JP7360741B2 - 遺伝子組換え微生物及びこれを用いた目的物質の生産方法 - Google Patents
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Description
なお、本願は、2019年4月12日付けで日本国特許庁に提出された日本国特許出願No.JP2019-76629(特願2019-76629)に基いて優先権を主張するものであり、上記日本国特許出願の内容は、あらゆる目的において本明細書で援用される。
しかしながら、現在のアスパラギン酸の工業生産は、石油から大量に安価に合成されるフマル酸を原料にしているのが現状であり、バイオマス由来の糖を原料とした発酵技術によるアスパラギン酸の工業生産は未だ実現していない。
[1]下記の条件(I)、(II)及び(IV)のうちの少なくとも1つを充足し、かつ下記の条件(III)を充足する、遺伝子組換え微生物:
条件(I)上記遺伝子組換え微生物に対応する野生型微生物と比較して、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性又はフマル酸還元酵素活性が低減され又は不活化されていること;
条件(II)上記野生型微生物と比較して、乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低減され又は不活化されていること;
条件(III)野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性におけるアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対し抵抗性を示す改変型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性、又は上記野生型微生物が示す野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性よりもアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性が高い外来性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有すること;
条件(IV)上記野生型微生物と比較して、ピルビン酸:キノンオキシドレダクターゼ活性が低減され又は不活化されていること。
ここで、いくつか実施形態においては、条件(I)、(II)及び(IV)のうちの少なくとも2つの条件を充足してもよく、特定の実施形態においては、条件(I)及び(II)の両方、条件(I)及び(IV)の両方、又は条件(II)及び(IV)の両方を充足してもよい。
条件(I)上記遺伝子組換え微生物に対応する野生型微生物と比較して、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性又はフマル酸還元酵素活性が低減され又は不活化されていること;
条件(II)上記野生型微生物と比較して、乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低減され又は不活化されていること;
条件(III)野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性におけるアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対し抵抗性を示す改変型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性、又は上記野生型微生物が示す野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性よりもアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性が高い外来性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有すること。
なお、本発明においては、[4]において「細菌由来の変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸」を「微生物、植物、原核生物又は細菌由来の外来性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸」と読み替えることによる実施形態も採用され得る。
[6]上記変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、コリネバクテリウム属に属する細菌に由来するものである、[4]又は[5]に記載の遺伝子組換え微生物。
(a)第299番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換(ただし、置換後のアミノ酸はアスパラギン酸ではないものとし、好ましくはアラニン、アスパラギン、グリシン又はセリンへのアミノ酸置換である。);
(b)第653番目のリシンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換(ただし、置換後のアミノ酸はリシンではないものとし、好ましくはアラニン、アスパラギン、又はセリンへのアミノ酸置換である。);
(c)第813番目のリシンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換(ただし、置換後のアミノ酸はリシンではないものとし、好ましくはアラニン、アスパラギン、グリシン又はセリンへのアミノ酸置換である。);
(d)第869番目のセリンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換(ただし、置換後のアミノ酸はセリンではないものとし、好ましくはアラニン、アスパラギン、又はグリシンへのアミノ酸置換である。);
(e)第873番目のアルギニンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換(ただし、置換後のアミノ酸はアルギニンではないものとし、好ましくはアラニン、アスパラギン、グリシン又はセリンへのアミノ酸置換である。);及び
(f)第917番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換(ただし、置換後のアミノ酸はアスパラギンではないものとし、好ましくはアラニン、フェニルアラニン、グリシン又はセリンへのアミノ酸置換である。)、
ただし、上記(a)~(f)において、置換前のアミノ酸と置換後のアミノ酸とは異なるものとする。
(g)第299番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸のアスパラギンへのアミノ酸置換;
(h)第653番目のリシンに相当するアミノ酸のセリンへのアミノ酸置換;
(i)第813番目のリシンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換(ただし、置換後のアミノ酸はリシンではないものとし、好ましくはグリシン又はセリンへのアミノ酸置換である。);
(j)第869番目のセリンに相当するアミノ酸のグリシンへのアミノ酸置換;
(k)第873番目のアルギニンに相当するアミノ酸のグリシンへのアミノ酸置換;及び
(l)第917番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換(ただし、置換後のアミノ酸はアスパラギンではないものとし、好ましくはアラニン、フェニルアラニン、グリシン又はセリンへのアミノ酸置換である。)。
[10]上記変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼにおける上記少なくとも1つのアミノ酸変異は、上記(g)に示すアミノ酸置換と、上記(i)又は(l)に示すアミノ酸置換とを含む、[8]又は[9]に記載の遺伝子組換え微生物。
(A)配列番号2~13(好ましくは配列番号2~12、より好ましくは配列番号2~11)の何れか1つに示すアミノ酸配列に対して、上記少なくとも1つのアミノ酸置換を導入してなるアミノ酸配列;
(B)上記(A)に規定のアミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列(但し、上記少なくとも1つのアミノ酸置換は維持されているものとする。);
(C)上記(A)に規定のアミノ酸配列に対して少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列(但し、上記少なくとも1つのアミノ酸置換は維持されているものとする。)。
[13]上記変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、配列番号2に示すアミノ酸配列に対して、上記少なくとも1つのアミノ酸置換を導入してなるアミノ酸配列を有する、[4]~[12]の何れか1つに記載の遺伝子組換え微生物。
該アミノ酸変異が、配列番号2に示すアミノ酸配列を基準として、
(g)第299番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸のアスパラギンへのアミノ酸置換と、
(i)第813番目のリシンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換(ただし、置換後のアミノ酸はリシンではないものとする。);又は
(l)第917番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換(ただし、置換後のアミノ酸はアスパラギンではないものとする。)と、
を少なくとも含み、
上記野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのアミノ酸配列に対して、上記(g)、(i)又は(l)に規定のアミノ酸置換のみを有してなるタンパク質よりも、アスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性が高い、
変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ。
ここで、[14]に係る変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼにおいては、上記(i)において、第813番目のリシンに相当するアミノ酸は、アラニン、アスパラギン、グリシン又はセリンに置換されることが好ましく、さらにグリシン又はセリンに置換されることがより好ましく、さらにセリンに置換されることが最も好ましい。さらに、上記(l)において、第917番目のアスパラギンに相当するアミノ酸は、アラニン、フェニルアラニン、グリシン又はセリンに置換されることが好ましく、フェニルアラニン又はグリシンに置換されることがより好ましい。
(J)配列番号2~13(好ましくは配列番号2~12、より好ましくは配列番号2~11)の何れか1つに示すアミノ酸配列において、上記アミノ酸置換を導入してなるアミノ酸配列;
(K)上記(J)に規定のアミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列(但し、上記アミノ酸置換は維持されているものとする。);
(L)上記(J)に規定のアミノ酸配列に対して少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列(但し、上記アミノ酸置換は維持されているものとする。)。
[18]配列番号2~13(好ましくは配列番号2~12、より好ましくは配列番号2~11)の何れか1つに示すアミノ酸配列に対して、上記アミノ酸置換を導入してなるアミノ酸配列を有する、[14]~[17]の何れか1つに記載の変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ。
[20]DNA断片である、[19]に記載の核酸。
条件(I)上記遺伝子組換え微生物に対応する野生型微生物と比較して、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性又はフマル酸還元酵素活性が低減され又は不活化されていること;
条件(II)上記野生型微生物と比較して、乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低減され又は不活化されていること;
条件(III)野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性におけるアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対し抵抗性を示す改変型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性、又は上記野生型微生物が示す野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性よりもアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性が高い外来性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有すること。
[24]条件(I)~(III)の全ての条件を充足する、[22]又は[23]に記載の遺伝子組換え微生物。
[27]グラム陽性菌に属する遺伝子組換え微生物である、[1]~[13]及び[21]~[26]の何れか1つに記載の遺伝子組換え微生物。
[28]コリネ型細菌に属する遺伝子組換え微生物である、[27]に記載の遺伝子組換え微生物。
[29]コリネバクテリウム属に属する遺伝子組換え微生物である、[28]に記載の遺伝子組換え微生物。
[30]コリネバクテリウム・グルタミカムの遺伝子組換え菌株である、[29]に記載の遺伝子組換え微生物。
[31]グラム陰性菌に属する遺伝子組換え微生物である、[1]~[13]及び[21]~[26]の何れか1つに記載の遺伝子組換え微生物。
[32]エシェリキア属に属する遺伝子組換え微生物である、[31]に記載の遺伝子組換え微生物。
[33]エシェリキア・コリの遺伝子組換え微生物である、[32]に記載の遺伝子組換え微生物。
[34]さらに、条件(V)として、上記野生型微生物と比較して、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性が低減され又は不活化されていることを充足する、[31]~[33]の何れか1つに記載の遺伝子組換え微生物。
(q)上記目的物質を回収すること、
を含む、目的物質を生産する方法。
[39]上記反応媒体(X)の酸化還元電位が、-200ミリボルトから-500ミリボルトの範囲にある所定の値である、[38]に記載の方法。
[40]上記反応媒体(X)が糖類を含む、[38]又は[39]に記載の方法。
[41]上記反応媒体(X)がグルコースを含む、[38]~[40]の何れか1つに記載の方法。
(p’)所定の培地(Y)中で、好気条件下に、上記遺伝子組換え微生物を培養し及び増殖させること、
をさらに含み、工程(p’)において増殖させた該遺伝子組換え微生物の菌体又はその菌体処理物を工程(p)に供試する、[37]~[41]の何れか1つに記載の方法。
[44]上記目的物質が、アスパラギン酸又はこれから誘導される代謝産物である、[37]~[43]の何れか1つに記載の方法。
[45]上記目的物質が、アスパラギン酸、ベータアラニン、又はアスパラギンである、[37]~[44]の何れか1つに記載の方法。
以下、本発明の態様においてさらに採用し得る実施形態ないし変形例を例示すると共に、本発明の利点及び効果についても言及する。
本発明の第一の態様によれば、以下の遺伝子組換え微生物が提供される。
下記の条件(I)、(II)及び(IV)のうちの少なくとも1つを充足し、かつ下記の条件(III)を充足する、遺伝子組換え微生物:
条件(I)上記遺伝子組換え微生物に対応する野生型微生物と比較して、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性又はフマル酸還元酵素活性が低減され又は不活化されていること;
条件(II)上記野生型微生物と比較して、乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低減され又は不活化されていること;
条件(III)野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性におけるアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対し抵抗性を示す改変型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性、又は上記野生型微生物が示す野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性よりもアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性が高い外来性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有すること;
条件(IV)上記野生型微生物と比較して、ピルビン酸:キノンオキシドレダクターゼ活性が低減され又は不活化されていること。
下記の条件(I)~(III)の全てを充足する、遺伝子組換え微生物:
条件(I)上記遺伝子組換え微生物に対応する野生型微生物と比較して、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性又はフマル酸還元酵素活性が低減され又は不活化されていること;
条件(II)上記野生型微生物と比較して、乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低減され又は不活化されていること;
条件(III)野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性におけるアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対し抵抗性を示す改変型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性、又は上記野生型微生物が示す野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性よりもアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性が高い外来性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有すること。
なお、以下、本発明の第一の態様に係る遺伝子組換え微生物と、発明の第二の態様に係る遺伝子組換え微生物とを、まとめて「本発明の遺伝子組換え微生物」又は「本発明に係る遺伝子組換え微生物」と言うことがある。
より詳細には、コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属菌、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属菌、アースロバクター(Arthrobacter)属菌、マイコバクテリウム(Mycobacterium)属菌、マイクロコッカス(Micrococcus)属菌、マイクロバクテリウム(Microbacterium)属菌等が挙げられる。
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)(例えば、FERM P-18976株、ATCC13032株、ATCC31831株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株);
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacterium acetoglutamicum)(例えばATCC15806株);
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)(例えばATCC13870株);
コリネバクテリウム・メラセコラ(Corynebacterium melassecola)(例えばATCC17965株);
コリネバクテリウム・エフィシエンス(Corynebacterium efficiens)(例えばYS-314株、YS-314T株(NBRC100395T株));
コリネバクテリウム・アルカノリティカム(Corynebacterium alkanolyticum)(例えばATCC21511株);
コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)(例えばATCC15991株、NBRC15359株、DSM20147株);
コリネバクテリウム・リリウム(Corynebacterium lilium)(例えばATCC15990株);
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(コリネバクテリウム・エフィシエンス)(Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens))(例えばAJ12340株、FERM BP1539株);
コリネバクテリウム・ハーキュリス(Corynebacterium herculis)(例えばATCC13868株);
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(コリネバクテリウム・スタティオニス)(Corynebacterium ammoniagenes(Brevibacterium ammoniagenes)(例えばATCC6871株、ATCC6872株、DSM20306株、NBRC12071T株、NBRC12072株、NBRC12612T株);
コリネバクテリウム・ポリュティソリ(Corynebacterium pollutisoli);
コリネバクテリウム・マリナム(Corynebacterium marinum)(例えばDSM44953株);
コリネバクテリウム・フミリドゥセンス(Corynebacterium humireducens)(例えばNBRC106098株);
コリネバクテリウム・ハロトレランス(Corynebacterium halotolerans)(例えばYIM70093株);
コリネバクテリウム・デザーティ(Corynebacterium deserti)(例えばGIMN1.010株);
コリネバクテリウム・ドオサネンス(Corynebacterium doosanense)(例えばCAU212株、DSM45436株);
コリネバクテリウム・マリス(Corynebacterium maris)(例えばDSM45190株)。
ブレビバクテリウム・ディバリカタム(Brevibacterium divaricatum)(例えばATCC14020株);
ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)[例えば、MJ-233(FERM BP-1497)株、MJ-233AB-41(FERM BP-1498)株、ATCC13826株、ATCC14067株、ATCC13826株];
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム(Brevibacterium immariophilum)(例えばATCC14068株);
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum))(例えばATCC13869株);
ブレビバクテリウム・ロゼウム(Brevibacterium roseum)(例えばATCC13825株);
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム(Brevibacterium saccharolyticum)(例えばATCC14066株);
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス(Brevibacterium thiogenitalis)(例えばATCC19240株);
ブレビバクテリウム・アルバム(Brevibacterium album)(例えばATCC15111株);
ブレビバクテリウム・セリナム(Brevibacterium cerinum)(例えばATCC15112株)。
アースロバクター・グロビフォルミス(Arthrobacter globiformis)(例えば、ATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株、NBRC3062株、NBRC12137T株)等が挙げられる。
マイクロバクテリウム属菌の具体例としては、マイクロバクテリウム・アンモニアフィラム(Microbacterium ammoniaphilum)(例えばATCC15354株)。
まず、条件(I)、(II)及び(IV)について説明する。
条件(I)における「遺伝子組換え微生物に対応する野生型微生物と比較して、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性又はフマル酸還元酵素活性が低減され又は不活化されていること」とは、本発明に係る遺伝子組換え微生物を作製する上で、出発材料として使用される野生型微生物と比較して、コハク酸デヒドロゲナーゼ又はフマル酸還元酵素活性が有意に低減されているか、又は完全に不活化していることを意味する。なお、コリネバクテリウム属菌等の一部の細菌では、フマル酸還元酵素はもっておらず、コハク酸デヒドロゲナーゼがこの反応を触媒するが、大腸菌等の一部の細菌では、コハク酸デヒドロゲナーゼとフマル酸還元酵素の両方の酵素を有しており、主にフマル酸還元酵素が上記の反応を触媒する。
さらに、条件(II)における「野生型微生物と比較して、乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低減され又は不活化されていること」とは、本発明に係る遺伝子組換え微生物を作製する上で、出発材料として使用される野生型微生物と比較して、乳酸デヒドロゲナーゼ活性が有意に低減されているか、又は完全に不活化していることを意味する。
さらに加えて、条件(IV)における「野生型微生物と比較して、ピルビン酸:キノンオキシドレダクターゼ活性が低減され又は不活化されていること」とは、本発明に係る遺伝子組換え微生物を作製する上で、出発材料として使用される野生型微生物と比較して、ピルビン酸:キノンオキシドレダクターゼ活性が有意に低減されているか、又は完全に不活化していることを意味する。
即ち、本発明において条件(I)を充足する実施形態が採用された場合、好気条件下では、コハク酸からフマル酸への変換が抑制されることから、より多量のクエン酸、cis -アコニット酸、D-イソクエン酸、α-ケトグルタル酸、スクシニルCoA、コハク酸又はこれから誘導される更なる代謝産物を効率的に産生させることができ、他方、還元条件又は嫌気条件下では、より多量のオキサロ酢酸、L-リンゴ酸、フマル酸又はこれから誘導される更なる代謝産物を効率的に産生させることができる。ここで、TCAサイクルにおける上記代謝産物から誘導される更なる代謝産物は、条件(I)を充足する本発明の遺伝子組換え微生物において、もともと野生型微生物が保持する代謝系を介して生合成されるものであってもよいし、さらに所定の遺伝子を導入することで新たに構築された代謝系を介して生合成されるものであってもよい。
本発明において、条件(V)の充足は必須ではないが、特定の実施形態において、本発明に係る遺伝子組換え微生物は、さらに、下記の条件(V)を充足する。
条件(V):野生型微生物と比較して、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性が低減され又は不活化されていること。
ここで、条件(V)における「野生型微生物と比較して、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性が低減され又は不活化されていること」とは、本発明に係る遺伝子組換え微生物を作製する上で、出発材料として使用される野生型微生物と比較して、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性が有意に低減されているか、又は完全に不活化していることを意味する。
(I)遺伝子組換え微生物のゲノム(染色体DNA)上において、各酵素活性を付与し得る酵素遺伝子コード領域が完全に又は部分的に破壊されていることにより、条件(I)及び/又は(II)及び/又は(IV)及び/又は(V)を充足する実施形態。
(II)遺伝子組換え微生物のゲノム上において、各酵素活性を付与し得る酵素遺伝子コード領域の上流に存在する遺伝子発現調節領域(例えばプロモーター領域)が完全に又は部分的に破壊されていることにより、条件(I)及び/又は(II)及び/又は(IV)及び/又は(V)を充足する実施形態。
(III) 遺伝子組換え微生物のゲノム上において、各酵素活性を付与し得る酵素遺伝子コード領域に対して、それぞれ、1又は複数のアミノ酸変異を誘発するヌクレオチド変異が導入されていることにより、条件(I)及び/又は(II)及び/又は(IV)及び/又は(V)を充足する実施形態。ここで、「1又は複数のアミノ酸変異」は、各酵素活性の低減又は不活化を生じ得るアミノ酸変異を意味する。
(IV)各酵素活性を付与し得る酵素タンパク質の酵素活性を活性化させる内因性アクチベーターが、上記実施形態(I)~(III)に記載の方法により不活化されることにより、条件(I)及び/又は(II)及び/又は(IV)及び/又は(V)を充足する実施形態。
(1)破壊すべき標的領域の決定と同領域のクローニング
Corynebacterium属菌、Escherichia属菌、Bacillus属菌、Clostridium属菌等の多くの細菌、さらにSaccharomyces cerevisiae、Yarrowia lipolytica等の各種菌類は、全ゲノム配列が決定されており、そのヌクレオチド配列並びに各遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列も既知である。
例えば、本発明において好ましく利用され得る微生物の1つであるCorynebacterium glutamicumについて言えば、ATCC13032株、R株、ATCC21831株、ATCC14067株等の多数の菌株において全ゲノム配列が決定されており、そのヌクレオチド配列等は既知である。さらに加えて、Corynebacterium efficiens YS-314株;Corynebacterium callunae DSM20147株;Corynebacterium ammoniagenes DSM20306株;Corynebacterium marinum DSM44953株;Corynebacterium humireducens NBRC106098株(DSM45392株);Corynebacterium halotolerans YIM70093株(DSM44683株);Corynebacterium deserti GIMN1.010株;Corynebacterium maris DSM45190株;Corynebacterium doosanense CAU212株(DSM45436株)等のコリネバクテリウム属菌株について全ゲノム配列が決定されており、それらヌクレオチド配列等は既知である。さらに、全ゲノム配列が決定されていないにしても、条件(I)、(II)、(IV)及び(V)に係る各酵素活性を付与する各酵素遺伝子のヌクレオチド配列並びに該酵素のアミノ酸配列が既知である微生物も存在する。
これら既知のヌクレオチド配列やアミノ酸配列は、ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション・サポート・センター(National Center for Biotechnology Information Support Center;NCBI)(アメリカ合衆国メリーランド州ベセスダ・ロックビルパイク8600)がインターネット上で公開するデータベース(URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等の各種データベースから容易に入手可能である。
なお、細菌においては、コハク酸デヒドロゲナーゼ(Sdh)については、sdhC遺伝子にコードされる膜貫通タンパク質(サブユニットC)、sdhA遺伝子にコードされるフラビンタンパク質サブユニット(サブユニットA)、及びsdhB遺伝子にコードされるFe-Sタンパク質(サブユニットB)の3つのサブユニットタンパク質、並びに場合によってはSdhD(サブユニットD)から構成される複合体であり、これらサブユニットをコードする各遺伝子は、原核生物の場合、細菌ゲノム上でオペロンを構成している(例えば、図2B)。加えて、フマル酸還元酵素(Frd)は、例えばエシェリキア・コリ等の細菌では、サブユニットD、C、B、Aから構成される複合体であり、frdDCBA遺伝子(オペロン)によりコードされている。さらに、ピルビン酸ギ酸リアーゼ(Pfl)は、例えばエシェリキア・コリ等の細菌では、サブユニットA、B、C、Dから構成される複合体であり、pflABCD遺伝子(オペロン)によりコードされている。
次いで、条件(I)、(II)、(IV)及び(V)に係る酵素遺伝子の破壊に関し、相同組換え法を用いた遺伝子破壊株の作製方法について説明する。
まず、ゲノム上において破壊したい領域と相同組換えを生じ得る遺伝子破壊用プラスミドベクターを作製する必要がある。
なお、遺伝子組換え微生物におけるゲノム上の標的領域の破壊の確認は、PCR法やサザンハイブリダイゼーション法、各種酵素活性測定法等に基いて実施できる。
本発明に係る遺伝子組換え微生物は、さらに、条件(III)として「野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性におけるアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対し抵抗性を示す改変型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性、又は上記野生型微生物が示す野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性よりもアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性が高い外来性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有すること」を充足し得る。
まず、本発明において、「ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性」とは、具体的にはEC4.1.1.31に規定される反応を触媒する酵素活性を言い、多種多様な植物や微生物が広く保有するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)により発揮される酵素活性である。以下に、PEPCが触媒する代謝反応を示す。
即ち、上記の用語は、本発明に係る遺伝子組換え微生物が属する種に対応する野生型微生物、又は本発明に係る遺伝子組換え微生物を作製する上で出発材料として用いられる野生型微生物が保有する野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが示す「アスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性」と比較して、アスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性がより高い外来性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を意味する。このような外来性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性は、具体的には、上記「対応する野生型宿主微生物」とは異なる菌株系統又は生物種」が保有する異種性のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼによって付与され得る。ここで、「野生型宿主微生物とは異なる生物種」は、微生物(例えば、菌類、古細菌や細菌等の原核生物)、植物、哺乳類等の動物などの各種生物種を含む。さらに、本発明に係る遺伝子組換え微生物における「外来性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性」の付与は、より具体的には「野生型宿主微生物とは異なる菌株系統又は生物種」から単離されたPEPC遺伝子をコードする核酸の導入により実現できる。
加えて、本明細書においては、「ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ」を「PEPC」、又は「ppc」と表すことがある。
(i)野生型PEPCのアミノ酸配列に対して、1又は複数のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加されてなる変異型PEPC。ここで、「1又は複数」の範囲は、例えば1から100個、1から50個、1から30個、好ましくは少なくとも2個以上、2から20個、より好ましくは2から10個、さらにより好ましくは2から5個、特に好ましくは2から4個、2から3個、例えば2個である。
(ii)2種以上の野生型PEPCのアミノ酸配列の一部を組合せて構成したキメラ型PEPC。
(a)第299番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換(ただし、置換後のアミノ酸はアスパラギン酸ではないものとし、好ましくはアラニン、アスパラギン、グリシン又はセリンへのアミノ酸置換である。);
(b)第653番目のリシンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換(ただし、置換後のアミノ酸はリシンではないものとし、好ましくはアラニン、アスパラギン、又はセリンへのアミノ酸置換である。);
(c)第813番目のリシンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換(ただし、置換後のアミノ酸はリシンではないものとし、好ましくはアラニン、アスパラギン、グリシン又はセリンへのアミノ酸置換である。);
(d)第869番目のセリンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換(ただし、置換後のアミノ酸はセリンではないものとし、好ましくはアラニン、アスパラギン、又はグリシンへのアミノ酸置換である。);
(e)第873番目のアルギニンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換(ただし、置換後のアミノ酸はアルギニンではないものとし、好ましくはアラニン、フェニルアラニン、グリシン又はセリンへのアミノ酸置換である。);及び
(f)第917番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換(ただし、置換後のアミノ酸はアスパラギンではないものとし、好ましくはアラニン、フェニルアラニン、グリシン又はセリンへのアミノ酸置換である。)、
ただし、上記(a)~(f)において、置換前のアミノ酸と置換後のアミノ酸とは異なるものとする。
なお、例えば、「第299番目のアスパラギン酸」を、アミノ酸の1文字表記を利用して「D299」と表し、「第299番目のアスパラギン酸のアスパラギンへのアミノ酸置換」を「D299N」と表すことがある。その他のアミノ酸及びアミノ酸置換も同様の方法で表記され得る。
(g)第299番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸のアスパラギンへのアミノ酸置換;
(h)第653番目のリシンに相当するアミノ酸のセリンへのアミノ酸置換;
(i)第813番目のリシンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換(ただし、置換後のアミノ酸はリシンではないものとし、好ましくはグリシン又はセリンへのアミノ酸置換である。);
(j)第869番目のセリンに相当するアミノ酸のグリシンへのアミノ酸置換;
(k)第873番目のアルギニンに相当するアミノ酸のグリシンへのアミノ酸置換;及び
(l)第917番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換(ただし、置換後のアミノ酸はアスパラギンではないものとし、好ましくはアラニン、フェニルアラニン、グリシン又はセリンへのアミノ酸置換である。)。
さらに、別の好ましい実施形態においては、上記変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼにおける上記少なくとも1つのアミノ酸変異は、上記(g)に示すアミノ酸置換と、上記(i)~(l)に示すアミノ酸置換のうちの少なくとも1つとを含む。
加えて、特に好ましい実施形態においては、上記変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼにおける上記少なくとも1つのアミノ酸変異は、上記(g)に示すアミノ酸置換と、上記(i)又は(l)に示すアミノ酸置換とを含む。
(A)配列番号2~13(好ましくは配列番号2~12、より好ましくは配列番号2~11)の何れか1つに示すアミノ酸配列において、上記(a)~(l)に示すアミノ酸置換からなる群から選択される少なくとも1つを導入してなるアミノ酸配列(ただし、置換前のアミノ酸と置換後のアミノ酸は異なるものとする。);
(B)上記(A)に規定のアミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列(但し、上記少なくとも1つのアミノ酸置換は維持されているものとする。);
(C)上記(A)に規定のアミノ酸配列に対して少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列(但し、上記少なくとも1つのアミノ酸置換は維持されているものとする。)。
(D)配列番号2~13(好ましくは配列番号2~12、より好ましくは配列番号2~11)の何れか1つに示すアミノ酸配列において、上記(g)に示すアミノ酸置換と、上記(h)~(l)に示すアミノ酸置換のうちの少なくとも1つとを導入してなるアミノ酸配列(ただし、置換前のアミノ酸と置換後のアミノ酸は異なるものとする。);
(E)上記(D)に規定のアミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列(但し、上記各アミノ酸置換は維持されているものとする。);
(F)上記(D)に規定のアミノ酸配列に対して少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列(但し、上記各アミノ酸置換は維持されているものとする。)。
(G)配列番号2~13(好ましくは配列番号2~12、より好ましくは配列番号2~11)の何れか1つに示すアミノ酸配列において、上記(g)に示すアミノ酸置換と、上記(i)~(l)に示すアミノ酸置換のうちの少なくとも1つとを導入してなるアミノ酸配列(ただし、置換前のアミノ酸と置換後のアミノ酸は異なるものとする。);
(H)上記(G)に規定のアミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列(但し、上記各アミノ酸置換は維持されているものとする。);
(I)上記(G)に規定のアミノ酸配列に対して少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列(但し、上記各アミノ酸置換は維持されているものとする。)。
(J)配列番号2~13(好ましくは配列番号2~12、より好ましくは配列番号2~11)の何れか1つに示すアミノ酸配列において、上記(g)に示すアミノ酸置換と、上記(i)又は(l)に示すアミノ酸置換とを導入してなるアミノ酸配列(ただし、置換前のアミノ酸と置換後のアミノ酸は異なるものとする。);
(K)上記(J)に規定のアミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列(但し、上記各アミノ酸置換は維持されているものとする。);
(L)上記(J)に規定のアミノ酸配列に対して少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列(但し、上記各アミノ酸置換は維持されているものとする。)。
加えて、上記(C)、(F)、(I)及び(L)において、「少なくとも60%」は、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%と読み替えられる。
さらに加えて、上記(A)、(D)、(G)及び(J)において、「配列番号2~13(好ましくは配列番号2~12、より好ましくは配列番号2~11)の何れか1つに示すアミノ酸配列」は、「配列番号2に示すアミノ酸配列」(即ち、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株の野生型PEPCアミノ酸配列)と読み替える実施形態は、特に好ましい。
なお、上述の各実施形態において、上記(A)~(L)の何れかに規定のアミノ酸配列を有する変異型PEPCが、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を保持し、かつ条件(III)を充足せしめる趣旨であることに変わりは無い。
本発明の第三の態様によれば、以下の目的物質を生産する方法が提供される。
(p)本発明に係る遺伝子組換え微生物の菌体又はその菌体処理物を用いて目的物質を生成させること;並びに
(q)上記目的物質を回収すること、
を含む、目的物質を生産する方法。
さらに、より好ましい実施形態においては、本発明に係る方法は、工程(p)の前に、
(p’)所定の培地(Y)中で、好気条件下に、上記遺伝子組換え微生物を予め培養し及び増殖させること、をさらに含み、
工程(p’)において増殖させた該遺伝子組換え微生物の菌体又はその菌体処理物を工程(p)に供試する。
以下、工程(p’)、工程(p)、工程(q)の順に、これらの工程で採用され得る具体的構成及び要素について詳述する。
培地(Y)は、特に限定されるものではなく、方法において用いる遺伝子組換え微生物の種類に応じて、適当なもので選択して用いれば良い。具体的には、培地(Y)としては、炭素源、窒素源、無機塩類およびその他栄養物質等を含有する天然培地または合成培地を用いることができる。培地中に含まれる成分は、例えば以下のとおりである。
グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトース等の単糖類;スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖類;セルロース,デンプン,グリコーゲン、アガロース、ペクチン、アルギン酸等の多糖類;糖蜜等;稲わら、林地残材、バガス、コーンストーバー等の非可食農産廃棄物や非可食性バイオマス(非可食性の草本植物や木本植物を原料とした資源);スイッチグラス、ネピアグラス、ミスキャンサス等のエネルギー作物を糖化酵素などで糖化したグルコースやキシロース等の複数の糖類を含む糖化液;マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリン等の糖アルコール;酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸等の有機酸;エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール;ノルマルパラフィン等の炭化水素。
なお、炭素源は、1種を単独で、又は2種以上を混合して使用できる。
なお、窒素源は、1種を単独で又は2種以上を組合せて用いることができる。窒素源の培地中の濃度は、採用する遺伝子組換え微生物の種類やその性質、窒素化合物の種類等の条件に応じて適宜調整すればよく特に限定されるものでもないが、例えば約0.1~10w/v%とすることができる。
なお、無機塩は、1種を単独で又は2種以上を混合して使用できる。無機塩類の培地中の濃度は、採用する遺伝子組換え微生物の種類やその性質、無機塩類の種類等の条件に応じて適宜調整すればよく特に限定されるものでもないが、例えば約0.01~1(w/v%)とすればよい。
さらに加えて、必要に応じて、シリコーン系消泡剤やポリエーテル系消泡剤等の消泡剤を添加してもよく、細菌培地用の各種消泡剤が市販されているので、それらを利用してもよい。
なお、培地(Y)のpHは、採用する遺伝子組換え微生物が生育できる程度であれば特に限定されるものでもないが、約6~8が好ましい。
ここで、遺伝子組換え微生物の培養条件については、該遺伝子組換え微生物が十分に増殖し、十分な量の菌体又はその菌体処理物が得られるように適宜設定すれば足りる。具体的には、好気的条件下で培養温度を約25℃~38℃とし、培養時間を約12時間~48時間培養させることができる。さらに加えて、凍結乾燥や冷凍保存による菌体ストックについては、一度、固形培地上に播種し、該固形培地上で生育が確認されたコロニー等をさらに上述の培地(Y)に植菌することにより工程(p)に供試する遺伝子組換え微生物を調製することができる。
いくつかの実施形態においては、上述のとおり、工程(p’)において、培地(Y)中で遺伝子組換え微生物を培養及び増殖させた後、培地(Y)から遺伝子組換え微生物を回収又は分離することなく、該遺伝子組換え微生物を含む培地(Y)をそのまま、工程(p)に供試し、該遺伝子組換え微生物の菌体を用いて目的物質を生成させてもよい。さらに、工程(p)に先立ち、工程(p’)において取得した遺伝子組換え微生物を含む培地(Y)に、必要に応じて、後述の反応媒体(X)の成分となり得る炭素源(糖類)、窒素源、無機塩類、ビタミン類、還元剤等を追加し、工程(p)における目的物質の生成反応に供試してもよい。
本発明の反応媒体(X)の組成は、遺伝子組換え微生物が実質的に増殖せず、かつ遺伝子組換え微生物による目的物質の産生反応を進行させる還元条件下の反応媒体(X)を実現するものである限り、特に限定されるものではない。反応媒体(X)は、例えば炭素源、窒素源、及び無機塩類等を含有し、生物体等に由来する天然のものであってもよく、又は人工的に合成したものであってもよい。反応媒体(X)中に含まれる成分は、例えば以下のとおりである。
グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖類;スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースのような二糖類;セルロース,デンプン,グリコーゲン、アガロース、ペクチン、アルギン酸等の多糖類;糖蜜等;稲わら、林地残材、バガス、コーンストーバー等の非可食農産廃棄物や非可食性バイオマス(非可食性の草本植物や木本植物を原料とした資源);スイッチグラス、ネピアグラス、ミスキャンサス等のエネルギー作物を糖化酵素などで糖化したグルコースやキシロース等の複数の糖類を含む糖化液;マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリン等の糖アルコール;酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸等の有機酸;エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール;ノルマルパラフィン等の炭化水素。
なお、窒素源は、1種を単独で又は2種以上を組合せて用いることができる。窒素源の反応液中の濃度は、用いる遺伝子組換え微生物の種類や、所望の目的物質の種類や性状、反応条件、窒素化合物の種類等の条件に応じて適宜調整すればよく、特に限定されるものでもないが、例えば、約0.1~10(w/v%)に調整することができる。
なお、無機塩類は、1種を単独で又は2種以上を組合せて用いることができる。無機塩類の反応液中の濃度は、用いる遺伝子組換え微生物の種類や、所望の目的物質の種類や性状、反応条件、無機塩類の種類等の条件に応じて適宜調整すればよく、特に限定されるものでもないが、例えば約0.01~1(w/v%)とすればよい。
加えて、具体的な好ましい反応媒体(X)の基本組成としては、上述のBT培地等が挙げられ、これらの培地の組成をベースとして、上述のとおり、炭素源(糖類)の濃度、ニコチン酸及びその誘導体のうち少なくとも1つの濃度(xn)、ビオチン濃度(xb)等を適宜調整することにより反応媒体(X)を調製することができる。
コリネ型細菌が実質的に増殖しない還元条件とは、字義どおりに解釈して遺伝子組換え微生物が実質に増殖しない程度に反応媒体が還元状態にあることを意味するが、より具体的には反応媒体の酸化還元電位で規定される。反応媒体(X)の酸化還元電位は、約-200mV~-500mVが好ましく、約-250mV~-500mVがより好ましい。
なお、反応媒体(X)の酸化還元電位は、酸化還元電位計を用いて測定することができる。酸化還元電位計は、市販品も存在することから、本発明にける反応媒体(X)の酸化還元電位の測定には、それら市販品を利用してもよい。
即ち、反応媒体の溶媒として、蒸留水等の代わりに反応液用水溶液を使用してもよく、反応液用水溶液の調製方法は、例えば硫酸還元微生物などの絶対嫌気性微生物用の培養液調製方法(Pfennig, N. et al., (1981) : The dissimilatory sulfate-reducing bacteria,In The Prokaryotes,A Handbook on Habitats Isolation and Identification of Bacteria,Ed.by Starr,M.P.et al., p926-940, Berlin,Springer Verlag.)や「農芸化学実験書 第三巻、京都大学農学部 農芸化学教室編、1990年第26刷、産業図書株式会社出版」などが参考となり、所望の還元条件下の水溶液を得ることができる。
さらに、適当な還元剤(例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオン、硫化ソーダ等)を添加して還元条件の反応液用水溶液を調製することもできる。
これらの方法を適宜組み合わせることも有効な還元条件の反応液用水溶液の調製方法である。
工程(p)における反応温度は、所望の目的物質を生成する範囲であればよく、採用する遺伝子組換え微生物の性質等に応じて適宜に設定すればよく、特に限定されるものではない。典型的には、約20~50℃、好ましくは約25~47℃であり、より好ましくは約27~37℃であり、このような温度範囲であれば効率良く目的物質を製造できる。
反応時間も、所望の目的物質が得られるように適宜調整すればよく、特に限定されるものでもないが、例えば約1時間~約7日間、より効率的な目的物質の観点から約1時間~約3日間が好ましく、例えば約1時間~48時間とすることができる。
工程(p)において目的物質を生成させた後、工程(q)として、目的物質を回収する。ここで、工程(q)において、「目的物質を回収する(こと)」と言う用語は、目的物質を含有する遺伝子組換え微生物及び/又は培養液若しくは反応媒体のものを採取することにより、目的物質を回収することを包含する概念である。
さらに、本発明の方法は、任意に目的物質を洗浄し、乾燥し、破砕し、粉体化又は粒状化し、及び/又は梱包する等の工程をさらに含んでも良い。
本発明の方法においては、本発明に係る遺伝子組換え微生物を利用して、様々な目的物質を収率良く生産することができる。採用する遺伝子組換え微生物の種類に応じて目的物質の種類は様々であるが、具体的には、核酸関連化合物(例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、5'-グアニル酸、アデノシン、ATP,CDP-コリン);ホルモン用物質等の各種生理活性物質;炭水化物や糖類;ビタミン関連物質及び補酵素(例えば、ビタミンC、ビタミンB2、B12、ソルボース、NAD,FAD、コエンザイムA);タンパク質、ペプチド、アミノ酸;L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン(L-DOAP)、5-ヒドロキシトリプトファン、ピロリドンカルボン酸等のアミノ酸誘導体;エタノール、ブタノール、イソプロパノール等のアルコール類;フェノール、カテコール、4-ヒドロキシ安息香酸、4-アミノ安息香酸、アントラニル酸、没食子酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、シキミ酸、3-デヒドロシキミ酸、3-デヒドロキナ酸、プロトカテク酸、コリスミ酸等の各種有機化合物等が挙げられる。
さらに加えて、L-アミノ酸の誘導体は、具体的には、遺伝子組換え微生物の代謝系において、L-アミノ酸から誘導される代謝産物である。
さらに、本発明において、目的物質は、L-アスパラギン酸又はこれから誘導される代謝産物であることがこのましい。L-アスパラギン酸から誘導される代謝産物には、L-スレオニン、L-リシン、L-アルギニン、L-ホモセリン等のアミノ酸やアミノ酸誘導体が含まれる。
さらに別の実施形態においては、目的物質は、オキサロ酢酸、リンゴ酸又は生合成経路上これらの化合物を経由する代謝産物である。
好ましい実施形態においては、目的物質は、アスパラギン酸又はこれから誘導される代謝産物である。より好ましい実施形態においては、目的物質は、アスパラギン酸、ベータアラニン、又はアスパラギンである。
本発明の第四の態様によれば、下記の変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが提供される。
コリネ型細菌に属する微生物が保有する野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのアミノ酸配列に対して、該野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性におけるアスパラギン酸によるフィードバック阻害を低減し得るアミノ酸変異を有し、
該アミノ酸変異が、配列番号2に示すアミノ酸配列を基準として、
(g)第299番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸のアスパラギンへのアミノ酸置換と、
(i)第813番目のリシンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換(ただし、置換後のアミノ酸はリシンではないものとする。);又は
(l)第917番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換(ただし、置換後のアミノ酸はアスパラギンではないものとする。)と、
を少なくとも含み、
上記野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのアミノ酸配列に対して、上記(g)、(i)又は(l)に規定のアミノ酸置換のみを有してなるタンパク質よりも、アスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性が高い、
変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ。
(J)配列番号2~13(好ましくは配列番号2~12、より好ましくは配列番号2~11)の何れか1つに示すアミノ酸配列において、上記(g)に示すアミノ酸置換と、上記(i)又は(l)に示すアミノ酸置換とを導入してなるアミノ酸配列(ただし、置換前のアミノ酸と置換後のアミノ酸は異なるものとする。);
(K)上記(J)に規定のアミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列(但し、上記各アミノ酸置換は維持されているものとする。);
(L)上記(J)に規定のアミノ酸配列に対して少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列(但し、上記各アミノ酸置換は維持されているものとする。)。
加えて、上記(L)において、「少なくとも60%」は、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%と読み替えられる。
さらに加えて、上記(J)において、「配列番号2~13(好ましくは配列番号2~12、より好ましくは配列番号2~11)の何れか1つに示すアミノ酸配列」は、「配列番号2に示すアミノ酸配列」(即ち、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株の野生型PEPCアミノ酸配列)と読み替える実施形態は、特に好ましい。
本発明の第五の態様によれば、第四の態様に係る変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸が提供される。
加えて、本発明に係る核酸は、必ずしも必須ではないが、特定の微生物の細胞内で自律複製可能となるように複製起点等を含み、プラスミドの形態で提供されてもよい。さらに加えて、本発明に係る核酸においては、当該変異型PEPCコード配列に加え、微生物の細胞内で本発明に係る変異型PEPCが発現可能となるように、プロモーター配列やシャイン・ダルガノ配列等の遺伝子制御配列を含んでもよい。に当該変異型PEPCコード領域を含んでもよい。
なお、本発明において「含む」及び「有する」の語はそれぞれ、特に断わりのない限り、これらの語が目的語として言及する要素以外の要素の存在を排除するものではなく、これらの用語は混用される。加えて、本願の優先権主張の基礎とされる日本国特許出願No.JP2019-76629(特願2019-76629)の内容に加え、本明細書において言及される各文献の内容は、本明細書の一部を構成するものとしてここに援用される。
出発材料としてコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株を用い、遺伝子破壊の手法により所定の酵素活性を不活化し、かつ所定のアミノ酸置換を有する変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を導入した組換えコリネ型細菌を作出した。以下に、その手順を示す。
まず、PCR法により、プラスミドpNIC-Bsa4(Source BioScience社)を鋳型とし、以下の表12に示すプライマーのペアーを用い、SacB遺伝子断片を増幅させた。
さらに、PCR反応により、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株のゲノムDNAを鋳型として、ldh遺伝子コード領域上流の約1000bpの領域と、該遺伝子コード領域下流の約1000bpの領域とをそれぞれ増幅させた。
なお、これらPCR反応では、上流領域についてはプライマーF2及びR2のペアーを用い、下流領域についてはプライマーF3及びR3を用いた(表13)。
なお、図2Aに、各プライマーと遺伝子コード領域との位置関係が模式的に示されている。
即ち、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株のゲノムDNAを鋳型として、sdhCAB遺伝子コード領域上流の約1000bpの領域と、該遺伝子コード領域下流の約1000bpの領域とをそれぞれ増幅させた。
なお、これらPCR反応では、上流領域についてはプライマーF4及びR4のペアーを用い、下流領域についてはプライマーF5及びR5を用いた(表14)。加えて、上述のとおり、sdhCABは、sdhCコード領域、sdhAコード領域、sdhBコード領域により、ゲノム上でオペロンを構成しているが、各プライマーと、各コード領域の位置関係は、図2Bに示されている。
即ち、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株のゲノムDNAを鋳型として、poxB遺伝子コード領域上流の約1000bpの領域と、該遺伝子コード領域下流の約1000bpの領域とをそれぞれ増幅させた。
なお、これらPCR反応では、上流領域についてはプライマーF6及びR6のペアーを用い、下流領域についてはプライマーF7及びR7を用いた(表15)。
なお、図2Cに、各プライマーと遺伝子コード領域との位置関係が模式的に示されている。
コリネバクテリウム菌の複製起点に係るDNA断片は、PCR法により、pBL1(和地正明博士より贈与、ヌクレオチド配列GenBankID:AF092037.1)を鋳型として、表16に示すプライマーF8及びR8のペアーを用いて増幅させた。さらに、大腸菌の複製起点に係るDNA断片は、PCR法により、pMW119(タカラバイオ株式会社)を鋳型として、表16に示すプライマーF9及びR9のペアーを用いて増幅させた。さらに、カナマイシン耐性遺伝子DNA断片は、PCR法により、pHSG299(タカラバイオ株式会社)を鋳型として、表16に示すプライマーF10及びR10のペアーを用いて増幅させた。
次いで、PCR反応をベースとした部位特異的変異導入法に基づき、各種アミノ酸置換を有する変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子DNA断片を増幅させ、それらDNA断片がそれぞれ、上記シャトルベクターpGEK004に挿入されてなるプラスミドを構築した。
構築したプラスミドの名称及びPEPCのアミノ酸置換の内容を、以下の表17に示す。
(2-2-1)pGE320(ppcD299N遺伝子)について
まず、PCR反応により、コリネATCC13032株のゲノムDNAを鋳型とし、表18に示すプライマーF11及びR11のペアーを用いて、コリネ型細菌で機能可能なプロモーターであるgapA遺伝子プロモーター領域を含むDNA断片を増幅させた。
ここで、PEPCのN末端側断片の増幅に用いたプライマーR12-1(リバースプライマー)と、PEPCのC末端側断片の増幅に用いたプライマーF13-1(フォワードプライマー)とは、PEPCのコード領域においてオーバラップしており、かつD299Nに係る変異コドン(表18にそれぞれ下線で示す「GTT」/「AAC」)を含んでいる。なお、相応する野生型コドンは「GAC」(センス鎖)である。
まず、pGE320の作製時と同様にして、PCR反応により、gapA遺伝子プロモーター領域を含むDNA断片を増幅させた。
さらに、PEPCコード領域については、まず、PCR法により、ATCC13032株ゲノムDNAを鋳型として、表18に示すプライマーF12と表19に示すプライマーR12-2とのペアーを用いることにより、PEPCのN末端側に相当する約2430bpの領域を増幅すると共に、同じくATCC13032株ゲノムDNAを鋳型として、表19に示すプライマーF13-2と表18に示すプライマーR13とのペアーを用いることによりPEPCのC末端側領域を含む約530bpの領域を増幅した。
まず、pGE320の作製時と同様にして、PCR反応により、gapA遺伝子プロモーター領域を含むDNA断片を増幅させた。
さらに、PEPCコード領域については、まず、PCR法により、ATCC13032株ゲノムDNAを鋳型として、表18に示すプライマーF12と表20に示すプライマーR12-3とのペアーを用いることにより、PEPCのN末端側に相当する約2430bpの領域を増幅すると共に、同じくATCC13032株ゲノムDNAを鋳型として、表20に示すプライマーF13-3と表18に示すプライマーR13とのペアーを用いることによりPEPCのC末端側領域を含む約530bpの領域を増幅した。
PCR法により、上述のプラスミドpGE320を鋳型として、プライマーF12とプライマーR13-2とのペアーを用い、gapA遺伝子プロモーター領域とppc遺伝子N末端側領域に相当するDNA断片を増幅させた。さらに、同じくPCR法により、プライマーF-14-2とプライマーR14とのペアーを用い、ppc遺伝子C末端側と3’下流域に相当するDNA断片を増幅させた。
上述のとおり取得したDNA断片2つを、pGEK004をBamHIで制限酵素処理することにより線状化したベクター断片に、In-Fusion cloning kit(タカラバイオ株式会社)を用いてタンデムに連結させて環状化し、プラスミドpGE333を取得した。
PCR法により、上述のプラスミドpGE320を鋳型として、プライマーF12とプライマーR13-3とのペアーを用い、gapA遺伝子プロモーター領域とppc遺伝子N末端側領域に相当するDNA断片を増幅させた。さらに、同じくPCR法により、プライマーF-14-3とプライマーR14とのペアーを用い、ppc遺伝子C末端側と3’下流域に相当するDNA断片を増幅させた。
上述のとおり取得したDNA断片2つを、pGEK004をBamHIで制限酵素処理することにより線状化したベクター断片に、In-Fusion cloning kit(タカラバイオ株式会社)を用いてタンデムに連結させて環状化し、プラスミドpGE322を取得した。
[試験例1]
(試験手順)
上述の電気パルス法により、上記(1)の項で作出したコリネバクテリウム ・グルタミカム遺伝子欠損株GES439(ATCC13032ΔldhΔsdhCAB株)に対して、上記(2-2)の項で構築したプラスミドpGEK004、pGE320、pGE343、pGE321、pGE333、pGE322をそれぞれ形質転換し、組換えコリネ型細菌を取得した。
アスパラギン酸生産試験の結果を、図4に示す。図4のグラフにおいて、縦軸は、反応後の試料におけるアスパラギン酸濃度を表す。さらに、以下の表21に、取得した組換えコリネ型細菌の遺伝子型、並びにアスパラギン酸生産試験により算出したアスパラギン酸生産効率(%)を示す。アスパラギン酸生産効率(%)の値は、菌体に取り込まれたグルコース0.5モルに対する生成アスパラギン酸の割合である。
(試験手順)
上述の電気パルス法により、上記(1)の項で作出したコリネバクテリウム ・グルタミカム遺伝子欠損株GES168(Δldh)、GES439(ΔldhΔsdhCAB)、GES524(ΔldhΔsdhCABΔpoxB)それぞれに対して、上記(2-2)の項で構築したプラスミドpGE333(ppcD299N/K813S)を形質転換し、組換えコリネ型細菌を取得した。
取得した各組換えコリネ型細菌を用いて、試験例1と同様の方法により、アスパラギン酸の生産試験を行った。
アスパラギン酸生産試験の結果を、図5に示す。図5のグラフにおいて、縦軸は、反応後の試料におけるアスパラギン酸濃度を表す。さらに、以下の表22に、取得した組換えコリネ型細菌の遺伝子型、並びにアスパラギン酸生産試験により算出したアスパラギン酸生産効率(%)を示す。アスパラギン酸生産効率(%)の値は、菌体に取り込まれたグルコース0.5モルに対する実際に生成されたアスパラギン酸の割合である。この値は、アスパラギン酸が、理論上、グルコース1モルから2モルできることに基く値である。
試験例1及び2では、組換えコリネ型細菌を、予め、A培地及びNA培地を用いて好気培養条件下に増殖させた後、遠心分離により培養液を取り除き、分離した菌体細胞を所定量のBT液に懸濁させてアスパラギン酸の生産反応を行った。これに対して、本試験例では、組換えコリネ型細菌をA培地及びNA培地を用いて好気培養条件下に増殖させた後に、遠心操作などにより菌体細胞は分離せずに、培養液をそのまま用いてアスパラギン酸生産反応を行った。以下に、その手順を示す。
なお、アミノ酸の同定及び測定には、アミノ酸分析システムProminence(株式会社島津製作所)を用いた。
本試験例におけるアスパラギン酸生産試験の結果を図6に示す。図6のグラフにおいて、縦軸は、反応後の試料におけるアスパラギン酸濃度を表す。
さらに、以下の表23に、取得した組換えコリネ型細菌の遺伝子型、並びにアスパラギン酸生産試験により算出したアスパラギン酸生産効率(%)を示す。アスパラギン酸生産効率(%)の値は、上述のとおり、菌体に取り込まれたグルコース0.5モルに対する実際に生成されたアスパラギン酸の割合である。
次に、エシェリキア・コリ(大腸菌)を用いて、本発明に係る組換え微生物及び該組換え微生物を用いてアスパラギン酸生産を行った例を示す。
(1)pflB遺伝子の破壊
まず、Datsenko and Wanner (Proc Natl Acad Sci U S A 2000, 97:6640-6645.)に記載されるBW25113株(lacIq rrnBT14 ΔlacZwj16 hsdR514 ΔaraBADAH33 ΔrhaBADLD78)を、当該文献に記載される方法に従い作製した。
上述のとおり取得したBW25113ΔpflB株に、再び、pKD46(Life Science Market)を形質転換し、得られた形質転換体について、上記同様の方法によりコンピテントセルを調製した。
次に、下記の表25に示すプライマーF15及びR15のペアーを用い、PCR反応により、pKD13を鋳型として、カナマイシン耐性遺伝子コード領域を含むDNA断片を増幅させた。ここで、プライマーF15及びR15はそれぞれ、大腸菌染色体DNAにおいてldhA遺伝子コード領域の上流域と下流域と相同なヌクレオチド配列を含む。
上述のとおり取得したBW25113ΔpflBΔldhA株に、再び、pKD46(Life Science Market)を形質転換し、得られた形質転換体について、上記同様の方法によりコンピテントセルを調製した。
次に、下記の表26に示すプライマーF16及びR16のペアーを用い、PCR反応により、pKD13を鋳型として、カナマイシン耐性遺伝子コード領域を含むDNA断片を増幅させた。ここで、プライマーF16及びR16はそれぞれ、大腸菌染色体DNAにおいてfrdA遺伝子コード領域の上流域と下流域と相同なヌクレオチド配列を含む。
上述のとおり取得したBW25113ΔpflBΔldhAΔfrdA株に、試験例1で構築したpGEK004、pGE333(ppcD229N/K813S)、pGE322(ppcD229N/N917G) をそれぞれ、定法により形質転換することにより、本発明所定の各種組換えエシェリキア・コリ菌株を取得した。
アミノ酸分析により得られたクロマトグラムを図7に示す。なお、図7に示すクロマトグラムにおいて、7分あたりに見られるピークがアスパラギン酸のピークである。さらに、以下の表27に、取得した組換えエシェリキア・コリ菌株の遺伝子型、アスパラギン酸生産試験により算出したアスパラギン酸生産効率(%)等を示す。アスパラギン酸生産効率(%)の値は、菌体に取り込まれたグルコース0.5モルに対する実際に生成されたアスパラギン酸の割合である。この値は、アスパラギン酸が、理論上、グルコース1モルから2モルできることに基く値である。
実施例において、各種遺伝子コード領域、プロモーター領域等のクローニングには上述のとおりIn-Fusion cloning kit(タカラバイオ株式会社)を利用した工程もあるが、PCR増幅の際に使用したプライマーペアーについては、フォワード/リバースプライマーの5’末端にはそれぞれ、上記クローニングキットの指示に従い適切なアダプター配列が付加されたものであることを補足する。
Claims (29)
- (p)遺伝子組換え微生物の菌体又はその菌体処理物を用いて目的物質を生成させること;並びに
(q)上記目的物質を回収すること、
を含み、
上記遺伝子組換え微生物は、下記の条件(I)~(III)の全てを充足するコリネ型細菌又はエシェリキア属菌であり、
上記目的物質は、上記遺伝子組換え微生物において左回りに代謝が進むTCAサイクルを介して生成される代謝産物であり、かつ上記TCAサイクル上の代謝物であるオキサロ酢酸又はフマル酸を少なくとも経由して生合成されるアスパラギン酸であり、又は該アスパラギン酸を経由して生合成される下流代謝産物である、
目的物質を生産する方法:
条件(I)上記遺伝子組換え微生物に対応する野生型微生物と比較して、還元条件又は嫌気条件下においてフマル酸からコハク酸への変換反応を触媒するフマル酸還元酵素活性が低減され又は不活化されていること;
条件(II)上記野生型微生物と比較して、乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低減され又は不活化されていること;
条件(III)野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性におけるアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対し抵抗性を示す改変型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性、又は上記野生型微生物が示す野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性よりもアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性が高い外来性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有すること。 - 工程(p)において、上記遺伝子組換え微生物が実質的に増殖しない程度に還元状態にある反応媒体(X)中で、該遺伝子組換え微生物の菌体又はその菌体処理物を反応させることにより上記目的物質を生成させる、請求項1に記載の方法。
- (p)遺伝子組換え微生物の菌体又はその菌体処理物を用いて目的物質を生成させること;並びに
(q)上記目的物質を回収すること、
を含み、
上記遺伝子組換え微生物は、下記の条件(I)~(III)の全てを充足するコリネ型細菌又はエシェリキア属菌であり、
上記目的物質は、アスパラギン酸又はこれから誘導される代謝産物(但し、TCAサイクル上の代謝物を除く。)であり、
工程(p)において、上記遺伝子組換え微生物が実質的に増殖しない程度に還元状態にある反応媒体(X)中で、該遺伝子組換え微生物の菌体又はその菌体処理物を反応させることにより上記目的物質を生成させる、
目的物質を生産する方法:
条件(I)上記遺伝子組換え微生物に対応する野生型微生物と比較して、還元条件又は嫌気条件下においてフマル酸からコハク酸への変換反応を触媒するフマル酸還元酵素活性が低減され又は不活化されていること;
条件(II)上記野生型微生物と比較して、乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低減され又は不活化されていること;
条件(III)野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性におけるアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対し抵抗性を示す改変型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性、又は上記野生型微生物が示す野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性よりもアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性が高い外来性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有すること。 - 上記反応媒体(X)の酸化還元電位が、-200ミリボルトから-500ミリボルトの範囲にある所定の値である、請求項2又は3に記載の方法。
- 上記反応媒体(X)が糖類を含む、請求項2~4の何れか1項に記載の方法。
- 上記反応媒体(X)がグルコースを含む、請求項2~5の何れか1項に記載の方法。
- 上記遺伝子組換え微生物は、コリネ型細菌であり、かつsdhC、sdhA、sdhB及びSdhDからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子が不活化されていることにより条件(I)を充足するものである、請求項1~6の何れか1項に記載の方法。
- 上記遺伝子組換え微生物は、エシェリキア属菌であり、かつfrdD、frdC、frdB及びfrdAからなる群から選択される少なくとも1つ遺伝子が不活化されていることにより条件(I)を充足するものである、請求項1~6の何れか1項に記載の方法。
- 工程(p)の前に、
(p’)所定の培地(Y)中で、好気条件下に、上記遺伝子組換え微生物を予め培養し及び増殖させること、
をさらに含み、工程(p’)において増殖させた該遺伝子組換え微生物の菌体又はその菌体処理物を工程(p)に供試する、請求項1~8の何れか1項に記載の方法。 - 上記目的物質が、アスパラギン酸、ベータアラニン、又はアスパラギンである、請求項1~9の何れか1項に記載の方法。
- 上記遺伝子組換え微生物は、さらに、条件(IV)として、上記野生型微生物と比較して、ピルビン酸:キノンオキシドレダクターゼが低減され又は不活化されていることを充足する、請求項1~10の何れか1項に記載の方法。
- コリネバクテリウム属に属する微生物が保有する野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのアミノ酸配列に対して、該野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性におけるアスパラギン酸によるフィードバック阻害を低減し得る少なくとも1つのアミノ酸変異を有し、
該少なくとも1つのアミノ酸変異が、配列番号2に示すアミノ酸配列を基準として、下記の(g)に示すアミノ酸置換と、下記の(i)、(k)又は(l)に示すアミノ酸置換を含み、かつ下記の(g)、(i)、(k)及び(l)の何れか1つに規定のアミノ酸置換のみを有してなるタンパク質よりも、アスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性が高く、
下記の(J)又は(L)に示すアミノ酸配列を有する、
変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ:
(g)第299番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸のアスパラギンへのアミノ酸置換;
(i)第813番目のリシンに相当するアミノ酸のセリンへのアミノ酸置換;
(k)第873番目のアルギニンに相当するアミノ酸のセリンへのアミノ酸置換;及び
(l)第917番目のアスパラギンに相当するアミノ酸のグリシンへのアミノ酸置換、
(J)配列番号2~11の何れか1つに示すアミノ酸配列において、上記アミノ酸置換を導入してなるアミノ酸配列;
(L)上記(J)に規定のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列(但し、上記各アミノ酸置換は維持されているものとする。)。 - 上記(J)に規定のアミノ酸配列は、配列番号2に示すアミノ酸配列に対して、上記アミノ酸置換を導入してなるアミノ酸配列である、請求項12に記載の変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ。
- 請求項12又は13に記載の変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸。
- DNA断片である、請求項14に記載の核酸。
- 請求項14又は15に記載の核酸が導入された、遺伝子組換え微生物。
- グラム陽性菌に属する遺伝子組換え微生物である、請求項16に記載の遺伝子組換え微生物。
- コリネ型細菌に属する遺伝子組換え微生物である、請求項17に記載の遺伝子組換え微生物。
- グラム陰性菌に属する遺伝子組換え微生物である、請求項16に記載の遺伝子組換え微生物。
- エシェリキア属に属する遺伝子組換え微生物である、請求項19に記載の遺伝子組換え微生物。
- 上記核酸は、上記遺伝子組換え微生物の細胞内において上記変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを発現せしめる形態を有するものであり、
下記の条件(I)~(III)の全てを充足する、請求項18又は20に記載の遺伝子組換え微生物:
条件(I)上記遺伝子組換え微生物に対応する野生型微生物と比較して、還元条件又は嫌気条件下においてフマル酸からコハク酸への変換反応を触媒するフマル酸還元酵素活性が低減され又は不活化されていること;
条件(II)上記野生型微生物と比較して、乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低減され又は不活化されていること;
条件(III)野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性におけるアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対し抵抗性を示す改変型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有すること。 - 上記核酸は、上記遺伝子組換え微生物の細胞内において上記変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを発現せしめる形態を有し、
sdhC、sdhA、sdhB及びSdhDからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子、並びにLDH遺伝子が不活化されている、請求項18に記載の遺伝子組換え微生物。 - 上記核酸は、上記遺伝子組換え微生物の細胞内において上記変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを発現せしめる形態を有し、
frdD、frdC、frdB及びfrdAからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子、並びにLDH遺伝子が不活化されている、請求項20に記載の遺伝子組換え微生物。 - pflA、pflB、pflC及びpflDからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子が不活化されている、請求項23に記載の遺伝子組換え微生物。
- さらに、条件(IV)として、上記遺伝子組換え微生物に対応する野生型微生物と比較して、ピルビン酸:キノンオキシドレダクターゼが低減され又は不活化されていることを充足する、請求項21~24の何れか1項に記載の遺伝子組換え微生物。
- エシェリキア属に属する遺伝子組換え微生物であり、さらに、条件(V)として、上記野生型微生物と比較して、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性が低減され又は不活化されていることを充足する、請求項21及び23~25の何れか1項に記載の遺伝子組換え微生物。
- (p)請求項21~26の何れか1項に記載の遺伝子組換え微生物を用いて目的物質を生成させること;並びに
(q)上記目的物質を回収すること、
を含み、
上記目的物質は、アスパラギン酸又はこれから誘導される代謝産物(但し、TCAサイクル上の代謝物を除く。)であり、
工程(p)において、上記遺伝子組換え微生物が実質的に増殖しない程度に還元状態にある反応媒体(X)中で、該遺伝子組換え微生物の菌体又はその菌体処理物を反応させることにより上記目的物質を生成させる、
目的物質を生産する方法。 - 下記の条件(I)~(III)の全てを充足するコリネ型細菌又はエシェリキア属菌であり、
左回りに代謝が進むTCAサイクルを介し、かつ該TCAサイクル上の代謝物であるオキサロ酢酸又はフマル酸を少なくとも経由してアスパラギン酸を産生する生合成経路、又は該アスパラギン酸を経由して下流代謝産物を産生する生合成経路を有する、
遺伝子組換え微生物:
条件(I)上記遺伝子組換え微生物に対応する野生型微生物と比較して、還元条件又は嫌気条件下においてフマル酸からコハク酸への変換反応を触媒するフマル酸還元酵素活性が低減され又は不活化されていること;
条件(II)上記野生型微生物と比較して、乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低減され又は不活化されていること;
条件(III)野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性におけるアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対し抵抗性を示す改変型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性、又は上記野生型微生物が示す野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性よりもアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性が高い外来性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有すること。 - 下記の条件(I)~(III)の全てを充足するコリネ型細菌又はエシェリキア属菌であり、
実質的に増殖しない程度に還元状態にある反応媒体(X)中で、アスパラギン酸又はこれから誘導される代謝産物(但し、TCAサイクル上の代謝物を除く。)を産生する生合成経路を有する、遺伝子組換え微生物:
条件(I)上記遺伝子組換え微生物に対応する野生型微生物と比較して、還元条件又は嫌気条件下においてフマル酸からコハク酸への変換反応を触媒するフマル酸還元酵素活性が低減され又は不活化されていること;
条件(II)上記野生型微生物と比較して、乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低減され又は不活化されていること;
条件(III)野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性におけるアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対し抵抗性を示す改変型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性、又は上記野生型微生物が示す野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性よりもアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性が高い外来性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有すること。
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