μg/ml的卡那霉素的LB琼脂培养基[在1L水中含有10g的胰化蛋白胨(Bactotrypton)(DIFCO公司制造)、5g的酵母浸膏(DIFCO公司制造)、10g的氯化钠、16g的细菌琼脂(Bacto agar)(DIFCO公司制造)，调节至pH7.0的培养基]上培养该菌株，并选择转化株。使用含有20μg/ml的卡那霉素的LB培养基将该转化株培养过夜，利用碱SDS法(分子克隆第3版)从所得到的培养液中制备质粒。将该质粒命名为pDfruKA。
(3)FruKA基因破坏株的建立
使用(2)中制备的质粒pDfruKA，按照Rest等的方法[Appl.Microbiol.Biotech.,52,541(1999)]利用电穿孔法转化谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株，分别选择卡那霉素抗性株。推测在卡那霉素抗性株中，pDfruKA通过Campbell型同源重组整合到各菌株的染色体上。在这样的菌株中，本来存在于染色体上的编码FruKA的DNA和pDfruKA上的fruKA被破坏的结构的DNA在染色体上相邻存在，在它们之间容易发生第二次同源重组。
sacB所编码的果聚糖蔗糖酶会将蔗糖转变为自杀底物，因此，具有sacB的微生物无法在含有蔗糖的培养基中生长。但是，在本来存在于染色体上的FruKA基因的周围区域与pDFruKA上的FruKA基因被破坏的结构的DNA之间发生第二次同源重组的菌株中，任一DNA与sacB同时缺失，因此，即使在含有蔗糖的培养基中也能够生长。这样，能够获得本来存在于宿主微生物的染色体上的FruKA基因缺失的微生物。
利用该性质，将上述转化株涂布到Suc琼脂培养基[在1L水中含有100g的蔗糖、7g的肉浸膏、10g的蛋白胨、3g的氯化钠、5g的酵母浸膏(DIFCO公司制造)和15g的细菌琼脂(DIFCO公司制造)，调节至pH7.2的培养基]上，在30℃下培养一天，选择生长的菌落。
将这样得到的菌落接种到以果糖为单一碳源的培养基[在1L水中含有氯化铵4g、磷酸二氢钾1g、磷酸氢二钾3g、尿素2g、生物素100mg、盐酸硫胺素5mg、烟酸5mg、七水合硫酸铁10mg、七水合硫酸锌1mg、五水合硫酸铜0.2mg、五水合硫酸锰1mg、氯化钙10mg、果糖10g、硫酸镁0.4g和15g的细菌琼脂(DIFCO公司制造)，制备成pH7.2的培养基]上，获得生长变差或者无法生长的菌落，并命名为WTΔfruKA株。
(4)FruA基因破坏株的建立
利用与FruKA基因的破坏同样的方法，也建立谷氨酸棒状杆菌ATCC13032菌株(以下称为WT株)的仅FruA基因被破坏的菌株作为对照。
用于破坏FruA基因的质粒的建立以与FruKA基因破坏株的建立时同样的方式进行，但引物对使用由序列号9和序列号10所示的碱基序列构成的DNA代替由序列号6和序列号7所示的碱基序列构成的DNA。
将这样建立的菌株接种到以果糖为单一碳源的培养基上，并将生长变差或者无法生长的菌落命名为WTΔfruA株。
(5)WTΔfruKA株、WTΔfruA株的评价
将获得的WT株、WTΔfruA株、WTΔfruKA株接种到装有加入了6g碳酸钙的300ml的种子培养基(在1L水中含有葡萄糖60g、玉米浆5g、硫酸铵80g、磷酸氢二钾12g、七水合硫酸镁4g、七水合硫酸铁40mg、五水合硫酸锰20mg、硫酸铜2mg、六水合氯化镍2mg、六水合氯化钴2mg、二水合氯化钙200mg、四水合七钼酸六铵40mg、β-丙氨酸40mg、烟酸40mg、盐酸硫胺素40mg、生物素0.4mg，并调节到pH7.2的培养基)的2L三角烧瓶中，在28℃下培养24小时。将100ml该种子培养液接种到加入了1150ml的主培养培养基(在1L水中含有葡萄糖60g、玉米浆5g、硫酸铵80g、磷酸氢二钾12g、七水合硫酸镁4g、七水合硫酸铁40mg、五水合硫酸锰20mg、硫酸铜2mg、六水合氯化镍2mg、六水合氯化钴2mg、二水合氯化钙200mg、七钼酸六铵40mg、β-丙氨酸40mg、烟酸40mg、盐酸硫胺素40mg、生物素0.4mg的培养基)的发酵罐中，在33℃下进行培养。培养在用氨水调节pH使其保持为6.7下进行。在葡萄糖耗尽的时刻结束培养，计算该时刻的培养时间。
结果如表1所示，在FruKA基因被破坏的WTΔfruKA株中，糖消耗速度快。
表1
将起始为6%的葡萄糖完全消耗的时间及其菌体量
菌株 消耗时间(小时) OD
WT 13.5 65.3
WTΔfruKA 11.5 64.2
WTΔfruA 13.5 64.4
实施例2
L-精氨酸的制造
如表1所示，通过破坏野生株FruKA基因可以得到糖消耗提高的效果，因此，为了确认在有用物质的制造中的应用，建立L-精氨酸生产菌RB2631菌株(WO2006/035831)的FruKA基因缺陷株，考查其L-精氨酸生产能力。
通过与实施例1中记载的方法同样的方法，建立作为RB2631菌株的FruKA基因缺陷株的RB2631ΔfruKA株、和作为FruA基因缺陷株的RB2631ΔfruA株。
在与实施例1中记载的条件同样的条件下、在发酵罐中培养这些菌株。其中，将培养温度设定为37℃。
结果如表2所示，在FruKA基因被破坏的RB2631ΔfruKA株中，糖消耗速度快、并且L-精氨酸生产率高。
表2
将起始为6%的葡萄糖完全消耗的时间及其滴定量
菌株 消耗时间(小时)OD L-精氨酸(g/L)
RB2631 1184.6 1.57
RB2631ΔfruKA 974.4 2.05
RB2631ΔfruK 1579.8 1.59
实施例3
使用L-赖氨酸生产菌的研究
建立具有与L-精氨酸不同的生物合成途径的氨基酸即L-赖氨酸的生产菌、AHP-3菌株(FERMBP-7382)的FruKA基因和FruA基因缺陷株，并考查其L-赖氨酸生产率。
通过与实施例1中记载的方法同样的方法，建立作为AHP-3菌株的FruKA基因缺陷株的AHP-3ΔfruKA株、和作为FruA基因缺陷株的AHP-3ΔfruA株。
在与实施例1中记载的条件同样的条件下、在发酵罐中培养这些菌株。
结果如表3所示，在FruKA基因被破坏的AHP-3ΔfruKA株中，糖消耗速度快、并且L-赖氨酸生产率高。
表3
将起始为6%的葡萄糖完全消耗的时间及其滴定量
菌株 消耗时间(小时)OD L-赖氨酸(g/L)
AHP-3 1125.7 9.9
AHP-3ΔfruKA 9.526.7 12.8
AHP-3ΔfruK 14.523.2 11.6
产业上的可利用性
根据本发明，能够使用发酵法高效地制造目标物质。
序列表自由文本
序列号5-人工序列的说明：合成DNA
序列号6-人工序列的说明：合成DNA
序列号7-人工序列的说明：合成DNA
序列号8-人工序列的说明：合成DNA
序列号9-人工序列的说明：合成DNA
序列号10-人工序列的说明：合成DNA
Figure IDA00003644558400011
Figure IDA00003644558400021
Figure IDA00003644558400031
Figure IDA00003644558400041
Figure IDA00003644558400051
Figure IDA00003644558400071
Figure IDA00003644558400081
Figure IDA00003644558400091
Figure IDA00003644558400101
Figure IDA00003644558400111
Figure IDA00003644558400121
Figure IDA00003644558400131
Figure IDA00003644558400141
Figure IDA00003644558400151

Claims (6)

1.一种目标物质的制造方法，其特征在于，在培养基中培养与果糖摄取相关的PTS系统蛋白的活性低于亲本株或丧失、并且能够生产目标物质的棒状杆菌(Coryneform bacterium)，使该目标物质在培养物中生成并蓄积，并从该培养物中收集该目标物质。
2.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于，与果糖摄取相关的PTS系统蛋白的活性低于亲本株或丧失、并且能够生产目标物质的棒状杆菌，是通过在位于亲本株的染色体DNA上的编码该蛋白质的基因中引入碱基的缺失、置换或添加从而该蛋白质的活性低于亲本株或丧失的棒状杆菌。
3.如权利要求1或2所述的制造方法，其特征在于，与果糖摄取相关的PTS系统蛋白是包含FruK蛋白和FruA蛋白的蛋白质。
4.如权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其特征在于，棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
5.如权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其特征在于，目标物质为氨基酸、肽或蛋白质。
6.如权利要求1～5中任一项所述的制造方法，其特征在于，氨基酸为选自由L-赖氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-苏氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-瓜氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-鸟氨酸、L-甲硫氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺和甘氨酸构成的组的氨基酸。
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