MXPA01013445A - Regulacion de la asimilacion de carbono. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona un metodo para incrementar la productividad de un microorganismo al mejorar la asimilacion del dioxido de carbono. Especificamente, la invencion proporciona un polipeptido que tiene actividad de la fosfoenolpiruvato carboxilasa, que no requiere de la acetil coenzima A para la activacion, y esta desensibilizado para la inhibicion de la retroalimentacion por acido aspartico, y a los genes que codifican este polipeptido. Un gen que codifica la PEP carboxilasa que no esta regulado por la acetil-CoA o el acido aspartico, puede mejorar el flujo de carbono a partir de la PEP intermediaria de tres carbones al OAA intermediario de cuatro carbones, contribuye a compuestos derivados de OAA, e incrementa la biosintesis de aminoacidos. La invencion proporciona ademas moleculas recombinantes de ADN que contienen estos genes, bacterias transformadas con estos genes, y un metodo para la produccion de aminoacidos usando las bacterias transformadas.

Description

REGULACIÓN DE LA ASIMILACIÓN DE CARBONO. Campo de la invención Esta invención se refiere a un polipéptido que tiene actividad de la fosfoenolpiruvato carboxilasa, que no 5 requiere a la acetil co-enzima A para la activación, y está desensibilizada para la inhibición de la retroalimentación por el ácido aspártico, y a los genes que codifican este polipéptido. La invención también se refiere a moléculas reco binantes de ADN que contienen 10 estos genes, a las bacterias transformadas con estos genes, y a métodos para la producción de aminoácidos que usan las bacterias transformadas. Antecedentes de la invención. La fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEP) (EC 4.1.1.31) 15 es una enzima que se encuentra entre casi todas las bacterias y casi todas las plantas. La PEP carboxilasa, cataliza la reacción de condensación entre el PEP intermediario glicolítico de tres carbones, y dióxido de carbono que resultan en la formación del oxaloacetato de 20 cuatro carbones (OAA) , un intermediario metabólico común al ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y a la biosíntesis del ácido L-aspártico. El ciclo de TCA, requiere el reemplazo continuo de moléculas C4 con objeto de reemplazar los intermediarios retirados de la 25 biosíntesis de aminoácidos, y al jugar un papel Ref : 135170 t~*áu*??ábi? ?¡káB??? .i i „« _. A __ __ \. -i. . í , t - . anaplerótico en el suministro de la OAA al ciclo de la TCA, la PEP carboxilasa independiente de la biotina ayuda en el cumplimiento de esta función. El OAA, es un substrato muy importante para la 5 producción de metabolitos celulares tales como aminoácidos especialmente la familia del glutamato, esto es, la familia del glutamato, arginina y prolina y la familia del aspartato, esto es aspartato, lisina, metionina, treonina e isoleucina. Al catalizar la 10 reacción que resulta en la formación de OAA, la PEP carboxilasa juega un papel importante en el suministro de ácidos orgánicos por procesos metabólicos. Por ejemplo, la producción fermentativa del ácido succínico a partir de la glucosa por Eschericha coli , se incrementa 15 significativamente por la sobre expresión de la PEP carboxilasa. Ver Millard, C, y colaboradores, Appl. Environ. Microbiol. 62:1808-1810 (1996). De esta manera, la PEP carboxilasa también juega un rol importante en la producción de aminoácidos que se forman del glutamato y 20 del aspartato. El aminoácido es un compuesto que existe universalmente en las células como componentes de las proteínas. Sin embargo, debido al metabolismo económico de la energía y al metabolismo de la sustancia, su 25 producción está estrictamente controlada. Este control es ¡^b^M ^^^m. ? J. ? í Í^_^ ,„_, ^^.^.. , _, . , s - . . , ^ji í^^ principalmente un control de retroalimentación en el cual, el producto final de una trayectoria metabólica inhibe la actividad de una enzima que cataliza una etapa mas temprana de la trayectoria. La PEP carboxilasa también somete diversas regulaciones en la expresión de esta actividad. Por ejemplo, en el caso de la PEP carboxilasa de los microorganismos que pertenecen a los géneros Brevibacterium, Corynebacterium o del género Escherichia , se inhibe la actividad de la PEP carboxilasa por el ácido aspártico. Ver por ejemplo, Morí, M., y colaboradores, J. Biochem. 98:1621-1630 (1985); O'Regan, M., y colaboradores, Gene 77:237-251 (1989). Por lo tanto, la biosíntesis de los aminoácidos arriba mencionados, en los cuales participa la PEP carboxilasa, también se inhibe por el ácido aspártico. Sin embargo, las actividades de la PEP carboxilasa a partir de los microorganismos Corynebacterium, tienen una sensibilidad disminuida al ácido aspártico han sido descritos. Ver Ei amanns, B.J., y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 218:330-339 (1989). Además de estar inhibidos alostéricamente por el ácido aspártico, la acetil co-enzima A (acetil-CoA) es un activador alostérico de la PEP carboxilasa del Brevibacterium flavum y Escherichia coli , por ejemplo. Ver Mori, M., y colaboradores, J. Biochem. 98:1621-1630 (1985); Morikawa, M., y colaboradores, J. Biochem. 81:1473-1485 (1977). Se han reportado PEP carboxilasas de otros organismos que no están reguladas por el ácido aspártico o la acetil CoA. Ver Valle, F. , y colaboradores, J. Indus. Microbiol. 17:458-462 (1996); O'Regan, M., y colaboradores, Gene 77:237-251 (1989); Vanee, C, y colaboradores, Plant Physiol. 75:261-264 (1984) . Ya que la enzima PEP carboxilasa anaplerotica es crítica para el mantenimiento de una acumulación óptima de OAA, y determina consecuentemente los niveles biosintéticos de los aminoácidos que se derivan de la OAA, una forma de mejorar la producción de aminoácidos por fermentación sería manipular el gen correspondiente ppc. Por ejemplo, la amplificación del gen ppc del Brevibacteri um lactofermen tum, ha demostrado mejorar la producción de prolina y treonina. Ver Sano, K. , y colaboradores, Agrie. Biol. Chem. 51:597-599 (1987) . Se han desarrollado diversas técnicas para la producción eficiente en la fermentación de aminoácidos, al usar cepas mutantes convertidas para ser insensibles al control de la retroalimentación. Sin embargo, no ha habido un reporte de uso de la PEP carboxilasa derivada de una planta para la producción fermentativa de aminoácidos del ácido aspártico o familias de ácido .^iißXi ?Ítl glutámico, o de utilizar un gen ppc derivado de una bacteria corineforme que se integra dentro del ADN cromosomal microbiano para la producción fermentativa de aminoácidos de las mismas familias, en las cuales la PEP carboxilasa no se regula substancialmente por la acetil CoA o el ácido aspártico. La patente U.S. No. 4,757,009 (Ssano y colaboradores, Ajinomoto Company), describe un proceso para la producción de un aminoácido por fermentación, el cual comprende el cultivo en un medio de cultivo, de una cepa de Corynebacterium o Brevibacterium que lleva una molécula recombinante de ADN que comprende un plásmido que tienen insertado operacionalmente en el mismo, un gen que codifica a la PEP carboxilasa, en donde el gen es un gen cromosomal aislado de una cepa de Corynejacterium o de Brevibacterium, que lleva un gen de PEP carboxilasa y que tiene un gen cromosomal que codifica un aminoácido, y aisla el aminoácido del medio de cultivo. La cepa de Corynebacteri um o Brevibacterium a partir de la cual el gen que codifica la PEP carboxilasa se aisla, es una cepa que muestra una inhibición de retroalimentación debilitada por el ácido aspártico. La patente europea No.358, 940 (Bachmann y colaboradores, Degussa Aktiengesellschaft) describe un plásmido pDM6 que se introduce dentro de la Corynebacterium glutamicum DM58-1, que se deposita en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) bajo el DSM 4697, en donde el plásmido contiene una secuencia genética que comprende información que codifica la producción de una proteína que tiene una actividad de PEP carboxilasa. El gen ppc, se aisla de un banco genómico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, y la PEP carboxilasa no se estimula por la acetil-CoA. También se describe un método para la producción de L-lisina, L- treonina, y L-isoleucina, por fermentación el cual comprende el cultivo en un medio apropiado, de una bacteria huésped que pertenece al género Corynebacteri um o Brevibacterium, que contiene el plásmido pDM6, y la recuperación del L-aminoácido del medio. La patente U.S. No. 5,876,983 (Sugimoto y colaboradores, Ajinomoto Company) describe un método de producción de un aminoácido, que comprende seleccionar un microorganismo del género Escherichia que contiene una secuencia de ADN que codifica una PEP carboxilasa mutante, desensibilizada para la inhibición de la retroalimentación por ácido aspártico por el crecimiento de organismos de Escherichia , en presencia de un inhibidor de la PEP carboxilasa de tipo silvestre, seleccionado del grupo que consiste de 3-bromopiruvato, ácido aspártico-ß-hidrazida, y ácido DL-treo-ß- S i ¡A tt i í .->-t.. hidroxiaspártico; el cultivo de un microorganismo del género Escherichia o bacterias corineformes transformadas con una secuencia de ADN que codifica una PEP carboxilasa mutante en un medio apropiado; y la separación del medio de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de L-lisina, L-treonina, L-metionina, L-isoleucina, ácido L-glutámico, L-arginina, y L-prolina. Aunque existen muchos ejemplos de cultivo de bacterias que producen aminoácidos por técnicas recombinantes de ADN, los altos niveles de la productividad de aminoácidos no siempre se alcanzan. Por lo tanto, continúa todavía una necesidad de existir un método de producción de aminoácidos por fermentación en altas concentraciones y rendimientos. Una PEP carboxilasa que no se regula substancialmente por el acetil-CoA o el ácido aspártico, puede mejorar el flujo de carbón a partir de la PEP intermediaria de tres carbones hasta la OAA intermediaria de cuatro carbones.' El flujo mejorado puede contribuir a compuestos derivados de OAA, e incrementar la biosíntesis de los aminoácidos. Breve descripción de la invención . De conformidad, la presente invención se refiere a un fragmento de ADN que comprende un gen que codifica un polipéptido que tiene una actividad de PEP carboxilasa, en donde el gen es capaz de expresarse en un microorganismo huésped, y en donde el polipéptido no requiere la acetil-CoA para la activación y se desensibiliza para la inhibición de la retroalimentación por ácido aspártico. 5 La presente invención también se refiere a una molécula recombinante de ADN que comprende un plásmido y un gen que codifica un polipéptido que tiene la actividad de la PEP carboxilasa insertada operacionalmente en el mismo, en donde la molécula recombinante de ADN es capaz de propagarse y el gen es capaz de expresarse en un microorganismo huésped que comprende los géneros Escherichia , Corynebacterium y Brevibacterium, y en donde el polipéptido no requiere la acetil-CoA para la activación y se desensibiliza para la inhibición de la retroalimentación por el ácido aspártico. La presente invención se refiere además a un microorganismo huésped que pertenece al género Escherichia , Corynebacterium y Brevibacterium, transformado con un fragmento de ADN que comprende un gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de PEP carboxilasa, en donde el gen se deriva de una planta que pertenece a la clase de monocotiledóneas, o dicotiledóneas, o a partir de un microorganismo que pertenece a los géneros Corynebacterium o _BreviJbacteriu.il, en donde el polipéptido no requiere la acetil-CoA para la activación y está desensibilizado para la inhibición de la retroalimentación por el ácido aspártico, y en donde el microorganismo huésped es transformado con el fragmento de ADN que expresa el gen. En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método de producción de un aminoácido por fermentación. El método comprende el cultivo de un microorganismo huésped que pertenece al género Escherichia , Corynebacterium y Brevibacterium, en un medio apropiado y aislar del medio de cultivo un aminoácido, en donde el microorganismo huésped se transforma con un fragmento de ADN que comprende un gen que codifica un polipéptido que tiene la actividad de la PEP carboxilasa, en donde el microorganismo huésped expresa el gen, y en donde el polipéptido no requiere la acetil-CoA para la activación y se desensibiliza para la inhibición de la retroalimentación por ácido aspártico. Además, la presente invención se 'refiere a un método de selección de un fragmento de ADN, que comprende un gen que codifica a un polipéptido que tiene actividad de la PEP carboxilasa, en donde el polipéptido no requiere la acetil-CoA para la activación y se desensibiliza para la inhibición de la retroalimentación por ácido aspártico, a un método para incrementar la velocidad de conversión de PEP a OAA, a un método para reciclar el carbono en un proceso de fermentación, a un método para asimilar el carbono en un proceso de fermentación, que no requiere biotina, a un método para incrementar la producción de ácidos orgánicos en un proceso de fermentación, y a un 5 método para incrementar la producción de aminoácidos en un proceso de fermentación. Breve descripción de los dibujos. La figura 1 es un diagrama de una estrategia para reemplazo de genes. 10 Descripción detallada de las modalidades preferidas . Antes de describir en detalle la invención, se definirán diversos términos usados en la especificación. "Activador" como se usa aquí, incluye una substancia necesaria para que el polipéptido se vuelva activo en el 15 primer lugar, así como una substancia que meramente acentúa la actividad. Los "aminoácidos" como se usan aquí, se refiere a L- aminoácidos que se presentan naturalmente (alanina, arginina, ácido aspártico, asparagina, cistina, ácido 20 glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, prolina, fenilalanina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina) . El "gen quimérico", se refiere a un gen que comprende secuencias de codificación y regulatorias heterogéneas. Es un gen híbrido producido por tecnología de ADN recombinante. El "fragmento de ADN" se refiere a una fracción de una molécula de ácido dexoxiribonucleico. 5 La "expresión", como se usa aquí, pretende significar la producción de un producto de proteína codificado por un gen. El "gen", se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo 10 secuencias regulatorias precedentes (5' no codificadora) y siguientes (3' no codificadora) a la región de codificación. Es una región cromosomal discreta que comprende secuencias regulatorias de ADN responsables del control de la expresión, esto es, transcripción y 15 traducción, y para una secuencia de codificación que se transcribe y traduce para dar un polipéptido diferente. El "microorganismo huésped", significa un microorganismo que se transforma con e'l material genético introducido. 20 La "inhibición" incluye la reducción de actividad del polipéptido y la carencia completa de actividad también. "Aislado", como se usa aquí, significa que el material se separa de su medio original (por ejemplo el 25 medio natural si se presenta naturalmente) .

^^^¡¡^ "Polipéptido" o "Proteína", como se usa aquí, se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) que se ligan linealmente por enlaces amida (también conocidos como enlaces péptidos) . Indica una 5 cadena molecular de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto. Así, los péptidos, oligopéptidos y proteínas se incluyen dentro de la definición de polipéptidos. Este término también se pretende referir a modificaciones posteriores a la 10 expresión del polipéptido por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Un polipéptido recombinante o derivado no se traduce necesariamente a partir de una secuencia designada de ácido nucleico. Se puede también generar de cualquier 15 manera incluyendo síntesis química o expresión de un sistema de expresión recombinante. Las "secuencias regulatorias" se refieren a secuencias de nucleótidos localizadas en la dirección 5' , dentro y/o en la dirección 3' de una secuencia de 20 codificación, que controla la transcripción y/o expresión de las secuencias codificadoras potencialmente en conjunto con el aparato biosintético de proteína de las células . ¿¡Éuae??&iMhm*mii¡?Éiks?. * . ., .. , ot*,**.» . ________—,„, . - ..... ... . —.. ..— . . ^ __ .^t t t ¡ El "ADN sintético" se refiere a una molécula de ácido nucleico producida en su totalidad o en parte por métodos de síntesis química. La "transformación" se refiere aquí a la transferencia de un gen externo dentro de una célula huésped, ya sea como parte del ADN genómico de la célula huésped o como una molécula independiente, y su herencia genéticamente estable. En un aspecto de la invención, se proporciona un fragmento de ADN que comprende un gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de PEP carboxilasa, en donde el gen es capaz de expresarse en un microorganismo huésped, y en donde el polipéptido no requiere la acetil-CoA para la activación y se desensibiliza para la inhibición de la retroalimentación por ácido aspártico. El gen ppc, que codifica la enzima de PEP carboxilasa, puede ser cualquiera proporcionado que sea un gen que codifica la PEP carboxilasá de una planta que pertenece al tipo de las monocotiledóneas o dicotiledóneas o de un microorganismo que pertenece al género Brevibacterium o Corynebacteri um, y con la condición de que el polipéptido expresado no requiere la acetil-CoA para la activación, y se desensibiliza sustancialmente para la inhibición de la retroalimentación por ácido aspártico. El gen ppc se determina preferiblemente por su secuencia base y se clona. Cuando no ha sido clonado, un fragmento de ADN que contiene el gen se puede amplificar y aislar al usar el método PCR y similares, seguido por el uso de un vector apropiado para lograr el clonado. Los donadores preferidos del gen ppc, son cepas que muestran una retroalimentación disminuida de la inhibición por ácido aspártico. Tales cepas se reconocen como resistentes a los inhibidores antagonísticos del ácido aspártico. La PEP carboxilasa es una enzima clave de la fotosíntesis en la planta C4. Se localiza específicamente en el citosol de células de mesófilos y se regula por un proceso de fosforilación/desfosforilación. Ver Giglioli-Guivarc'h, N., y colaboradores, Cytometry 23:241-249 (1996) . Además, la PEP carboxilasa juega un rol crucial en la asimilación del C02 durante la fijación simbiótica de N2 en nodulos de raíz de legumbre. Ver Pathirana, S., y colaboradores, Plant J. 12:293-304" (1997). En una modalidad, el fragmento de ADN que contiene un gen que codifica un polipéptido que tiene la actividad de la PEP carboxilasa, se deriva de una planta que pertenece a la clase de monocotiledóneas o dicotiledóneas. En una modalidad preferida, el fragmento de ADN se deriva de una planta de alfalfa. Más l?.-?-?. t _____l______<,_.l.^.__l________,_.____„ . __._-. . ..___, . . , . , _._,__,_, _, _.t. Jk**. i ? ,ta preferiblemente, el fragmento de ADN se deriva de una cepa de Medicago sa tiva . También se ha demostrado que la actividad de la PEP carboxilasa de una cepa de Medicago sa tiva , no se inhibe substancialmente por el ácido L-aspártico. Ver Vanee, C.P., y colaboradores, Plant Physol. 75:261-264 (1984). Además, la secuencia de nucleótidos nativa ppc de la Medicagos sa tiva se conoce (Pathirana, S., y colaboradores, Plant Molecular Biology 20:437-450 (1992)) y se proporciona en la SEQ ID NO: 1, y la secuencia de aminoácidos de la PEP carboxilasa nativa codificada por lo cual, se proporciona en la SEQ ID NO: 2. Ya que se conocen estas secuencias, se pueden diseñar los cebadores y sintetizar con base en las secuencias de nucleótidos, y después los genes se pueden obtener por PCR, usando el ARN mensajero como plantilla. Se alcanza la regulación post-traduccional de la PEP carboxilasa de plantas, por ejemplo', a través de la fosforilación de la proteína. Ver Jiao, J.A., y colaboradores, Arch. Biochem Biophys. 269:526-535 (1989); Duff, S.M., y colaboradores, Eur. J. Biochem. 228:92-95 (1995). La PEP carboxilasa de la alfalfa contiene diversas secuencias conservadas una de las cuales se propone estar involucrada en la fosforilación (MASIDAQLR, residuos 8 al 16). Ver Pathirana, S.M., y colaboradores, Plant Molecular Biology 20:437-450 (1992) . En otra modalidad preferida, el fragmento de ADN contiene un gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de PEP carboxilasa, que se deriva de una planta que pertenece a la clase de monocotiledóneas o dicotiledóneas, se modifica por una o más substituciones, eliminaciones y/o inserciones de nucleótidos. Más preferiblemente, la modificación comprende la eliminación de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos: Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln-Leu-Arg. En otra modalidad, el fragmento de ADN que contiene un gen que codifica a un polipéptido que tiene actividad de PEP carboxilasa, se deriva de un microorganismo que pertenece al género Brevibacterium o Corynebacterium . En una modalidad preferida, el fragmento de ADN se deriva de una cepa de Corynebacterium gl utamicum . La secuencia nativa de nucleótidos ppc del Corynebacteri um glutamicum se muestra en la SEQ ID NO: 3. Se entiende que el número de aminoácidos en la molécula activa de PEP carboxilasa de la presente invención puede variar, y que todas las secuencias de aminoácidos derivadas de una planta de alfalfa o de una cepa de Corynebacterium que tienen actividad de PEP carboxilasa y las características deseadas desregulatorias se contemplan como incluyentes en la presente invención. Las secuencias de polipéptidos que difieren una de la otra solamente por substituciones conservadoras se incluyen también. Tales substituciones 5 conservadoras consisten de una substitución de un aminoácidos en una posición dada en la secuencia de otro aminoácido de otra clase. También se incluyen una o más substituciones no conservadoras de aminoácidos, eliminaciones y/o inserciones localizadas en la posiciones de la secuencia que no alteran el polipéptido al grado de que la actividad biológica del polipéptido se destruya. También se contemplan modificaciones a la secuencia, tales como eliminaciones, inserciones, y/o substituciones en la secuencia que producen cambios silentes que no afectan substancialmente las propiedades funcionales de la molécula de proteína de PEP carboxilasa resultante. Por ejemplo, se contemplan una alteración de la secuencia de genes que refleja la degeneración del código genético, o que resulta en la producción de un aminoácido químicamente equivalente en un sitio dado. Por lo tanto se entiende que la invención abarca más de las secuencias específicas ejemplares. Cada una de las modificaciones propuestas se encuentra bien dentro de la habilidad de rutina en el arte, como es la determinación - >- -» — *~- --"•* de la retención de la actividad biológica de los productos codificados. En otra modalidad, el fragmento de ADN que contiene un gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de PEP carboxilasa, es un gen quimérico que comprende una secuencia incompleta de nucleótido de PEP carboxilasa derivado de un microorganismo que pertenece al género Brevijbacteriuin o Corynebacterium, y una secuencia incompleta de nucleótido de PEP carboxilasa, derivada de una planta que pertenece a la clase de monocotiledóneas o dicotiledóneas. Juntas, las dos secuencias incompletas forman un gen quimérico ppc completo capaz de expresar un polipéptido que tiene actividad de PEP carboxilasa, en la cual el polipéptido no requiere de la acetil co-enzima A para la activación, y se desensibiliza para la inhibición de la retroalimentación por ácido aspártico. En una modalidad preferida, una secuencia incompleta del nucleótido de PEP carboxilasa - se deriva de un microorganismo que pertenece al género Corynebacterium, y las otras secuencias incompletas de nucleótidos de PEP carboxilasa se derivan de una planta de alfalfa. Más preferiblemente, una secuencia de nucleótido incompleta de PEP carboxilasa se deriva de una cepa de Corynebacterium glutamicum, y la otra secuencia incompleta de nucleótido de PEP carboxilasa se deriva de una cepa de Medicago sa tiva . En otra modalidad, el fragmento de ADN es ADN complementario (cADN) , ADN genómico o ADN sintético. Un fragmento de ADN de la presente invención que codifica la PEP carboxilasa, se puede obtener fácilmente en diversas formas incluyendo sin limitación síntesis química, separación por exclusión de colecciones genómicas o de cADN, separación por exclusión de colecciones de expresión y/o amplificación PCR del cADN. Estos métodos y otros útiles para aislar tales ADN se establecen por ejemplo por Sambrook y colaboradores, (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989)), by Ausuble y colaboradores, eds. (Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press (1994)), y por Berger and Kimmel (Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, Vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego (1987) ) . El aislamiento del gen ppc se puede llevar a cabo por ejemplo por el método siguiente. Aunque el siguiente ejemplo se refiere al Coryneba cterium por simplicidad, se reconocerá que las bacterias del género BreviJbacterium pueden similarmente usarse. Primero, se extrae un gen cromosomal de una cepa de Corynebacterium que lleva un gen ppc (utilizando por ejemplo, el método de H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta 72:619 (1963)). El gen se desdobla con una enzima de restricción apropiada y después se subclona sobre un vector de transferencia de 5 plásmidos capaz de propagarse en las bacterias corineformes o en la E. coli . Para desdoblar los genes cromosomales, se pueden emplear una amplia variedad de enzimas de restricción al controlar el grado de desdoblamiento por ejemplo, al controlar el tiempo de la reacción de desdoblamiento, la temperatura, etc.. El desdoblamiento del ADN por enzimas de restricción, está bien entendido por aquellos con habilidad en el arte y no se necesita establecer aquí en detalle. Un mutante deficiente en PEP carboxilasa de las bacterias corineformes o de la E. coli , se transforma con el ADN recombinante resultante. Los transformantes así obtenidos se pueden seleccionar y aislar por métodos convencionales con base en las características poseídas por el ADN vector y/o el receptor. Por ejemplo, las cepas bacterianas que poseen actividad de la PEP carboxilasa se aislan, y se puede aislar de las mismas un gen ppc. Cuando el microorganismo transformado con el fragmento de ADN de la presente invención como se describe arriba se cultiva, y la secuencia de ADN se expresa, entonces se puede obtener una enzima que no ^^ ||¡ *& requiere la acetil-CoA para la activación y que está subtancialmente desensibilizada para la inhibición del ácido aspártico. Se vuelve aparente, al medir la actividad de la PEP carboxilasa en ausencia y/o presencia de acetil-CoA por ejemplo, si o no la enzima requiere acetil-CoA como un activador. También se vuelve aparente, al medir la actividad de la PEP carboxilasa en presencia y/o ausencia del ácido aspártico en un sistema de reacción por enzima por ejemplo, si la enzima así obtenida está o no substancialmente inhibida por el ácido aspártico . Es posible para la medición de la actividad de la enzima usar un método espectrométrico (Yoshinage, T., y colaboradores, J. Biochem. 68:747-750 (1970)) y similares. Por ejemplo, cuando se mide el ensayo de enzima en una forma continua o cinética mientras sucede la reacción, se puede medir la reacción espectrofotométricamente al seguir la' disminución en la absorbancia (usualmente a 340 nanómetros) . En otro aspecto de la invención, se proporciona un método de selección de un fragmento de ADN, que comprende un gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de PEP carboxilasa en donde el polipéptido no requiere la acetil-CoA para la activación y se desensibiliza para la inhibición de la retroalimentación por ácido aspártico.

El método comprende la extracción de un gen cromosomal de una cepa de Corynebacteri um que lleva un gen ppc, desdoblando el gen cromosomal con una enzima apropiada de restricción, ligando el gen ppc con un vector de plásmido capaz de propagarse en Corynebacterium, transformar una cepa de Coryne-bacterium en la cual los genes ppc y pyc no son funcionales, aislar las cepas que muestran una crecimiento superior sobre un medio mínimo con glucosa como la única fuente de carbono, y aislar un fragmento de ADN de la cepa. La piruvato carboxilasa (EC 6.4.1.1) es una enzima anaplorética importante que reestablece el OAA, que se consume por la biosíntesis durante el crecimiento, a partir del piruvato y se usa en la producción de lisina y ácido glutámico en fermentaciones industriales. Además de la PEP carboxilasa, la piruvato carboxilasa dependiente de la biotina codificada por el gen pyc, se ha encontrado recientemente que es una enzima anaplerótica en la Corynebacteri um glutamicum . La inactivación del gen ppc y pyc en la Corynebacterium glutamicum, conduce a la incapacidad del microorganismo para crecer en la glucosa. Ver Peters- endisch, P., y colaboradores, Microbiology 144:915-27 (1998). Al inactivar los genes ppc y pyc, se puede identificar un fragmento de ADN que contiene un gen ppc de la invención que fue clonado dentro de un plásmido replicante por la capacidad de una cepa para mostrar crecimiento en un medio mínimo con glucosa como la única fuente de carbono. En otra modalidad, los inhibidores de la actividad de la PEP carboxilasa también se agregan al medio. Por ejemplo, un análogo del ácido aspártico se puede agregar. El compuesto análogo muestra preferiblemente una acción inhibitoria de crecimiento contra un microorganismo que pertenece al género Corynebacterium que produce una PEP carboxilasa de tipo silvestre, se recupera la acción inhibitoria de crecimiento arriba mencionada por la existencia de ácido L-glutámico o L-aspártico, y el compuesto análogo inhibe la actividad de la PEP carboxilasa de tipo silvestre. Si se selecciona una cepa que es resistente al compuesto análogo de un microorganismo que pertenece al género Corynebacteri um, es mucho más probable que un microorganismo huésped que produce la PEP carboxilasa con la inhibición desensibilizada de la retroalimentación por ácido aspártico se obtenga. En otra modalidad, las cepas se aislan que muestran una producción creciente de un aminoácido derivado del OAA. Tales aminoácidos incluyen aspartato, lisina, metionina, treonina, e isoleucina. Además, las cepas pueden crecer en un medio mínimo en ausencia de acetil-CoA, y la actividad de la PEP carboxilasa se puede medir. En otro aspecto de la invención, se proporciona una molécula recombinante de ADN que comprende una plásmido y un gen que codifica un polipéptido que tiene una actividad de PEP carboxilasa insertada operacionalmente en el mismo, en donde la molécula de ADN recombinante es capaz de propagarse y el gen es capaz de expresarse en un microorganismo huésped que comprende los géneros Escherichia , Corynebacterium y Brevibacterium, y en donde el polipéptido no requiere la acetil-CoA para la activación y se desensibiliza para la inhibición de la retroalimentación por ácido aspártico. El vector plásmido usado en la presente invención, puede ser cualquier vector con tal que se pueda propagar en células de las bacterias Escherichia , Corynebacterium o Brevibacterium . El ADN del vector se desdobla por la misma enzima de restricción usada para el desdoblamiento del gen cromosomal, o se conecta a un oligonucléotido que tiene una secuencia base complementaria en las terminales respectivas del fragmento de desdoblamiento del ADN cromosomal y el ADN del vector desdoblado. El vector plásmido y el fragmento que contiene el gen cromosomal se somete después a una reacción de ligación. Cuando se inserta un gen por este o cualquier otro método en la &- ? ? ? dirección de sentido y en la estructura de lectura adecuada de manera que la enzima de PEP carboxilasa se exprese cuando el plásmido se transcribe y se traduzca por la maquinaria genética de una célula en la cual se 5 inserta el plásmido, el gen se dice que esta "insertado operacionalmente" dentro del vector plásmido. En una modalidad preferida, el gen que codifica al polipéptido que tiene una actividad de PEP carboxilasa se deriva de una planta de alfalfa. Más preferiblemente, el gen se deriva de una cepa de Medicagos sativa . En otra modalidad preferida, el gen se modifica por una o más substituciones, eliminaciones y/o inserciones de nucleótidos. Más preferiblemente, la modificación comprende eliminar los nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos: Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln- Leu-Arg. En otro aspecto de la invención, se proporciona un microorganismo huésped transformado con un fragmento de ADN de la presente invención que contiene un gen que codifica un polipéptido que tiene una actividad de PEP carboxilasa. Como el huésped, los microorganismos utilizados para la producción de L-aminoácidos se pueden usar por ejemplo, aquellos que pertenecen al género BreviJbacterium, el género Corynejbacte ium, el género Bacillus, el género Escherichia , el género Sera tia , el género Providencia , y el género Artrobacter. En una modalidad preferida, el fragmento de ADN que contiene el gen ppc se expresa en un microorganismo huésped que pertenece a los géneros Escheri chia , Corynebacteri um o Brevibacterium . Como el huésped, puede haber microorganismos ejemplificados que pertenecen al género Escherichia por ejemplo, Escherichia coli , preferiblemente Escherichia coli que produce L-lisina, bacterias corineformes, preferiblemente cepas que producen L-lisina y similares. Las bacterias corineformes referidas en la presente invención, es un grupo de microorganismos que son bastoncillos de ayuno no ácido, aeróbicos Gram positivos que tienen una capacidad para la no formación de esporas incluyendo bacterias que pertenecen al género Corynebacterium, bacterias que pertenecen al género Brevibacterium que han sido hasta aquí clasificadas dentro del género 'Brevibacteri um pero que se unen como bacterias que pertenecen al género Coryneba cteri um en la actualidad, y bacterias que pertenecen al género Brevibacteri um cercanamente relacionadas con las bacterias que pertenecen al género Coryneba cteri um . En una modalidad, cuando se deriva el fragmento de ADN de una planta de la clase de monocotiledóneas o í*& Í .^ ?? r árr&iL*rlr, & ~- l S &. x*.. AA v * LA dicotiledóneas, el microorganismo huésped se puede transformar con una molécula de ADN recombinante que comprende un plásmido y el fragmento de ADN insertado operativamente en el mismo. Alternativamente, se puede transformar el microorganismo huésped al integrar el fragmento de ADN de la presente invención dentro del ADN cromosomal del huésped. Preferiblemente, el fragmento de ADN se deriva de una planta de alfalfa y más preferiblemente, se deriva de una cepa de Medicagos sa tiva . En otra modalidad preferida, el fragmento de ADN derivado de la planta se modifica por una o más substituciones, eliminaciones y/o inserciones de nucleótidos. Más preferiblemente la modificación comprende eliminar los nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos: Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln-Leu-Arg . Además como se describe arriba, es aceptable que la secuencia de ADN de la presente invención se inserte dentro de un ADN vector capaz de autoreplicación y se introduzca dentro del huésped. Como el ADN vector, es preferible un vector plásmido, y aquellos capaces de la autorreplicación en una célula huésped son los más preferidos. Alternativamente, se puede también utilizar un vector de ADN de fago. ,,.£, ¿ ... .a Cuando el fragmento de ADN que contiene un gen se deriva de una planta del tipo de monocotiledóneas o dicotiledóneas o de un microorganismo que pertenece al género Corynebacterium o Brevibacterium, es también 5 aceptable que el fragmento de ADN se integre dentro del ADN cromosomal de un microorganismo huésped por medio de un método usando por ejemplo transposones (Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio/technol. 1:417 (1983)), fagos Mu (patante japonesa Laid-open No 2-109985) o recombinación homologa (Experments in Molecular genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)). Además, con objeto de integrar el ADN de la presente invención dentro de las bacterias corineformes, es posible utilizar un plásmido sensible a la temperatura como se describe en la patente abierta japonesa No. 5- 15 7491. En una modalidad preferida, el fragmento de ADN se deriva de una cepa de Corynebacteri um gl utamicum y se integra dentro de un ADN cromosomal de un microorganismo huésped, la región que flanquea el gen ppc en el cromosoma de Corynebacteri um gl utamicum, ha sido formada en secuencias (SEQ ID NO: 3) . Según la estrategia de reemplazo de genes de la presente invención, la copia cromosomal del gen ppc se separa y sustituye con un marcador de gen de resistencia a antibióticos (figura 1).

El marcador es a su vez reemplazado con un gen modificado ppc de la presente invención. El diseño único de esta estrategia de reemplazo de genes, facilita la separación completa de la secuencia de ADN cromosomal ppc de un microorganismo huésped y la sustitución de un nuevo gen ppc sin alterar la expresión de los dos genes vecinos, el gen tpi y el gen secG. El gen tpi codifica la enzima glicolítica triosefosfato isomerasa, y el gen secG codifica la secG, una proteína de membrana integral involucrada en la exportación de proteínas . El diseño de esta estrategia de reemplazo de genes, depende de la reconstitución de los genes intactos tpi y secG que flanquean al gen ppc . Se pueden usar cuatro oligonucleótidos para clonar las regiones de flanqueo ppc de ADN: (1) 5' GTTGGTGAGCCACTGGAAATCCGTG 3' (SEQ ID NO: 4) (2) 5' GATGTCATCGCGTAAAAAATCAGTC 3' (SEQ ID NO: 5) (3) 5' CACTGCGCTGCGCAACTCTAGATAG 3' (SEQ ID NO: 6) (4) 5' GACCACCACCTTGCCGAAATCTTGG 3' (SEQ ID NO: 7). En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método de producción de un aminoácido por fermentación. El método comprende el cultivo de un microorganismo huésped que pertenece al género Escheri chia , Coryneba cterium o Brevibacterium en un medio apropiado, y aislarlo del medio de cultivo un aminoácido, en donde el microorganismo huésped se transforma con un fragmento de ADN que comprende un gen que codifica un polipéptido que tiene una actividad de PEP carboxilasa, en donde el microorganismo huésped expresa el gen, y en donde el polipéptido no requiere a la acetil-CoA para activación, y se desensibiliza para la retroalimentación de inhibición por ácido aspártico. El método de cultivo de los huéspedes arriba mencionados, no es especialmente diferente de un método de cultivo para microorganismos que producen aminoácidos en el arte previo. Nominalmente, se usa un medio ordinario que contiene una fuente de carbón, una fuente de nitrógeno, iones inorgánicos, substancias que satisfacen la auxotropía de nutrientes, y opcionalmente nutrientes de trazas orgánicas tales como aminoácidos, vitaminas y similares. Como fuente de carbón, se pueden- usar carbohidratos tales como glucosa, sacarosa, lactosa, etc, así como ácidos orgánicos tales como el ácido acético. Como fuente de nitrógeno, se pueden usar gas de amoniaco, amonio acuoso, sales de amonio y similares. Como iones inorgánicos se agregan apropiadamente los iones potasio, iones sodio, iones magnesio, iones fosfato y similares a los medios como se requiera. í íí^t .,t. .?. i El cultivo se lleva a cabo hasta que la generación y acumulación del aminoácido se detiene substancialmente mientras que se controla apropiadamente pH y la temperatura del medio bajo una condición aeróbica. Con 5 objeto de recolectar los aminoácidos así acumulados en el medio de cultivo, se puede aplicar un método ordinario. Por ejemplo, después de la separación de las células por filtración, ultrafiltración, centrifugación u otros medios conocidos, se recupera el aminoácido por ejemplo, 10 por concentración de la solución libre de célula y la cristalización del aminoácido (o una sal del mismo) . Alternativamente, se puede recuperar el compuesto por cromatografía de intercambio de iones. En una modalidad preferida, el aminoácido es uno que 15 se deriva de OAA, tal como L-aspártico, L-lisina, L- metionina, L-treonina y L-isoleucina . Más preferiblemente, el aminoácido es L-lisina. En otro aspecto de la invención,' se proporciona un método para incrementar la rapidez de conversión de PEP a 20 OAA. El método comprende la transformación de un microorganismo huésped con un fragmento de ADN de la presente invención. En una modalidad preferida, el microorganismo huésped se selecciona de los géneros Escherichia , Corynebacterium o Brevibacterium . ffiiiüt .^ff^aa^attiaM^...».- La PEP carboxilasa cataliza la reacción de condensación entre el PEP y el dióxido de carbono resultando en la formación de OAA. Una PEP carboxilasa de la presente invención que no está substancialmente 5 regulada por la acetil-CoA o el ácido aspártico incrementa por lo tanto la rapidez de conversión de PEP a OAA. En el caso en donde el fragmento de ADN se deriva de una planta que pertenece a la clase de monocotiledóneas o 10 dicotiledóneas, la transformación puede ser por la integración o por la utilización de una molécula recombinante de ADN por ejemplo. En el caso en donde el fragmento de ADN se deriva de un microorganismo que pertenece al género Corynebacterium o Brevijbacterium, el 15 microorganismo huésped se transforma por la integración del fragmento de ADN de la invención dentro del ADN cromosomal del microorganismo huésped. En otro aspecto de la invención,' se proporciona un método para el reciclado del carbón en un proceso de 20 fermentación. El método comprende la transformación de un microorganismo huésped con un fragmento de ADN de la presente invención. En una modalidad preferida, el microorganismo huésped se selecciona de los géneros Escherichia , Corynebacterium o Brevibacterium .

- WWíMltH tí^"-"^-''"'- ' -J-J . >-» » » - .<-«*-**»- <- * ?*)u i?É~* . ,,--» ¿»*«a«~* El ciclo TCA, requiere la reposición continua de moléculas de C4 con objeto de reemplazar los intermediarios retirados por la biosíntesis de aminoácidos. La PEP carboxilasa ayuda en el cumplimiento de esta función al jugar un papel anaplerótico en el suministro de OAA de cuatro carbones para el ciclo TCA. Al transformar un microorganismo huésped con un fragmento de ADN de la presente invención que codifica un polipéptido que tiene actividad de PEP carboxilasa, se proporciona con lo cual un método para el reciclado del carbón. En el caso en donde el fragmento de ADN se deriva de una planta que pertenece a la clase de monocotiledónea o dicotiledóneas, la transformación puede ser por la integración o por la utilización de una molécula recombinante de ADN por ejemplo. En el caso en donde el fragmento de ADN se deriva de un microorganismo que pertenece al género Corynebacterium o ' Brevibacteri um, el microorganismo huésped se transforma por la integración del fragmento de ADN de la invención dentro del ADN cromosomal del microorganismo huésped. La L-lisina y el ácido L-glutámico se han producido hasta aquí industrialmente por métodos fermentativos al usar bacterias corineformes que pertenecen a los géneros Brevibacteri um o Corynebacteri um que tienen capacidad para producir estos aminoácidos. En estos métodos, se conoce que las bacterias corineformes requieren biotina para su crecimiento. La enzima de PEP carboxilasa no requiere biotina para la actividad biológica. Además, uno de los principales roles fisiológicos de la PEP carboxilasa es reponer el ciclo TCA por la asimilación del carbón. La PEP carboxilasa desregulada de la presente invención mejora la asimilación del dióxido de carbono. Por lo tanto en otro aspecto de la invención, se proporciona un método de asimilación del carbono en un proceso de fermentación que no requiere biotina. El método comprende la transformación de un microorganismo huésped con un fragmento de ADN de la presente invención. En una modalidad preferida, el microorganismo huésped se selecciona del género Escherichia , Corynebacterium o Brevibacterium. En el caso en donde el fragmento de ADN se deriva de una planta que pertenece a la clase de- monocotiledóneas o dicotiledóneas, la transformación puede ser por integración o por utilización de una molécula de ADN recombinante por ejemplo. En donde el caso en donde el fragmento de ADN se deriva de un microorganismo que pertenece al género Corynebacteri um o Brevibacteri um, el microorganismo huésped se transforma por la integración t~3 - , i» ¿ -& *n -a s * .,-d^a. del fragmento de ADN de la invención dentro del ADN cromosomal del microorganismo huésped. La enzima anaplerótica de PEP carboxilasa, es crítica para el mantenimiento de una acumulación óptima de OAA, y determina consecuentemente los niveles biosintéticos de ácidos orgánicos que se derivan de él. Al transformar un microorganismo huésped con el fragmento de ADN de la presente invención, la rapidez de producción de OAA se incrementa. Como tal, se incrementa también la producción de ácidos orgánicos derivados de OAA. De conformidad en todavía otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para incrementar la producción de ácidos orgánicos en un proceso de fermentación. En una modalidad preferida, el microorganismo huésped se selecciona de los géneros Escherichia , Corynebacterium o Brevijbacterium. En el caso en donde el fragmento de ADN se deriva de una planta que pertenece a la clase monocotiledóneas o dicotiledóneas, la transformación puede ser por integración o por utilización de una molécula recombinante de ADN por ejemplo. En el caso en donde el fragmento de ADN se deriva de un microorganismo que pertenece al género Corynebacterium o Brevibacteri um, el microorganismo huésped se transforma por la integración * * a*-»**-*»-**- +. * ¡# . ± ~ - -*-- á. del fragmento de ADN de la invención, dentro del ADN cromosomal del microorganismo huésped. El OAA es un substrato importante para la producción de metabolitos celulares tales como los aminoácidos. Al incrementar la velocidad de conversión del PEP al OAA, los genes de ppc de la invención incrementan por lo cual la producción de aminoácidos. Por lo tanto, en otro aspecto de la invención se proporciona un método para incrementar la producción de aminoácidos en un proceso de fermentación. El método comprende la transformación de un huésped que comprende un fragmento de ADN de la presente invención. En una modalidad preferida, el microorganismo huésped se selecciona del género Escherichia , Corynebacterium o Brevibacteri um . En otra modalidad preferida, el aminoácido comprende un L-aspartato, L-lisina, L-metionina, L-treonina y L-isoleucina. Más preferiblemente, el aminoácido es L-lisina. En el caso en donde el fragmento de ADN se deriva de una planta que pertenece a la clase de monocotiledóneas o dicotiledóneas, la transformación puede ser por integración o por utilización de una molécula de ADN recombinante por ejemplo. En donde el caso en donde el fragmento de ADN se deriva de un microorganismo que pertenece al género Corynebacterium o BreviJbacterium, el z. i. Z . t microorganismo huésped se transforma por la integración del fragmento de ADN de la invención dentro del ADN cromosomal del microorganismo huésped. Todas las patentes y publicaciones citadas en esta descripción son indicativas del nivel de habilidad de aquellos hábiles en el arte para los cuales es pertinente esta invención, y se incorporan todas aquí como referencia en su totalidad. Habiendo ahora descrito generalmente la invención, la misma se entenderá mas fácilmente a través de la referencia a los siguientes ejemplos que se proporcionan a manera de ilustración y no pretenden ser limitativos de la presente invención a menos que se especifique. Ejemplo 1 Un gen ppc de planta funciona en Escherichia coli. El clon de cADN (APPC) del gen ppc de la alfalfa (Medicago sa tiva ) fue funcional en el mutante de Escherichia coli CGSC3594 que carece de una PEP carboxilasa funcional y que no puede crecer en el medio M9 con glucosa como la única fuente de carbón. Cuando se transforma con el plásmido APPC (pMS2), el mutante de E. coli CGSC3594, fue capaz de crecer en el medio M9 con glucosa como la única fuente de carbono. Las secuencias de ADN y de aminoácidos de la PEP carboxilasa de la ...- . alfalfa se proporcionan en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente. Ejemplo 2 El gen ppc de la alfalfa muestra una estimulación del crecimiento en Corynebacterium en matraces agitados . El efecto del gen ppc de la alfalfa (Medicago sa tiva ) en la estimulación del crecimiento en la cepa BF100 de Corynebacterium productora de lisina se determinó. Se midió el crecimiento como la densidad óptica 660nm, se midió la concentración como g lisina/litro de medio, y se midió el rendimiento como (g lisina/g de glucosa consumida) x 100. Estuvieron presentes 30 mg/L de isopropil-beta-D-galactosida (IPTG) un inductor. Los resultados se muestran en la tabla 1: Tabla 1 Ejemplo 3 El gen ppc de una cepa de Corynebacterium de tipo silvestre mejora la productividad de una cepa de Corynebacterium que produce lisina.

El clon de cADN (CPPC) del gen ppc de la Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, se inserta dentro del plásmido pCPPC. Cuando la cepa BF100 de Corynebacterium glutamicum que produce lisina se transforma con el plásmido de pCPPC en matraces agitados, se mejora la productividad. Se inhibe el crecimiento como la densidad óptica a 660nm, la concentración se mide como g de lisina/litro de medio y el rendimiento se midió como (g de lisisna/g de glucosa consumida) x 100. Se muestran los resultados en la tabla 2. Tabla 2 Ejemplo 4 La sensibilidad a la acetil-CoA y el ácido L-aspártico de cepas de Corynebacterium productoras de lisina y de tipo silvestre. Se observaron diferentes sensibilidades a la acetil- CoA y al ácido L-aspártico en extractos de una cepa de Coryneba cteri um glutamicum de tipo silvestre (ATCC 13032) y en una cepa de Corynebacterium glutamicum que produce lisina (BF100) como se determina por la actividad de la _. a. & i á PEP carboxilasa. Se miden espectrofotométricamente las unidades de actividad como el cambio en la absorbancia (340 nm/min) usando extractos crudos. Los resultados se muestran en la tabla 3. Tabla 3 Ejemplo 5 Sustitución del gen cromosomal de ppc con un gen modificado de ppc. La región que flanquea el gen ppc en el cromosoma de Corynebacteri um glutamicum ha sido formada en secuencias (SEQ ID NO: 3) . La copia cromosomal del gen ppc se separa y reemplaza con un marcador de gen de resistencia a antibióticos (figura 1). El marcador a su vez reemplaza con un gen modificado ppc de la presente invención. El diseño único de esta estrategia de reemplazo de genes, facilita la eliminación completa de la secuencia de ADN cromosomal ppc de un microorganismo huésped, y una sustitución de un nuevo gen sin alterar la expresión de los dos genes vecinos.

El diseño de esta estrategia de reemplazo de genes depende de la reconstitución de los genes intactos tpi y secG que flanquean al gen ppc. Se pueden usar cuatro oligonucleótidos para clonar las regiones de ADN que flanquean ppc: (1) 5' GTTGG TGAGC CACTG GAAAT CCGTG 3' (SEQ ID NO: 4) (2) 5' GATGT CATCG CGTAA AAAAT CAGTC 3' (SEQ ID NO: 5) (3) 5' CACTG CGCTG CGCAA CTCTA GATAG 3' (SEQ ID NO: 6) (4) 5' GACCA CCACC TTGCC GAAAT CTTGG 3' (SEQ ID NO: 7). En vista de la descripción anterior tomada con los ejemplos, aquellos hábiles en el arte podrán practicar la invención en diversas posibilidades y modalidades sin alejarse del espíritu y alcance de la invención como se define en las reivindicaciones anexas. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (70)

1. Reivindicaciones . Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 5 1. Un fragmento de ADN que comprende un gen que codifica un polipéptido que tiene una actividad de fosfoenoLpiruvato carboxilasa, caracterizado porque el gen es capaz de expresarse en un microorganismo huésped, y en donde el polipéptido no requiere la acetil coenzima 10 A para activación y se desensibiliza para la inhibición de la retroalimentación por ácido aspártico.
2. 2. El fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento de ADN se deriva de una planta que pertenece a la clase de 15 monocotiledóneas o dicotiledóneas.
3. 3. El fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el fragmento de ADN se deriva de una planta de alfalfa-.
4. 4. El fragmento de ADN de conformidad con la 20 reivindicación 3, caracterizado porque el fragmento de ADN se deriva de una cepa de Medicago sa tiva .
5. 5. El fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el fragmento de ADN se modifica por una o más substituciones, 25 eliminaciones o inserciones de nucleótidos.
6. 6. El fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la modificación comprende la eliminación de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos: Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln- 5 Leu-Arg.
7. 7. El fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento de ADN se deriva de un microorganismo que pertenece al género Brevibacterium o Corynebacterium . 10
8. 8. El fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el fragmento de ADN se deriva de una cepa de Corynebacterium gl utamicum .
9. 9. El fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el fragmento de 15 ADN se integra dentro del ADN cromosomal de un microorganismo huésped.
10. 10. El fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento de ADN se expresa en un microorganismo huésped que comprende 20 los géneros Escherichia , Corynebacteri um y Breviba cteri um .
11. 11. El fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento de ADN es un gen quimérico que comprende una secuencia de 25 nucleótido incompleta de fosfoenolpiruvato carboxilasa, -^msaat á _______¡__i_á?¿ ¿=?Siaa^ta?totiá - . ... t a A . -> .•« > . «-j-.- - .. , ..i-*— -— jJitílUj^ t ;, «__a_? ... _. *? > - -. ; i _. t iii i. JÉ derivado de un microorganismo que pertenece al género Brevibacteri um o Corynebacterium, y una secuencia de nucleótido incompleta de fosfoenopiruvato carboxilasa, derivada de una planta que pertenece a la clase de 5 monocotiledónea o dicotiledónea.
12. 12. El fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento de ADN es cADN, ADN genómico o ADN sintético.
13. 13. Un fragmento de ADN derivado de una planta que 10 pertenece a la clase de monocotiledóneas o dicotiledóneas, caracterizado porque comprende un gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfoenolpiruvato carboxilasa, en donde el gen es capaz de expresarse en un microorganismo huésped que comprende 15 el género Escherichia , Corynebacterium y Brevibacterium, y en donde el polipéptido no requiere la acetil coenzima A para activación, y se desensibiliza para la inhibición de la retroalimentación por ácido aspártico.
14. 14. El fragmento de ADN de conformidad con la 20 reivindicación 13, caracterizado porque el fragmento de ADN se deriva de una planta de alfalfa.
15. 15. El fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el fragmento de ADN se deriva de una cepa de Medicago sa tiva . ^jg^^HÍII^^
16. 16. El fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el fragmento de ADN se modifica por una o más substituciones, eliminaciones o inserciones de nucleótidos.
17. 17. El fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la modificación comprende eliminación de los nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos: Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln-Leu-Arg.
18. 18. El fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el fragmento de ADN es cADN, ADN genómico o ADN sintético.
19. 19. Un fragmento de ADN derivado de un microorganismo que pertenece al género Brevibacteri um o Corynebacterium, caracterizado porque comprende un gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfoenolpiruvato carboxilasa en donde el gen es capaz de expresarse en un microorganismo huésp'ed que comprende los géneros Escherichia , Corynebacterium y Brevibacterium, en donde el gen se integra dentro del ADN cromosomal del microorganismo huésped, y en donde el polipéptido no requiere la acetil coenzima A para la activación y se desensibiliza para la inhibición de la retroalimentación por ácido aspártico.
20. 20. El fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el fragmento de ADN se deriva de una cepa de Corynebacteri um gl utamicum .
21. 21. El fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el gen se integra al eliminar el gen cromosomal ppc del microorganismo huésped e insertar al gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfoenopiruvato carboxilasa, sin alterar la expresión de los dos genes que flanquean al gen cromosomal ppc del microorganismo huésped.
22. 22. Un polipéptido aislado que tiene una actividad de fosfoenolpiruvato carboxilasa, caracterizado porque el polipéptido no requiere la acetil co-enzima A para la activación y está desensibilizado para la inhibición de la retroalimentación por ácido aspártico, y en donde el polipéptido esta codificado por el fragmento de ADN de cualquiera de las reivindicaciones 1, 13 y 19.
23. 23. Una molécula recombinante de- ADN, que comprende un plásmido y un gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfoenolpiruvato carboxilasa insertada operacionalmente en el mismo, caracterizada porque la molécula recombinante de ADN es capaz de propagarse y el gen es capaz de expresarse en un microorganismo huésped que comprende los géneros Escherichia , Corynebacteri um y Brevibacterium, en donde el gen se deriva de una planta monocotiledónea o dicotiledónea, y en donde el polipéptido no requiere a la acetil co-enzima A para activación y se desensibiliza para la inhibición de la retroalimentación por ácido 5 aspártico.
24. 24. La molécula recombinante de ADN de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfoenolpiruvato carboxilasa se deriva de una planta de 10 alfalfa.
25. 25. La molécula recombinante de ADN de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfoenolpiruvato carboxilasa se deriva de una cepa de 15 Medicago sa tiva .
26. 26. La molécula recombinante de ADN de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfoenolpiruvato carboxilasa, se modifica por una o mas 20 substituciones, eliminaciones o inserciones de nucleótidos .
27. 27. La molécula recombinante de ADN de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la modificación comprende la eliminación de los nucleótidos ».^¿^-aa^,.^ . que codifican la secuencia de aminoácidos: Met-Ala-Ser- Ile-Asp-Ala-Gln-Leu-Arg .
28. 28. Un polipéptido aislado que tiene una actividad de fosfoenolpiruvato carboxilasa, caracterizada porque el 5 polipéptido no requiere la acetil co-enzima A para la activación y está desensibilizado para la inhibición de la retroalimentación por ácido aspártico y en donde el polipéptido se codifica por la molécula de ADN de la reivindicación 23. 10
29. 29. Un microorganismo huésped que pertenece a los géneros CoryneJbacteriu-ii o Brevibacterium, transformado con un fragmento de ADN caracterizado porque comprende un gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfoenolpiruvato carboxilasa, en donde el gen se deriva 15 de una planta que pertenece a la clase de monocotiledóneas o dicotiledóneas, en donde el polipéptido no requiere la acetil co-enzima A para activación y se desensibiliza para la inhibición de la retroalimentación por ácido aspártico, y en donde el 20 microorganismo huésped transformado con el fragmento de ADN expresa el gen.
30. 30. El microorganismo huésped de la reivindicación 29, caracterizado porque el microorganismo huésped se transforma al integrar el fragmento de ADN dentro del ADN 25 cromosomal del microorganismo huésped o se transforma con una molécula recombinante de ADN que comprende un plásmido y un fragmento de ADN insertado operativamente en el .
31. 31. El microorganismo huésped de conformidad con la 5 reivindicación 29, caracterizado porque el gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfoenolpiruvato carboxilasa, se deriva de una planta de alfalfa.
32. 32. El microorganismo huésped de conformidad con la 10 reivindicación 31, caracterizado porque el gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfoenolpiruvato carboxilasa, se deriva de una cepa de Medi cago sa tiva .
33. 33. El microorganismo huésped de conformidad con la 15 reivindicación 29, caracterizado porque el gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfoenolpiruvato carboxilasa, se modifica por una o más substituciones, eliminaciones o - inserciones de nucleótidos . 20
34. 34. El microorganismo huésped de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la modificación comprende la eliminación de los nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos: Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln- Leu-Arg.
35. 35. Un microorganismo huésped que pertenece a los géneros Escherichia , Corynebacterium o Brevibacteri um, en los cuales un fragmento de ADN que comprende un gen que codifica un polipéptido que tiene una actividad de fosfoenolpiruvato carboxilasa, se integra dentro del ADN cromosomal del microorganismo huésped, caracterizado porque el fragmento de ADN se deriva de un microorganismo que pertenece al género Corynebacterium o Brevibacteri um, en donde el polipéptido no requiere la acetil co-enzima A para activación y se desensibiliza para la inhibición de la retroalimentación por ácido aspártico y en donde el microorganismo huésped expresa el gen.
36. 36. El microorganismo huésped de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el fragmento de ADN se deriva de una cepa de Corynebacterium glutamicum .
37. 37. El microorganismo huésped de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el gen se integra al separar el gen cromosomal de ppc 'del microorganismo huésped e inserta el gen codificando un polipéptido que tiene actividad de fosfoenolpiruvato carboxilasa, sin alterar la expresión de los dos genes que flanquean el gen cromosomal ppc del microorganismo huésped.
38. 38. Un método para la producción de un aminoácido por fermentación caracterizado porque comprende: Í. . . Í .Í. a -i, i (a) cultivar un microorganismo huésped que pertenece al género Escherichia , Corynebacterium o Brevibacteri um, en un medio apropiado; y (b) aislar del medio de cultivo un aminoácido, en 5 donde el microorganismo huésped (a) se transforma con un fragmento de ADN que comprende un gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfoenolpiruvato carboxilasa, en donde el microorganismo huésped (a) expresa el gen y en donde el polipéptido no requiere a la 10 acetil co-enzima A para activación y se desensibiliza para la inhibición de la retroalimentación por ácido aspártico.
39. 39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque en la etapa (b) el aminoácido 15 comprende L-aspartato, L-lisina, L-metionina, L-treonina y L-isoleucina.
40. 40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque en la etapa fb) el aminoácido es L-lisina . 20
41. 41. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el fragmento de ADN se deriva de una planta que pertenece a la clase de monocotiledóneas o dicotiledóneas .
42. 42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el fragmento de ADN se deriva de una planta de alfalfa.
43. 43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el fragmento de ADN se deriva de una cepa de Medicago sa tiva .
44. 44. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el fragmento de ADN se modifica por una o más substituciones, eliminaciones o inserciones de nucleótidos.
45. 45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la modificación comprende la eliminación de los nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos: Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln-Leu-Arg.
46. 46. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el fragmento de ADN se deriva de un microorganismo que pertenece al género Brevi£>acteri¡j/n o Corynebacteri um .
47. 47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el fragmento de ADN se deriva de una cepa de Corynebacterium glutami cum .
48. 48. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el gen que codifica un polipéptido que tiene una actividad de fosfoenolpiruvato carboxilasa, es un gen quimérico que comprende una secuencia de nucleótido incompleta de fosfoenolpiruvato carboxilasa, derivada de un microorganismo que pertenece a los géneros Bervijbacterium o Corynebacterium, y una secuencia de nucleótidos incompleta de fosfoenolpiruvato carboxilasa, derivada de una planta que pertenece a la clase de monocotiledóneas o dicotiledóneas.
49. 49. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el fragmento de ADN es un cADN, ADN genómico o ADN sintético.
50. 50. Un método para producir un aminoácido por fermentación, caracterizado porque comprende: (a) cultivar un microorganismo huésped, que pertenece a los géneros Escherichia , Corynebacteri um o Brevibacterium en un medio apropiado; y (b) aislar del medio de cultivo un aminoácido, en donde el microorganismo huésped (a) se transforma al integrar un fragmento de ADN que comprende un gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfoenolpiruvato carboxilasa dentro del ADN cromosomal del microorganismo (a) , o se transforma con una molécula de ADN recombinante que comprende un plásmido y un fragmento de ADN insertado operacionalmente en él, en donde el microorganismo huésped (a) expresa el gen, en donde el fragmento de ADN se deriva de una planta monocotiledónea o dicotiledónea, y en donde el <y¿ Í . > » A^s stg yfc polipéptido no requiere de la acetil coenzima A para la activación y se desensibiliza para la inhibición de la retroalimentación por ácido aspártico.
51. 51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque en la etapa (b) el aminoácido comprende L-aspartato, L-lisina, L-metionina, L-treonina y L-isoleucina.
52. 52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque en la etapa (b) , el aminoácido es L-lisina.
53. 53. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el fragmento de ADN se deriva de una planta de alfalfa.
54. 54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque se deriva de una cepa de Medicago sa tiva .
55. 55. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el fragmento 'de ADN se modifica por una o más substituciones, eliminaciones o inserciones de uno o más nucleótidos.
56. 56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la modificación comprende la eliminación de los nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos: Met-Ala-Ser-Ile-Asp-Ala-Gln-Leu-Arg. ÍtL?.?,a i». Mi rA»*--Alta
57. 57. Un método para producir un aminoácido por fermentación, caracterizado porque comprende: (a) cultivar un microorganismo huésped, que pertenece a los géneros Escherichia , Corynebacteri um o Brevibacterium en un medio apropiado; y (b) aislar del medio de cultivo un aminoácido, en donde el microorganismo huésped (a) se transforma al integrar un fragmento de ADN dentro del ADN cromosomal del microorganismo huésped, en donde el fragmento de ADN comprende un gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de la fosfoenolpiruvato carboxilasa, en donde el microorganismo huésped (a) expresa el gen, en donde el fragmento de ADN se deriva de un microorganismo que pertenece al género Corynebacterium o Brevibacterium, y en donde el polipéptido no requiere la acetil coenzima A para activación y se desensibiliza para la inhibición de la retroalimentación por ácido aspártico.
58. 58. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el proceso para la integración es la separación del gen cromosomal ppc del microorganismo huésped y se inserta el fragmento de ADN sin alterar la expresión de los dos genes que flanquean al gen cromosomal ppc del microorganismo huésped.
59. 59. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque en la etapa (b) el aminoácido comprende L-aspartato, L-lisina, L-metionina, L-treonina y L-isoleucina .
60. 60. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque en la etapa (b) el aminoácido es 5 L-lisina.
61. 61. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el fragmento de ADN se deriva de una cepa de Corynebacterium glutamicum .
62. 62. Un método para la selección de un fragmento de 10 ADN que comprende un gen que codifica a un polipéptido que tiene actividad de la fosfoenolpiruvato carboxilasa, en donde el polipéptido no requiere a la acetil coenzima A para la activación, y está desensibilizado para la inhibición de la retroalimentación por ácido aspártico, 15 caracterizado porque comprende: (a) extraer un gen cromosomal de la cepa de Coryneba cterium que lleva un gen ppc; (b) desdoblar el gen cromosomal '(a) con una enzima de restricción apropiada 20 (c) ligar el gen ppc (a) con un vector plásmido capaz de propagarse en el Coryneba cteri um; (d) transformar con el vector plásmido (c) una cepa de Coryneba cteri um en la cual se inactivan los genes ppc y pyc. aaá________j__te___??iiBÉeiaia6i»..j..i. - ?? * ¿.^¡m. - .......... -... — -....... ¡¡¡^¡¡^^¡^ (e) Aislar las cepas que muestran un crecimiento superior sobre un medio mínimo con glucosa como la única fuente de carbono; y (f) aislar el fragmento de ADN que comprende un gen 5 que codifica un polipéptido que tiene actividad de fosfoenolpiruvato carboxilasa, en donde el polipéptido no requiere de la acetil coenzima A para la activación, y es menos sensible para la inhibición de la retroalimentación por ácido aspártico, de la cepa (e) . 10
63. 63. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque en la etapa (e) se agregan los inhibidores de la actividad de la fosfoenolpiruvato carboxilasa al medio.
64. 64. El método de conformidad con la reivindicación 15 62, caracterizado porque en la etapa (e) , las cepas se aislan y muestran una producción creciente de un aminoácido derivado del ácido oxaloacético.
65. 65. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque en la etapa (e) , las cepas 20 crecen en un medio mínimo en ausencia de acetil coenzima A.
66. 66. Un método para incrementar la rapidez de conversión de la fosfoenolpiruvato al oxaloacetato, caracterizado porque comprende transformar un ^^^g¡m¡¡g microorganismo huésped con el fragmento de ADN de cualesquiera de las reivindicaciones 1, 13 y 19.
67. 67. Un método para el reciclado del carbono en un proceso de fermentación, caracterizado porque comprende transformar un microorganismo huésped con el fragmento de ADN de cualesquiera de las reivindicaciones 1, 13 y 19.
68. 68. Un método para asimilar el carbono en un proceso de fermentación, que no requiere biotina, caracterizado porque comprende transformar un microorganismo huésped cono el fragmento de ADN de cualesquiera de las reivindicaciones 1, 13 y 19.
69. 69. Un método para incrementar la producción de ácidos orgánicos en un proceso de fermentación, caracterizado porque comprende transformar un microorganismo huésped con el fragmento de ADN de cualesquiera de las reivindicaciones 1, 13 y 19.
70. 70. Un método para incrementar la producción de aminoácidos en un proceso de fermentación, caracterizado porque comprende transformar un microorganismo huésped con el fragmento de ADN de cualesquiera de las reivindicaciones 1, 13 y 19. -»*-«.. ,. -_u.-l.aMfa.fa .. A,