JP2003503064A

JP2003503064A - 炭素同化の調節

Info

Publication number: JP2003503064A
Application number: JP2001506844A
Authority: JP
Inventors: ピー．ジョンラヤパチ，; コレイエム．クラフトン，
Original assignee: アーカー−ダニエルズ−ミッドランドカンパニー
Priority date: 1999-06-29
Filing date: 1999-06-29
Publication date: 2003-01-28
Also published as: CA2377488A1; WO2001000852A1; MXPA01013445A; KR20020015708A; AU4720999A; EP1196611A1; CN1373810A

Abstract

(57)【要約】本発明は、二酸化炭素の同化を改善することによって、微生物の生産性を増加させる方法を提供する。詳細には、本発明は、活性化にアセチル補酵素Ａを必要とせず、かつアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対して減感作されている、ホスホエノールピルビン酸活性を有するポリペプチド、およびこのポリペプチドをコードする遺伝子を提供する。アセチルＣｏＡまたはアスパラギン酸によって調節されないＰＥＰカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、３炭素中間体ＰＥＰから４炭素中間体ＯＡＡへの炭素のフローを改善し得、ＯＡＡ由来の化合物に寄与し得、そしてアミノ酸生合成を増加させ得る。本発明はさらに、これらの遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子、これらの遺伝子で形質転換された細菌、そしてその形質転換された細菌を使用してアミノ酸を産生する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）（発明の分野）本発明は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプ
チド（これは、活性化のためにアセチル補酵素Ａを必要としない）に関し、そし
てアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対して、およびこのポリペプチド
をコードする遺伝子に対して減感作されている。本発明はまた、これらの遺伝子
を含む組換えＤＮＡ分子、これらの遺伝子で形質転換された細菌、および形質転
換された細菌を使用してアミノ酸を産生する方法に関する。

【０００２】（関連分野）ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．３
１）は、ほとんど全ての細菌またはほとんど全ての植物において見出される酵素
である。ＰＥＰカルボキシラーゼは、３炭素解糖系中間体ＰＥＰと二酸化炭素と
の間の濃縮反応を触媒し、４炭素オキサロ酢酸（ＯＡＡ）（トリカルボン酸（Ｔ
ＣＡ）サイクルおよびＬ−アスパラギン酸生合成に共通の代謝中間体）の形成を
生じる。ＴＣＡサイクルは、アミノ酸生合成のために回収されたその中間体を交
換するために、連続的なＣ４分子の補充を必要とし、そしてＯＡＡをＴＣＡサイ
クルに提供する際に補充の役割を演じることによって、ビオチン独立性のＰＥＰ
カルボキシラーゼは、この機能を履行を補助する。

【０００３】ＯＡＡは、細胞の代謝産物（例えば、アミノ酸、特にグルタミン酸ファミリー
（すなわち、グルタミン酸、アルギニンおよびプロリン）、およびアスパラギン
酸ファミリー（すなわち、アスパラギン酸、リジン、メチオニン、スレオニンお
よびイソロイシン））の生産のための重要な基質である。ＯＡＡの形成を生じる
反応を触媒することによって、ＰＥＰカルボキシラーゼは、代謝プロセスによっ
て有機酸を提供する際に、重要な役割を果たす。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ
ｃｏｌｉによるグルコースからのコハク酸の発酵産物は、ＰＥＰカルボキシラ
ーゼの過剰発現によって有意に増加した。例えば、Ｍｉｌｌａｒｄ，Ｃ．ら、Ａ
ｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：１８０８−１８１０（１
９９６）を参照のこと。従って、ＰＥＰカルボキシラーゼはまた、グルタミン酸
およびアスパラギン酸から形成されるアミノ酸の生成に重要な役割を果たす。

【０００４】そのアミノ酸は、タンパク質の構成成分として、細胞中に普遍的に存在する化
合物である。しかし、経済的なエネルギー代謝および基質代謝のために、その生
産は、厳密に制御される。この制御は、原則的にフィードバック制御であって、
そこで、その代謝経路の最終産物は、その経路の初期の工程を触媒する酵素の活
性を阻害する。ＰＥＰカルボキシラーゼはまた、その活性を発現する際に、種々
の調節を起こす。

【０００５】例えば、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
属またはＥｓｃｈｅｒｃｈｉａ属に属する微生物のＰＥＰカルボキシラーゼの場
合では、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性は、アスパラギン酸によって阻害される。
例えば、Ｍｏｒｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８：１６２１−１６３０（
１９８５）；Ｏ’Ｒｅｇａｎ，Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ７７：２３７−２５１（１９
８９）を参照のこと。従って、ＰＥＰカルボキシラーゼが関与する上述のアミノ
酸生合成はまた、アスパラギン酸によって阻害される。しかし、アスパラギン酸
に対して減少した感受性を有するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ微生物由来の
ＰＥＰカルボキシラーゼ活性が、記載されている。Ｅｉｋｍａｎｎｓ，Ｂ．Ｊ．
ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８：３３０−３３９（１９８９）を参照
のこと。

【０００６】アスパラギン酸によってアロステリックに阻害されることに加えて、アセチル
補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）は、例えば、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌ
ａｖｕｍおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ由来のＰＥＰカルボキシラー
ゼのアロステリック活性化因子である。Ｍｏｒｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．９８：１６２１−１６３０（１９８５）；Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．８１：１４７３−１４８５（１９７７）を参照のこと。アスパラ
ギン酸またはアセチルＣｏＡによって調節されない他の生物由来のＰＥＰカルボ
キシラーゼが、報告されている。Ｖａｌｌｅ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｉｎｄｕｓ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．１７：４５８−４６２（１９９６）；Ｏ’Ｒｅｇａｎ，Ｍ．ら、
Ｇｅｎｅ７７：２３７−２５１（１９８９）；Ｖａｎｃｅ，Ｃ．ら、Ｐｌａｎ
ｔＰｈｙｓｉｏｌ．７５：２６１−２６４（１９８４）を参照のこと。

【０００７】アナプレロティック酵素であるＰＥＰカルボキシラーゼは、ＯＡＡの最適プー
ルの維持にとって重要であり、そして結果的にＯＡＡに由来するアミノ酸の生合
成レベルを決定するので、発酵によってアミノ酸生成を改善する１つの方法は、
対応するｐｐｃ遺伝子を操作することであり得る。Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ由来のｐｐｃ遺伝子の増幅は、プロリンおよ
びスレオニンの生産を改善することが示されている。Ｓａｎｏ，Ｋ．ら、Ａｇｒ
ｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１：５９７−５９９（１９８７）を参照のこと。

【０００８】アミノ酸発酵における効率的な生産についての種々の技術が、フィードバック
制御に対して非感受性であるように変換された変異体株を使用して、開発されて
きた。しかし、アスパラギン酸ファミリーまたはグルタミン酸ファミリーのアミ
ノ酸の発酵産生のための植物に由来するＰＥＰカルボキシラーゼを利用する報告
も、ＰＥＰカルボキシラーゼがアセチルＣｏＡまたはアスパラギン酸によって実
質上調節されない、同一ファミリーのアミノ酸の発酵産生のために微生物染色体
ＤＮＡに組み込まれるｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のｐｐｃ
遺伝子を利用する報告も全くない。

【０００９】米国特許第４，７５７，００９号（Ｓａｎｏら；ＡｊｉｎｏｍｏｔｏＣｏｍ
ｐａｎｙ）は、プラスミドに作動可能に挿入されたＰＥＰカルボキシラーゼをコ
ードする遺伝子を有するプラスミドを含む組換えＤＮＡ分子を保有するＣｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を培養培地で
培養することおよび培養培地からアミノ酸を単離することを含む発酵によって、
アミノ酸を産生するためのプロセスを開示する。ここで、その遺伝子は、ＰＥＰ
カルボキシラーゼ遺伝子を保有するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株またはＢ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ株から単離された染色体遺伝子であり、そしてアミ
ノ酸をコードする染色体遺伝子を有する。ＰＥＰカルボキシラーゼをコードする
遺伝子が単離されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株またはＢｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ株は、アスパラギン酸によって弱められたフィードバック阻害を示
す株である。

【００１０】欧州特許第３５８，９４０号（Ｂａｃｈｍａｎｎら；ＤｅｇｕｓｓａＡｋｔ
ｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ）は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌ
ｕｔａｍｉｃｕｍＤＭ５８−１（これは、ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎ
ｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）ｕｎｄｅｒＤＭＳ
４６９７に寄託されている）に導入されたプラスミドｐＤＭ６を開示し、ここで
、このプラスミドは、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質の産生を
コードする情報を含む遺伝子配列を含むプラスミドである。ｐｐｃ遺伝子は、Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２
のゲノムバンクより単離され、そしてそのＰＥＰカルボキシラーゼは、アセチル
ＣｏＡによって刺激されない。また、プラスミドｐＤＭ６を含むＣｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ株またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ株に属する宿主細菌を
、適切な培地において培養することを含む、発酵によるＬ−リジン、Ｌ−スレオ
ニン、およびＬ−イソロイシンの生産方法が開示され、およびその培地からＬ−
アミノ酸を回収する方法が開示される。

【００１１】米国特許第５，８７６，９８３号（Ｓｕｇｉｍｏｔｏら；Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ
Ｃｏｍｐａｎｙ）は、以下の工程；３−ブロモピルビン酸、アスパラギン酸−
β−ヒドラジドおよびＤＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸からなる群
から選択される野生型ＰＥＰカルボキシラーゼインヒビターの存在下で、Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ微生物を増殖させることによってアスパラギン酸によるフィー
ドバック阻害に対して減感作された変異体ＰＥＰカルボキシラーゼをコードする
ＤＮＡ配列を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の微生物を選択する工程を含み；適
切な培地で、変異体ＰＥＰカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列で形質転換
したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌またはＣｏｒｙｎｅｆｏｒｍ属の細菌の微生
物を培養する工程；およびＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−
イソロイシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニンおよびＬ−プロリンからなる
群より選択されるアミノ酸をその培地から分離する工程、を包含するアミノ酸を
産生する方法を開示する。

【００１２】組換えＤＮＡ技術によってアミノ酸産生細菌を培養する多数の例が存在するが
、必ずしも高いレベルのアミノ酸生産性が達成されない。従って、高い力価およ
び生産性での発酵によるアミノ酸産生方法の必要性がなお、存在し続ける。実質
上アセチルＣｏＡまたはアスパラギン酸によって調節されていないＰＥＰカルボ
キシラーゼは、３炭素中間体ＰＥＰから４炭素中間体ＯＡＡへの炭素移動を改善
し得る。その増加した移動は、ＯＡＡに由来する化合物に寄与し得、そしてアミ
ノ酸生合成を増加し得る。

【００１３】（発明の要旨）従って、本発明は、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコー
ドする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントに関し、ここで、その遺伝子は、宿主微
生物での発現が可能であり、そしてそのポリペプチドは、アセチルＣｏＡの活性
化に必要でなく、そしてアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対して減感
作されている。

【００１４】本発明はまた、プラスミドおよびプラスミドに作動可能に挿入されるＰＥＰカ
ルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換えＤＮ
Ａ分子に関し、ここで、この組換えＤＮＡ分子は、増幅可能であって、そしてそ
の遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属お
よびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属を含む宿主微生物で発現可能であり、かつ
ここで、このポリペプチドは、活性化にアセチルＣｏＡを必要とせず、そしてア
スパラギン酸によるフィードバック阻害に対して減感作されている。

【００１５】本発明はさらに、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコード
する遺伝子を含むＤＮＡフラグメントで形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属
に属する宿主微生物に関し、ここで、この遺伝子は、単子葉植物綱または双子葉
植物綱に属する植物に由来するか、またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属ま
たはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物に由来し、ここで、このポ
リペプチドは、活性化にアセチルＣｏＡを必要とせず、そしてアスパラギン酸に
よるフィードバック阻害に対して減感作されており、そして、ここで、このＤＮ
Ａフラグメントで形質転換された宿主微生物は、この遺伝子を発現する。

【００１６】本発明の別の局面において、発酵によってアミノ酸を生成する方法が提供され
る。この方法は、適切な培地で、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する宿主微生物を
培養する工程、および培養培地からアミノ酸を単離する工程を包含し、ここで、
宿主微生物は、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする
遺伝子を含むＤＮＡフラグメントで形質転換されており、ここで、宿主微生物は
、その遺伝子を発現し、そして、ここで、そのポリペプチドは、活性化にアセチ
ルＣｏＡを必要とせず、そしてアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対し
て減感作されている。

【００１７】さらに、本発明は、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコー
ドする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを選択する方法であって、ここで、この
ポリペプチドは、活性化にアセチルＣｏＡを必要とせず、そして、アスパラギン
酸によるフィードバック阻害に対して減感作されている、方法に関し、ＰＥＰを
ＯＡＡに変換する速度を増加させる方法に関し、発酵プロセスにおける炭素の再
循環する方法に関し、ビオチンを必要としない発酵プロセスにおいて炭素を同化
させる方法に関し、発酵プロセス中で有機酸の生産を増加させる方法に関し、そ
して発酵プロセス中のアミノ酸生産を増加させる方法に関する。

【００１８】（好ましい実施形態の詳細な説明）本発明を詳細に記述する前に、本明細書中で使用されるいくつかの用語が定義
される。

【００１９】本明細書中で使用される「活性化因子」とは、第一に活性となるポリペプチド
に必要な基質および活性を単に強化させる基質の両方を含む。

【００２０】本明細書中で使用される「アミノ酸」とは、天然に存在するＬアミノ酸（アラ
ニン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、シスチン、グルタミン酸、
グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオ
ニン、プロリン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チ
ロシン、およびバリン）についていう。

【００２１】「キメラ遺伝子」とは、異質な調節およびコード配列を含む遺伝子をいう。こ
れは、組換えＤＮＡ技術によって産生されるハイブリッド遺伝子である。

【００２２】「ＤＮＡフラグメント」とは、デオキシリボ核酸分子の一部をいう。

【００２３】本明細書中で使用される「発現」とは、遺伝子によってコードされるタンパク
質産物の生成を意味することが意図される。

【００２４】「遺伝子」とは、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントをいい、コー
ド領域の前の（５’非コード領域）調節配列およびコード領域の後の（３’非コ
ード領域）調節配列を含む。これは、発現の制御（すなわち、転写および翻訳）
、ならびに別個のポリペプチドを与えるために転写および翻訳されるコード配列
を担う調節ＤＮＡ配列を含む分散した染色体領域である。

【００２５】「宿主微生物」とは、導入された遺伝物質で形質転換されている微生物を意味
する。

【００２６】「阻害」とは、そのポリペプチドの活性の減少と活性の完全な欠如の両方を含
む。

【００２７】「単離された」とは、本明細書中で使用される場合、その物質が、その元来の
環境（例えば、その物質が天然に存在する場合は天然の環境）から取り出されて
いることを意味する。

【００２８】「ポリペプチド」または「タンパク質」とは、本明細書中で使用される場合、
アミド結合（ペプチド結合としても公知）により直線状に連結されたモノマー（
アミノ酸）から構成される、分子をいう。この語は、アミノ酸の分子鎖を示し、
そしてその生成物の特定の長さは言及しない。従って、ペプチド、オリゴペプチ
ドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はまた、そ
のポリペプチドの発現後修飾（例えば、グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｏｌａｔｉ
ｏｎ）、アセチル化、リン酸化など）をいうことが意図される。組換えポリペプ
チドまたは誘導ポリペプチドは、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されない
。これらはまた、任意の様式（化学合成または組換え発現系の発現を含む）にて
産生され得る。

【００２９】「調節配列」とは、コード配列上流（５’）、コード配列内、および／または
コード配列下流（３’）に位置するヌクレオチド配列であって、おそらく細胞の
タンパク質生合成装置とともに、そのコード配列の転写および／または発現を制
御する。

【００３０】「合成ＤＮＡ」とは、全体または部分的に化学合成法により生成された、核酸
分子をいう。

【００３１】本明細書中で「形質転換」とは、宿主細胞ゲノムＤＮＡの一部または独立した
分子のいずれかとして、宿主細胞に外来遺伝子およびその遺伝的に安定な形質を
移入することをいう。

【００３２】本発明の１つの局面において、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性を有するポリペプ
チドをコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントであって、その遺伝子が宿主
微生物にて発現され得、そしてそのポリペプチドは活性化のためにアセチル−Ｃ
ｏＡを必要とせず、そしてアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対して減
感作されている、ＤＮＡフラグメントが提供される。

【００３３】酵素ＰＥＰカルボキシラーゼをコードするｐｐｃ遺伝子は、任意のｐｐｃ遺伝
子であり得るが、ただし、それは、単子葉植物（Ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎａ
ｅ）綱または双子葉植物（Ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎａｅ）綱に属する植物あるい
はＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に
属する微生物のＰＥＰカルボキシラーゼをコードする遺伝子であり、そして発現
されるポリペプチドが活性化にアセチル−ＣｏＡを必要とせず、そしてアスパラ
ギン酸によるフィードバック阻害に対して実質的に減感作されている。このｐｐ
ｃ遺伝子は、好ましくは、その塩基配列について決定されておりそしてクローニ
ングされている。そのｐｐｃ遺伝子がクローニングされていない場合、その遺伝
子を含むＤＮＡフラグメントが、ＰＣＲ法などを使用して増幅および単離され得
、その後適切なベクターを使用してクローニングが達成される。ｐｐｃ遺伝子の
好ましいドナーは、アスパラギン酸による弱まったフィードバック阻害を示す株
である。このような株は、アスパラギン酸拮抗阻害剤に対して耐性であると認識
される。

【００３４】ＰＥＰカルボキシラーゼは、Ｃ₄植物における光合成の主要酵素である。ＰＥ
Ｐカルボキシラーゼは、葉肉細胞の細胞質に特異的に局在し、そしてリン酸化／
脱リン酸化プロセスにより調節される。Ｇｉｇｌｉｏｌｏ−Ｇｕｉｖａｒｃ’ｈ
，Ｎ．ら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ２３：２４１〜２４９（１９９６）を参照のこ
と。さらに、ＰＥＰカルボキシラーゼは、マメ科植物根粒における共生Ｎ₂固定
の間のＣＯ₂の同化において重要な役割を果たす。Ｐａｒｔｈｉｒａｎａ，Ｓ．
ら、ＰｌａｎｔＪ．１２：２９３〜３０４（１９９７）を参照のこと。

【００３５】１つの実施形態において、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチド
をコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントが、単子葉植物綱または双子葉植
物綱に属する植物に由来する。好ましい実施形態において、このＤＮＡフラグメ
ントは、アルファルファ植物に由来する。最も好ましくは、このＤＮＡフラグメ
ントは、Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａ株に由来する。

【００３６】Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａ株からのＰＥＰカルボキシラーゼ活性は、Ｌ
−アスパラギン酸により実質的には阻害されなかったことが示されている。Ｖａ
ｎｃｅ，Ｃ．Ｐ．ら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．７５：２６１〜２６４（１
９８４）を参照のこと。さらに、Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａ由来のネイテ
ィブのｐｐｃヌクレオチド配列は公知であり（Ｐａｔｈｉｒａｎａ，Ｓ．ら、Ｐ
ｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ２０：４３７〜４５０（１９
９２））、そして配列番号１にて提供され、そしてそれによりコードされるネイ
ティブＰＥＰカルボキシラーゼのアミノ酸配列は、配列番号２にて提供される。
これらの配列は公知であるので、このヌクレオチド配列に基づいてプライマーが
設計され得、そして合成され得、次いでその遺伝子が、テンプレートとしてメッ
センジャーＲＮＡを使用して、ＰＣＲにより得られ得る。

【００３７】植物ＰＥＰカルボキシラーゼの翻訳後調節が、例えば、このタンパク質のリン
酸化を介して達成される。Ｊｉａｏ，Ｊ．Ａ．ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．２６９：５２６〜５３５（１９８９）；Ｄｕｆｆ，Ｓ．Ｍ．ら
、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２８：９２〜９５（１９９５）を参照のこと
。アルファルファＰＥＰカルボキシラーゼは、いくつかの保存配列を含み、その
１つはリン酸化に関与すると提唱されている（ＭＡＳＩＤＡＱＬＲ、残基（８〜
１６）。Ｐａｔｈｉｒａｎａ，Ｓ．Ｍ．ら、ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ２０：４３７〜４５０（１９９２）を参照のこと。

【００３８】別の好ましい実施形態において、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植
物に由来するＰＥＰカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺
伝子を含むＤＮＡフラグメントが、１つ以上のヌクレオチド置換、欠失および／
または挿入により改変される。最も好ましくは、この改変は、以下のアミノ酸配
列をコードするヌクレオチドを欠失することを含む：Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−
Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ。

【００３９】別の実施形態において、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドを
コードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントが、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
属またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物に由来する。好まし
い実施形態において、このＤＮＡフラグメントは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株に由来する。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのネイティブのｐｐｃヌクレオチド配列は、配列番号３に
示される。

【００４０】本発明の活性ＰＥＰカルボキシラーゼ分子におけるアミノ酸の数が変化し得る
こと、そしてＰＥＰカルボキシラーゼ活性および所望の脱調節特徴を有するアル
ファルファ植物またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株由来のすべてのアミノ
酸配列が本発明に含まれると意図されることが、理解されるべきである。保存的
置換によってのみ互いに異なるポリペプチド配列もまた、含まれる。このような
保存的置換は、配列中の所定の位置の１つのアミノ酸を同じ種類の別のアミノ酸
に代えて置換することからなる。そのポリペプチドの生物学的活性を破壊する程
度まではそのポリペプチドを改変しない配列の位置に位置する、１つ以上の非保
存的アミノ酸置換、欠失、および／または挿入もまた、含められる。

【００４１】生じたＰＥＰカルボキシラーゼタンパク質分子の機能的特性に実質的には影響
しないサイレントな変化を生じる、配列に対する改変（例えば、配列中の欠失、
挿入および／または置換）もまた、意図される。例えば、遺伝コードの縮重を反
映するかまたは所定部位での化学的に等価なアミノ酸の生成を生じる、遺伝子配
列における改変が、意図される。

【００４２】従って、本発明は、特定の例示的配列以上のものを包含することが理解される
。提示される改変の各々が十分に当業者の範囲内であり、コードされる生成物の
生物学的活性の保持の決定も同様に、十分に当業者の範囲内である。

【００４３】別の実施形態において、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドを
コードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントは、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
属またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物に由来する不完全Ｐ
ＥＰカルボキシラーゼヌクレオチド配列と単子葉植物綱または双子葉植物綱に属
する植物由来の不完全ＰＥＰカルボキシラーゼヌクレオチド配列とを含む、キメ
ラ遺伝子である。まとめると、その２つの不完全配列が、ＰＥＰカルボキシラー
ゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る完全キメラｐｐｃ遺伝子であって、そ
のポリペプチドが活性化にアセチル補酵素Ａを必要とせずかつアスパラギン酸に
よるフィードバック阻害に対して減感作されている、完全キメラｐｐｃ遺伝子を
形成する。

【００４４】好ましい実施形態において、一方の不完全ＰＥＰカルボキシラーゼヌクレオチ
ド配列は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物に由来し、もう一
方の不完全ＰＥＰカルボキシラーゼヌクレオチド配列は、アルファルファ植物に
由来する。最も好ましくは、一方の不完全ＰＥＰカルボキシラーゼヌクレオチド
配列は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株に由来し、
もう一方の不完全ＰＥＰカルボキシラーゼヌクレオチド配列は、Ｍｅｄｉｃａｇ
ｏｓａｔｉｖａ株に由来する。

【００４５】別の実施形態において、そのＤＮＡフラグメントは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ
）、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡである。ＰＥＰカルボキシラーゼをコードす
る本発明のＤＮＡフラグメントは、種々の様式で容易に入手され得、そのような
様式としては、化学合成、ｃＤＮＡライブラリースクリーニングまたはゲノムラ
イブラリースクリーニング、発現ライブラリースクリーニング、および／または
ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅が挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法お
よびこのようなＤＮＡを単離するために有用な他の方法は、例えば、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ（１９８９））、Ａｕｓ
ｕｂｅｌら編（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓＰｒｅｓｓ（１９
９４））、ならびにＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第１５２巻、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎ
ｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ（１９８７））によって示されている。

【００４６】ｐｐｃ遺伝子の単離は、例えば、以下の方法によって実行され得る。以下の例
は簡明なようにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍを参照するが、Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ属由来の細菌も同様に使用され得ることが、認識されるべきであ
る。第１に、染色体遺伝子が、ｐｐｃ遺伝子を保有するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ株から抽出される（例えば、Ｈ．ＳａｉｔｏおよびＫ．Ｍｉｕｒａ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ７２：６１９（１９６３）の方法を
使用する）。この遺伝子は、適切な制限酵素を用いて切断され、次いでコリネフ
ォルム細菌群またはＥ．ｃｏｌｉにて増幅し得るプラスミドシャトルベクター上
にサブクローニングされる。染色体遺伝子を切断するために、広範な種類の制限
酵素が、切断の程度を制御する（例えば、切断反応の時間、温度などを制御する
）ことによって、使用され得る。制限酵素によるＤＮＡの切断は、当業者に十分
理解されており、本明細書中に詳細に示す必要はない。

【００４７】コリネフォルム細菌群またはＥ．ｃｏｌｉのＰＥＰカルボキシラーゼ欠損変異
体が、生じた組換えＤＮＡで形質転換される。そのようにして得られた形質転換
体は、ベクターＤＮＡおよび／またはレシピエントにより保有される特徴に基づ
いて従来の方法によって、選択および単離され得る。例えば、ＰＥＰカルボキシ
ラーゼ活性を保有するようになる細菌株が単離され、そしてｐｐｃ遺伝子がその
株から単離され得る。

【００４８】上記のような本発明のＤＮＡフラグメントで形質転換された微生物が培養され
、そしてそのＤＮＡ配列が発現された場合、活性化にアセチル−ＣｏＡを必要と
せずかつアスパラギン酸阻害に対して実質的に減感作されている酵素が、得られ
得る。アセチル−ＣｏＡの非存在下および／または存在下でＰＥＰカルボキシラ
ーゼ活性を測定することによって、例えば、その酵素が、アクチベーターとして
アセチル−ＣｏＡを必要とするか否かが明らかになる。酵素反応系において、ア
スパラギン酸の非存在下および／または存在下でＰＥＰカルボキシラーゼ活性を
測定することによって、例えば、そのようして得られた酵素が、アスパラギン酸
により実質的に阻害されるか否かもまた明らかになる。

【００４９】酵素活性の測定のために、分光測定法（Ｙｏｓｈｉｎａｇｅ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．６８：７４７〜７５０（１９７０））などを使用することが可能
である。例えば、酵素アッセイが、その反応が生じている間に連続様式または速
度論的様式で測定される場合、その反応は、吸光度（通常は３４０ナノメーター
での）の減少を追跡することによって、分光光度的に測定され得る。

【００５０】本発明の別の局面において、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチ
ドをコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを選択する方法であって、その
ポリペプチドが活性化にアセチル−ＣｏＡを必要とせずかつアスパラギン酸によ
るフィードバック阻害に対して減感作されている、方法が提供される。この方法
は、ｐｐｃ遺伝子を保有するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株から染色体遺伝
子を抽出する工程、その染色体遺伝子を適切な制限酵素で切断する工程、Ｃｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにて増殖し得るプラスミドベクターとそのｐｐｃ遺伝
子を連結する工程、ｐｐｃ遺伝子およびｐｙｃ遺伝子が非機能性であるＣｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を形質転換する工程、唯一の炭素源としてグルコース
を含む最小培地上で優れた増殖を示す株を単離する工程、ならびにその株からＤ
ＮＡフラグメントを単離する工程、を包含する。

【００５１】ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．１）は、成長の間の生合成の
ために消費されるＯＡＡを、ピルビン酸から補充する重要なアナプレロティック
酵素であり、そして工業的発酵におけるリジンおよびグルタミン酸の製造におい
て使用される。ＰＥＰカルボキシラーゼに加えて、ｐｙｃ遺伝子によってコード
されるビオチン依存性ピルビン酸カルボキシラーゼがＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいてアナプレロティック酵素であることが最
近見出された。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけ
るｐｐｃ遺伝子およびｐｙｃ遺伝子の両方の不活性化は、この微生物をグルコー
スでの生育を不可能にすることをもたらした。Ｐｅｔｅｒｓ−Ｗｅｎｄｉｓｃｈ
，Ｐ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１４４：９１５−２７（１９９８）を参
照のこと。ｐｐｃ遺伝子およびｐｙｃ遺伝子の両方の不活性化によって、複製す
るプラスミドにクローニングされた本発明のｐｐｃ遺伝子を含むＤＮＡフラグメ
ントは、唯一の炭素源としてグルコースを用いる最小培地上での生育を示す株の
能力によって同定され得る。

【００５２】別の実施形態において、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性のインヒビターもまた、
培地に添加され得る。例えば、アスパラギン酸のアナログが添加され得る。この
アナログ化合物は、好ましくは、野生型ＰＥＰカルボキシラーゼを産生するＣｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物に対して増殖阻害作用を示し、上
述の増殖阻害作用は、Ｌ−グルタミン酸またはＬ−アスパラギン酸の存在によっ
て回復され、そしてアナログ化合物は、野生型ＰＥＰカルボキシラーゼ活性を阻
害する。アナログ化合物に対して耐性である株がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ属に属する微生物から選択される場合、アスパラギン酸によるフィードバック
阻害が減感作されたＰＥＰカルボキシラーゼを産生する宿主微生物が得られる可
能性が高い。

【００５３】別の実施形態において、ＯＡＡに由来するアミノ酸の産生の増加を示す株が単
離される。このようなアミノ酸には、アスパラギン酸、リジン、メチオニン、ス
レオニン、およびイソロイシンが挙げられる。さらに、株は、アセチル−ＣｏＡ
の非存在下で最小培地上で生育し得、そしてＰＥＰカルボキシラーゼ活性が測定
され得る。

【００５４】本発明の別の局面において、プラスミドおよびその中に作動可能に挿入された
ＰＥＰカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有す
る組換えＤＮＡ分子が提供され、ここで、この組換えＤＮＡ分子は増殖可能であ
り、そしてこの遺伝子はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ属、およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属を含む宿主微生物中で発現し
得、そしてここで、このポリペプチドは、活性化にアセチル−ＣｏＡを必要とせ
ず、そしてアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対して減感作されている
。

【００５５】本発明において使用されるプラスミドベクターは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍからの
細菌細胞において増殖し得る限りは、任意のベクターであり得る。このベクター
ＤＮＡは、染色体遺伝子の切断のために使用される同じ制限酵素によって切断さ
れるか、または染色体ＤＮＡ切断フラグメントおよび切断されたベクターＤＮＡ
のそれぞれの末端で相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドに連結される。
次いで、このプラスミドベクターおよび染色体遺伝子含有フラグメントは、連結
反応に供される。この方法または任意の他の方法によって遺伝子がセンス方向に
かつ正しいリーディングフレームに挿入されると、その結果、ＰＥＰカルボキシ
ラーゼ酵素は、プラスミドが、細胞の遺伝的機構（ｇｅｎｅｔｉｃｍａｃｈｉ
ｎｅｒｙ）（プラスミドがここに挿入される）によって転写および翻訳される場
合に発現され、この遺伝子は、プラスミドベクターに「作動可能に挿入される」
といわれる。

【００５６】好ましい実施形態において、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチ
ドをコードする遺伝子は、アルファルファ植物に由来する。最も好ましくは、こ
の遺伝子は、Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａ株に由来する。別の好ましい実施
形態において、この遺伝子は、１以上のヌクレオチドの置換、欠失、および／ま
たは挿入によって改変される。最も好ましくは、この改変は、アミノ酸配列：Ｍ
ｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇをコ
ードするヌクレオチドの欠失を含む。

【００５７】本発明の別の局面において、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチ
ドをコードする遺伝子を含有する本発明のＤＮＡフラグメントで形質転換した宿
主微生物が提供される。宿主としては、Ｌ−アミノ酸の製造のために利用される
微生物（例えば、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒａｔｉａ属
、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ属、およびＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属に属する微生
物）が使用され得る。

【００５８】好ましい実施形態において、ｐｐｃ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントは、Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、またはＢｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する宿主微生物において発現される。宿主としては、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、好ま
しくは、Ｌ−リジン産生Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、コリネフォルム
細菌（好ましくは、Ｌ−リジン産生株）などに属する例証的な微生物が存在し得
る。本発明において言及されるコリネフォルム細菌は、胞子形成能を有さない、
好気性グラム陽性抗酸性（ｎｏｎ−ａｃｉｄ−ｆａｓｔ）桿菌である微生物の群
である。この微生物の群には、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌
、これまではＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に分類されてきたが現在はＣｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌として統合されている、Ｂｒｅｖｉｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に
属する細菌に密接に関連するＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌が挙
げられる。

【００５９】１つの実施形態において、ＤＮＡフラグメントが単子葉植物綱または双子葉植
物綱からの植物由来である場合、宿主微生物は、プラスミドおよびそこに作動可
能に挿入されたＤＮＡフラグメントを含む組換えＤＮＡ分子で形質転換され得る
。あるいは、その宿主微生物は、本発明のＤＮＡフラグメントを宿主の染色体Ｄ
ＮＡに組み込むことによって形質転換され得る。

【００６０】好ましくは、ＤＮＡフラグメントは、アルファルファ植物に由来し、そして最
も好ましくは、ＤＮＡフラグメントは、Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａ株に由
来する。別の好ましい実施形態において、植物に由来するＤＮＡフラグメントは
、１以上のヌクレオチドの置換、欠失、および／または挿入によって改変される
。最も好ましくは、この改変は、アミノ酸配列：Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｉｌ
ｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇをコードするヌクレオチドの欠失
を含む。

【００６１】さらに、上記のように、本発明のＤＮＡ配列は、自己複製し得るベクターＤＮ
Ａに挿入され、そして宿主に導入されることが許容可能である。ベクターＤＮＡ
としては、プラスミドベクターが好ましく、そして宿主細胞中で自己複製し得る
プラスミドベクターが最も好ましい。あるいは、ファージＤＮＡのベクターもま
た、利用され得る。

【００６２】遺伝子を含むＤＮＡフラグメントが単子葉植物綱もしくは双子葉植物綱の植物
由来であるか、またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属もしくはＢｒｅｖｉｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物由来である場合、ＤＮＡフラグメントは、例
えば、以下を使用する方法の手段によって宿主微生物の染色体ＤＮＡに組み込ま
れることもまた、許容可能である：トランスポゾン（Ｂｅｒｇ，Ｄ．Ｅ．および
Ｂｅｒｇ，Ｃ．Ｍ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１：４１７（１９８３））、Ｍ
ｕファージ（日本国特許公開番号２−１０９９８５）または相同組換え（Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．（１９７２））。さらに、コリネフォル
ム細菌に本発明のＤＮＡを組み込むために、日本国特許公開番号５−７４９１に
開示されるような温度感受性プラスミドを利用することが可能である。

【００６３】好ましい実施形態において、ＤＮＡフラグメントは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株由来であり、そして宿主微生物の染色体ＤＮ
Ａに組み込まれる。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ染
色体中のｐｐｃ遺伝子に隣接する領域が配列決定された（配列番号３）。本発明
の遺伝子置換ストラテジーに従って、ｐｐｃ遺伝子の染色体コピーは除去され、
そして抗生物質耐性遺伝子マーカーで置換される（図１）。マーカーは、次には
、本発明の改変されたｐｐｃ遺伝子で置換される。

【００６４】この遺伝子置換ストラテジーの独特の設計は、２つの隣接する遺伝子（ｔｐｉ
遺伝子およびｓｅｃＧ遺伝子）の発現を変化させることのない、宿主微生物の染
色体ｐｐｃＤＮＡ配列の完全な除去および新規なｐｐｃ遺伝子の置換を容易に
する。このｔｐｉ遺伝子は、解糖系の酵素であるトリオースリン酸イソメラーゼ
をコードし、そしてｓｅｃＧ遺伝子は、タンパク質搬出に関与する内在性膜タン
パク質であるｓｅｃＧをコードする。

【００６５】この遺伝子置換ストラテジーの設計は、ｐｐｃ遺伝子に隣接するインタクトな
ｔｐｉ遺伝子およびｓｅｃＧ遺伝子の再構成に依存する。４つのオリゴヌクレオ
チドが、ｐｐｃに隣接するＤＮＡ領域をクローニングするために使用され得る：（１）５’ＧＴＴＧＧＴＧＡＧＣＣＡＣＴＧＧＡＡＡＴＣＣＧＴＧ
３’（配列番号４）（２）５’ＧＡＴＧＴＣＡＴＣＧＣＧＴＡＡＡＡＡＡＴＣＡＧＴＣ
３’（配列番号５）（３）５’ＣＡＣＴＧＣＧＣＴＧＣＧＣＡＡＣＴＣＴＡＧＡＴＡＧ
３’（配列番号６）（４）５’ＧＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＴＧＣＣＧＡＡＡＴＣＴＴＧＧ
３’（配列番号７）。

【００６６】本発明の別の局面において、発酵によってアミノ酸を製造する方法が提供され
る。この方法は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
属、またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する宿主微生物を適切な培地中
で培養する工程、および培養培地からアミノ酸を単離する工程を包含し、ここで
宿主微生物は、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする
遺伝子を含むＤＮＡフラグメントで形質転換され、そして宿主微生物がこの遺伝
子を発現し、そしてこのポリペプチドは、活性のためにアセチル−ＣｏＡを必要
とせず、そしてアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対して減感作される
。

【００６７】上述の宿主を培養するための方法は、先行技術におけるアミノ酸を産生する微
生物についての培養方法とは特に異なってはいない。すなわち、炭素源、窒素源
、無機イオン、栄養要求性（ｎｕｔｒｉｅｎｔａｕｘｏｔｒｏｐｈｙ）を満足
する物質、および必要に応じて有機微量栄養素（例えば、アミノ酸、ビタミンな
ど）を含む通常の培地が使用される。

【００６８】炭素源として、炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトースなど
）および有機酸（例えば、酢酸）が使用され得る。窒素源としては、アンモニア
ガス、水性アンモニウム、アンモニウム塩などが使用され得る。無機イオンとし
ては、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、リン酸イオン
などが、必要に応じて、適切に培地に添加される。

【００６９】培養は、好気的条件下で培地のｐＨおよび温度を適切に制御しながら、アミノ
酸の生成および蓄積が実質的に停止するまで実行する。このように培養培地中に
蓄積したアミノ酸を収集するために、通常の方法が適用され得る。例えば、濾過
、限外濾過、遠心分離、または他の公知の手段による細胞の除去後、アミノ酸は
、例えば、細胞を含まない溶液の濃縮およびアミノ酸（またはその塩）の結晶化
によって回収される。あるいは、化合物は、イオン交換クロマトグラフィーによ
って回収され得る。

【００７０】好ましい実施形態において、アミノ酸は、ＯＡＡに由来するアミノ酸（例えば
、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−スレオニン、および
Ｌ−イソロイシン）である。最も好ましくは、アミノ酸はＬ−リジンである。

【００７１】本発明の別の局面において、ＰＥＰのＯＡＡへの転換の速度を増加させる方法
が提供される。この方法は、本発明のＤＮＡフラグメントで宿主微生物を形質転
換する工程を包含する。好ましい実施形態において、宿主微生物は、Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、またはＢｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ属から選択される。

【００７２】ＰＥＰカルボキシラーゼは、ＰＥＰと二酸化炭素との間の縮合反応を触媒して
、ＯＡＡの形成を生じる。アセチル−ＣｏＡまたはアスパラギン酸によって実質
的に調節されていない本発明のＰＥＰカルボキシラーゼは、従って、ＰＥＰのＯ
ＡＡへの転換の速度を増加させる。

【００７３】ＤＮＡフラグメントが単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物由来であ
る場合、形質転換は、例えば組換えＤＮＡ分子の組込みまたは利用によって行わ
れ得る。ＤＮＡフラグメントがＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、またはＢｒ
ｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物由来である場合、宿主微生物は、宿
主微生物の染色体ＤＮＡへの本発明のＤＮＡフラグメントの組込みによって形質
転換される。

【００７４】本発明の別の局面において、発酵プロセスにおける炭素再循環の方法が提供さ
れる。この方法は、本発明のＤＮＡフラグメントで宿主微生物を形質転換する工
程を包含する。好ましい実施形態において、宿主微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ属から選択される。

【００７５】ＴＣＡ回路は、アミノ酸生合成のために回収された中間体を置換するために、
Ｃ₄分子の連続的な補充を必要とする。ＰＥＰカルボキシラーゼは、ＴＣＡ回路
への４炭素ＯＡＡの供給におけるアナプレロテッィクな役割を果たすことによる
この機能の実現を助ける。宿主の微生物を、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性を有す
るポリペプチドをコードする本発明のＤＮＡフラグメントで形質転換することに
よって、これにより炭素を再循環するための方法が提供される。

【００７６】ＤＮＡフラグメントが、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物由来で
ある場合、形質転換は、例えば組換えＤＮＡ分子の組込みまたは利用によって行
われ得る。ＤＮＡフラグメントが、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒ
ｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物由来である場合、宿主の微生物は、
宿主の微生物の染色体ＤＮＡへの本発明のＤＮＡフラグメントの組込みによって
形質転換される。

【００７７】Ｌ−リジンおよびＬ−グルタミン酸は、従来、これらのアミノ酸を産生する能
力を有するＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ属に属するコリネフォルム細菌を使用することによる発酵方法によって工業的
に製造された。これらの方法において、コリネフォルム細菌が、その増殖にビオ
チンを必要とすることが公知である。酵素ＰＥＰカルボキシラーゼは、生物学的
活性のためにビオチンを必要としない。さらに、ＰＥＰカルボキシラーゼの主要
な生理学的役割のうちの１つは、炭素同化によるＴＣＡ回路の補充である。本発
明の脱調節化ＰＥＰカルボキシラーゼは、二酸化炭素の同化を改善する。

【００７８】従って、本発明の別の局面において、ビオチンを必要としない発酵過程におけ
る炭素同化の方法が提供される。この方法は、宿主の微生物を、本発明のＤＮＡ
フラグメントで形質転換する工程を包含する。好ましい実施形態において、この
宿主の微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
属またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属から選択される。

【００７９】ＤＮＡフラグメントが、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物由来で
ある場合、形質転換は、例えば組換えＤＮＡ分子の組込みまたは利用によって行
われ得る。ＤＮＡフラグメントが、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒ
ｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物由来である場合、宿主の微生物は、
宿主の微生物の染色体ＤＮＡへの本発明のＤＮＡフラグメントの組込みによって
形質転換される。

【００８０】アナプレロティックな酵素ＰＥＰカルボキシラーゼは、ＯＡＡの最適なプール
の維持に決定的であり、結果的に、ＯＡＡに由来する有機酸の生合成レベルを決
定する。宿主の微生物を本発明のＤＮＡフラグメントで形質転換することによっ
て、ＯＡＡの産生速度は増大する。それだけで、ＯＡＡに由来する有機酸の産生
は、同様に増大する。

【００８１】従って、本発明のなお別の局面において、発酵過程において有機酸の産生を増
大する方法が提供される。好ましい実施形態において、宿主の微生物は、Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ属から選択される。

【００８２】ＤＮＡフラグメントが、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物由来で
ある場合、形質転換は、例えば組換えＤＮＡ分子の組込みまたは利用によって行
われ得る。ＤＮＡフラグメントが、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒ
ｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物由来である場合、宿主の微生物は、
宿主の微生物の染色体ＤＮＡへの本発明のＤＮＡフラグメントの組込みによって
形質転換される。

【００８３】ＯＡＡは、アミノ酸のような細胞代謝産物の産生についての重要な基質である
。ＯＡＡへのＰＥＰの変換速度を増大することによって、これにより本発明のｐ
ｐｃ遺伝子は、アミノ酸の産生を増大する。従って、本発明の別の局面において
、発酵過程においてアミノ酸の産生を増大する方法が提供される。この方法は、
宿主の微生物を本発明のＤＮＡフラグメントで形質転換する工程を包含する。

【００８４】好ましい実施形態において、宿主の微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属から選
択される。別の好ましい実施形態において、アミノ酸は、Ｌ−アスパラギン酸、
Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンを含む。
最も好ましくは、アミノ酸はＬ−リジンである。

【００８５】ＤＮＡフラグメントが、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物由来で
ある場合、形質転換は、例えば組換えＤＮＡ分子の組込みまたは利用によって行
われ得る。ＤＮＡフラグメントが、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒ
ｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物由来である場合、宿主の微生物は、
宿主の微生物の染色体ＤＮＡへの本発明のＤＮＡフラグメントの組込みによって
形質転換される。

【００８６】本開示において引用されるすべての特許および刊行物は、本発明が属し、そし
て本明細書中にその全体が参考としてすべて援用される当業者の技術レベルを示
す。

【００８７】ここで一般的に本発明を記載してきたが、特別の定めがない限り、例示の目的
で提供され、本発明の限定を意図しない以下の実施例を参照して、本発明はより
容易に理解される。

【００８８】（実施例１）（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉにおける植物ｐｐｃ遺伝子の機能）アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａ）由来のｐｐｃ遺伝子のｃ
ＤＮＡクローン（ＡＰＰＣ）は、機能的ＰＥＰカルボキシラーゼを欠失し、そし
て唯一の炭素源としてグルコースを含むＭ９培地上で増殖できないＥｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａｃｏｌｉ変異体ＣＧＳＣ３５９４において機能的であった。ＡＰＰ
Ｃプラスミド（ｐＭＳ２）で形質転換した場合、Ｅ．ｃｏｌｉ変異体ＣＧＳＣ３
５９４は、唯一の炭素源としてグルコースを含むＭ９培地上で増殖し得た。アル
ファルファＰＥＰカルボキシラーゼのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、それぞ
れ配列番号１および配列番号２に提供される。

【００８９】（実施例２）（アルファルファ由来のｐｐｃ遺伝子は、振盪フラスコにおいてＣｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍにおける増殖刺激を示す）リジン産生Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＢＦ１００における増殖刺激に
対するアルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａ）由来のｐｐｃ遺伝子
の効果を決定した。増殖を６６０ｎｍでの光学濃度として測定し、力価を培地の
リットル当たりのリジンのグラムとして測定し、そして収率を、（リジンのグラ
ム／消費されたグルコースのグラム）×１００として測定した。３０ｍｇ／Ｌの
イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）（誘導物質）が存在した。結
果を、表１に示す：

【００９０】

【表１】

【００９１】（実施例３）（野生型Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株由来のｐｐｃ遺伝子は、リジン産
生Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株の生産性を向上する）ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３
２由来のｐｐｃ遺伝子のｃＤＮＡクローン（ＣＰＰＣ）を、ｐＣＰＰＣプラスミ
ドに挿入した。リジン産生Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃ
ｕｍ株ＢＦ１００を、振盪フラスコにおいてｐＣＰＰＣプラスミドで形質転換し
た場合、生産性が向上した。

【００９２】増殖を６６０ｎｍでの光学濃度として測定し、力価を培地のリットル当たりの
リジンのグラムとして測定し、そして収率を、（リジンのグラム／消費されたグ
ルコースのグラム）×１００として測定した。結果を、表２に示す：

【００９３】

【表２】

【００９４】（実施例４）（野生型およびリジン産生Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株由来のアセチル
ＣｏＡおよびＬ−アスパラギン酸に対する感受性）アセチルＣｏＡおよびＬ−アスパラギン酸に対する異なる感受性を、ＰＥＰカ
ルボキシラーゼ活性によって決定されたように、野生型Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株（ＡＴＣＣ１３０３２）およびリジン産生
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株（ＢＦ１００）由来
の抽出物において観察した。活性単位を、粗抽出物を使用した吸光度の変化（３
４０ｎｍ／分）として分光光度的に測定した。結果を、表３に示す。

【００９５】

【表３】

【００９６】（実施例５）（改変ｐｐｃ遺伝子での染色体ｐｐｃ遺伝子の置換）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ染色体におけるｐｐ
ｃ遺伝子に隣接する領域を配列決定した（配列番号３）。ｐｐｃ遺伝子の染色体
コピーを取り除き、そして抗生物質耐性遺伝子マーカーで置換した（図１）。こ
のマーカーを、今度は本発明の改変ｐｐｃ遺伝子で置換した。この遺伝子置換ス
トラテジーの独特の設計は、２つの隣接する遺伝子の発現の変更を伴わない、宿
主の微生物の染色体ｐｐｃＤＮＡ配列の完全な除去および新規の遺伝子の置換を
容易にする。

【００９７】この遺伝子置換ストラテジーの設計は、ｐｐｃ遺伝子に隣接するインタクトな
ｔｐｉ遺伝子およびｓｅｃＧ遺伝子の再構成に依存する。４つのオリゴヌクレオ
チドを使用して、ｐｐｃに隣接するＤＮＡ領域をクローニングし得る：

【００９８】

【化１】

【００９９】実施例とともに取り上げられた前述の説明を考慮して、当業者は、添付の特許
請求の範囲に規定されるような本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、種
々の手段および実施形態において本発明を実施し得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、遺伝子置換のためのストラテジーの図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13 Ｃ１２Ｒ 1:15） 1:185 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:185） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:185） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:185） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者クラフトン，コレイエム．アメリカ合衆国イリノイ 62526，ディカター，ウエストパーシングロード 1371 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA05 BA07 BA71 BA72 BA73 CA04 DA05 DA06 EA04 GA11 4B050 CC03 DD09 LL05 4B064 AE07 AE10 AE16 AE25 CA02 CA19 CC24 DA01 DA10 4B065 AA22X AA24X AA26X AA89Y AB01 BA02 CA17 CA27 CA41 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポ
リペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントであって、該遺伝子は
、宿主微生物中で発現され得、そして該ポリペプチドは、活性化にアセチル補酵
素Ａを必要とせず、かつアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対して減感
作されている、ＤＮＡフラグメント。
【請求項２】前記ＤＮＡフラグメントが、単子葉植物綱または双子葉植物
綱に属する植物に由来する、請求項１のＤＮＡフラグメント。
【請求項３】前記ＤＮＡフラグメントが、アルファルファ植物に由来する
、請求項２のＤＮＡフラグメント。
【請求項４】前記ＤＮＡフラグメントが、Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖ
ａ株に由来する、請求項３に記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項５】前記ＤＮＡフラグメントが、１以上のヌクレオチド置換、欠
失または挿入によって改変されている、請求項２に記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項６】前記改変が、アミノ酸配列：Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｉｌ
ｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇをコードするヌクレオチドの欠失
を含む、請求項５に記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項７】前記ＤＮＡフラグメントが、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
属またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物に由来する、請求項
１のＤＮＡフラグメント。
【請求項８】前記ＤＮＡフラグメントが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株に由来する、請求項７に記載のＤＮＡフラグメント
。
【請求項９】前記ＤＮＡフラグメントが、宿主微生物の染色体ＤＮＡ内に
組み込まれている、請求項７に記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項１０】前記ＤＮＡフラグメントが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属を含
む宿主微生物において発現される、請求項１に記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項１１】請求項１に記載のＤＮＡフラグメントであって、該ＤＮＡ
フラグメントは、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ属に属する微生物由来の不完全なホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼヌクレオチド配列および単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物
由来の不完全なホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼヌクレオチド配列を
含む、キメラ遺伝子である、ＤＮＡフラグメント。
【請求項１２】前記ＤＮＡフラグメントが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまた
は合成ＤＮＡである、請求項１に記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項１３】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有する
ポリペプチドをコードする遺伝子を含む、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属
する植物由来のＤＮＡフラグメントであって、該遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ属を含む宿主微生物中で発現され得、そして該ポリペプチドは、活性化にアセ
チル補酵素Ａを必要とせず、かつアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対
して減感作されている、ＤＮＡフラグメント。
【請求項１４】前記ＤＮＡフラグメントが、アルファルファ植物に由来す
る、請求項１３に記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項１５】前記ＤＮＡフラグメントが、Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉ
ｖａ株に由来する、請求項１４に記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項１６】前記ＤＮＡフラグメントが、１以上のヌクレオチド置換、
欠失または挿入によって改変されている、請求項１３に記載のＤＮＡフラグメン
ト。
【請求項１７】前記改変が、アミノ酸配列：Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｉ
ｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇをコードするヌクレオチドの欠
失を含む、請求項１６に記載のフラグメント。
【請求項１８】前記ＤＮＡフラグメントが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまた
は合成ＤＮＡである、請求項１３に記載のＤＮＡフラグメント。
【請求項１９】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有する
ポリペプチドをコードする遺伝子を含む、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属また
はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物由来のＤＮＡフラグメント
であって、該遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ属およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属を含む宿主微生物中で発現され
得、該遺伝子は、該宿主微生物の染色体ＤＮＡ内に組み込まれており、そして該
ポリペプチドは、活性化にアセチル補酵素Ａを必要とせず、かつアスパラギン酸
によるフィードバック阻害に対して減感作されている、ＤＮＡフラグメント。
【請求項２０】前記ＤＮＡフラグメントが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株に由来する、請求項１９に記載のＤＮＡフラグメ
ント。
【請求項２１】請求項１９に記載のＤＮＡフラグメントであって、前記宿
主微生物の染色体ｐｐｃ遺伝子を取り除くこと、そしてホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記遺伝子を、該宿
主微生物の染色体ｐｐｃ遺伝子に隣接する２つの遺伝子の発現を変更することな
く挿入することによって、該遺伝子が組み込まれている、ＤＮＡフラグメント。
【請求項２２】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有する
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、活性化にアセチル補酵素
Ａを必要とせず、かつアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対して減感作
されており、そして該ポリペプチドは、請求項１、１３および１９のいずれか１
項に記載のＤＮＡフラグメントによってコードされる、単離されたポリペプチド
。
【請求項２３】組換えＤＮＡ分子であって、該組換えＤＮＡ分子は、プラ
スミドおよび該プラスミド中に作動可動に挿入されたホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含み、Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属およびＢｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ属を含む宿主微生物中で、該組換えＤＮＡ分子は増幅し得、かつ
該遺伝子は発現され得、ここで、該遺伝子は、単子葉植物または双子葉植物に由
来し、そして該ポリペプチドは、活性化にアセチル補酵素Ａを必要とせず、かつ
アスパラギン酸によるフィードバック阻害に対して減感作されている、組換えＤ
ＮＡ分子。
【請求項２４】前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有
するポリペプチドをコードする遺伝子が、アルファルファ植物に由来する、請求
項２３に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項２５】前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有
するポリペプチドをコードする遺伝子が、Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａ株に
由来する、請求項２４に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項２６】前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有
するポリペプチドをコードする遺伝子が、１以上のヌクレオチド置換、欠失また
は挿入によって改変されている、請求項２３に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項２７】前記改変が、アミノ酸配列：Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｉ
ｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇをコードするヌクレオチドの欠
失を含む、請求項２６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項２８】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有する
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、活性化にアセチル補酵素
Ａを必要とせず、かつアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対して減感作
されており、そして該ポリペプチドは、請求項２３に記載のＤＮＡ分子によって
コードされる、単離されたポリペプチド。
【請求項２９】Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する宿主微生物であって、該
微生物は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチ
ドをコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントで形質転換されており、該遺伝
子は、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物に由来し、該ポリペプチド
は、活性化にアセチル補酵素Ａを必要とせず、かつアスパラギン酸によるフィー
ドバック阻害に対して減感作されており、そして該ＤＮＡフラグメントで形質転
換された該宿主微生物は、該遺伝子を発現する、宿主微生物。
【請求項３０】請求項２９に記載の宿主微生物であって、該宿主微生物は
、前記ＤＮＡフラグメントを該宿主微生物の染色体ＤＮＡ内に組み込むことによ
って形質転換されているか、またはプラスミドおよび該プラスミド中に作動可能
に挿入された前記ＤＮＡフラグメントを含む組換えＤＮＡ分子で形質転換されて
いる、宿主微生物。
【請求項３１】前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有
するポリペプチドをコードする遺伝子が、アルファルファ植物に由来する、請求
項２９に記載の宿主微生物。
【請求項３２】前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有
するポリペプチドをコードする遺伝子が、Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａ株に
由来する、請求項３１に記載の宿主微生物。
【請求項３３】前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有
するポリペプチドをコードする遺伝子が、１以上のヌクレオチド置換、欠失また
は挿入によって改変されている、請求項２９に記載の宿主微生物。
【請求項３４】前記改変が、アミノ酸配列：Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｉ
ｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇをコードするヌクレオチドの欠
失を含む、請求項３３に記載の宿主微生物。
【請求項３５】Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する宿主微生物であって、該
宿主微生物において、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有する
ポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントが、該微生物の染色
体ＤＮＡ内に組み込まれており、該ＤＮＡフラグメントは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物に由来し
、該ポリペプチドは、活性化にアセチル補酵素Ａを必要とせず、かつアスパラギ
ン酸によるフィードバック阻害に対して減感作されており、そして該宿主微生物
は、該遺伝子を発現する、宿主微生物。
【請求項３６】前記ＤＮＡフラグメントが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株に由来する、請求項３５に記載の宿主微生物。
【請求項３７】請求項３５に記載の宿主微生物であって、該宿主微生物の
染色体ｐｐｃ遺伝子を取り除くこと、そしてホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記遺伝子を、該宿主微生物の
染色体ｐｐｃ遺伝子に隣接する２つの遺伝子の発現を変更することなく挿入する
ことによって、該遺伝子が組み込まれている、宿主微生物。
【請求項３８】発酵によってアミノ酸を産生する方法であって、該方法は
、以下の工程：（ａ）適切な培地中でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する宿主微生物を培養する
工程；および（ｂ）該培養培地からアミノ酸を単離する工程を包含し、ここで、該宿主微生物（ａ）は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントで形質
転換されており、該宿主微生物（ａ）は、該遺伝子を発現し、そして該ポリペプ
チドは、活性化にアセチル補酵素Ａを必要とせず、かつアスパラギン酸によるフ
ィードバック阻害に対して減感作されている、方法。
【請求項３９】工程（ｂ）において、前記アミノ酸が、Ｌ−アスパラギン
酸、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンを含
む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】工程（ｂ）において、前記アミノ酸が、Ｌ−リジンである
、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】前記ＤＮＡフラグメントが、単子葉植物綱または双子葉植
物綱に属する植物に由来する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】前記ＤＮＡフラグメントが、アルファルファ植物に由来す
る、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】前記ＤＮＡフラグメントが、Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉ
ｖａ株に由来する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】前記ＤＮＡフラグメントが、１以上のヌクレオチド置換、
欠失または挿入によって改変されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】前記改変が、アミノ酸配列：Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｉ
ｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇをコードするヌクレオチドの欠
失を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】前記ＤＮＡフラグメントが、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ属またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物に由来する、請求
項３８に記載の方法。
【請求項４７】前記ＤＮＡフラグメントが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株に由来する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】請求項３８に記載の方法であって、前記ホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子は、Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属す
る微生物由来の不完全なホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼヌクレオチ
ド配列および単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物由来の不完全なホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼヌクレオチド配列を含む、キメラ遺伝子
である、方法。
【請求項４９】前記ＤＮＡフラグメントが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまた
は合成ＤＮＡである、請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】発酵によってアミノ酸を産生する方法であって、該方法は
、以下の工程：（ａ）適切な培地中でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する宿主微生物を培養する
工程；および（ｂ）該培養培地からアミノ酸を単離する工程を包含し、ここで、該宿主微生物（ａ）は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを該宿
主微生物（ａ）の染色体ＤＮＡ内に組み込むことによって形質転換されているか
、またはプラスミドおよび該プラスミド中に作動可能に挿入された該ＤＮＡフラ
グメントを含む組換えＤＮＡ分子で形質転換されており、該宿主微生物（ａ）は
、該遺伝子を発現し、該ＤＮＡフラグメントは、単子葉植物または双子葉植物に
由来し、そして該ポリペプチドは、活性化にアセチル補酵素Ａを必要とせず、か
つアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対して減感作されている、方法。
【請求項５１】工程（ｂ）において、前記アミノ酸が、Ｌ−アスパラギン
酸、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンを含
む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】工程（ｂ）において、前記アミノ酸が、Ｌ−リジンである
、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】前記ＤＮＡフラグメントが、アルファルファ植物に由来す
る、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】前記ＤＮＡフラグメントが、Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉ
ｖａ株に由来する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】前記ＤＮＡフラグメントが、１以上のヌクレオチド置換、
欠失または挿入によって改変されている、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】前記改変が、アミノ酸配列：Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｉ
ｌｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇをコードするヌクレオチドの欠
失を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】発酵によってアミノ酸を産生する方法であって、該方法は
、以下の工程：（ａ）適切な培地中でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する宿主微生物を培養する
工程；および（ｂ）該培養培地からアミノ酸を単離する工程を包含し、ここで、該宿主微生物（ａ）は、ＤＮＡフラグメントを該宿主微生物の染色体
ＤＮＡに組み込むことによって形質転換されており、該ＤＮＡフラグメントは、
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコード
する遺伝子を含み、該宿主微生物（ａ）は、該遺伝子を発現し、該ＤＮＡフラグ
メントは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ属に属する微生物由来し、そして該ポリペプチドは、活性化にアセチル補酵
素Ａを必要とせず、かつアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対して減感
作されている、方法。
【請求項５８】請求項５７に記載の方法であって、前記組み込みプロセス
は、前記宿主微生物の染色体ｐｐｃ遺伝子を取り除くこと、そして前記ＤＮＡフ
ラグメントを、該宿主微生物の染色体ｐｐｃ遺伝子に隣接する２つの遺伝子の発
現を変更することなく挿入することである、方法。
【請求項５９】工程（ｂ）において、前記アミノ酸が、Ｌ−アスパラギン
酸、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−スレオニンおよびＬ−イソロイシンを含
む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】工程（ｂ）において、前記アミノ酸が、Ｌ−リジンである
、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】前記ＤＮＡフラグメントが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株に由来する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有する
ポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを選択する方法であ
って、該ポリペプチドは、活性化にアセチル補酵素Ａを必要とせず、かつアスパ
ラギン酸によるフィードバック阻害に対して減感作されており、該方法は、以下
の工程：（ａ）ｐｐｃ遺伝子を保持するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株から染色体
遺伝子を抽出する工程；（ｂ）該染色体遺伝子（ａ）を適切な制限酵素で切断する工程；（ｃ）該ｐｐｃ遺伝子（ａ）をＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で増幅可能
なプラスミドベクターと連結する工程；（ｄ）該プラスミドベクター（ｃ）で、ｐｐｃ遺伝子およびｐｙｃ遺伝子が不
活化されているＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を形質転換する工程；（ｅ）単一炭素原としてグルコースを含む最小培地上で優れた増殖を示す株を
単離する工程；および（ｆ）該株（ｅ）からホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有す
るポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを単離する工程で
あって、該ポリペプチドは、活性化にアセチル補酵素Ａを必要とせず、かつアス
パラギン酸によるフィードバック阻害に対して感受性がより低い、工程を包含する、方法。
【請求項６３】工程（ｅ）において、ホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼ活性のインヒビターが、前記培地に添加される、請求項６２に記載の方
法。
【請求項６４】工程（ｅ）において、オギザロ酢酸から誘導されるアミノ
酸の産生の増加を示す株を単離する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】工程（ｅ）において、アセチル補酵素Ａの非存在下の最小
培地上で株を増殖させる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】ホスホエノールピルビン酸からオギザロ酢酸への変換の速
度を増加させる方法であって、請求項１、１３および１９のいずれか１項に記載
のＤＮＡフラグメントで宿主微生物を形質転換する工程を包含する、方法。
【請求項６７】発酵プロセスにおいて炭素を再循環する方法であって、請
求項１、１３および１９のいずれか１項に記載のＤＮＡフラグメントで宿主微生
物を形質転換する工程を包含する、方法。
【請求項６８】ビオチンを必要としない発酵プロセスにおいて炭素を同化
する方法であって、請求項１、１３および１９のいずれか１項に記載のＤＮＡフ
ラグメントで宿主微生物を形質転換する工程を包含する、方法。
【請求項６９】発酵プロセスにおいて有機酸の産生を増加させる方法であ
って、請求項１、１３および１９のいずれか１項に記載のＤＮＡフラグメントで
宿主微生物を形質転換する工程を包含する、方法。
【請求項７０】発酵プロセスにおいてアミノ酸の産生を増加させる方法で
あって、請求項１、１３および１９のいずれか１項に記載のＤＮＡフラグメント
で宿主微生物を形質転換する工程を包含する、方法。