CN116445387A - 生产目标物质的方法、转基因微生物及核酸的应用 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种使用满足规定条件中的若干条件的转基因微生物、其菌体或其菌体处理物生成目标物质的方法以及其在核酸的应用。所述规定条件包括：(I)与野生型微生物相比，琥珀酸脱氢酶活性或富马酸还原酶活性经降低或失活；(II)与野生型微生物相比，乳酸脱氢酶活性经降低或失活；(III)具有修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性或外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性，所述修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相对于野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性，所述外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性与野生型微生物显示出的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相比，相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制的抵抗性更高。

Description

生产目标物质的方法、转基因微生物及核酸的应用
本发明是2019年9月6日所提出的申请号为201980069550.X、发明名称为《生产目标物质的方法》的发明专利申请的分案申请。
本申请基于2019年4月12日在日本专利厅提交的日本专利申请No.JP2019-76629(日本专利特愿2019-76629)而主张优先权，所述日本专利申请的内容出于所有目的而援用于本说明书中。
技术领域
本发明涉及一种转基因微生物、以及使用其的物质的生产方法，所述转基因微生物的乳酸脱氢酶活性、琥珀酸脱氢酶活性或富马酸还原酶活性等规定的酶活性经降低或失活，且具有相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性的修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性。
背景技术
在使用微生物的物质生产技术中，进行了如下的提高多种目标物质的生产效率的尝试：在参与由植物来源的糖产生目标物质的过程的代谢体系中，利用转基因技术等来强化代谢酶的活性，或者使一部分代谢酶的活性失活等。例如，关于很多氨基酸，利用此种技术且使用微生物的生产正在以商用水平进行。
另一方面，也存在由石油来源的原料制作的氨基酸。例如，在广泛用于医疗品、食品添加剂、人工甜味剂等中利用的天冬苯丙二肽酯(aspartame)及作为生物降解性树脂的聚天冬胺酸的原料等中的天冬胺酸的工业生产中，使用由石油大量且廉价地合成的富马酸作为原料。更详细而言，采用的是如下方法：在如上所述由石油合成的富马酸中加入氨，使微生物所产生的天冬氨酸酶作用于此，由此合成天冬氨酸。现在，一般而言利用k-卡拉胶将具有高天冬酶活性的大肠杆菌固定化来进行连续酶反应。但现状是，在1973年旧田边制药股份有限公司确立了此手法之后，在此领域中一直未发生大的技术革新。
而且，现状是，关于利用包括微生物发酵的生物工程学手法而能够从作为比富马酸廉价的碳源的葡萄糖生产天冬氨酸的技术开发的报告，数量少。若强行举例，则其大部分仅限于涉及使用天冬氨酸脱氢酶的手法的报告。
例如，在专利文献1中，记载了一种变异型天冬氨酸脱氢酶及使用其的L-天冬氨酸制造方法，通过对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的天冬氨酸脱氢酶导入变异而提高了酶活性。专利文献1中记载的L-天冬氨酸制造方法实际上采用的是以下手法：对大肠杆菌中表达出的所述变异型天冬氨酸脱氢酶进行精制，并使用精制后的变异型酶在体外(in vitro)酶反应体系中生成天冬氨酸。因此，专利文献1中记载的方法严格来说不能称为天冬氨酸的发酵生产技术。
进而，对更适合于发酵生产的天冬氨酸脱氢酶也在进行探索，例如，在专利文献2中，发现了一种即便在常温下也发挥高催化剂活性的、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PA01株或富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)JM134株来源的天冬氨酸脱氢酶，并公开了一种使用所述天冬氨酸脱氢酶的L-天冬氨酸制造方法。更详细而言，在专利文献2中记载了：通过对表达所述规定的天冬氨酸脱氢酶的大肠杆菌进行甲苯处理而制备酶混合物，使用所述酶混合物并利用体外酶法制造天冬氨酸；以及使用导入有所述规定的天冬氨酸脱氢酶的大肠杆菌，通过以琥珀酸为基质的培养发酵来生产天冬氨酸。在专利文献2中，记载了在所述培养发酵中即便使用柠檬酸或葡萄糖来代替作为基质的琥珀酸，也确认到天冬氨酸的生成，但并未示出从这些基质向天冬氨酸的转换效率或反应速度等任何具体的数据，关于专利文献2中公开的技术是否能够称为适合于天冬氨酸的工业生产的技术，有诸多疑问。
此外，在专利文献2的背景技术一项中，记载了若使用专利文献3中公开的古细菌闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)来源的天冬氨酸脱氢酶，则能够获得天冬氨酸，但在专利文献2及专利文献3的任一者中，均未记载使用所述闪烁古生球菌来源的天冬氨酸脱氢酶实际制造出了天冬氨酸。
进而，在专利文献4中，公开了一种肠内细菌科细菌、及使用所述细菌制造L-天冬氨酸或由所述L-天冬氨酸衍生的代谢产物的方法，通过导入天冬氨酸脱氢酶来生产L-天冬氨酸或由所述L-天冬氨酸衍生的代谢产物。具体而言，专利文献4中公开的细菌是通过在大肠埃希菌(Escherichia coli)(大肠杆菌)等中导入来源于海栖热袍菌(Thermotogamaritima)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)等的各种异种性天冬氨酸脱氢酶基因而获得的重组体。在专利文献4中示出了：根据通过此种异种性天冬氨酸脱氢酶基因的导入而赋予了所述酶活性的大肠杆菌，L-天冬氨酸及其下游的代谢产物可得到一定程度的增加。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利特开2006-254795号公报
专利文献2：日本专利特开2010-183860公报
专利文献3：日本专利特开2006-254730号公报
专利文献4：日本专利特表2013-516958公报
专利文献5：日本专利特开2007-43947公报
专利文献6：日本专利特开平8-70860公报
专利文献7：日本专利特表2003-503064公报
非专利文献
非专利文献1：利萨诺夫B、卡布斯A、布罗克M、博特M(Litsanov B、Kabus A、Brocker M、Bott M).微生物生物技术(Microbial Biotechnology，Microb Biotechnol).2012年1月(2012Jan)；5(1)：116-28.
非专利文献2：陈振、布玛莱迪RR、弗兰克D、拉佩特S、曾AP(Chen Z，BommareddyRR，Frank D，Rappert S，Zeng AP).应用与环境微生物学(Applied and EnvironmentalMicrobiology，Appl Environ Microbiol).2014年2月(2014Feb)；80(4)：1388-93.
非专利文献3：和田M、泽田K、小仓K、下野Y、萩原T、杉本M、小贯A、横田A(Wada M、Sawada K、Ogura K、Shimono Y、Hagiwara T、Sugimoto M、Onuki A、Yokota A).生物科学与生物工程杂志(Journal of Bioscience and Bioengineering，J Biosci Bioeng).2016年2月(2016Feb)；121(2)：172-7.
非专利文献4：矢野M1、泉井K(Yano M1，Izui K).欧洲生物化学杂志(EuropeanJournal of Biochemistry，Eur J Biochem).1997年7月1日(1997Jul 1)；247(1)：74-81.
发明内容
发明所要解决的问题
如上所述，天冬氨酸被广泛用作作为医疗品、食品添加剂、人工甜味剂而利用的天冬苯丙二肽酯、及作为生物降解性树脂的聚天冬胺酸的原料等。除此之外，天冬氨酸在微生物中例如作为β丙氨酸、天冬酰胺等进一步的代谢物的中间物质而具有重要的作用，在由天冬氨酸派生的所述代谢物的发酵生产技术的开发中，可以说也重要的是强化至天冬氨酸为止的代谢体系。
然而，现状是，现在的天冬氨酸的工业生产是将由石油大量且廉价地合成的富马酸作为原料，利用以生物质(biomass)来源的糖为原料的发酵技术进行的天冬氨酸的工业生产尚未实现。
作为如上所述的天冬氨酸的工业生产尚未实现的理由，考虑如下问题：即便将工业上通用的大肠杆菌或棒状细菌等微生物在天冬氨酸生产菌株的制作中用作宿主，天冬氨酸脱氢酶基因相对于宿主而言也为外源基因，在其表达中会产生不良情况，无法在菌体内构建所预期的代谢途径等。在由申请人进行的研究开发中，也实际研究了天冬氨酸脱氢酶的使用，但即便将所述酶蛋白质编码基因导入至大肠杆菌或棒状细菌，也无法制作在菌体内如预想的那样生成天冬氨酸的菌株。实际上，如上所述，使用天冬氨酸脱氢酶发酵生产天冬氨酸的技术的报告不仅数量少，而且不存在实现了可应用于工业生产的程度的生产效率的报告，也未报告实际已经工业化。
因此，本发明的课题在于提供如下的技术：其代替使用天冬氨酸脱氢酶的所述现有方法，能够通过利用微生物的直接发酵而从糖源生产天冬氨酸或所述天冬氨酸所派生的代谢物，且能够实现可应用于工业生产的程度的生产效率。
此外，在专利文献4中，记载有一种使用以具有各种异种性的天冬氨酸脱氢酶的方式进行了修饰的大肠杆菌等来制造L-天冬氨酸或其下游的代谢产物的方法，且追加性地记载了使α-酮戊二酸脱氢酶等的一部分代谢酶失活，进而使磷酸烯醇丙酮酸羧化酶等的一部分代谢酶强化。然而，专利文献4中公开的技术原本便为依赖于在大肠杆菌等中表达出各种异种性的天冬氨酸脱氢酶的技术，因此可以说难以在菌体内实现所述异种性酶蛋白质的充分的表达量。因此，在专利文献4中未记载且未暗示涉及可应用于工业生产的天冬氨酸及相关代谢物的发酵生产的见解。
在专利文献5中公开了一种使用乳酸脱氢酶失活的棒状细菌的氨基酸的生产方法。然而，专利文献5原本便为关注总氨基酸的生产的技术，在所述专利文献中，未记载且未暗示涉及可应用于工业生产的天冬氨酸及相关代谢物的发酵生产的见解。
在专利文献6中公开了：制作在大肠埃希菌来源的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶中导入有变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的大肠杆菌及谷氨酸棒状杆菌、以及使用它们制造各种氨基酸，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有解除磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的由天冬氨酸引起的反馈抑制的变异。然而，在专利文献6中，仅记载了实际上生产谷氨酸及赖氨酸，未记载且未暗示涉及可应用于工业生产的天冬氨酸及相关代谢物的发酵生产的见解。
在专利文献7中，公开了一种导入有修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的谷氨酸棒状杆菌等重组细菌，所述修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因来源于紫苜蓿(alfalfa)，不需要乙酰CoA作为辅酶，且被赋予了相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制而脱敏的性质，专利文献7在形式上也记载了使用所述重组细菌的氨基酸的生产方法。然而，在专利文献7中，仅记载了实际上生产赖氨酸，未记载且未暗示涉及可应用于工业生产的天冬氨酸及相关代谢物的发酵生产的见解。
在非专利文献1中，示出了若在谷氨酸棒状杆菌中使琥珀酸脱氢酶(succinodehydrogenase，SDH)、丙酮酸：醌氧化还原酶(pyruvic acid:quinoneoxidoreductases，PQO)等规定的代谢酶失活，且使导入有规定的单一氨基酸置换的变异型丙酮酸羧化酶以及野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶过量表达，则琥珀酸的生产量提高。非专利文献1是公开了关注琥珀酸的生产的技术的文献，因此未记载且未暗示涉及可应用于工业生产的天冬氨酸及相关代谢物的发酵生产的见解。
在非专利文献2中示出了：在对源自谷氨酸棒状杆菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶实施N917G等规定的单一氨基酸置换的情况下，在维持所述酶活性的同时，与野生型相比，由天冬氨酸等引起的反馈抑制减少；以及在导入有实施了所述单一氨基酸变异的变异型ppc的谷氨酸棒状杆菌中，赖氨酸的生产量提高。在非专利文献2中仅示出了单纯使用所述变异型ppc进行的赖氨酸的生产，因此未记载且未暗示涉及可应用于工业生产的天冬氨酸及相关代谢物的发酵生产的见解。
在非专利文献3中，示出了：在对源自谷氨酸棒状杆菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶实施D299N等规定的单一氨基酸置换的情况下，在维持酶活性的同时，与野生型相比，由天冬氨酸或α-酮戊二酸等引起的反馈抑制减少；以及在导入有实施了所述单一氨基酸置换的变异型ppc的谷氨酸棒状杆菌中，谷氨酸及天冬氨酸的生产量提高。然而，本发明人通过再现试验进行确认的结果为，在非专利文献3记载的导入有所述变异型ppc的谷氨酸棒状杆菌中，无法实现充分量的天冬氨酸的生产量(例如，参照下述实施例一项)。因此，非专利文献3并非记载涉及可应用于工业生产的天冬氨酸及相关代谢物的发酵生产的见解的文献。
在非专利文献4中记载了：相对于大肠埃希菌来源的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，将第620位的赖氨酸置换为丝氨酸而成的变异型酶显示出减少了由天冬氨酸及苹果酸引起的反馈抑制的性质。非专利文献4仅是从酶反应速度论的观点出发，通过使用精制重组酶的体外分析，针对大肠埃希菌来源的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶调查氨基酸变异对所述反馈抑制的影响的学术论文。因此，非专利文献4并非记载涉及可应用于工业生产的天冬氨酸及相关代谢物的发酵生产的见解的文献。
解决问题的技术手段
本发明人为了解决所述课题进行了努力研究，结果发现，若在微生物中，使琥珀酸脱氢酶活性或富马酸还原酶活性、乳酸脱氢酶活性等规定的酶活性失活，并且赋予相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性的修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性，则天冬氨酸及其相关代谢产物的生成效率提高。本发明是根据所述见解而完成的。
即，根据本发明，提供以下内容。
[1]一种转基因微生物，满足下述条件(I)、条件(II)及条件(IV)中的至少一个，且满足下述条件(III)：
条件(I)与所述转基因微生物的对应野生型微生物相比，琥珀酸脱氢酶活性或富马酸还原酶活性经降低或失活；
条件(II)与所述野生型微生物相比，乳酸脱氢酶活性经降低或失活；
条件(III)具有修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性或外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性，所述修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相对于野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性，所述外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性与所述野生型微生物显示出的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相比，相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制的抵抗性更高；
条件(IV)与所述野生型微生物相比，丙酮酸：醌氧化还原酶活性经降低或失活。
此处，在若干实施方式中，可满足条件(I)、条件(II)及条件(IV)中的至少两个条件，在特定的实施方式中，可满足条件(I)及条件(II)两者、条件(I)及条件(IV)两者、或条件(II)及条件(IV)两者。
[2]一种转基因微生物，满足所有下述条件(I)～条件(III)：
条件(I)与所述转基因微生物的对应野生型微生物相比，琥珀酸脱氢酶活性或富马酸还原酶活性经降低或失活；
条件(II)与所述野生型微生物相比，乳酸脱氢酶活性经降低或失活；
条件(III)具有修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性或外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性，所述修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相对于野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性，所述外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性与所述野生型微生物显示出的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相比，相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制的抵抗性更高。
[3]根据[2]所述的转基因微生物，进而，作为条件(IV)，与所述野生型微生物相比，丙酮酸：醌氧化还原酶经降低或失活。
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的转基因微生物，其中，对细菌来源的变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的核酸以能够表达所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的形态导入，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有使所述转基因微生物满足条件(IV)的至少一个氨基酸变异。
此外，在本发明中，也可采用将[4]中“对细菌来源的变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的核酸”替换为“对微生物、植物、原核生物或细菌来源的外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的核酸”而成的实施方式。
[5]根据[4]所述的转基因微生物，其中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶来源于棒状细菌。
[6]根据[4]或[5]所述的转基因微生物，其中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶来源于属于棒状杆菌属的细菌。
[7]根据[4]至[6]中任一项所述的转基因微生物，其中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶中的所述至少一个氨基酸变异以序列号2所示的氨基酸序列为基准，且包括选自由下述(a)～(f)所示的氨基酸置换所组成的群组中的至少一个：
(a)相当于第299位的天冬氨酸的氨基酸向规定的氨基酸的氨基酸置换(其中，设为置换后的氨基酸不为天冬氨酸，且优选为向丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸或丝氨酸的氨基酸置换。)；
(b)相当于第653位的赖氨酸的氨基酸向规定的氨基酸的氨基酸置换(其中，设为置换后的氨基酸不为赖氨酸，且优选为向丙氨酸、天冬酰胺或丝氨酸的氨基酸置换。)；
(c)相当于第813位的赖氨酸的氨基酸向规定的氨基酸的氨基酸置换(其中，设为置换后的氨基酸不为赖氨酸，且优选为向丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸或丝氨酸的氨基酸置换。)；
(d)相当于第869位的丝氨酸的氨基酸向规定的氨基酸的氨基酸置换(其中，设为置换后的氨基酸不为丝氨酸，且优选为向丙氨酸、天冬酰胺或甘氨酸的氨基酸置换。)；
(e)相当于第873位的精氨酸的氨基酸向规定的氨基酸的氨基酸置换(其中，设为置换后的氨基酸不为精氨酸，且优选为向丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸或丝氨酸的氨基酸置换。)；及
(f)相当于第917位的天冬酰胺的氨基酸向规定的氨基酸的氨基酸置换(其中，设为置换后的氨基酸不为天冬酰胺，且优选为向丙氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸的氨基酸置换)，
其中，在所述(a)～所述(f)中，设为置换前的氨基酸与置换后的氨基酸不同。
[8]根据[4]至[7]中任一项所述的转基因微生物，其中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶中的所述至少一个氨基酸变异以序列号2所示的氨基酸序列为基准，且包括选自由下述(g)～(l)所示的氨基酸置换所组成的群组中的至少一个：
(g)相当于第299位的天冬氨酸的氨基酸向天冬酰胺的氨基酸置换；
(h)相当于第653位的赖氨酸的氨基酸向丝氨酸的氨基酸置换；
(i)相当于第813位的赖氨酸的氨基酸向规定的氨基酸的氨基酸置换(其中，设为置换后的氨基酸不为赖氨酸，且优选为向甘氨酸或丝氨酸的氨基酸置换。)；
(j)相当于第869位的丝氨酸的氨基酸向甘氨酸的氨基酸置换；
(k)相当于第873位的精氨酸的氨基酸向甘氨酸的氨基酸置换；及
(l)相当于第917位的天冬酰胺的氨基酸向规定的氨基酸的氨基酸置换(其中，设为置换后的氨基酸不为天冬酰胺，且优选为向丙氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸的氨基酸置换。)。
[9]根据[8]所述的转基因微生物，其中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶中的所述至少一个氨基酸变异包括所述(g)所示的氨基酸置换、以及所述(h)～所述(l)所示的氨基酸置换中的至少一个。
[10]根据[8]或[9]所述的转基因微生物，其中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶中的所述至少一个氨基酸变异包括所述(g)所示的氨基酸置换、以及所述(i)或所述(l)所示的氨基酸置换。
[11]根据[4]至[10]中任一项所述的转基因微生物，其中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有下述(A)、(B)及(C)的任一个所示的氨基酸序列：
(A)对序列号2～序列号13(优选为序列号2～序列号12，更优选为序列号2～序列号11)的任一个所示的氨基酸序列导入所述至少一个氨基酸置换而成的氨基酸序列；
(B)在所述(A)中规定的氨基酸序列中，一个或多个氨基酸经删除、置换和/或加成而成的氨基酸序列(其中，设为维持所述至少一个氨基酸置换。)；
(C)相对于所述(A)中规定的氨基酸序列而具有至少60％的序列同一性的氨基酸序列(其中，设为维持所述至少一个氨基酸置换。)。
[12]根据[11]所述的转基因微生物，其中，所述(A)中规定的氨基酸序列是对序列号2所示的氨基酸序列导入所述至少一个氨基酸置换而成的氨基酸序列。
[13]根据[4]至[12]中任一项所述的转基因微生物，其中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有对序列号2所示的氨基酸序列导入所述至少一个氨基酸置换而成的氨基酸序列。
[14]一种变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，相对于属于棒状细菌的微生物所保有的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列，具有能够降低所述野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制的氨基酸变异，
所述氨基酸变异以序列号2所示的氨基酸序列为基准，且至少包括：
(g)相当于第299位的天冬氨酸的氨基酸向天冬酰胺的氨基酸置换；以及
(i)相当于第813位的赖氨酸的氨基酸向规定的氨基酸的氨基酸置换(其中，设为置换后的氨基酸不为赖氨酸。)；或
(l)相当于第917位的天冬酰胺的氨基酸向规定的氨基酸的氨基酸置换(其中，设为置换后的氨基酸不为天冬酰胺。)，
与相对于所述野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列而仅具有所述(g)、所述(i)或所述(l)中规定的氨基酸置换的蛋白质相比，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶对由天冬氨酸引起的反馈抑制的抵抗性更高。
此处，在[14]的变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶中，在所述(i)中，相当于第813位的赖氨酸的氨基酸优选被置换为丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸或丝氨酸，进而更优选被置换为甘氨酸或丝氨酸，进而最优选被置换为丝氨酸。进而，在所述(l)中，相当于第917位的天冬酰胺的氨基酸优选被置换为丙氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸，更优选被置换为苯丙氨酸或甘氨酸。
[15]根据[14]所述的变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，相对于属于棒状杆菌属的微生物所保有的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列，具有所述氨基酸变异。
[16]根据[14]或[15]所述的变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，具有下述(J)、(K)及(L)的任一个所示的氨基酸序列：
(J)在序列号2～序列号13(优选为序列号2～序列号12，更优选为序列号2～序列号11)的任一个所示的氨基酸序列中，导入所述氨基酸置换而成的氨基酸序列；
(K)在所述(J)中规定的氨基酸序列中，一个或多个氨基酸经删除、置换和/或加成而成的氨基酸序列(其中，设为维持所述氨基酸置换。)；
(L)相对于所述(J)中规定的氨基酸序列而具有至少60％的序列同一性的氨基酸序列(其中，设为维持所述氨基酸置换。)。
[17]根据[16]所述的变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中，所述(J)中规定的氨基酸序列是对序列号2所示的氨基酸序列导入所述氨基酸置换而成的氨基酸序列。
[18]根据[14]至[17]中任一项所述的变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，具有对序列号2～序列号13(优选为序列号2～序列号12，更优选为序列号2～序列号11)的任一个所示的氨基酸序列导入所述氨基酸置换而成的氨基酸序列。
[19]一种核酸，对根据[14]至[18]中任一项所述的变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码。
[20]根据[19]所述的核酸，其为脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)片段。
[21]一种转基因微生物，导入有根据[19]或[20]所述的核酸。
[22]根据[21]所述的转基因微生物，满足下述条件(I)或条件(II)，且满足条件(III)：
条件(I)与所述转基因微生物的对应野生型微生物相比，琥珀酸脱氢酶活性或富马酸还原酶活性经降低或失活；
条件(II)与所述野生型微生物相比，乳酸脱氢酶活性经降低或失活；
条件(III)具有修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性或外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性，所述修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相对于野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性，所述外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性与所述野生型微生物显示出的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相比，相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制的抵抗性更高。
[23]根据[22]所述的转基因微生物，满足条件(I)及条件(II)两个条件。
[24]根据[22]或[23]所述的转基因微生物，满足条件(I)～条件(III)的所有条件。
[25]根据[1]至[13]及[21]至[24]中任一项所述的转基因微生物，满足条件(IV)：与所述转基因微生物的对应野生型微生物相比，丙酮酸：醌氧化还原酶经降低或失活。
[26]根据[1]至[13]及[21]至[25]中任一项所述的转基因微生物，其为属于细菌的转基因微生物。
[27]根据[1]至[13]及[21]至[26]中任一项所述的转基因微生物，其为属于革兰氏阳性菌的转基因微生物。
[28]根据[27]所述的转基因微生物，其为属于棒状细菌的转基因微生物。
[29]根据[28]所述的转基因微生物，其为属于棒状杆菌属的转基因微生物。
[30]根据[29]所述的转基因微生物，其为谷氨酸棒状杆菌的转基因菌株。
[31]根据[1]至[13]及[21]至[26]中任一项所述的转基因微生物，其为属于革兰氏阴性菌的转基因微生物。
[32]根据[31]所述的转基因微生物，其为属于埃希菌属的转基因微生物。
[33]根据[32]所述的转基因微生物，其为属于大肠埃希菌的转基因微生物。
[34]根据[31]至[33]中任一项所述的转基因微生物，还满足条件(V)：与所述野生型微生物相比，丙酮酸甲酸裂合酶活性经降低或失活。
[35]根据[1]至[13]及[21]至[34]中任一项所述的转基因微生物，其中，满足所述转基因微生物中的条件(I)和/或条件(II)和/或条件(IV)和/或条件(V)是通过在所述转基因微生物的染色体DNA上，将琥珀酸脱氢酶基因或富马酸还原酶基因的编码区域、和/或乳酸脱氢酶基因编码区域、和/或丙酮酸：醌氧化还原酶基因编码区域、和/或丙酮酸甲酸裂合酶基因编码区域完全或局部地破坏来实现。
[36]根据[1]至[13]及[21]至[35]中任一项所述的转基因微生物，其中，所述转基因微生物中的条件(I)和/或条件(II)和/或条件(IV)和/或条件(V)是通过在所述转基因微生物的染色体DNA上，将琥珀酸脱氢酶基因或富马酸还原酶基因的编码区域、和/或乳酸脱氢酶基因编码区域、和/或丙酮酸：醌氧化还原酶基因编码区域、和/或丙酮酸甲酸裂合酶基因编码区域各自的上游所存在的基因表达调节区域完全或局部地破坏来实现。
[37]一种生产目标物质的方法，包括：
(p)使用根据[1]至[13]及[21]至[36]中任一项所述的转基因微生物的菌体或其菌体处理物生成目标物质；以及
(q)回收所述目标物质。
[38]根据[37]所述的方法，其中，在工序(p)中，通过在所述转基因微生物实质上不增殖的还原条件下的反应介质(X)中，使所述转基因微生物的菌体或其菌体处理物反应来生成目标物质。
[39]根据[38]所述的方法，其中，所述反应介质(X)的氧化还原电位是处于-200毫伏至-500毫伏的范围内的规定值。
[40]根据[38]或[39]所述的方法，其中，所述反应介质(X)包含糖类。
[41]根据[38]至[40]中任一项所述的方法，其中，所述反应介质(X)包含葡萄糖。
[42]根据[37]至[41]中任一项所述的方法，其中，在工序(p)之前，还包括：
(p')在规定的培养基(Y)中，在好氧条件下对所述转基因微生物进行培养及增殖，
并将在工序(p')中增殖的所述转基因微生物的菌体或其菌体处理物供于工序(p)中。
[43]根据[37]至[42]中任一项所述的方法，其中，所述目标物质为草酰乙酸、苹果酸或在生物合成途径上经由这些化合物的代谢产物。
[44]根据[37]至[43]中任一项所述的方法，其中，所述目标物质为天冬氨酸或由所述天冬氨酸衍生的代谢产物。
[45]根据[37]至[44]中任一项所述的方法，其中，所述目标物质为天冬氨酸、β丙氨酸或天冬酰胺。
发明的效果
根据本发明，可提高天冬氨酸及由所述天冬氨酸派生的通过代谢途径生成的代谢物的生成效率，其结果，可提高目标物质的产率。此外，根据本发明，可提高糖类等起始基质向目标物质的转变效率，其结果，可实现生物加工(bioprocess)的节能化、成本削减、有效率的物质生产。
以下，例示在本发明的实施方式中可进一步采用的实施方式及变形例，并且也会提及本发明的优点及效果。
附图说明
图1是说明在本发明的若干实施方式中可采用的代谢途径的图。
图2A是示意性地表示实施例中使用的聚合酶链式反应(polymerase chainreaction，PCR)引物(primer)与各基因的位置关系的图。
图2B是示意性地表示实施例中使用的PCR引物与各基因的位置关系的图。
图2C是示意性地表示实施例中使用的PCR引物与各基因的位置关系的图。
图3A是表示对各种野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶蛋白质序列进行多重比对(multiple alignment)分析而得的结果的一部分的图。
图3B是表示通过图3A的多重比对分析而得的结果的另一部分的图。
图3C是表示通过图3A的多重比对分析而得的结果的又一部分的图。
图4是表示实施例中的试验例1的结果的图。
图5是表示实施例中的试验例2的结果的图。
图6是表示实施例中的试验例3的结果的图。
图7是表示实施例中的试验例4的结果的图。
具体实施方式
＜转基因微生物＞
根据本发明的第一实施方式，提供以下的转基因微生物。
一种转基因微生物，满足下述条件(I)、条件(II)及条件(IV)中的至少一个，且满足下述条件(III)：
条件(I)与所述转基因微生物的对应野生型微生物相比，琥珀酸脱氢酶活性或富马酸还原酶活性经降低或失活；
条件(II)与所述野生型微生物相比，乳酸脱氢酶活性经降低或失活；
条件(III)具有修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性或外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性，所述修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相对于野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性，所述外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性与所述野生型微生物显示出的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相比，相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制的抵抗性更高；
条件(IV)与所述野生型微生物相比，丙酮酸：醌氧化还原酶活性经降低或失活。
进而，根据本发明的第二实施方式，还提供下述转基因微生物。
一种转基因微生物，满足所有下述条件(I)～条件(III)：
条件(I)与所述转基因微生物的对应野生型微生物相比，琥珀酸脱氢酶活性或富马酸还原酶活性经降低或失活；
条件(II)与所述野生型微生物相比，乳酸脱氢酶活性经降低或失活；
条件(III)具有修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性或外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性，所述修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相对于野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性，所述外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性与所述野生型微生物显示出的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相比，相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制的抵抗性更高。
此外，以下有时将本发明第一实施方式所述的转基因微生物与发明第二实施方式所述的转基因微生物统称为“本发明的转基因微生物”或“本发明所述的转基因微生物”。
在本发明中，“转基因微生物”按照字面理解便足够，可理解为对微生物实施了某种转基因操作而成的微生物。更详细而言，此种转基因操作可为在对本发明的第一实施方式及第二实施方式所述的各转基因微生物分别规定的范围内，使得所述条件(I)～条件(IV)以规定的组合实现。
在本发明中，“微生物”按照字面理解便足够，更具体而言，在本发明中，“微生物”及“转基因微生物”可为菌类、或古细菌、蓝藻菌(cyanobacterium)细菌类等原核生物。在本发明中，“微生物”及“转基因微生物”优选为菌类或细菌类，更优选为细菌类。
作为菌类，可列举：酵母属酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母属酵母(例如，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、毕赤酵母属酵母(例如，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))、克鲁维酵母属酵母(乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis))、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、耶氏酵母属酵母(例如，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))、隐球菌属菌类(例如，隐球菌(Cryptococcus)sp.S-2)、曲霉菌属菌类(例如，米曲酶菌(Aspergillus oryzae))、拟酵母(Pseudozyma)属菌类(例如，南极拟酵母(Pseudozyma antarctica))等。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)等由于已经确立了转基因技术及异种蛋白质表达体系，因此在本发明中可便利地利用。
作为细菌类，例如可列举：埃希菌属菌(例如，大肠埃希菌(Escherichia coli))、芽孢杆菌属菌(例如，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、乳杆菌属菌(例如，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus))、梭菌属菌(例如，热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum))、红假单胞菌属(例如，沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris))、红细菌属菌(荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus))、以及下述详述的属于棒状细菌的细菌类。本发明中的“微生物”及“转基因微生物”优选为已经确立了转基因技术及蛋白质表达体系且能够在细胞实质上不增殖的还原条件下生产物质的埃希菌属菌或棒状细菌，更优选为大肠埃希菌或棒状细菌，最优选为棒状杆菌属菌。
进而，在若干实施方式中，本发明所述的转基因微生物是属于革兰氏阳性菌(例如，放线菌)的微生物。进而，在其他的若干实施方式中，本发明所述的转基因微生物也可为属于革兰氏阴性菌的微生物。革兰氏阴性菌具体而言是属于变形菌门(Proteobacteria)的微生物，更详细而言，包括属于阿尔法-变形菌纲、贝塔-变形菌纲、伽马-变形菌纲、德尔塔-变形菌纲、伊普西龙-变形菌纲或截塔-变形菌纲的微生物及属于Oligoflexia纲的微生物。作为可在本发明中优选地利用的革兰氏阴性菌的例子，可列举属于肠内细菌科、弧菌科或假单胞菌科的微生物。
此处，所谓“棒状细菌”，是指伯杰氏细菌鉴定手册(Bergey's Manual ofDeterminative Bacteriology，第8卷，p.599，1974年)中所定义的一群组微生物。
更详细而言，作为棒状细菌，可列举：棒状杆菌(Corynebacterium)属菌、短杆菌(Brevibacterium)属菌、节杆菌(Arthrobacter)属菌、分枝杆菌(Mycobacterium)属菌、微球菌(Micrococcus)属菌、微杆菌(Microbacterium)属菌等。
作为棒状杆菌属菌，例如可列举如下所述的种类及菌株。
谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)(例如，FERM P-18976株、ATCC13032株、ATCC31831株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株)；
醋谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)(例如ATCC15806株)；
嗜乙酰乙酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)(例如ATCC13870株)；
栖蜜糖棒状杆菌(Corynebacterium melassecola)(例如ATCC17965株)；
有效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)(例如YS-314株、YS-314T株(NBRC100395T株))；
解烷棒状杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)(例如ATCC21511株)；
帚石南棒状杆菌(Corynebacterium callunae)(例如ATCC15991株、NBRC15359株、DSM20147株)；
百合棒状杆菌(Corynebacterium lilium)(例如ATCC15990株)；
热产氨棒状杆菌(有效棒状杆菌)(Corynebacterium thermoaminogenes(Corynebacterium efficiens))(例如AJ12340株、FERM BP1539株)；
力士棒状杆菌(Corynebacterium herculis)(例如ATCC13868株)；
产氨棒状杆菌(停滞棒状杆菌(Corynebacterium stationis))(Corynebacteriumammoniagenes(产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)))(例如ATCC6871株、ATCC6872株、DSM20306株、NBRC12071T株、NBRC12072株、NBRC12612T株)；
污染棒状杆菌(Corynebacterium pollutisoli)；
海洋棒状杆菌(Corynebacterium marinum)(例如DSM44953株)；
腐殖质还原棒状杆菌(Corynebacterium humireducens)(例如NBRC106098株)；
耐盐棒状杆菌(Corynebacterium halotolerans)(例如YIM70093株)；
荒漠棒状杆菌(Corynebacterium deserti)(例如GIMN1.010株)；
道桑棒状杆菌(Corynebacterium doosanense)(例如CAU212株、DSM45436株)；
马里斯棒状杆菌(Corynebacterium maris)(例如DSM45190株)。
作为短杆菌属菌的具体例，例如可列举以下的种类及菌株。
散枝短杆菌(Brevibacterium divaricatum)(例如ATCC14020株)；
黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)[例如，MJ-233(FERM BP-1497)株、MJ-233AB-41(FERM BP-1498)株、ATCC13826株、ATCC14067株、ATCC13826株]；
未成熟短杆菌(Brevibacterium immariophilum)(例如ATCC14068株)；
乳糖发酵短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)(Brevibacterium lactofermentum(Corynebacterium glutamicum))(例如ATCC13869株)；
玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)(例如ATCC13825株)；
解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)(例如ATCC14066株)；
硫殖短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)(例如ATCC19240株)；
白色短杆菌(Brevibacterium album)(例如ATCC15111株)；
蜡状短杆菌(Brevibacterium cerinum)(例如ATCC15112株)。
作为节杆菌属菌的具体例，例如可列举如下所述的种类及菌株。
可列举球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)(例如，ATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株、NBRC3062株、NBRC12137T株)等。
作为微球菌属菌的具体例，可列举：弗氏微球菌(Micrococcus freudenreichii)[例如，No.239(FERM P-13221)株]；藤黄微球菌(Micrococcus luteus)[例如，NCTC2665株、No.240(FERM P-13222)株]；脲微球菌(Micrococcus ureae)(例如，IAM1010株)；玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)(例如，IFO3764株)等。
作为微杆菌属菌的具体例，为嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)(例如ATCC15354株)。
此外，所述棒状细菌菌株若为例如ATCC株，则可从提供所述菌株的美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)(邮箱(post office Box，P.O.Box)1549马纳萨斯(Manassas)，VA 20108USA)分售。关于其他菌株，也可从提供这些菌株的各微生物保存机构分售。
本发明所述的转基因微生物可通过对以上所例示的微生物实施规定的基因操作来制作。
〔关于条件(I)、条件(II)、条件(IV)及条件(V)〕
首先，对条件(I)、条件(II)及条件(IV)进行说明。
所谓条件(I)中的“与转基因微生物的对应野生型微生物相比，琥珀酸脱氢酶活性或富马酸还原酶活性经降低或失活”，是指在制作本发明所述的转基因微生物时，与用作起始材料的野生型微生物相比，琥珀酸脱氢酶活性或富马酸还原酶活性有意地经降低或者完全失活。此外，在棒状杆菌属菌等一部分细菌中，不具有富马酸还原酶，而是琥珀酸脱氢酶催化其反应，但在大肠杆菌等一部分细菌中，具有琥珀酸脱氢酶与富马酸还原酶这两种酶，且主要是富马酸还原酶催化所述反应。
进而，所谓条件(II)中的“与野生型微生物相比，乳酸脱氢酶活性经降低或失活”，是指在制作本发明所述的转基因微生物时，与用作起始材料的野生型微生物相比，乳酸脱氢酶活性有意地经降低或者完全失活。
除此之外，所谓条件(IV)中的“与野生型微生物相比，丙酮酸：醌氧化还原酶活性经降低或失活”，是指在制作本发明所述的转基因微生物时，与用作起始材料的野生型微生物相比，丙酮酸：醌氧化还原酶活性有意地经降低或者完全失活。
更具体而言，所述条件(I)、条件(II)及条件(IV)的意义如图1所示，分别依次是指在微生物的代谢途径中从琥珀酸向富马酸的代谢或其逆代谢(SdhCAB/FrdDCBA等)、从丙酮酸向乳酸的代谢(Ldh)、从丙酮酸向乙酸的代谢(PoxB；Pro)有意地经抑制或失活。
而且，在能够在好氧条件下增殖、且在还原条件(厌氧条件)下不增殖的微生物中，一般而言，在好氧条件下，图1所示的三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循环(柠檬酸回路)向右旋转地进行代谢，另一方面，在还原条件或厌氧条件下，TCA循环向左旋转地进行代谢。
即，当在本发明中采用满足条件(I)的实施方式时，在好氧条件下，从琥珀酸向富马酸的转变被抑制，因此，可有效率地产生更大量的柠檬酸、顺式(cis-)乌头酸、D-异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酰CoA、琥珀酸或由它们衍生的进一步的代谢产物，另一方面，在还原条件或厌氧条件下，可有效率地产生更大量的草酰乙酸、L-苹果酸、富马酸或由它们衍生的进一步的代谢产物。此处，由TCA循环中的所述代谢产物衍生的进一步的代谢产物可在满足条件(I)的本发明的转基因微生物中，经由野生型微生物原本所保持的代谢体系进行生物合成而得，也可经由通过进一步导入规定的基因而新构建的代谢体系进行生物合成而得。
继而，当在本发明中采用满足条件(II)的实施方式时，从丙酮酸向乳酸的转变被抑制，因此，从丙酮酸向草酰乙酸的代谢途径有效率地推进。其结果，根据所述实施方式，可有效率地进行草酰乙酸、L-苹果酸、富马酸或由它们衍生的进一步的代谢产物的生产。
进而，当在本发明中采用满足条件(IV)的实施方式时，从丙酮酸向乙酸的转变被抑制，因此，与满足条件(II)的实施方式同样地，从丙酮酸向草酰乙酸的代谢途径有效率地推进。其结果，根据所述实施方式，可有效率地进行草酰乙酸、L-苹果酸、富马酸或由此衍生的进一步的代谢产物的生产。因此，在满足条件(II)及条件(IV)两者的实施方式中，可更进一步提高草酰乙酸、L-苹果酸、富马酸或由它们衍生的进一步的代谢产物的生产效率，因此，可在本发明中优选地采用此实施方式。
在特定的实施方式中，本发明所述的转基因微生物满足条件(I)、条件(II)及条件(IV)中的至少两个条件。此情况下，本发明所述的转基因微生物优选满足条件(I)及条件(II)两者、条件(I)及条件(IV)两者、或条件(II)及条件(IV)两者，更优选为满足所有的条件(I)、条件(II)及条件(IV)。
在此种实施方式中，从丙酮酸朝向TCA循环的代谢途径以及TCA循环中的代谢有效率地进行，可有效率地生成TCA循环中的草酰乙酸、L-苹果酸、富马酸或由它们衍生的代谢产物、或者柠檬酸、cis-乌头酸、D-异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酰CoA、琥珀酸等下游的代谢产物，因此可有效率地实现所述代谢产物或由所述代谢产物通过进一步的代谢而衍生的物质的生产。
更详细而言，例如，在图1所示的实施方式中，在好氧条件下，可有效率地生产琥珀酸等下游的代谢产物或所述琥珀酸等所派生的代谢产物(例如，谷氨酸或谷氨酸所派生的代谢产物)，在还原条件下，可有效率地生产富马酸等下游的代谢产物或所述富马酸等所派生的代谢产物(例如，天冬氨酸或天冬氨酸所派生的代谢产物)。
接下来，对条件(V)进行说明。
在本发明中，并非必须满足条件(V)，但在特定的实施方式中，本发明所述的转基因微生物还满足下述条件(V)。
条件(V)：与野生型微生物相比，丙酮酸甲酸裂合酶活性经降低或失活。
此处，所谓条件(V)中的“与野生型微生物相比，丙酮酸甲酸裂合酶活性经降低或失活”，是指在制作本发明所述的转基因微生物时，与用作起始材料的野生型微生物相比，丙酮酸甲酸裂合酶活性有意地经降低或者完全失活。
特别是在本发明所述的转基因微生物为属于革兰氏阴性菌的微生物的情况下，优选为满足条件(V)。其理由如下。属于革兰氏阴性菌的野生型微生物表达出在革兰氏阳性菌中通常不会见到的丙酮酸甲酸裂合酶活性。如下所述，所述丙酮酸甲酸裂合酶活性制作出如下文所述由丙酮酸合成甲酸或乙酸等有机酸的次要生物合成途径。即，若使此种丙酮酸甲酸裂合酶活性降低或失活，则可阻断所述次要生物合成途径，因此可使朝向目标物质的代谢通量更稳固，可有效率地生产目标物质。
而且，所谓条件(I)所述的琥珀酸脱氢酶活性或富马酸还原酶活性、条件(II)所述的乳酸脱氢酶活性、条件(IV)所述的丙酮酸：醌氧化还原酶活性、及条件(V)所述的丙酮酸甲酸裂合酶活性，是指在制作本发明所述的转基因微生物时，用作起始材料的野生型微生物原本可示出的各酶活性。更详细而言，可通过基于基质与酶的反应种类的系统分类、及作为基于反应类别的国际酶分类而被人所知的EC编号来记述，各条件下的酶活性包括下述表1所示的酶活性。
[表1]
此处，满足条件(I)和/或条件(II)和/或条件(IV)和/或条件(V)可使用基因工程学及分子生物学的各种手法来实现。例如，相对于在下述表2～表10所例示的微生物中发现的琥珀酸脱氢酶基因或富马酸还原酶基因、乳酸脱氢酶基因、丙酮酸：醌氧化还原酶基因、丙酮酸甲酸裂合酶基因(甲酸乙酰转移酶基因)，可采用利用基因组(genome)上的以所述基因为靶的基因破坏或变异导入的手法、利用mRNA表达水平上的反义(antisense)抑制(反义核糖核酸(ribonucleic acid，RNA))的手法等。或者，以表达出抑制各酶活性的肽或蛋白质的方式实施基因操作而成的转基因微生物也包含于本发明中。又或者，在为了在微生物中表达出各酶活性而需要利用规定的内源性激活剂激活能够赋予各酶活性的酶蛋白质的工艺的情况下，也可通过使所述内源性激活剂失活来抑制各酶活性的表达，从而实现满足各条件。
然而，就能够比较简便且更切实地实现所述条件所述的各酶活性的降低或失活的方面而言，优选为使用基因破坏或变异导入的手法，更具体而言，优选为采用下述实施方式(I)～实施方式(IV)的任一个。
(I)在转基因微生物的基因组(染色体DNA)上，将能够赋予各酶活性的酶基因编码区域完全或局部地破坏，由此满足条件(I)和/或条件(II)和/或条件(IV)和/或条件(V)的实施方式。
(II)在转基因微生物的基因组上，将能够赋予各酶活性的酶基因编码区域的上游所存在的基因表达调节区域(例如启动子(promoter)区域)完全或局部地破坏，由此满足条件(I)和/或条件(II)和/或条件(IV)和/或条件(V)的实施方式。
(III)在转基因微生物的基因组上，对能够赋予各酶活性的酶基因编码区域分别导入诱发一个或多个氨基酸变异的核苷酸(nucleotide)变异，由此满足条件(I)和/或条件(II)和/或条件(IV)和/或条件(V)的实施方式。此处，“一个或多个氨基酸变异”是指能够造成各酶活性的降低或失活的氨基酸变异。
(IV)利用所述实施方式(I)～实施方式(III)中记载的方法，使激活能够赋予各酶活性的酶蛋白质的酶活性的内源性激活剂失活，由此满足条件(I)和/或条件(II)和/或条件(IV)和/或条件(V)的实施方式。
此外，当然可为了实现各条件中规定的各酶活性的降低或失活而分别独立地采用实施方式(I)～(IV)。除此之外，也可为了满足一个条件，特别是在不产生矛盾的范围内采用实施方式(I)～实施方式(IV)中的至少两个实施方式。例如，可为了满足条件(I)而采用实施方式(I)及实施方式(II)两者，更具体而言，可在微生物的基因组中将各基因的编码区域以及基因表达调节区域两者破坏。除此之外，例如，可为了满足条件(I)而采用实施方式(I)及实施方式(II)两者，且为了满足条件(II)而采用实施方式(III)。
此处，对转基因微生物中的基因编码区域及基因表达调节区域(靶区域)的破坏例如可通过同源重组法、基因组编辑技术(规律间隔成簇短回文重复序列及其关联(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated，CRISPR/CAS)系统)、转座子(transposons)法、变异导入法等手法来实现。在所述手法中，就能够比较廉价且有效率地实现靶区域的破坏的方面而言，便利的是采用同源重组法。以下示出利用同源重组的基因破坏法的例子。但需要注意的是，本发明所述的转基因微生物的制作方法并不限定于下述所示的手法，也可采用任何手法。
〔利用同源重组的基因破坏法〕
(1)决定应破坏的靶区域以及克隆此区域
棒状杆菌(Corynebacterium)属菌、埃希菌(Escherichia)属菌、芽孢杆菌(Bacillus)属菌、梭菌(Clostridium)属菌等多种细菌、以及酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)等各种菌类的全基因组序列已定，且也已知它们的核苷酸序列以及各基因要编码的蛋白质的氨基酸序列。
例如，就作为可在本发明中优选地利用的微生物之一的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)而言，在ATCC13032株、R株、ATCC21831株、ATCC14067株等多个菌株中，全基因组序列已定，且已知它们的核苷酸序列等。除此之外，关于有效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)YS-314株；帚石南棒状杆菌(Corynebacteriumcallunae)DSM20147株；产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)DSM20306株；海洋棒状杆菌(Corynebacterium marinum)DSM44953株；腐殖质还原棒状杆菌(Corynebacterium humireducens)NBRC106098株(DSM45392株)；耐盐棒状杆菌(Corynebacterium halotolerans)YIM70093株(DSM44683株)；荒漠棒状杆菌(Corynebacterium deserti)GIMN1.010株；马里斯棒状杆菌(Corynebacterium maris)DSM45190株；道桑棒状杆菌(Corynebacterium doosanense)CAU212株(DSM45436株)等棒状杆菌属菌株，全基因组序列已定，且已知它们的核苷酸序列等。进而，也存在虽然全基因组序列未定、但已知赋予条件(I)、条件(II)、条件(IV)及条件(V)所述的各酶活性的各酶基因的核苷酸序列以及所述酶的氨基酸序列的微生物。
所述已知的核苷酸序列及氨基酸序列可从美国国家生物技术信息中心支持中心(National Center for Biotechnology Information Support Center；NCBI)(美利坚合众国马里兰州贝塞斯达(Bethesda)·洛克维尔大道(Rockville Pike)8600)在因特网上公开的数据库(统一资源定位符(uniform resource locator，URL)：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)等各种数据库中容易地获取。
在下述表2～表10中，例示在制作本发明所述的转基因微生物时作为起始材料的微生物、以及在所述微生物中为了使条件(I)和/或条件(II)和/或条件(IV)和/或条件(V)所述的酶活性降低或失活而可予以破坏等的基因等的信息。此外，可在本发明中利用的微生物、以及为了使各酶活性降低或失活而可设为靶的各基因的信息等当然并不限定于下述表所示的信息。
[表2]
[表3]
(续表2)
[表4]
[表5]
(续表4)
[表6]
进而，关于针对全基因组序列已确定的各种棒状杆菌属菌而确认了sdhCABD基因、ldh基因及poxB基因的同源(homolog)基因的细菌，将基因库(GenBank)识别符(identifier，ID)的登记号(accession number)等信息示于表7～表10。
[表7]
[表8]
[表9]
[表10]
对细菌所保有的各酶基因进行说明，琥珀酸脱氢酶活性、富马酸还原酶活性、乳酸脱氢酶活性、丙酮酸：醌氧化还原酶活性、及丙酮酸甲酸裂合酶活性分别依次为在野生型菌株中发现的琥珀酸脱氢酶(Sdh)、富马酸还原酶(Frd)、乳酸脱氢酶(Ldh)、丙酮酸：醌氧化还原酶(Pox或Pqo)、及丙酮酸甲酸裂合酶(Pfl)所显示出的酶活性。这些酶所涉及的蛋白质分别可被表述为sdhCAB(根据菌种的不同而为sdhCABD)、ldhA、dld及lldD等(对显示出乳酸脱氢酶活性的酶蛋白质进行编码的基因)、poxB(pqo)、及pflABCD的基因等(参照表2～表10)编码。
此外，在细菌中，关于琥珀酸脱氢酶(Sdh)，其为包含被sdhC基因编码的跨膜蛋白质(亚基(subunit)C)、被sdhA基因编码的黄素蛋白质亚基(亚基A)及被sdhB基因编码的Fe-S蛋白质(亚基B)这三个亚基蛋白质、以及视情况的SdhD(亚基D)的复合体，对所述亚基进行编码的各基因在原核生物的情况下，在细菌基因组上构成操纵子(operon)(例如，图2B)。除此之外，富马酸还原酶(Frd)例如在大肠埃希菌等细菌中为包含亚基D、亚基C、亚基B、亚基A的复合体，且经frdDCBA基因(操纵子)编码。进而，丙酮酸甲酸裂合酶(Pfl)例如在大肠埃希菌等细菌中为包含亚基A、亚基B、亚基C、亚基D的复合体，且经pflABCD基因(操纵子)编码。
如上所述，便利的是使用条件(I)、条件(II)、条件(IV)及条件(V)所述的各酶基因的编码区域及其周边区域的核苷酸序列以及蛋白质序列已知的微生物。其原因在于，通过参照这些已知序列，可容易地确定应破坏的基因组区域。然而，在制作本发明所述的重组微生物时，可用作起始材料的微生物当然并不限定于如上所述基因组核苷酸序列等已知的微生物，也可利用所述酶蛋白质编码区域或其周边区域未知的微生物。
在利用各酶蛋白质编码区域或其周边区域未知的微生物的情况下，例如，利用各种基因工程学技术的手法适宜地克隆各酶基因的编码区域，并根据需要决定核苷酸序列等，如此便可确定并克隆应破坏的区域。例如，若进行相对于已知的同源酶蛋白质的氨基酸序列(表2～表10)的比对分析，则会发现多个一定的氨基酸保守区域。而且，若针对在所述酶蛋白质的N末端侧与C末端侧发现的氨基酸保守区域分别设计简并引物(degenerateprimer)并将设为克隆对象的微生物的基因组DNA作为模板、将所述简并引物设为一对来进行简并PCR法，则也可对作为对象的酶基因的一部分编码区域进行扩增、克隆。然后，适宜地决定所述一部分编码区域的核苷酸序列，并且基于后述的基因破坏株的制作方法等，将所克隆的一部分编码区域作为基因破坏的对象，来制作使得条件(I)、条件(II)、条件(IV)及条件(V)满足的本发明所述的转基因微生物即可。另一方面，当欲制作在作为对象的酶基因全长上的编码区域或其周边的基因表达调节区域的整个区域中均经破坏的转基因微生物的情况下，可设为：在如上所述地决定了核苷酸序列的酶基因的一部分内部编码区域中反向地适宜设计引物，使用反向PCR法等手法，对作为对象的酶基因全长上的编码区域或其周边区域进行克隆，并决定所述区域的核苷酸序列。此种基于PCR的克隆手法可简便地克隆应破坏的基因组区域，就此方面而言便利，但作为其他手法，也可制作作为对象的微生物的基因文库(gene library)，并设计适当的探针，利用各种杂交(hybridization)法，对作为破坏对象的酶基因及其周边区域进行克隆，并决定它们的核苷酸序列。进而，关于无法利用同源基因的序列的微生物种类，可依照现有方法将蛋白质精制技术与各酶活性测定法加以组合来鉴定靶酶，并局部地决定肽序列等，然后利用以上各种遗传工程学手法对靶酶基因进行克隆。
(2)基因破坏用质粒载体(plasmid vector)的制作及利用同源重组的基因(编码区域/表达控制区域等)破坏
继而，关于条件(I)、条件(II)、条件(IV)及条件(V)所述的酶基因的破坏，对使用同源重组法的基因破坏株的制作方法进行说明。
首先，需要制作可与基因组上所欲破坏的区域产生同源重组的基因破坏用质粒载体。
作为此种基因破坏用质粒载体的一例，可列举：在通过对微生物基因组上所欲破坏的区域进行克隆而得的质粒载体中，向所述所欲破坏的区域的内部插入卡那霉素(Kanamycin)抗性基因等药物抗性基因而成的基因破坏用质粒载体。根据此种基因破坏用质粒载体，在药物抗性基因的两侧分别存在与微生物的基因组上所欲破坏的区域相同的区域。因此，相对于微生物的基因组上所欲破坏的区域，在插入药物抗性基因的形态下在微生物基因组与基因破坏用质粒之间发生同源重组，因此可实现靶酶基因的破坏。除此之外，也可通过向培养基中添加所述药物抗性基因所涉及的药物来有效率地选择基因破坏株。
作为基因破坏用质粒载体的另一例，也可利用包含位于微生物基因组上所欲破坏的部分的两侧的区域(即，欲从基因组上去除的区域的5'上游与3'下游)串联地连结而成的片段的质粒载体。此种破坏用质粒例如可通过以下方式获取：利用PCR法，分别对设为破坏的靶的酶基因的5'上游区域与3'下游区域进行扩增，且在这些片段串联地连结的形态下，插入至质粒载体的多克隆位点(multi cloning site)等规定的部位。或者，也可利用PCR法对所欲破坏的酶基因的5'上游至3'下游的整个区域进行扩增，并使用各种质粒载体进行克隆，然后在所克隆的区域内部设计反向的引物，利用反向PCR法，制作导入有所述酶基因的缺失变异的基因破坏用质粒载体。
在基因破坏用质粒中，与设为基因破坏的对象的微生物基因组序列相同的区域的序列长度只要可产生同源重组，则不受限定，但一般可为约500bp以上，优选为约1000bp左右。进而，基因破坏用质粒若可使用克隆用大肠杆菌来构建，则构建作业将变得简便，因此便利的是具有大肠杆菌的复制起点。进而，基因破坏用质粒优选为不存在能够在作为基因破坏的靶的微生物中进行自主复制的复制起点。在基因破坏用质粒中具有所述微生物的复制起点的情况下，建议在通过限制酶处理等将所述复制起点去除后再导入棒状细菌中。除此之外，基因破坏用质粒也可使用如下的基因破坏用质粒：其是将能够利用药物进行选择的药物抗性基因、与在蔗糖存在下可产生抑制革兰氏阴性菌的生长的毒素的SacB基因等能够进行正选择(positive selection)的致死性基因组合而成。若使用此种基因破坏用质粒，则通过利用药物进行的选择而将发生了同源重组的菌株分离，然后，通过在含有蔗糖的培养基中培养而进行选择，如此便可分离出在第二次同源重组中排除了载体部分的基因破坏株，因此可有效率地获取基因破坏株。
基因破坏用质粒载体向微生物中的导入并无特别限定，使用根据各种微生物确立的转化方法即可。例如，若就在本发明中优选地采用的棒状细菌而言，则便利的是使用电脉冲法(例如，范德雷斯特等人(Van der Rest et al.).应用微生物学与生物技术(AppliedMicrobiology and Biotechnology，Appl.Microbiol Biotechnol)52，PP541-545，1999中记载的方法)进行。其原因在于，根据电脉冲法，可有效率地向棒状细菌细胞内导入核酸。
此外，可基于PCR法、萨瑟恩杂交(Southern hybridization)法、各种酶活性测定法等来实施对转基因微生物的基因组上的靶区域破坏的确认。
通过利用所述基因破坏的手法，能够比较简易地制作出条件(I)和/或条件(II)和/或条件(IV)和/或条件(V)所述的酶活性经降低或失活的转基因微生物。
〔关于条件(III)〕
本发明所述的转基因微生物还可满足作为条件(III)的“具有修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性或外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性，所述修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相对于野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性，所述外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性与所述野生型微生物显示出的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相比，相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制的抵抗性更高”。
关于条件(III)中的“相对于野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制的抵抗性”的含义，如以下所说明。
首先，在本发明中，所谓“磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性”具体而言是指催化EC4.1.1.31中规定的反应的酶活性，且是通过多种多样的植物及微生物所广泛保有的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvic carboxylase，PEPC)而发挥的酶活性。以下，示出PEPC催化的代谢反应。
[化1]
此处，已知野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶因天冬氨酸、苹果酸、α-酮戊二酸(2-氧代戊二酸)等代谢产物而受到别构效应(allosteric effect)，所述酶活性受到抑制，所述酶活性的抑制被称为“反馈抑制”(非专利文献2～非专利文献4)。即，本发明的“修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性”是通过以下的酶特性来定义，即，与对应的野生型微生物及所述微生物所保有的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶相比，本发明所述的转基因微生物在显示出磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性的同时，在所述酶活性中由天冬氨酸引起的反馈抑制有意地经降低。
继而，关于“外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性与野生型微生物显示出的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相比，相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制的抵抗性更高”的用语的含义，如下所述。
即，所述用语是指：外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性与本发明所述的转基因微生物所属种类的对应野生型微生物、或在制作本发明所述的转基因微生物时用作起始材料的野生型微生物所保有的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶显示出的“相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制的抵抗性”相比，相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制的抵抗性更高。具体而言，此种外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性可由与所述“对应野生型宿主微生物”不同的菌株系统或生物种类所保有的异种性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶赋予。此处，“与野生型宿主微生物不同的生物种类”包括微生物(例如，菌类、古细菌或细菌等原核生物)、植物、哺乳类等动物等各种生物种类。进而，更具体而言，本发明所述的转基因微生物中的“外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性”的赋予可通过导入从“与野生型宿主微生物不同的菌株系统或生物种类”中分离出的对PEPC基因进行编码的核酸来实现。
此外，关于“修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(活性)”“相对于野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性”、以及“外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(活性)”“与野生型微生物显示出的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相比，相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制的抵抗性更高”，例如可通过利用非专利文献2～非专利文献4中记载的方法；吉永,T.泉井,K与胜生,H(Yoshinaga,T.Izui，K and Katsuki，H)生物化学杂志(Journal of Biochemistry，J.Biochem),68,747-750(1970)中记载的测定方法等进行确认。
除此之外，在本说明书中，有时将“磷酸烯醇丙酮酸羧化酶”表示为“PEPC”或“ppc”。
更详细而言，在本发明所述的转基因微生物中，条件(III)的满足也无特别限定，可通过如下的实施方式来实现。即，可利用基因工程学手法对各种微生物所保持的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的蛋白质序列导入氨基酸变异，由此人为地制作对变异型酶进行编码的基因，所述变异型酶在维持“磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性”的同时，“相对于野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制”而获得了“抵抗性”。例如，可利用基于易错(error prone)PCR的随机变异导入法、基于使用了变异引物的PCR的部位特异性变异导入法等碱基置换技术。进而，也可通过对多种野生型PEPC编码DNA应用DNA混编(shuffling)等分子进化的手法来制作优越性更高的变异型PEPC。
将对如上所述地获取的变异型PEPC进行编码的核酸导入各种微生物中，可制作满足(III)的转基因微生物。更具体而言，将对变异型PEPC进行编码的核酸以能够表达所述变异型PEPC的形态导入各种微生物中即可。在此技术领域中，在以棒状细菌为首的许多微生物种类中，已经确立了对于各微生物种类而言优选的基因表达系统。关于能够利用这些已知的基因表达系统所涉及的技术的微生物，为了向所述微生物导入所述变异型PEPC，可利用这些已知技术。但是，当然也可独自开发转基因技术及基因表达系统技术，并将这些技术用于向微生物导入变异型PEPC。
在本发明所述的转基因微生物中，使得(III)满足的变异型PEPC也无特别限定，优选为对细菌来源的野生型PEPC导入规定的变异而成的变异型酶。进而，所述变异型PEPC是对优选为棒状细菌来源、更优选为棒状杆菌属菌来源的野生型PEPC导入规定的变异而成的变异型酶。
在以下的表11中，列举在本发明中优选地利用的细菌来源的PEPC的例子。
[表11]
更详细而言，作为使得条件(III)满足的变异型PEPC的具体结构，例如设想有下述实施方式(i)及实施方式(ii)。
(i)相对于野生型PEPC的氨基酸序列，将一个或多个氨基酸删除、置换或加成而成的变异型PEPC。此处，“一个或多个”的范围例如为1个至100个、1个至50个、1个至30个，优选为至少两个以上、2个至20个，更优选为2个至10个，进而更优选为2个至5个，特别优选为2个至4个、2个至3个，例如为2个。
(ii)将两种以上的野生型PEPC的氨基酸序列的一部分组合而构成的嵌合(chimera)型PEPC。
在若干实施方式所述的转基因微生物中，对细菌来源的变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的核酸以能够表达所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的形态被导入，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有使得所述转基因微生物满足条件(III)的至少一个氨基酸变异。此处，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶优选为来源于棒状细菌或棒状杆菌属菌或埃希菌属菌的变异型PEPC，更优选为来源于棒状杆菌属菌的变异型PEPC，特别优选为来源于谷氨酸棒状杆菌的变异型PEPC。
进而，在特定的实施方式中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶中的所述至少一个氨基酸变异以序列号2所示的氨基酸序列为基准，且包括选自由下述(a)～(f)所示的氨基酸置换所组成的群组中的至少一个。
(a)相当于第299位的天冬氨酸的氨基酸向规定的氨基酸的氨基酸置换(其中，设为置换后的氨基酸不为天冬氨酸，且优选为向丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸或丝氨酸的氨基酸置换。)；
(b)相当于第653位的赖氨酸的氨基酸向规定的氨基酸的氨基酸置换(其中，设为置换后的氨基酸不为赖氨酸，且优选为向丙氨酸、天冬酰胺或丝氨酸的氨基酸置换。)；
(c)相当于第813位的赖氨酸的氨基酸向规定的氨基酸的氨基酸置换(其中，设为置换后的氨基酸不为赖氨酸，且优选为向丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸或丝氨酸的氨基酸置换。)；
(d)相当于第869位的丝氨酸的氨基酸向规定的氨基酸的氨基酸置换(其中，设为置换后的氨基酸不为丝氨酸，且优选为向丙氨酸、天冬酰胺或甘氨酸的氨基酸置换。)；
(e)相当于第873位的精氨酸的氨基酸向规定的氨基酸的氨基酸置换(其中，设为置换后的氨基酸不为精氨酸，且优选为向丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸或丝氨酸的氨基酸置换。)；及
(f)相当于第917位的天冬酰胺的氨基酸向规定的氨基酸的氨基酸置换(其中，设为置换后的氨基酸不为天冬酰胺，且优选为向丙氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸的氨基酸置换。)，
其中，在所述(a)～所述(f)中，设为置换前的氨基酸与置换后的氨基酸不同。
即，此处，所述(a)～(f)所示的氨基酸的主旨为：以序列号2所示的氨基酸序列中所含的氨基酸为基准，在设为变异导入的对象的PEPC氨基酸序列中确定氨基酸置换部位。即，所谓所述(a)～所述(f)中的“相当于···的氨基酸”，更具体而言是指如下的氨基酸：在利用克拉斯托W(ClustalW)或克拉斯托X(ClustalX)(生物信息学，第23卷，第21期，2008年11月，第2947-2948页；生物信息学，第23卷，第21期，2007年11月1日，第2947-2948页(Bioinformatics，Volume23，issue 21，1November 2007，pp2947-2948))等手法，相对于序列号2所示的氨基酸序列而基于作为变异导入的对象的PEPC氨基酸序列的同一性来进行一对一的对齐(成对比对(pairwise alignment))的情况下，与所述(a)～所述(g)所示的氨基酸一对一地对齐的氨基酸。
在图3A～图3B中示出如下例子：相对于来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株的野生型PEPC的氨基酸序列(序列号2)，针对表11所示的其他11种棒状杆菌属菌的野生型PEPC蛋白质序列(序列号3～序列号13)，利用克拉斯托W(ClustalW)进行多重比对分析，确定出所述(a)～所述(f)中被置换的氨基酸。
如图3A所示，所述(a)中的“相当于第299位的天冬氨酸的氨基酸”在属于棒状杆菌属的9种野生型PEPC中均为天冬氨酸(D)，在作为棒状细菌的一种的球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)NBRC12137株的野生型PEPC中为苏氨酸(T)，在大肠埃希菌(Escherichia coli)K-12株的野生型PEPC中为谷氨酸(E)。进而，如图3B所示，就属于棒状杆菌属的9种野生型PEPC而言，所述(b)中的“相当于第653位的赖氨酸的氨基酸”在产氨棒状杆菌(C.ammoniagenes)中为精氨酸(R)，在道桑棒状杆菌(C.doosanense)中为组氨酸(H)，但在其他菌种中，全部与作为基准的序列中的赖氨酸(K)相同。进而，如图3C所示，所述(c)中的“相当于第813位的赖氨酸的氨基酸”在所有菌种中均相同而为作为基准的序列中的赖氨酸(K)。进而，如图3C所示，所述(d)中的“相当于第869位的丝氨酸的氨基酸”在所有菌种中均相同而为作为基准的序列中的丝氨酸(S)。进而，如图3C所示，所述(e)中的“相当于第873位的精氨酸的氨基酸”在所有菌种中均相同而为作为基准的序列中的精氨酸(R)。除此之外，如图3C所示，所述(f)中的“相当于第917位的天冬酰胺的氨基酸”在产氨棒状杆菌(C.ammoniagenes)中为“苏氨酸”，在道桑棒状杆菌(C.doosanense)中为为缬氨酸(V)，在其他菌种中全部相同而为作为基准的序列中的天冬酰胺(N)。
此外，例如，有时将“第299位的天冬氨酸”利用氨基酸的单字母表述而表示为“D299”，将“第299位的天冬氨酸向天冬酰胺的氨基酸置换”表示为“D299N”。其他氨基酸及氨基酸置换也可利用同样的方法来表述。
在更优选的实施方式中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶中的所述至少一个氨基酸变异以序列号2所示的氨基酸序列为基准，且包括选自由下述(g)～(l)所示的氨基酸置换所组成的群组中的至少一个。
(g)相当于第299位的天冬氨酸的氨基酸向天冬酰胺的氨基酸置换；
(h)相当于第653位的赖氨酸的氨基酸向丝氨酸的氨基酸置换；
(i)相当于第813位的赖氨酸的氨基酸向规定的氨基酸的氨基酸置换(其中，设为置换后的氨基酸不为赖氨酸，且优选为向甘氨酸或丝氨酸的氨基酸置换)；
(j)相当于第869位的丝氨酸的氨基酸向甘氨酸的氨基酸置换；
(k)相当于第873位的精氨酸的氨基酸向甘氨酸的氨基酸置换；及
(l)相当于第917位的天冬酰胺的氨基酸向规定的氨基酸的氨基酸置换(其中，设为置换后的氨基酸不为天冬酰胺，且优选为向丙氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸的氨基酸置换。)。
在进而更优选的实施方式中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶中的所述至少一个氨基酸变异包括所述(g)所示的氨基酸置换、以及所述(h)～所述(l)所示的氨基酸置换中的至少一个。
进而，在另一优选的实施方式中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶中的所述至少一个氨基酸变异包括所述(g)所示的氨基酸置换、以及所述(i)～所述(l)所示的氨基酸置换中的至少一个。
除此之外，在特别优选的实施方式中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶中的所述至少一个氨基酸变异包括所述(g)所示的氨基酸置换、以及所述(i)或所述(l)所示的氨基酸置换。
进而，在另一实施方式中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶可为具有下述(A)～(C)的任一个所示的氨基酸序列的变异型PEPC。
(A)在序列号2～序列号13(优选为序列号2～序列号12，更优选为序列号2～序列号11)的任一个所示的氨基酸序列中，导入选自由所述(a)～(l)所示的氨基酸置换所组成的群组中的至少一个而成的氨基酸序列(其中，设为置换前的氨基酸与置换后的氨基酸不同。)；
(B)在所述(A)中规定的氨基酸序列中，一个或多个氨基酸经删除、置换和/或加成而成的氨基酸序列(其中，设为维持所述至少一个氨基酸置换。)；
(C)相对于所述(A)中规定的氨基酸序列而具有至少60％的序列同一性的氨基酸序列(其中，设为维持所述至少一个氨基酸置换。)。
进而，在又一实施方式中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶可为具有下述(D)～(F)的任一个所示的氨基酸序列的变异型PEPC。
(D)在序列号2～序列号13(优选为序列号2～序列号12，更优选为序列号2～序列号11)的任一个所示的氨基酸序列中，导入所述(g)所示的氨基酸置换、以及所述(h)～所述(l)所示的氨基酸置换中的至少一个而成的氨基酸序列(其中，设为置换前的氨基酸与置换后的氨基酸不同。)；
(E)在所述(D)中规定的氨基酸序列中，一个或多个氨基酸经删除、置换和/或加成而成的氨基酸序列(其中，设为维持所述各氨基酸置换。)；
(F)相对于所述(D)中规定的氨基酸序列而具有至少60％的序列同一性的氨基酸序列(其中，设为维持所述各氨基酸置换。)。
进而，在又一实施方式中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶可为具有下述(G)～(I)的任一个所示的氨基酸序列的变异型PEPC。
(G)在序列号2～序列号13(优选为序列号2～序列号12，更优选为序列号2～序列号11)的任一个所示的氨基酸序列中，导入所述(g)所示的氨基酸置换、以及所述(i)～所述(l)所示的氨基酸置换中的至少一个而成的氨基酸序列(其中，设为置换前的氨基酸与置换后的氨基酸不同。)；
(H)在所述(G)中规定的氨基酸序列中，一个或多个氨基酸经删除、置换和/或加成而成的氨基酸序列(其中，设为维持所述各氨基酸置换。)；
(I)相对于所述(G)中规定的氨基酸序列而具有至少60％的序列同一性的氨基酸序列(其中，设为维持所述各氨基酸置换。)。
进而，在又一实施方式中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶可为具有下述(J)～(L)的任一个所示的氨基酸序列的变异型PEPC。
(J)在序列号2～序列号13(优选为序列号2～序列号12，更优选为序列号2～序列号11)的任一个所示的氨基酸序列中，导入所述(g)所示的氨基酸置换、以及所述(i)或所述(l)所示的氨基酸置换而成的氨基酸序列(其中，设为置换前的氨基酸与置换后的氨基酸不同。)；
(K)在所述(J)中规定的氨基酸序列中，一个或多个氨基酸经删除、置换和/或加成而成的氨基酸序列(其中，设为维持所述各氨基酸置换。)；
(L)相对于所述(J)中规定的氨基酸序列而具有至少60％的序列同一性的氨基酸序列(其中，设为维持所述各氨基酸置换。)。
此处，在所述(B)、所述(E)、所述(H)及所述(K)中，“一个或多个”的范围例如为1个至100个、1个至50个、1个至30个，优选为1个至20个、1个至15个、1个至10个，更优选为1个至9个、1个至8个、1个至7个、1个至6个、1个至5个、1个至4个、1个至3个、1个至2个。
除此之外，在所述(C)、所述(F)、所述(I)及所述(L)中，“至少60％”优选被替换成至少70％，更优选被替换成至少80％，进而更优选被替换成至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。
除此之外，特别优选为在所述(A)、所述(D)、所述(G)及所述(J)中，将“序列号2～序列号13(优选为序列号2～序列号12，更优选为序列号2～序列号11)的任一个所示的氨基酸序列”替换成“序列号2所示的氨基酸序列”(即，谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株的野生型PEPC氨基酸序列)的实施方式。
此外，在所述各实施方式中，具有所述(A)～所述(L)的任一个中规定的氨基酸序列的变异型PEPC保持磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、且使得条件(III)满足的主旨并未改变。
进而，在特定的实施方式中，在本发明所述的转基因微生物中，例如，天冬氨酸脱氢酶(AspDH，EC 1.4.1.21)、天冬氨酸氨基转移酶(AspC，EC2.6.1.1)及所述天冬氨酸氨裂合酶(aspartate ammonia-lyase)(AspA，EC4.3.1.1)(参照图1)可经强化，更具体而言，为了强化这些酶活性，可追加地导入对这些酶进行编码的基因。作为被导入本发明的重组棒状细菌中的酶基因，例如可列举如专利文献2及专利文献2、其他日本专利特开2016-516435等中公开的酶基因。这些现有技术文献的公开内容也援用于本说明书中。
根据适宜地采用了所述各实施方式的转基因微生物，可更有效率地将糖类等起始基质用于目标物质的生产，可期待天冬氨酸或天冬氨酸所派生的代谢产物等目标物质的生产效率的显著提高。
＜生产目标物质的方法＞
根据本发明的第三实施方式，提供以下的生产目标物质的方法。
一种生产目标物质的方法，包括：
(p)使用本发明所述的转基因微生物的菌体或其菌体处理物生成目标物质；以及
(q)回收所述目标物质。
在若干实施方式中，在工序(p)中，可通过对本发明所述的转基因微生物在实质上能够增殖的好氧条件下进行培养来产生目标物质。在好氧条件下，在棒状细菌中，图1所示的TCA循环顺时针地进行代谢，因此，只要考虑到了此情况、同时根据作为靶的所欲生产的目标物质的种类而在好氧条件下进行物质生产的实施方式是优选的，则选择此实施方式即可
另一方面，例如大肠埃希菌(E.coli)等埃希菌属菌或棒状细菌等微生物在还原条件下的培养基或反应液中实质上不伴有增殖，而是还原条件下特有的代谢体系发挥作用。因此，若如上所述在还原条件下的培养基或反应液中使本发明的棒状细菌或其菌体处理物反应，则可消除由菌体细胞的增殖分裂引起的营养源的浪费，可提高营养源向目标物质的转变效率。除此之外，关于本发明所述的转基因微生物，由于条件(I)、条件(II)及条件(IV)中的一个以上的酶活性经降低或失活，并且保持了相对于由代谢产物引起的反馈抑制而显示出抵抗性的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性，因此，在营养源向目标物质的转变效率方面预计会有格外显著的提高。进而，根据在此种微生物实质上不增殖的还原条件下推进反应的实施方式，与伴有细胞的分裂/增殖的好氧条件下的生物加工相比，可防止发酵热的产生，进而也不需要确保培养时的充分的曝气(aeration)，因此，可实现生物加工所需的设备的简化及能量的降低，对地球环境友好，也有助于成本削减。
因此，在工序(p)中，优选通过在转基因微生物实质上不增殖的还原条件下的反应介质(X)中，使所述转基因微生物的菌体或其菌体处理物反应来产生目标物质。
关于工序(p')
进而，在更优选的实施方式中，本发明的方法在工序(p)之前，还包括：
(p')在规定的培养基(Y)中，在好氧条件下对所述转基因微生物预先进行培养及增殖，
并将在工序(p')中增殖的所述转基因微生物的菌体或其菌体处理物供于工序(p)中。
像这样在本发明的方法中包含工序(p')的实施方式是即便在好氧条件下的物质生产的实施方式中也会设想的实施方式，但特别优选为适用于在转基因微生物实质上不增殖的还原条件下的反应介质(X)中进行物质生产的情况。其原因在于：若作为工序(p')而在好氧条件下预先使转基因微生物增殖至一定程度，继而在工序(p)中将所增殖的充分量的转基因微生物在所述转基因微生物实质上不增殖的反应介质(X)中进行物质生产，则可恰如化学催化剂那样利用所述转基因微生物进行有效率的物质生产。除此之外，也可在反应介质(X)中的物质生产后，视情况从反应介质(X)中回收所述转基因微生物以再利用于两个循环以后的工序(p)的反应。
以下，按照工序(p')、工序(p)、工序(q)的顺序，对这些工序中可采用的具体结构及要素进行详述。
〔构成培养基(Y)的基本培养基〕
培养基(Y)并无特别限定，根据方法中使用的转基因微生物的种类，在适当的培养基中进行选择使用即可。具体而言，作为培养基(Y)，可使用含有碳源、氮源、无机盐类及其他营养物质等的天然培养基或合成培养基。培养基中所含的成分例如如以下所述。
作为碳源，可列举碳水化合物，更具体而言，可列举包括多糖类、单糖类的糖类等含碳的物质以及包含它们的各种材料等，例如可列举以下成分。
葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖类；蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖(cellobiose)、木二糖(xylobiose)、海藻糖之类的二糖类；纤维素、淀粉、糖原、琼脂糖、果胶、海藻酸等多糖类；糖蜜等；稻草、林地残材、蔗渣(bagasse)、玉米秸秆(cornstover)等非可食用农产废弃物或非可食用性生物质(biomass)(以非可食用性的草本植物或木本植物为原料的资源)；包含将柳枝稷(switchgrass)、象草(napier grass)、芒草(miscanthus)等能源作物利用糖化酶加以糖化而成的葡萄糖或木糖等多个糖类的糖化液；甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油(glycerin)等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡萄糖酸等有机酸；乙醇、丙醇、丁醇等醇；正烷烃(normal paraffin)等烃。
此外，碳源可单独使用一种或者混合使用两种以上。
作为氮源，可使用碳酸铵((NH4)2CO3)、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物；尿素；氨水；硝酸钠、硝酸钾等。进而，也可使用玉米浆(corn steepliquor)、肉提取物、蛋白质水解物(酪蛋白氨基酸(casamino acid)、胰胨、蛋白胨、NZ-胺等)、氨基酸等含氮的有机化合物等。
此外，氮源可单独使用一种或组合使用两种以上。氮源在培养基中的浓度根据所采用的转基因微生物的种类及其性质、氮化合物的种类等条件适宜地调整即可，并无特别限定，例如可设为约0.1w/v％～10w/v％。
作为无机盐类，可列举：磷酸亚钾、磷酸钾、硫酸镁(水合物)、氯化钠、硫酸铁(II)七水合物、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。
此外，无机盐可单独使用一种或混合使用两种以上。无机盐类在培养基中的浓度根据所采用的转基因微生物的种类及其性质、无机盐类的种类等条件适宜地调整即可，并无特别限定，例如设为约0.01(w/v％)～1(w/v％)即可。
进而，作为其他营养物质，可列举肉提取物、蛋白胨、聚蛋白胨、酵母提取物、干燥酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物、动植物或微生物菌体的提取物或它们的分解物等。其他营养物质在培养基中的浓度根据所采用的转基因微生物的种类及其性质、营养物质的种类等条件适宜地调整即可，并无特别限定，例如设为约0.1(w/v％)～10(w/v％)即可。
除此之外，根据需要，还可添加维生素类。作为维生素类，可列举：生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇等。
除此之外，根据需要，也可添加硅酮系消泡剂或聚醚系消泡剂等消泡剂，细菌培养基用的各种消泡剂已有市售，因此可利用所述各种消泡剂。
此外，培养基(Y)的pH只要是所采用的转基因微生物可生长的程度，则并无特别限定，优选为约6～8。
除此之外，在所采用的转基因微生物是属于棒状细菌的微生物的情况下，作为培养基(Y)，可优选地利用A培养基〔乾,M等人(Inui,m.et al.)，缺氧条件下生产乳酸及琥珀酸的过程中的谷氨酸棒状杆菌的代谢分析(Metabolic analysis of Corynebacteriumglutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivationconditions).分子微生物学与生物技术杂志(Journal of Molecular Microbiology andBiotechnology，J.Mol.Microbiol.Biotechnol).7：182-196(2004)〕、BT培养基〔奥穆莎巴,C.A.等人(Omumasaba,C.A.et al.)，具有相反、ATP依赖性调节的谷氨酸棒状杆菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶异形体(Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase isoforms with opposite，ATP-dependent regulation).分子微生物学与生物技术杂志(Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology，J.Mol.Microbiol.Biotechnol).8：91-103(2004)〕、本说明书实施例中记载的NA培养基等。
如此，将通过对本发明的转基因微生物在如上所述的培养基(Y)中进行培养及增殖而获取的菌体或其菌体处理物供于工序(p)即可。
此处，关于转基因微生物的培养条件，只要以所述转基因微生物充分增殖而获得充分量的菌体或其菌体处理物的方式适宜地设定便足够。具体而言，可在好氧条件下将培养温度设为约25℃～38℃，并使培养时间为培养约12小时～48小时。除此之外，关于通过冷冻干燥或冷冻保存而提供的菌体原种(stock)，可通过一次播种至固体培养基上，并将在所述固体培养基上确认到生长的菌落等进一步接种至所述培养基(Y)中，来制备供于工序(p)的转基因微生物。
进而，在本发明中，关于“菌体或其菌体处理物”的具体形态，只要是可产生目标物质的状态便足够，并无特别限定。
在若干实施方式中，在如上所述在工序(p')中在培养基(Y)中对转基因微生物进行培养及增殖后，也可不从培养基(Y)中回收或分离转基因微生物，而将包含所述转基因微生物的培养基(Y)直接供于工序(p)，使用所转基因微生物的菌体来生成目标物质。进而，在工序(p)之前，也可向工序(p')中所获取的包含转基因微生物的培养基(Y)中，根据需要追加可成为后述的反应介质(X)的成分的碳源(糖类)、氮源、无机盐类、维生素类、还原剂等，并供于工序(p)中的目标物质的生成反应。
在另一实施方式中，也可将在工序(p')中在培养基(Y)中进行培养及增殖后的转基因微生物从培养基(Y)中分离及回收，将如此获得的菌体本身、或者对所述菌体实施规定的物理或化学处理而得的菌体处理物供于工序(p)。作为从所述培养基(Y)中分离及回收转基因微生物的手法，例如可列举离心分离、利用各种过滤器的分离、倾析(decantation)等。除此之外，在本发明中，“菌体处理物”只要可实现工序(p)的产生目标物质的反应，则也无特别限定，更详细而言，例如可列举：对所回收的菌体施加各种药物处理后的物质；将所回收的菌体固定于丙烯酰胺、卡拉胶、其他适当的高分子等的载体后的物质等。
〔反应介质(X)的组成〕
本发明的反应介质(X)的组成只要实现使转基因微生物实质上不增殖、且进行由转基因微生物产生目标物质的反应的还原条件下的反应介质(X)，则并无特别限定。反应介质(X)例如含有碳源、氮源、及无机盐类等，可为来源于生物体等的天然的反应介质，或者也可为人工合成的反应介质。反应介质(X)中所含的成分例如如以下所述。
作为碳源，可列举碳水化合物，更具体而言可列举包括多糖类、单糖类的糖类、以及包含它们的各种材料，例如可列举以下成分。
葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖之类的单糖类；蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖之类的二糖类；纤维素、淀粉、糖原、琼脂糖、果胶、海藻酸等多糖类；糖蜜等；稻草、林地残材、蔗渣、玉米秸秆等非可食用农产废弃物或非可食用性生物质(以非可食用性的草本植物或木本植物为原料的资源)；包含将柳枝稷、象草、芒草等能源作物利用糖化酶加以糖化而成的葡萄糖或木糖等多个糖类的糖化液；甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡萄糖酸等有机酸；乙醇、丙醇、丁醇等醇；正烷烃等烃。
这些碳源中，优选为单糖类，更优选为葡萄糖。另外，也优选为包含葡萄糖的糖类(二糖、低聚糖、多糖)。此外，碳源可单独使用一种或者组合使用两种以上。除此之外，反应介质(X)中的碳源的浓度优选为约1(w/v％)～20(w/v％)，更优选为约2(w/v％)～10(w/v％)，进而更优选为约2(w/v％)～5(w/v％)。除此之外，反应介质(X)中的糖类的浓度例如为约1(w/v％)～20(w/v％)，更优选为约2(w/v％)～10(w/v％)，进而更优选约为2(w/v％)～5(w/v％)。
作为氮源，可使用碳酸铵((NH4)2CO3)、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵之类的无机铵化合物或有机铵化合物；尿素；氨水；硝酸钠、硝酸钾等。进而，也可使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ-胺、蛋白质水解物、氨基酸等含氮的有机化合物等。
此外，氮源可单独使用一种或组合使用两种以上。氮源在反应液中的浓度根据所使用的转基因微生物的种类、所期望的目标物质的种类及性状、反应条件、氮化合物的种类等条件适宜地调整即可，也无特别限定，例如可调整为约0.1(w/v％)～10(w/v％)。
作为无机盐类，可列举：磷酸亚钾、磷酸钾、硫酸镁(水合物)、氯化钠、硫酸铁(II)七水合物、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。
此外，无机盐类可单独使用一种或组合使用两种以上。无机盐类在反应液中的浓度根据所使用的转基因微生物的种类、所期望的目标物质的种类及性状、反应条件、无机盐类的种类等条件适宜地调整即可，也无特别限定，例如设为约0.01(w/v％)～1(w/v％)即可。
进而，反应介质(X)根据需要也可添加维生素类。作为维生素类，可列举：生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆醛(维生素B6)、泛酸、肌醇等。
此外，反应介质(X)的pH只要成为生成所期望的目标物质的反应进行的范围，则也无特别限定，一般而言优选为约6.0～8.0，更优选为6.5～8.0，例如为7.5前后。
除此之外，作为具体的优选反应介质(X)的基本组成，可列举所述BT培养基等，通过以这些培养基的组成为基础，并如上所述适宜地调整碳源(糖类)的浓度、烟酸及其衍生物中的至少一个的浓度(xn)、生物素浓度(xb)等，可制备反应介质(X)。
〔还原条件〕
所谓棒状细菌实质上不增殖的还原条件，按字面解释是指反应介质以转基因微生物实质上不增殖的程度处于还原状态，但更具体而言是由反应介质的氧化还原电位规定的。反应介质(X)的氧化还原电位优选为约-200mV～-500mV，更优选为约-250mV～-500mV。
此外，反应介质(X)的氧化还原电位可使用氧化还原电位计测定。氧化还原电位计也存在市售品，因此在测定本发明中的反应介质(X)的氧化还原电位时，也可利用这些市售品。
关于反应介质的还原状态，作为简便的方法，可利用刃天青(resazurin)指示剂(若为还原状态，则从蓝色向无色脱色)来推定，但在欲更准确地控制的情况下，可使用氧化还原电位差计(例如，伯德利-杰姆斯(BROADLEY JAMES)公司制造，氧化还原电位电极(ORP(oxidation-reduction potential)Electrodes)来测定。
处于还原条件的反应介质(X)的制备方法也无特别限制，可使用各种手法，例如可利用如下的制备反应液用水溶液的已知手法。
即，作为反应介质的溶媒，可使用反应液用水溶液来代替蒸馏水等，反应液用水溶液的制备方法例如可参考硫酸还原微生物等绝对厌氧性微生物用的培养液制备方法(普芬尼,N.等人(Pfennig,N.et al.),(1981)：异化性硫酸盐还原细菌,出自原核生物,细菌的生境分离及鉴定手册(The dissimilatory sulfate-reducing bacteria,In TheProkaryotes,A Handbook on Habitats Isolation and identification of Bacteria),斯塔尔M.P.等人编辑(Ed.by Starr,M.P.et al.),p926-940,柏林(Berlin),施普林格(Springer Verlag).)、“农艺化学实验书第三卷，京都大学农学部农艺化学教室编辑，1990年第26次印刷，产业图书股份有限公司出版”等来获得所期望的还原条件下的水溶液。
具体而言，通过对蒸馏水等进行加热处理或减压处理来去除溶解气体，可获得还原条件的反应液用水溶液。此情况下，通过在约10mmHg以下、优选为约5mmHg以下、更优选为约3mmHg以下的减压下，对蒸馏水等进行约1分钟～60分钟左右、优选为约5分钟～40分钟左右处理，可将溶解气体、特别是溶解氧去除而制成还原条件下(厌氧状态)的反应液用水溶液。
进而，也可添加适当的还原剂(例如，硫代乙醇酸、抗坏血酸、胱氨酸盐酸盐、巯基乙酸、硫醇乙酸、谷胱甘肽、硫化钠等)来制备还原条件的反应液用水溶液。
适宜地组合这些方法也是有效的还原条件的反应液用水溶液的制备方法。
此外，优选为反应中也维持反应介质(X)的还原状态。为了在反应中持续维持反应介质(X)的还原状态，理想的是尽可能防止从反应体系外混入氧，具体而言，可列举利用氮气等惰性气体或二氧化碳等封入反应体系的方法。作为更有效地防止氧混入的方法，为了在反应中途效率良好地发挥本发明的好氧性细菌的菌体内的代谢功能，有时也需要适宜添加反应体系的pH维持调整液或各种营养素溶液，但在此种情况下，有效的是从添加溶液中预先去除氧。
此外，在本发明的方法包括工序(p')的情况下，可对通过工序(p')而本发明规定的转基因微生物增殖后的培养基(Y)实施所述规定的操作和/或添加还原剂等，以调整成满足所述转基因微生物实质上不增殖的还原条件，将调整后的所述培养基(Y)在工序(p)中用作反应介质(X)。
〔反应条件〕
工序(p)中的反应温度只要为生成所期望的目标物质的范围即可，可根据所采用的转基因微生物的性质等适宜地设定，并无特别限定。典型而言为约20℃～50℃，优选为约25℃～47℃，更优选为约27℃～37℃，若为此种温度范围，则可效率良好地制造目标物质。
反应时间也可适宜调整以获得所期望的目标物质，也无特别限定，例如为约1小时～约7天，就更有效率的目标物质的观点而言，优选为约1小时～约3天，例如可设为约1小时～约48小时。
反应可为批次式、流加式、连续式的任一种。其中，优选为批次式。
在工序(p)的反应结束后，可通过离心分离等适当的操作从反应介质(X)中回收转基因微生物及其菌体处理物等，并再利用所回收的转基因微生物而多次重复工序(p)。通过如此再利用转基因微生物而多次重复工序(p)的结构有助于生产成本的削减，可实现有效率的目标物质的生产，因此在本发明中为优选的实施方式。
关于工序(q)
在工序(p)中生成目标物质后，作为工序(q)而回收目标物质。此处，在工序(q)中，“回收目标物质(的情况)”这一用语是包括通过采集含有目标物质的转基因微生物和/或培养液或者反应介质的物质来回收目标物质的情况的概念。
如上所述，在工序(q)中，可设为通过采集含有目标物质的转基因微生物和/或培养液或者反应介质的物质来回收目标物质的情况，但也可设为从含有目标物质的培养液或反应介质(X)或者转基因微生物菌体或其菌体处理物中将目标物质分离和/或精制等，来回收所述目标物质的情况。
在采用此种目标物质的分离和/或精制工艺的实施方式中，在目标物质的分离和精制工艺中，考虑目标物质的种类及目标物质的用途，并根据所需要的纯度等，采用适当的分离/精制技术即可。虽也无特别限定，但例如可将各种结晶法、超滤法等各种过滤技术；离子交换色谱、亲和色谱(affinity chromatography)、疏水性色谱、反相色谱等各种色谱技术；浓缩法；透析；活性炭吸附法等适宜地组合，来回收目标物质。这些物质的分离精制技术已知有各种技术，因此适宜地利用这些技术即可。
进而，本发明的方法还可任意地包括对目标物质进行清洗、干燥、破碎、粉体化或粒状化和/或包装等工序。
＜目标物质的种类＞
在本发明的方法中，利用本发明所述的转基因微生物，可效率良好地生产多种目标物质。根据所采用的转基因微生物的种类的不同，目标物质的种类有多种，具体而言，可列举：核酸相关化合物(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5'-鸟苷酸、腺苷、腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)-胆碱、胞苷二磷酸(cytidine diphosphate，CDP)-胆碱)；激素用物质等各种生理活性物质；碳水化合物或糖类；维生素相关物质及辅酶(例如，维生素C、维生素B2、维生素B12、山梨糖、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadenine dinucleotide，NAD)、黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)、辅酶(coenzyme)A)；蛋白质、肽、氨基酸；L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOAP)、5-羟基色氨酸、吡咯烷酮羧酸等氨基酸衍生物；乙醇、丁醇、异丙醇等醇类；苯酚、邻苯二酚、4-羟基苯甲酸、4-氨基苯甲酸、邻氨基苯甲酸(anthranilic acid)、没食子酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、莽草酸(shikimic acid)、3-脱氢莽草酸、3-脱氢奎尼酸、原儿茶酸(protocatechuicacid)、分支酸(chorismic acid)等各种有机化合物等。
在特定的实施方式中，目标物质为选自由氨基酸、醇类、芳香族化合物及有机酸所组成的群组中的至少一个。
进而，在本发明中，目标物质优选为L-氨基酸或其衍生物。具体而言，氨基酸包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、半胱氨酸(cysteine)、赖氨酸(lysine)、苏氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、酪氨酸、组氨酸、色氨酸、胱氨酸、茶氨酸。
除此之外，具体而言，L-氨基酸的衍生物是在转基因微生物的代谢体系中由L-氨基酸衍生的代谢产物。
进而，在本发明中，目标物质优选为L-天冬氨酸或由其衍生的代谢产物。由L-天冬氨酸衍生的代谢产物包括L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-高丝氨酸等氨基酸或氨基酸衍生物。
在特定的实施方式中，目标物质为柠檬酸、cis-乌头酸、D-异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酰CoA、琥珀酸或由此衍生的进一步的代谢产物。这些代谢产物可通过在好氧条件下培养本发明所述的转基因微生物或使其反应而有效率地生产(图1)。在另一实施方式中，所述目标物质为草酰乙酸、L-苹果酸、富马酸或由此衍生的代谢产物。这些代谢产物可通过使本发明所述的转基因微生物在所述转基因微生物实质上不增殖的还原条件下反应而有效率地生产(图1)。
在又一实施方式中，目标物质为草酰乙酸、苹果酸或在生物合成途径上经由这些化合物的代谢产物。
在优选的实施方式中，目标物质为天冬氨酸或由所述天冬氨酸衍生的代谢产物。在更优选的实施方式中，目标物质为天冬氨酸、β丙氨酸或天冬酰胺。
目标物质可为转基因微生物在本发明规定的条件下利用从野生型继承的代谢体系而产生的物质，也可为转基因微生物利用通过基因操作或变异处理等人工制作出的进一步的代谢体系而产生的物质，或者是利用所述代谢系统两者所形成的组合而产生的物质。除此之外，在本发明所提供的目标物质的生产方法中，也设想还包括如下工序的实施方式：由利用转基因微生物而生成的物质，进一步通过化学合成工艺或基于无细胞体系的酶代谢的生物加工，合成最终的目标物质。
此外，在本发明中制造的目标物质的用途也无任何限定，例如可列举医药用途、食品用途、工业用途、燃料用途、化妆品用途等。除此之外，在本发明中制造的目标物质可为实际用于各种用途的物质，或者也可为用于制造最终产物的中间原料。
＜变异型PEPC＞
根据本发明的第四实施方式，提供下述的变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶。
一种变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，
相对于属于棒状细菌的微生物所保有的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列，具有能够降低所述野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制的氨基酸变异，
所述氨基酸变异以序列号2所示的氨基酸序列为基准，且至少包括：
(g)相当于第299位的天冬氨酸的氨基酸向天冬酰胺的氨基酸置换；
(i)相当于第813位的赖氨酸的氨基酸向规定的氨基酸的氨基酸置换(其中，设为置换后的氨基酸不为赖氨酸。)；或
(l)相当于第917位的天冬酰胺的氨基酸向规定的氨基酸的氨基酸置换(其中，设为置换后的氨基酸不为天冬酰胺。)，
与相对于所述野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列而仅具有所述(g)、所述(i)或所述(l)中规定的氨基酸置换的蛋白质相比，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶对由天冬氨酸引起的反馈抑制的抵抗性更高。
在优选的实施方式中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶是具有下述(J)～(L)的任一个所示的氨基酸序列的变异型PEPC。
(J)在序列号2～序列号13(优选为序列号2～序列号12，更优选为序列号2～序列号11)的任一个所示的氨基酸序列中，导入所述(g)所示的氨基酸置换、以及所述(i)或所述(l)所示的氨基酸置换而成的氨基酸序列(其中，设为置换前的氨基酸与置换后的氨基酸不同。)；
(K)在所述(J)中规定的氨基酸序列中，一个或多个氨基酸经删除、置换和/或加成而成的氨基酸序列(其中，设为维持所述各氨基酸置换。)；
(L)相对于所述(J)中规定的氨基酸序列而具有至少60％的序列同一性的氨基酸序列(其中，设为维持所述各氨基酸置换。)。
此处，在所述(K)中，“一个或多个”的范围例如为1个至100个、1个至50个、1个至30个，优选为1个至20个、1个至15个、1个至10个，更优选为1个～9个、1个～8个、1个～7个、1个～6个、1个～5个、1个～4个、1个～3个、1个～2个。
除此之外，在所述(L)中，“至少60％”优选被替换成至少70％，更优选被替换成至少80％，进而更优选被替换成至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。
除此之外，特别优选为在所述(J)中，“序列号2～序列号13(优选为序列号2～序列号12，更优选为序列号2～序列号11)的任一个所示的氨基酸序列”被替换成“序列号2所示的氨基酸序列”(即，谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株的野生型PEPC氨基酸序列)的实施方式。
＜对变异型PEPC进行编码的核酸＞
根据本发明的第五实施方式，提供一种对根据第四实施方式所述的变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的核酸。
在本发明中，“核酸”可以DNA(脱氧核糖核酸)及RNA(核糖核酸)的任一个形态提供。进而，本发明的核酸可为单链或双链的形态。此外，核酸具体而言为分离出的核酸、cDNA或cRNA。若考虑到与RNA相比DNA在化学上更稳定等，则本发明的核酸优选以DNA的形态提供。除此之外，在本发明中，核酸也可受到甲基化等化学修饰。
除此之外，虽然并非必须，但本发明的核酸也可包含复制起点等以能够在特定的微生物的细胞内进行自主复制，从而以质粒的形态提供。除此之外，在本发明的核酸中，除包含所述变异型PEPC编码序列之外，还可包含启动子序列、夏因-达尔加诺序列(Shine·Dalgarno sequence)等基因控制序列，以使本发明的变异型PEPC能够在微生物的细胞内表达。还可包括所述变异型PEPC编码区域。
进而，导入有本发明的核酸的转基因微生物当然作为本发明的第一实施方式或第二实施方式所述的转基因微生物的一部分而包含于本发明中。除此之外，使用导入有本发明的核酸的转基因微生物来生产目标物质的方法也作为本发明的第三实施方式的目标物质的生产方法的一部分而包含于本发明中。
以上，对本发明的具体的实施方式进行了详述，但本发明并不限定于所述实施方式。在不脱离本发明的要旨的范围内，可针对各结构、要素及特征采用各种改变、修正、组合。
此外，在本发明中，只要无特别说明，则用语“包含”及“具有”并不排除这些用语分别提及的作为宾语的要素以外的要素的存在，且这些用语可混用。除此之外，不仅是视为本申请的优先权主张的基础的日本专利申请No.JP2019-76629(日本专利特愿2019-76629)的内容，在本说明书中提及的各文献的内容也作为构成本说明书的一部分的内容而援用于此。
实施例
＜使用谷氨酸棒状杆菌的例子＞
使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株作为起始材料，制作出利用基因破坏的手法使规定的酶活性失活、且导入了具有规定的氨基酸置换的变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的重组棒状细菌。以下示出其流程。
(1)基因缺失株(谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032ΔldhΔsdhΔpoxB株)的制作
首先，通过PCR法，以质粒pNIC-Bsa4(源生物科学(Source BioScience)公司)为模板，使用以下的表12所示的引物的对，使SacB基因片段扩增。
[表12]
利用BamHI及HindIII对扩增后的DNA片段与质粒pHSG299(宝生物工程(TakaraBio)股份有限公司)进行限制性酶处理后，使用DNA连接试剂盒(DNA Ligation Kit)第二版(Ver.2)(宝生物工程(Takara Bio)股份有限公司)加以连接，获得质粒pGE015。
进而，通过PCR反应，以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株的基因组DNA为模板，分别使ldh基因编码区域上游的约1000bp的区域以及所述基因编码区域下游的约1000bp的区域扩增。
此外，在所述PCR反应中，针对上游区域使用了引物F2及引物R2的对，针对下游区域使用了引物F3及引物R3(表13)。
此外，在图2A中示意性地示出了各引物与基因编码区域的位置关系。
[表13]
引物名称 序列 序列号
引物F2 5'-GACGGCCAGTGAATTTTTCATACGACCACGGGCTA-3' 16
引物R2 5'-GACAATCTTGTTACCGACGG-3' 17
引物F3 5'-GGTAACAAGATTGTCACCCTGCGCGAAATTCAGAA-3' 18
引物R3 5'-TACCGAGCTCGAATTGAACTCACTGAAAAATGCTG-3' 19
此外，在所述流程中，在各PCR反应中利用了热循环仪(thermal cycler)T100TM(伯乐(BIO-RAD)公司)，且作为PCR酶试剂利用了原恒星(PrimeSTAR)MAX(宝生物工程(Takara Bio)股份有限公司)。关于以下说明的流程中的PCR反应，只要无特别说明则同样如此。
使用因福森克隆试剂盒(In-Fusion cloning kit)(宝生物工程(Takara Bio)股份有限公司)，将如上所述扩增后的ldh基因上游区域及下游区域DNA片段与利用EcoRI进行限制性酶处理而线性化的pGE15载体连结，并进行克隆。将以上述方式获得的质粒命名为pGE033。
在质粒pGE33中，ldh基因上游区域片段与所述基因的下游区域片段成为经串联地连结并插入多克隆位点中的形态，但ldh基因的编码区域缺失。除此之外，pGE33是能够在大肠杆菌中进行复制、但在棒状细菌的菌体内无法进行复制的质粒。将质粒pGE33利用电脉冲法(2500V，25μF，200Ω；范德雷斯特等人(Van der Rest et al.).应用微生物学与生物技术(Applied Microbiology and Biotechnology，Appl.Microbiol Biotechnol)52，pp541-545，1999)，导入谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株中。将电脉冲法后的试样涂布于包含卡那霉素25μg/ml的A琼脂培养基(培养基1L中的组成：将尿素：2g、(NH4)2SO4：7g、KH2PO4：0.5g、K2HPO4：0.5g、MgSO4·7H2O：0.5g、FeSO4·7H2O：6mg、MnSO4·n H2O：4.2mg、D-生物素：200μg、盐酸硫胺素：200μg、酵母提取物：2g、酪蛋白氨基酸：7g、葡萄糖：20g、琼脂：16g在蒸馏水中溶解1000ml(pH 6.6))，并利用常规方法进行培养。
此处，pGE33具有卡那霉素抗性基因作为药物抗性标记，因此如上所述在包含卡那霉素的A琼脂培养基上增殖的生长株是pGE33与染色体上的野生型ldh基因发生1处同源重组而与所述质粒一同组入基因组DNA中的株。
将以上述方式获取的生长株涂布于添加有10％蔗糖的LB琼脂培养基(培养基1L中的组成：细菌蛋白胨(Bacto Peptone)：10g，酵母提取物：5g，氯化钠：10g，琼脂：16g)，并利用常规方法进行培养。此处，保持了来源于pGE33的SacB基因的转化体由于在添加有蔗糖的培养基上产生毒性物质，因此无法生存。另一方面，关于包含SacB基因的质粒来源的区域因再次同源重组而脱落的转化体，在添加有蔗糖的培养基上也可生存，因此可获得质粒来源的区域脱落且ldh基因缺失的转化体作为生长株。此外，在再次同源重组时，质粒整个区域以完全的pGE33的形态脱落的物质恢复为完整地保持ldh基因的野生型ATCC13032株的性状。
从如上所述在LB琼脂培养基上获取的作为生长株的菌体菌落中，通过使用所述F2及R3的引物对的菌落PCR法筛选出ldh基因缺失株。
所述引物F2及引物R3是分别设计在ldh基因上游约1000bp区域的5'端与所述基因下游约1000bp区域的3'端的引物，因此若为缺失了ldh基因的菌株，则应获得约2kb的DNA片段。以此为指标，针对利用所述菌落PCR而得的生成物进行琼脂糖电泳(agaroseelectrophoresis)法(分子克隆(Molecular Cloning),萨姆布鲁克等人(Sambrook etal.),冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))，获取确认到ldh基因的缺失的菌落菌体作为ldh基因缺失株(GES168)。
继而，依据所述ldh基因缺失株的获取方法，针对ldh基因缺失株(ATCC13032Δldh株)(GES168)，进一步使sdhCAB基因缺失。
即，以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株的基因组DNA为模板，分别使sdhCAB基因编码区域上游的约1000bp区域与所述基因编码区域下游的约1000bp区域扩增。
此外，在所述PCR反应中，针对上游区域使用了引物F4及引物R4的对，针对下游区域使用了引物F5及引物R5(表14)。除此之外，如上所述，sdhCAB通过sdhC编码区域、sdhA编码区域、sdhB编码区域而在基因组上构成了操纵子，且各引物与各编码区域的位置关系示于图2B中。
[表14]
引物名称 序列 序列号
引物F4 5'-GACGGCCAGTGAATTGCGGCGGTCAAGGGCATCGA-3' 20
引物R4 5'-GCTAGCGGCACCTCCAGTGTCGTTGT-3' 21
引物F5 5'-GGAGGTGCCGCTAGCTCTTTAATCCAAGTAAGTAC-3' 22
引物R5 5'-TACCGAGCTCGAATTCTTCAAAGTAGTTCAGGGTG-3' 23
使用因福森克隆试剂盒(In-Fusion cloning kit)(宝生物工程(Takara Bio)股份有限公司)，将如上所述扩增后的SdhCAB基因的上游区域及下游区域DNA片段与利用EcoRI进行限制性酶处理而线性化的pGE15载体连结，并进行克隆。将以上述方式获得的质粒命名为pGE020。与获取ATCC13032Δldh株(GES168)时同样地，依照所述电脉冲法将质粒pGE020导入ATCC13032Δldh株(GES168)中，通过利用含有卡那霉素的培养基及含有蔗糖的培养基进行的选择、以及利用菌落PCR进行的筛选，获取ATCC13032ΔldhΔsdh株(GES439)。
进而，依据所述基因缺失株的获取方法，相对于ATCC13032ΔldhΔsdh株(GES439)，进一步使poxB基因缺失。
即，以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株的基因组DNA为模板，分别使poxB基因编码区域上游的约1000bp区域以及所述基因编码区域下游的约1000bp区域扩增。
此外，在所述PCR反应中，针对上游区域使用了引物F6及引物R6的对，针对下游区域使用了引物F7及引物R7(表15)。
此外，在图2C中示意性地示出各引物与基因编码区域的位置关系。
[表15]
引物名称 序列 序列号
引物F6 5'-GACGGCCAGTGAAAACGTTAATGAGGAAAACCG-3' 24
引物R6 5'-AATTAATTGTTCTGCGTAGC-3' 25
引物F7 5'-GCAGAACAATTAATTCTCGAGTCGAACATAAGGAATATTCC-3' 26
引物R7 5'-TACCGAGCTCGAATTTTCCAGGTACGGAAAGTGCC-3' 27
使用因福森克隆试剂盒(In-Fusion cloning kit)(宝生物工程(Takara Bio)股份有限公司)，将如上所述扩增后的poxB基因的上游区域及下游区域DNA片段与利用EcoRI进行限制性酶处理而线性化的pGE15载体连结，并进行克隆。将以上述方式获得的质粒命名为pGE191。与获取ATCC13032Δldh株(GES168)时同样地，依照所述电脉冲法将质粒pGE191导入ATCC13032ΔldhΔsdh株(GES439)中，通过利用含有卡那霉素的培养基及含有蔗糖的培养基进行的选择、以及利用菌落PCR进行的筛选，获取ATCC13032ΔldhΔsdhΔpoxB株(GES524)。
(2)向基因缺失株导入变异型PEPC基因
(2-1)穿梭载体(shuttle vector)的构建
首先，将包含使得在棒状杆菌体内能够进行自主复制的复制起点的DNA片段、包含使得在大肠杆菌中能够进行自主复制的复制起点的DNA片段、以及包含卡那霉素抗性基因的DNA片段连结，由此构建谷氨酸棒状杆菌ATCC13032用的穿梭载体。
对于棒状杆菌的复制起点所涉及的DNA片段，利用PCR法，以pBL1(由和地正明博士赠与，核苷酸序列GenBankID：AF092037.1)为模板，使用表16所示的引物F8及引物R8的对进行了扩增。进而，对于大肠杆菌的复制起点所涉及的DNA片段，利用PCR法，以pMW119(宝生物工程(Takara Bio)股份有限公司)为模板，使用表16所示的引物F9及引物R9的对进行了扩增。进而，关于卡那霉素抗性基因DNA片段，利用PCR法，以pHSG299(宝生物工程(TakaraBio)股份有限公司)为模板，使用表16所示的引物F10及引物R10的对进行了扩增。
[表16]
引物名称 序列 序列号
引物F8 5'-TTTCTACGCGGCCGCAACAACAAGACCCATCATAG-3' 28
引物R8 5'-TCGTCGACGGTACCGGATCCCATGCACATGCAGTCATGTC-3' 29
引物F9 5'-GAACCGTAAAAAGGCGACAGTAAGACGGGTAAGCC-3' 30
引物R9 5'-GCGGCCGCGTAGAAAGTAACGGTGAACAGTTGTTC-3' 31
引物F10 5'-CGGTACCGTCGACGATATCGAGGTCTGCCTCGTGAAGAA-3' 32
引物R10 5'-GCCTTTTTACGGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGC-3' 33
使用因福森克隆试剂盒(In-Fusion cloning kit)(宝(TAKARA))，将如上所述所获取的三个扩增片段连结并加以环状化，将所得物作为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032用穿梭载体，并命名为质粒pGEK004。
(2-2)构建包含各种变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的质粒
继而，基于以PCR反应为基础的部位特异性变异导入法，使具有各种氨基酸置换的变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因DNA片段扩增，构建将这些DNA片段分别插入所述穿梭载体pGEK004中而成的质粒。
将所构建的质粒的名称及PEPC的氨基酸置换的内容示于以下的表17。
[表17]
质粒名称 变异型PEPC中的氨基酸置换
pGE320 D299N
pGE343 K813S
pGE321 N917G
pGE333 D299N及K813S
pGE322 D299N及N917G
以下，对所述各质粒的构建方法进行详述。
(2-2-1)关于pGE320(ppcD299N基因)
首先，通过PCR反应，以棒状ATCC13032株的基因组DNA为模板，使用表18所示的引物F11及引物R11的对，使包含作为在棒状细菌中能够发挥作用的启动子的gapA基因启动子区域的DNA片段扩增。
[表18]
关于PEPC编码区域，首先，通过利用PCR法，以ATCC13032株基因组DNA为模板，使用表18所示的引物F12及引物R12-1的对，对相当于PEPC的N末端侧的约900bp的区域进行扩增，并且同样地通过以ATCC13032株基因组DNA为模板，使用表18所示的引物F13-1及引物R13的对，对包含PEPC的末端侧区域的约3500bp的区域进行扩增。
此处，用于PEPC的N末端侧片段的扩增的引物R12-1(反向引物)与用于PEPC的C末端侧片段的扩增的引物F13-1(正向引物)在PEPC的编码区域中重叠，且包含D299N所涉及的变异密码子(codon)(表18中分别用下划线表示的“GTT”/“AAC”)。此外，相应的野生型密码子为“GAC”(有义链(sense strand))。
使用因福森克隆试剂盒(In-Fusion cloning kit)(宝生物工程(Takara Bio)股份有限公司)，将如上所述所获取的三个DNA片段与利用BamHI对pGEK004进行限制性酶处理而线性化的载体片段串联连结并加以环状化，获取质粒pGE320。
(2-2-2)关于pGE343(ppcK813S基因)
首先，与制作pGE320时同样地，通过PCR反应，使包含gapA基因启动子区域的DNA片段扩增。
进而，关于PEPC编码区域，首先，通过利用PCR法，以ATCC13032株基因组DNA为模板，使用表18所示的引物F12与表19所示的引物R12-2的对，对相当于PEPC的N末端侧的约2430bp的区域进行扩增，并且同样地通过以ATCC13032株基因组DNA为模板，使用表19所示的引物F13-2与表18所示的引物R13的对，对包含PEPC的C末端侧区域的约530bp的区域进行扩增。
[表19]
此处，用于PEPC的N末端侧片段的扩增的引物R12-2(反向引物)与用于PEPC的C末端侧片段的扩增的引物F13-2(正向引物)在PEPC的编码区域中重叠，且包含K813S所涉及的变异密码子(表19中分别用下划线表示的“CGA”/“TCG”)。此外，相应的野生型密码子为“AAG”(有义链)。
继而，使用因福森克隆试剂盒(In-Fusion cloning kit)(宝生物工程(TakaraBio)股份有限公司)，将如上所述所获取的三个DNA片段与利用BamHI对pGEK004进行限制性酶处理而线性化的载体片段串联连结并加以环状化，获取质粒pGE343。
(2-2-3)关于pGE321(ppcN917G基因)
首先，与制作pGE320时同样地，通过PCR反应，使包含gapA基因启动子区域的DNA片段扩增。
进而，关于PEPC编码区域，首先，通过利用PCR法，以ATCC13032株基因组DNA为模板，使用表18所示的引物F12与表20所示的引物R12-3的对，对相当于PEPC的N末端侧的约2430bp的区域进行扩增，并且同样地通过以ATCC13032株基因组DNA为模板，使用表20所示的引物F13-3与表18所示的引物R13的对，对包含PEPC的C末端侧区域的约530bp的区域进行扩增。
[表20]
此处，用于PEPC的N末端侧片段的扩增的引物R12-3(反向引物)与用于PEPC的C末端侧片段的扩增的引物F13-3(正向引物)在PEPC的编码区域中重叠，且包含N917G所涉及的变异密码子(表20中分别用下划线表示的“GCC”/“GGC”)。此外，相应的野生型密码子为“AAC”(有义链)。
继而，使用因福森克隆试剂盒(In-Fusion cloning kit)(宝生物工程(TakaraBio)股份有限公司)，将如上所述所获取的三个DNA片段与利用BamHI对pGEK004进行限制性酶处理而线性化的载体片段串联连结并加以环状化，获取质粒pGE321。
(2-2-4)关于pGE333(ppcD299N/K813S基因)
利用PCR法，以所述质粒pGE320为模板，使用引物F12与引物R13-2的对，对相当于gapA基因启动子区域与ppc基因N末端侧区域的DNA片段进行扩增。进而，同样地利用PCR法，使用引物F-14-2与引物R14的对，使相当于ppc基因C末端侧与3'下游区域的DNA片段扩增。
使用因福森克隆试剂盒(In-Fusion cloning kit)(宝生物工程(Takara Bio)股份有限公司)，将如上所述所获取的两个DNA片段与利用BamHI对pGEK004进行限制性酶处理而线性化的载体片段串联连结并加以环状化，获取质粒pGE333。
(2-2-5)关于pGE322(ppcD299N/N917G基因)
利用PCR法，以所述质粒pGE320为模板，使用引物F12与引物R13-3的对，对相当于gapA基因启动子区域与ppc基因N末端侧区域的DNA片段进行扩增。进而，同样地利用PCR法，使用引物F-14-3与引物R14的对，使相当于ppc基因C末端侧与3'下游区域的DNA片段扩增。
使用因福森克隆试剂盒(In-Fusion cloning kit)(宝生物工程(Takara Bio)股份有限公司)，将如上所述所获取的两个DNA片段与利用BamHI对pGEK004进行限制性酶处理而线性化的载体片段串联连结并加以环状化，获取质粒pGE322。
(2-3)通过向谷氨酸棒状杆菌基因缺失株导入变异型ppc基因来制作重组棒状细菌以及使用所述棒状细菌来制造天冬氨酸
[试验例1]
(试验流程)
利用所述电脉冲法，相对于所述(1)一项中制作出的谷氨酸棒状杆菌基因缺失株GES439(ATCC13032ΔldhΔsdhCAB株)，分别使所述(2-2)一项中所构建的质粒pGEK004、质粒pGE320、质粒pGE343、质粒pGE321、质粒pGE333、质粒pGE322进行转化，获取重组棒状细菌。
继而，将各重组棒状细菌菌株分别在5mL的A培养基中进行预培养(试管)，将获得的各预培养液2mL分别在500mL烧瓶中接种于NA培养基(将尿素：2g、(NH4)2SO4：7g、KH2PO4：0.5g、K2HPO4：0.5g、MgSO4·7H2O：0.5g、FeSO4·7H2O：6mg、MnSO4·n H2O：4.2mg、D-生物素：200μg、盐酸硫胺素：200μg、酵母提取物：1g、葡萄糖：10g在蒸馏水中溶解成1000ml)100mL中而制成培养试样，针对各菌株分别准备各两个所述培养试样，在33℃、200rpm下振荡培养20小时。
培养后，将两根烧瓶的培养液汇总成一个，将通过离心分离除去培养液而分离的菌体细胞悬浮于60mL的BT液(每升中(NH4)2SO4：7g、KH2PO4：0.5g、K2HPO4：0.5g、MgSO4·7H2O：0.5g、FeSO4·7H2O：6mg、MnSO4·n H2O：4.2mg)中，并调整为光密度(optical density，OD)值成为30～40附近。将其移至装有搅拌器的100mL培养基瓶中，进而加入5mL的50％葡萄糖与5mL的2M(NH4)2CO3。将所述培养基瓶放入33℃的恒温槽中静置，一边搅拌一边反应。关于反应液的pH，使用pH控制器，利用2M(NH4)2CO3调节为pH7.5。此外，在BT溶液中的棒状细菌的反应时，若利用氧化还原电位计(ORP传感器)测量反应液的氧化还原电位，则一般集中在约-400毫伏～-500毫伏之间。反应24小时后，采集0.5mL反应液，并利用离心分离分离上清液，测定所消耗的葡萄糖的量与所产生的氨基酸量。氨基酸量的测定使用了氨基酸分析系统日珥(Prominence)(岛津制作所股份有限公司)。
(结果)
将天冬氨酸生产试验的结果示于图4。在图4的图表中，纵轴表示反应后的试样中的天冬氨酸浓度。进而，在以下的表21中示出所获取的重组棒状细菌的基因型、以及通过天冬氨酸生产试验算出的天冬氨酸生产效率(％)。天冬氨酸生产效率(％)的值是生成天冬氨酸相对于被吸入菌体的葡萄糖0.5摩尔的比例。
[表21]
首先，在本试验例中制作出的重组棒状细菌全部还包括作为阴性对照(negativecontrol)的GES439/pGEK004，基因组上的ldh基因(乳酸脱氢酶基因)及sdhCAB基因(琥珀酸脱氢酶基因)被破坏。在此前提下，相对于作为阴性对照的GES439/pGEK004，进一步分别导入了仅具有D299N、K813S的一氨基酸置换的ppc基因(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因)的GES439/pGE320及GES439/pGE343可见天冬氨酸生产效率的稍许增加。另一方面，关于导入了仅具有N917G的一氨基酸置换的ppc基因的GES439/pGE321，未发现天冬氨酸生产效率的增加。与此相对，关于分别具有由D299N与K813S组合而成的氨基酸置换、由D299N与N917G组合而成的氨基酸置换的GES439/pGE333及GES439/pGE322，天冬氨酸生产效率分别示出8.1％及7.8％的值，相对于作为作为阴性对照的GES439/pGEK004可见显著的增加。如此，可掌握：若在使所述规定的酶活性失活的条件下，进一步导入将N末端侧的氨基酸置换与C末端侧的氨基酸置换组合而成的变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)，则物质的生产效率显著提高。
[试验例2]
(试验流程)
利用所述电脉冲法，相对于所述(1)一项中制作出的谷氨酸棒状杆菌基因缺失株GES168(Δldh)、GES439(ΔldhΔsdhCAB)、GES524(ΔldhΔsdhCABΔpoxB)，分别使所述(2-2)一项中所构建的质粒pGE333(ppcD299N/K813S)进行转化，获取重组棒状细菌。
使用所获取的各重组棒状细菌，利用与试验例1同样的方法，进行天冬氨酸的生产试验。
(结果)
将天冬氨酸生产试验的结果示于图5。在图5的图表中，纵轴表示反应后的试样中的天冬氨酸浓度。进而，在以下表的22中示出所获取的重组棒状细菌的基因型、以及通过天冬氨酸生产试验算出的天冬氨酸生产效率(％)。天冬氨酸生产效率(％)的值是实际生成的天冬氨酸相对于被吸入菌体的葡萄糖0.5摩尔的比例。所述值是基于理论上可形成1摩尔葡萄糖至2摩尔葡萄糖的天冬氨酸这一情况的值。
[表22]
首先，关于保有具有由D299N/K813S组合而成的氨基酸置换的变异型ppc基因、同时仅ldh基因缺失的GES168/pGE333株，如图5及表22所示，未见天冬氨酸生产效率的有意义的提高。与此相对，如试验例1中所确认的那样，关于同样保有具有由D299N/K813S组合而成的氨基酸置换的变异型ppc基因、且缺失ldh基因及sdhCAB这两个基因的ES439/pGE333株，可见天冬氨酸生产效率的显著提高。更惊人的是，关于同样保有具有由D299N/K813S组合而成的氨基酸置换的变异型ppc基因、且缺失了ldh基因、sdhCAB以及poxB基因(丙酮酸：醌氧化还原酶)这三个基因的GES524/pGE333株，天冬氨酸生产效率示出16.8％的值，显示出生产效率的格外显著的提高。
[试验例3]
在试验例1及试验例2中，预先使用A培养基及NA培养基在好氧培养条件下使重组棒状细菌增殖后，使通过离心分离除去培养液而分离的菌体细胞悬浮于规定量的BT液中，来进行天冬氨酸的生产反应。与此相对，在本试验例中，使用A培养基及NA培养基在好氧培养条件下使重组棒状细菌增殖后，不通过离心操作等分离菌体细胞，而是直接使用培养液进行天冬氨酸生产反应。以下示出其流程。
首先，将试验例1中制作的GES439/pGEK004(未导入ΔldhΔsdhCAB/变异型PEP)、以及GES439/pGE322(ΔldhΔsdhCAB/D299N及N917G变异型PEPC)分别接种于试管内的A培养基5mL中，进行预培养。继而，将所获得的各预培养液2mL分别接种于500mL烧瓶内的NA培养基100mL中，将各培养试样在33℃、200rpm下振荡培养20小时。培养后，将60mL的各试样培养液直接移至装有搅拌器的100mL培养基瓶中，进而加入5mL的50％葡萄糖与5mL的2M(NH4)2CO3。将所述培养基瓶放入33℃的恒温槽中静置，一边利用所述搅拌器搅拌一边反应。24小时后，采集0.5mL的反应液，通过离心分离采集上清液，测定所消耗的葡萄糖的量以及所生产的氨基酸的量。
此外，氨基酸的鉴定及测定使用了氨基酸分析系统日珥(Prominence)(岛津制作所股份有限公司)。
(结果)
将本试验例中的天冬氨酸生产试验的结果示于图6。在图6的图表中，纵轴表示反应后的试样中的天冬氨酸浓度。
进而，在以下的表23中示出所获取的重组棒状细菌的基因型、以及通过天冬氨酸生产试验算出的天冬氨酸生产效率(％)。如上所述，天冬氨酸生产效率(％)的值是实际生成的天冬氨酸相对于被吸入菌体的葡萄糖0.5摩尔的比例。
[表23]
在本试验例中，作为阴性对照的GES439/pGEK004的天冬氨酸生产效率也明显差而为0.2％，与此相对，关于具有由D299N与N917G组合而成的氨基酸置换的GES439/pGE322，天冬氨酸生产效率示出4.0％的值，可见显著的增加。即，根据本试验例，显示出：对于通过好氧条件下的预培养而预先使重组菌体增殖后的培养物，即便不通过离心操作等除去培养液部分而直接用于物质生产(天冬氨酸生产)，也可效率良好地转变成目标物质(天冬氨酸)。
以上，如试验例1～试验例3所示，若使用本发明规定的重组棒状细菌，则可提高糖类等起始基质向目标物质的转变效率。
＜使用大肠埃希菌(大肠杆菌)的例子＞
接下来，使用大肠埃希菌(大肠杆菌)示出本发明所述的重组微生物及使用所述重组微生物进行天冬氨酸生产的例子。
依照下述流程，在大肠埃希菌中将规定的基因破坏。
(1)pflB基因的破坏
首先，依照达森口与万纳(Datsenko and Wanner)(美国科学院院报(Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America，Proc NatlAcad Sci USA)2000,97：6640-6645.)中记载的方法，制作所述文献中记载的BW25113株(laciq rrnBT14ΔlacZwj16hsdR514ΔaraBADAH33ΔrhaBADLD78)。
继而，在所述BW25113株中，为了破坏pflB基因，相对于此菌株，预先利用噬菌体的重组酶表达载体pKD46(生命科学市场(Life Science Market))进行了转化。将所得的转化体接种于100mL的LB培养基(以最终浓度10mM含有阿拉伯糖。)中，在30℃下培养至培养基浊度OD600成为0.6附近。将所得的重组大肠杆菌的菌体利用10％甘油洗涤三次，最终悬浮于1mL的10％甘油中，由此制备感受态细胞(competent cell)。
继而，使用下述表24所示的引物F14及引物R14的对，利用PCR反应，以pKD13为模板，使包含卡那霉素抗性基因编码区域的DNA片段扩增。此处，引物F14及引物R14分别包含与大肠杆菌染色体DNA中pflB基因编码区域的上游区域和下游区域相同的核苷酸序列。
[表24]
对于所得的PCR产物，使用牛克劳斯宾凝胶与PCR清除(NucleoSpin Gel and PCRClean-up)(宝生物工程(Takara Bio)股份有限公司)进行精制。
继而，向上述所制备的感受态细胞150μL中加入上述精制后的PCR产物10μL，利用电脉冲法(2500V，25μF，200Ω)进行基因导入，使获得的转化体在以50μg/mL包含卡那霉素的LB琼脂培养基上增殖，并选择生长株。关于pflB基因的删除，通过以下方式来确认：在规定的培养基中对所选择的生长株进行培养，并通过离心操作将菌体分离而获得培养液上清液，针对所述培养液上清液进行有机酸分析。即，获取在有机酸分析中未确认到甲酸的生产的菌株来作为pflB基因删除株。此外，有机酸分析是通过使用TSKgel OApak柱(东曹(Tosoh))的高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)分析来进行。
继而，对于如上所述所获取的BW25113ΔpflB：：Km株，使pCP20(生命科学市场(Life Science Market))在30℃下进行转化，将所得的转化体在不含抗生素的LB培养基平板上划线(streak)，在42℃下进行培养。此处，pCP20是以在高温的培养温度条件下表达出使卡那霉素抗性基因的组件(cassette)脱落的Flp重组酶的方式设计的质粒载体。由此，在以42℃培养菌株的所述LB培养基平板中，选择对卡那霉素显示感受性的菌落，并将其命名为BW25113ΔpflB。
(2)ldhA基因的破坏
对于如上所述所获取的BW25113ΔpflB株，再次使pKD46(生命科学市场(LifeScience Market))进行转化，关于获得的转化体，利用与上述同样的方法制备感受态细胞。
继而，使用下述表25所示的引物F15及引物R15的对，利用PCR反应，以pKD13为模板，使包含卡那霉素抗性基因编码区域的DNA片段扩增。此处，引物F15及引物R15分别包含与大肠杆菌染色体DNA中ldhA基因编码区域的上游区域和下游区域相同的核苷酸序列。
[表25]
与所述pflB基因破坏的操作同样地，对所述感受态细胞进行精制后的PCR产物的基因导入，制作ldhA基因删除株。此外，ldhA基因的删除是通过以下方式来确认：在规定的培养基中对转化体进行培养，并通过离心操作而分离出培养液上清液，针对所述培养液上清液，利用与上述同样的方法进行有机酸分析。即，获取在所述有机酸分析中未确认到乳酸的生产的菌株来作为ldhA基因删除株。此外，关于卡那霉素抗性基因从染色体DNA中的去除，也利用如上所述使用pCP20(生命科学市场(Life Science Market))的方法来进行，选择对卡那霉素显示感受性的菌落，并将其命名为BW25113ΔpflBΔldhA株。
(3)frdA基因的破坏
对于如上所述所获取的BW25113ΔpflBΔldhA株，再次使pKD46(生命科学市场(Life Science Market))进行转化，关于获得的转化体，利用与上述同样的方法制备感受态细胞。
继而，使用下述表26所示的引物F16及引物R16的对，利用PCR反应，以pKD13为模板，使包含卡那霉素抗性基因编码区域的DNA片段扩增。此处，引物F16及引物R16分别包含与大肠杆菌染色体DNA中frdA基因编码区域的上游区域和下游区域相同的核苷酸序列。
[表26]
与所述pflB基因破坏的操作同样地，对所述感受态细胞导入精制后的PCR产物，制作frdA基因删除株。此外，frdA基因的删除是通过以下方式来确认：在规定的培养基中对转化体进行培养，并通过离心操作而分离出培养液上清液，针对所述培养液上清液，利用与上述同样的方法进行有机酸分析。即，获取在所述有机酸分析中未确认到琥珀酸的生产的菌株来作为frdA基因删除株。此外，关于卡那霉素抗性基因从染色体DNA中的去除，也利用如上所述使用pCP20(生命科学市场(Life Science Market))的方法来进行，选择对卡那霉素显示感受性的菌落，并将其命名为BW25113ΔpflBΔldhAΔfrdA株。
[试验例4]
对于如上所述所获取的BW25113ΔpflBΔldhAΔfrdA株，分别利用常规方法使试验例1中所构建的pGEK004、pGE333(ppcD229N/K813S)、pGE322(ppcD229N/N917G)进行转化，由此获取本发明规定的各种重组大肠埃希菌菌株。
将所述各种重组菌株分别在试管内的5mL的LB培养基中进行预培养。将获得的预培养液接种于500mL烧瓶内的超级(Terrific)培养基(培养基1L的组成：细菌蛋白胨12g、酵母提取物24g、葡萄糖4mL、KH2PO4 2.31g、K2HPO4 12.54g)100mL中，进而在37℃、200rpm下振荡培养20小时。培养后，细胞离心而除去培养液，将获得的菌体悬浮于40mL的BT液中，并调整为悬浮液的OD值成为15～20附近。将悬浮液移至装有搅拌器的100mL培养基瓶中，进而加入5mL的50％葡萄糖与5mL的2M(NH4)2CO3。将所述培养基瓶放入33℃的恒温槽中静置，一边搅拌一边反应。20小时后，从培养基瓶中采集0.5mL反应液，并对其进行离心分离而获取上清液，测定所消耗的葡萄糖的量与所生产的氨基酸的量。氨基酸的鉴定及测定使用了氨基酸分析系统日珥(Prominence)(岛津制作所股份有限公司)。
(结果)
将通过氨基酸分析而得的色谱图示于图7。此外，在图7所示的色谱图中，每7分钟可见的波峰为天冬氨酸的波峰。进而，在以下的表27中示出所获取的重组大肠埃希菌菌株的基因型、通过天冬氨酸生产试验算出的天冬氨酸生产效率(％)等。天冬氨酸生产效率(％)的值是实际生成的天冬氨酸相对于被吸入菌体的葡萄糖0.5摩尔的比例。所述值是基于理论上可形成1摩尔葡萄糖至2摩尔葡萄糖的天冬氨酸这一情况的值。
[表27]
在使用大肠埃希菌制作本发明规定的重组微生物的本试验例中，作为阴性对照的BW25113ΔldhΔpflBΔfrdA/PGEK004株的天冬氨酸生产效率也明显差而为1％，与此相对，关于具有由D299N与K813S组合而成的氨基酸置换的BW25113ΔldhΔpflBΔfrdA/PGEK333株、以及具有由D299N与N917G组合而成的氨基酸置换的BW25113ΔldhΔpflBΔfrdA/PGEK322株，天冬氨酸生产效率分别依次显示4.3％、11.9％的值，可见超过所述阴性对照的4倍的有意义的提高。特别是关于具有由D299N与N917G组合而成的氨基酸置换的BW25113ΔldhΔpflBΔfrdA/PGEK322株，在天冬氨酸生产效率方面，确认到超过所述阴性对照的11倍的显著提高。即，根据本试验例显示出：在利用大肠埃希菌作为主体的本发明规定的重组微生物中，也可效率良好地将糖类转变为天冬氨酸，可极其效率良好地生产天冬氨酸。
根据所述试验例1～试验例4的结果显示出：根据本发明，能够提高作为目标物质的天冬氨酸及由所述天冬氨酸派生的在代谢途径中生成的代谢物的生成效率，其结果，能够提高目标物质的产率。即，可明确：根据本发明，可提高糖类等起始基质向目标物质的转变效率，其结果，可实现生物加工的节能化、成本削减、有效率的物质生产。
(补充)
作出补充如下：在实施例中，在各种基因编码区域、启动子区域等的克隆中，如上所述也有利用因福森克隆试剂盒(In-Fusion cloning kit)(宝生物工程(Takara Bio)股份有限公司)的工序，但关于PCR扩增时使用的引物对，是依照所述克隆试剂盒的指示在正向/反向引物的5'末端分别加成有适当的接头序列。
工业上的可利用性
本发明在生物技术领域、物质生产的领域等中，工业上的可利用性高。

Claims (38)

1.一种属于棒状杆菌属的转基因微生物，满足所有下述条件(I)～条件(III)：
条件(I)与所述转基因微生物的对应野生型微生物相比，琥珀酸脱氢酶活性经降低或失活；
条件(II)与所述野生型微生物相比，乳酸脱氢酶活性经降低或失活；
条件(III)具有变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性或外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相对于野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性，所述外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性与所述野生型微生物显示出的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相比，相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制的抵抗性更高。
2.根据权利要求1所述的转基因微生物，其中，所述转基因微生物对属于细菌来源的所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的核酸以能够表达所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的形态导入，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有使所述转基因微生物满足条件(III)的至少一个氨基酸变异。
3.根据权利要求2所述的转基因微生物，其中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶是属于棒状杆菌属的细菌来源的变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有使所述转基因微生物满足条件(III)的至少二个氨基酸变异，
所述至少二个氨基酸变异以序列号2所示的氨基酸序列为基准，且包括下述(a)所示的氨基酸置换，以及选自由下述(c)、(e)或(f)所示的氨基酸置换：
(a)相当于第299位的天冬氨酸的氨基酸向天冬酰胺的氨基酸的氨基酸置换；
(c)相当于第813位的赖氨酸的氨基酸向丝氨酸的氨基酸的氨基酸置换；
(e)相当于第873位的精氨酸的氨基酸向丝氨酸的氨基酸的氨基酸置换；
(f)相当于第917位的天冬酰胺的氨基酸向甘氨酸的氨基酸的氨基酸置换。
4.根据权利要求3所述的转基因微生物，其中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶中的所述至少二个氨基酸变异包括所述(a)所示的氨基酸置换，以及所述(c)或是所述(f)所示的氨基酸置换。
5.根据权利要求1所述的转基因微生物，其中，所述转基因微生物为谷氨酸棒状杆菌的转基因菌株。
6.根据权利要求1所述的转基因微生物，进而，作为条件(IV)，与所述野生型微生物相比，丙酮酸：醌氧化还原酶经降低或失活。
7.根据权利要求6所述的转基因微生物，其中所述丙酮酸：醌氧化还原酶的基因失活或被破坏。
8.根据权利要求1所述的转基因微生物，其中，所述琥珀酸脱氢酶的基因失活或被破坏，且所述乳酸脱氢酶的基因失活或被破坏。
9.一种生产目标物质的方法，所述目标物质是天冬氨酸或由所述天冬氨酸衍生的代谢物，其中所述方法包括：
(p)使用根据权利要求1至8中任一项所述的转基因微生物的菌体或其菌体处理物生成目标物质；以及
(q)回收所述目标物质。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述目标物质为天冬氨酸、β丙氨酸或天冬酰胺。
11.一种属于埃希菌属的转基因微生物，满足所有下述条件(I)～条件(III)：
条件(I)与所述转基因微生物的对应野生型微生物相比，富马酸还原酶活性经降低或失活；
条件(II)与所述野生型微生物相比，乳酸脱氢酶活性经降低或失活；
条件(III)具有变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性或外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相对于野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性，所述外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性与所述野生型微生物显示出的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相比，相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制的抵抗性更高。
12.根据权利要求11所述的转基因微生物，其中，所述转基因微生物对属于细菌来源的所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的核酸以能够表达所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的形态导入，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有使所述转基因微生物满足条件(III)的至少一个氨基酸变异。
13.根据权利要求12所述的转基因微生物，其中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶是属于棒状杆菌属的细菌来源的变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有使所述转基因微生物满足条件(III)的至少二个氨基酸变异，
所述至少二个氨基酸变异以序列号2所示的氨基酸序列为基准，且包括下述(a)所示的氨基酸置换，以及选自由下述(c)、(e)或(f)所示的氨基酸置换：
(a)相当于第299位的天冬氨酸的氨基酸向天冬酰胺的氨基酸的氨基酸置换；
(c)相当于第813位的赖氨酸的氨基酸向丝氨酸的氨基酸的氨基酸置换；
(e)相当于第873位的精氨酸的氨基酸向丝氨酸的氨基酸的氨基酸置换；
(f)相当于第917位的天冬酰胺的氨基酸向甘氨酸的氨基酸的氨基酸置换。
14.根据权利要求13所述的转基因微生物，其中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶中的所述至少二个氨基酸变异包括所述(a)所示的氨基酸置换，以及所述(c)或是所述(f)所示的氨基酸置换。
15.根据权利要求11所述的转基因微生物，其中，所述转基因微生物为属于大肠埃希菌的转基因菌株。
16.根据权利要求11所述的转基因微生物，进而，作为条件(V)：与所述野生型微生物相比，丙酮酸甲酸裂合酶活性经降低或失活。
17.根据权利要求16所述的转基因微生物，其中所述丙酮酸甲酸裂合酶的基因失活或被破坏。
18.根据权利要求11所述的转基因微生物，进而，作为条件(IV)，与所述野生型微生物相比，丙酮酸：醌氧化还原酶经降低或失活。
19.根据权利要求18所述的转基因微生物，其中所述丙酮酸：醌氧化还原酶的基因失活或被破坏。
20.根据权利要求11所述的转基因微生物，其中，所述富马酸还原酶的基因失活或被破坏，且所述乳酸脱氢酶的基因失活或被破坏。
21.一种生产目标物质的方法，所述目标物质是天冬氨酸或由所述天冬氨酸衍生的代谢物，其中所述方法包括：
(p)使用根据权利要求11至20中任一项所述的转基因微生物的菌体或其菌体处理物生成目标物质；以及
(q)回收所述目标物质。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述目标物质为天冬氨酸、β丙氨酸或天冬酰胺。
23.一种核酸的应用，所述核酸用于满足以下条件(I)和条件(II)的转基因微生物中的属于棒状杆菌属的细菌中，且用于生产作为目标物质的天冬氨酸或由所述天冬氨酸衍生的代谢物，并对变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶以能够表达的形态进行编码，且属于棒状杆菌属的细菌来源的所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有使所述转基因微生物满足以下条件(III)的至少二个氨基酸变异：
条件(I)与所述转基因微生物的对应野生型微生物相比，琥珀酸脱氢酶活性经降低或失活；
条件(II)与所述野生型微生物相比，乳酸脱氢酶活性经降低或失活；
条件(III)具有变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相对于野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性；
其中，所述至少二个氨基酸变异以序列号2所示的氨基酸序列为基准，且包括下述(a)所示的氨基酸置换，以及选自由下述(c)、(e)或(f)所示的氨基酸置换：
(a)相当于第299位的天冬氨酸的氨基酸向天冬酰胺的氨基酸的氨基酸置换；
(c)相当于第813位的赖氨酸的氨基酸向丝氨酸的氨基酸的氨基酸置换；
(e)相当于第873位的精氨酸的氨基酸向丝氨酸的氨基酸的氨基酸置换；
(f)相当于第917位的天冬酰胺的氨基酸向甘氨酸的氨基酸的氨基酸置换。
24.根据权利要求23所述的应用，其中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶中的所述至少二个氨基酸变异包括所述(a)所示的氨基酸置换，以及所述(c)或是所述(f)所示的氨基酸置换。
25.根据权利要求23所述的应用，其中，所述转基因微生物为谷氨酸棒状杆菌的转基因菌株。
26.据权利要求23所述的应用，其中，所述转基因微生物与所述野生型微生物相比，丙酮酸：醌氧化还原酶经降低或失活。
27.根据权利要求26所述的应用，其中，所述转基因微生物的所述丙酮酸：醌氧化还原酶的基因失活或被破坏。
28.据权利要求23所述的应用，其中，所述转基因微生物的所述琥珀酸脱氢酶的基因失活或被破坏，且所述乳酸脱氢酶的基因失活或被破坏。
29.据权利要求23所述的应用，其中，所述目标物质为天冬氨酸、β丙氨酸或天冬酰胺。
30.一种核酸的应用，所述核酸用于满足以下条件(I)和条件(II)的转基因微生物中的属于埃希菌属的细菌中，且用于生产作为目标物质的天冬氨酸或由所述天冬氨酸衍生的代谢物，并对变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶以能够表达的形态进行编码，且属于棒状杆菌属的细菌来源的所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有使所述转基因微生物满足以下条件(III)的至少二个氨基酸变异：
条件(I)与所述转基因微生物的对应野生型微生物相比，富马酸还原酶活性经降低或失活；
条件(II)与所述野生型微生物相比，乳酸脱氢酶活性经降低或失活；
条件(III)具有变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相对于野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性；
其中，所述至少二个氨基酸变异以序列号2所示的氨基酸序列为基准，且包括下述(a)所示的氨基酸置换，以及选自由下述(c)、(e)或(f)所示的氨基酸置换：
(a)相当于第299位的天冬氨酸的氨基酸向天冬酰胺的氨基酸的氨基酸置换；
(c)相当于第813位的赖氨酸的氨基酸向丝氨酸的氨基酸的氨基酸置换；
(e)相当于第873位的精氨酸的氨基酸向丝氨酸的氨基酸的氨基酸置换；
(f)相当于第917位的天冬酰胺的氨基酸向甘氨酸的氨基酸的氨基酸置换。
31.根据权利要求30所述的应用，其中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶中的所述至少二个氨基酸变异包括所述(a)所示的氨基酸置换，以及所述(c)或是所述(f)所示的氨基酸置换。
32.根据权利要求30所述的应用，其中，所述转基因微生物为属于大肠埃希菌的转基因菌株。
33.根据权利要求30所述的应用，其中，所述转基因微生物与所述野生型微生物相比，丙酮酸甲酸裂合酶活性经降低或失活。
34.根据权利要求33所述的应用，其中，所述转基因微生物的所述丙酮酸甲酸裂合酶的基因失活或被破坏。
35.据权利要求30所述的应用，其中，所述转基因微生物与所述野生型微生物相比，丙酮酸：醌氧化还原酶经降低或失活。
36.根据权利要求35所述的应用，其中，所述转基因微生物的丙酮酸：醌氧化还原酶的基因失活或被破坏。
37.据权利要求30所述的应用，其中，所述转基因微生物的所述富马酸还原酶的基因失活或被破坏，且所述乳酸脱氢酶的基因失活或被破坏。
38.据权利要求30所述的应用，其中，所述目标物质为天冬氨酸、β丙氨酸或天冬酰胺。
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