JP7475409B2

JP7475409B2 - Ｌ－アルギニンまたはｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物およびこれを用いたｌ－アルギニンまたはｌ－シトルリンの生産方法

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Publication number: JP7475409B2
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Authority: JP
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Priority date: 2022-07-21
Filing date: 2022-10-07
Publication date: 2024-04-26
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Description

KCCM

KCCM 13219P

KCCM

KCCM 13220P

本発明は、Ｌ－アルギニンまたはＬ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物およびこれを用いたＬ－アルギニンまたはＬ－シトルリンの生産方法に関する。

アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）は植物などに遊離状態で含有されていることが知られている。アルギニンは非必須アミノ酸の一つであるが、成長期の子供およびストレス状態、外傷、癌などの特異状態の場合には供給することが必須である準必須アミノ酸（ｓｅｍｉ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌａｍｉｎｏａｃｉｄ）であり、アミノ酸類強化剤、医薬品、食品などの成分として広く用いられている。医薬用としては、肝機能促進剤、脳機能促進剤、男性不妊治療剤、総合アミノ酸製剤などに使用されており、食品用としては、かまぼこ添加剤、健康飲料添加剤、高血圧患者の食塩代替用に使用されている。

シトルリン（Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）は非必須アミノ酸の一つで、シトルリンにはアンモニア代謝促進や血管拡張による血流改善、血圧低下、神経伝達、免疫力増進、活性酸素消去などの有用な作用があることが知られている。腎臓でシトルリンはアルギニンに代謝され、ＮＯ（ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ）を生成させる。すなわち、シトルリンは生体内のタンパク質を構成するアミノ酸ではないが、尿素サイクルの中間体の一つで、アルギニンから血管拡張作用を有する物質として知られたＮＯと共に生成され、追加的にアスパラギン酸と縮合してアルギニンに再生される。

このようなアルギニンおよびシトルリンの生産は、自然状態で得られた野生型菌株や、そのアルギニンまたはシトルリン生産能が向上するように変形された変異株を用いることができる。最近は、アルギニンまたはシトルリンの生産効率を改善させるために、大膓菌、コリネバクテリウムなどの微生物を対象に遺伝子組換え技術が活用されている。微生物におけるＬ－アルギニンの生合成は、Ｌ－グルタメート（Ｌ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ）を出発物質として、Ｎ－アセチルグルタメート（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ）、Ｎ－アセチルグルタミル－Ｐ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍｙｌ－Ｐ）、Ｎ－アセチルグルタメート５－セミアルデヒド（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ５－ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ）、Ｎ－アセチルオルニチン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、Ｌ－オルニチン（Ｌ－ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、Ｌ－シトルリン（Ｌ－ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）、そしてアルギニノスクシネート（ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ）を経て合成され、このような段階的な合成過程には酵素、転写因子、輸送タンパク質などの多様なタンパク質が関与する。したがって、遺伝子組換え技術によりＬ－アルギニンまたはＬ－シトルリンの生合成に関与する様々なタンパク質の活性を調節することにより、Ｌ－アルギニンまたはＬ－シトルリンの生産性を増大させることができ、優れたＬ－アルギニンまたはＬ－シトルリン生産能を有する組換え菌株または変異株を開発するためには多くの研究が要求されている。

韓国登録特許第１０－２２６９６３７号

本発明は、Ｌ－アルギニンまたはＬ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム属変異株を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記変異株を用いたＬ－アルギニンまたはＬ－シトルリンの生産方法を提供することを目的とする。

本発明の一態様は、アセチルグルタメートキナーゼの活性が強化されてＬ－アルギニンまたはＬ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム属変異株を提供する。

本発明で使われた「アセチルグルタメートキナーゼ（ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅｋｉｎａｓｅ）」は、Ｌ－アルギニンの生合成経路においてＮ－アセチルグルタメートをＮ－アセチルグルタミル－Ｐに変換する反応を触媒する役割を果たす。前記Ｎ－アセチルグルタメートは、様々な酵素によって順次に変換されて、結果として、Ｌ－アルギニンまたはＬ－シトルリンに合成される。

本発明の一具体例によれば、前記アセチルグルタメートキナーゼは、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物に由来するものであってもよい。

より具体的には、前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウムクルディラクティス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウムデザーティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｅｓｅｒｔｉ）、コリネバクテリウムカルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウムスラナレアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｕｒａｎａｒｅｅａｅ）、コリネバクテリウムルブリカンティス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｕｂｒｉｃａｎｔｉｓ）、コリネバクテリウムドサネンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｏｏｓａｎｅｎｓｅ）、コリネバクテリウムエフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウムウテレキー（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｕｔｅｒｅｑｕｉ）、コリネバクテリウムスタチオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｔａｔｉｏｎｉｓ）、コリネバクテリウムパカエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｃａｅｎｓｅ）、コリネバクテリウムシングレア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｉｎｇｕｌａｒｅ）、コリネバクテリウムフミリドゥセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、コリネバクテリウムマリヌム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍａｒｉｎｕｍ）、コリネバクテリウムハロトレランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、コリネバクテリウムスフェニスコルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐｈｅｎｉｓｃｏｒｕｍ）、コリネバクテリウムフレイブルゲンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｅｉｂｕｒｇｅｎｓｅ）、コリネバクテリウムストリアタム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｔｒｉａｔｕｍ）、コリネバクテリウムカニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃａｎｉｓ）、コリネバクテリウムアンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウムレナーレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｅｎａｌｅ）、コリネバクテリウムポルティソリ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｏｌｌｕｔｉｓｏｌｉ）、コリネバクテリウムイミタンス（Ｃｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｍｉｔａｎｓ）、コリネバクテリウムカスピウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃａｓｐｉｕｍ）、コリネバクテリウムテスツディノリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｅｓｔｕｄｉｎｏｒｉｓ）、コリネバクテリウムシュードペラルギ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃａｔｅｒｉｕｍｐｓｅｕｄｏｐｅｌａｒｇｉ）またはコリネバクテリウムフラベセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）であってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明で使われた「活性が強化」は、目的とする酵素、転写因子、輸送タンパク質などのタンパク質を暗号化する遺伝子の発現が新たに導入されるか増大して、野生型菌株または変形前の菌株に比べて発現量が増加することを意味する。このような活性の強化は、遺伝子を暗号化するヌクレオチド置換、挿入、欠失、またはこれらの組み合わせによりタンパク質自体の活性が本来微生物の持っているタンパク質の活性に比べて増加した場合と、これを暗号化する遺伝子の発現増加または翻訳増加などで細胞内で全体的な酵素活性の程度が野生型菌株または変形前の菌株に比べて高い場合、これらの組み合わせも含む。

本発明の一具体例によれば、前記アセチルグルタメートキナーゼの活性の強化は、アセチルグルタメートキナーゼを暗号化する遺伝子に位置特異的変異によるものであってもよい。

本発明の一具体例によれば、前記アセチルグルタメートキナーゼを暗号化する遺伝子は、配列番号１の塩基配列で表示されるか、または配列番号２のアミノ酸配列から構成されるものであってもよい。

本発明の一具体例によれば、前記位置特異的変異は、配列番号１の塩基配列のうち１つ以上の塩基が置換されたものであってもよい。

本発明の一具体例によれば、前記位置特異的変異は、配列番号２のアミノ酸配列のうち１つ以上のアミノ酸が置換されたものであってもよい。

より具体的には、前記位置特異的変異は、配列番号２のアミノ酸配列のうち５０～４００番目、または１００～３００番目において１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸が連続的にまたは非連続的に置換されていてもよい。

本発明の一具体例によれば、前記位置特異的変異は、配列番号２のアミノ酸配列のうち２５８番目のアミノ酸がグルタミンから非極性アミノ酸に置換されたものであってもよい。

前記非極性アミノ酸は、非極性炭化水素からなる疎水性Ｒ基を持っていて極性の水分子と相互結合せず、化学的に反応性が低く、球状タンパク質の３次元構造においてタンパク質の内部に位置することをいう。本発明における非極性アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファンからなる群より選択された１種であってもよいし、類似する３次元タンパク質構造を示すことができるアラニン、イソロイシン、ロイシンまたはバリンであることが好ましい。

また、本発明の一具体例によれば、前記位置特異的変異は、配列番号２のアミノ酸配列のうち２４５番目のアミノ酸がヒスチジンからアスパラギン酸に置換されたものであってもよい。

このような変異によるアセチルグルタメートキナーゼの活性の強化は、アセチルグルタメートキナーゼのフィードバック阻害（ｆｅｅｄｂａｃｋｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）が抑制または解除されてアルギニンの生合成経路が強化され、結果として、Ｌ－アルギニンまたはＬ－シトルリンの生産を向上させることができる。

本発明で使われた「生産能が向上した」は、親菌株に比べてＬ－アルギニンまたはＬ－シトルリンの生産性が増加したことを意味する。前記親菌株は、変異の対象となる野生型または変異株を意味し、直接変異の対象になるか、組換えられたベクターなどで形質転換される対象を含む。本発明において、親菌株は、野生型コリネバクテリウム属微生物、または野生型から変異された微生物または菌株であってもよい。

このように本発明のＬ－アルギニンまたはＬ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム属変異株は、アセチルグルタメートキナーゼを暗号化する遺伝子の変異塩基配列またはアミノ酸配列を含むことにより、親菌株に比べて増加したＬ－アルギニンまたはＬ－シトルリン生産能を示し、特に親菌株に比べてＬ－アルギニンまたはＬ－シトルリンの生産量が５％以上、具体的には５～８０％、５～３０％、または３０～７０％増加したものであってもよい。

本発明の一具体例によれば、前記コリネバクテリウム属変異株は、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）であってもよい。

本発明の一具体例によるコリネバクテリウム属変異株は、親菌株においてアセチルグルタメートキナーゼの配列の一部が置換された変異体を含む組換えベクターにより実現できる。

本発明で使われた「一部」は、塩基配列またはポリヌクレオチド、またはアミノ酸配列の全部ではないものを意味し、１～３００個、好ましくは１～１００個、より好ましくは１～５０個であってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明で使われた「変異体」は、特定遺伝子のアミノ酸配列のうちＮ－末端、Ｃ－末端および／または内部で１つ以上のアミノ酸が保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）または付加されて、前記変異体の変異前のアミノ酸配列と異なるものの、機能（ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）または特性（ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）が維持されるポリペプチドを意味する。ここで、「保存的置換」とは、１つのアミノ酸を構造的および／または化学的性質が類似する他のアミノ酸に置換させることを意味し、タンパク質またはポリペプチドの活性にほとんど影響を及ぼさないか、または全く影響を及ぼさない。また、変異体は、Ｎ－末端リーダー配列または膜転移ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎ）のような１つ以上の部分が除去されるか、または成熟タンパク質（ｍａｔｕｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）のＮ－および／またはＣ－末端から一部分が除去されたものを含む。このような変異体は、その能力が変異前のポリペプチドに比べて増加したり、変化しなかったり、または減少しうる。本発明では、変異体が変異型、変形、変異型ポリペプチド、変異したタンパク質、変異などと混用される。

本発明の一具体例によれば、前記アセチルグルタメートキナーゼ変異体は、配列番号４、６または８のアミノ酸配列を有するものであってもよい。

本発明で使われた「ベクター」は、適当な宿主細胞において目的タンパク質を発現できる発現ベクターであって、遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙｌｉｎｋｅｄ）必須の調節要素を含む遺伝子製造物を意味する。ここで、「作動可能に連結された」は、発現が必要な遺伝子とその調節配列が互いに機能的に結合して遺伝子発現を可能にする方式で連結されたことを意味し、「調節要素」は、転写を行うためのプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位を暗号化する配列、および転写および解読の終結を調節する配列を含む。このようなベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、ウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されるものではない。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＥＭＢＬ３、λＥＭＢＬ４、λＦＩＸＩＩ、λＤＡＳＨＩＩ、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４ＡおよびＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとして、ｐＤＺベクター、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系およびｐＥＴ系などを使用することができる。使用可能なベクターは特に制限されるものではなく、公知の発現ベクターを使用することができるが、これに限定されない。

本発明で使われた「組換えベクター」は、適した宿主細胞内に形質転換された後、宿主細胞のゲノムと無関係に複製可能であるか、ゲノムそのものに縫い込まれる。この時、前記「適した宿主細胞」は、ベクターが複製可能なものであって、複製が開始される特定の塩基配列である複製原点を含むことができる。

前記形質転換は、宿主細胞によって適したベクター導入技術が選択されて、目的とする遺伝子を宿主細胞内で発現させることができる。例えば、ベクターの導入は、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、熱衝撃（ｈｅａｔ－ｓｈｏｃｋ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法、またはこれらの組み合わせによって行われる。形質転換された遺伝子は、宿主細胞内で発現できれば宿主細胞の染色体内挿入または染色体外に位置しているものでも制限なく含まれる。

前記宿主細胞は、生体内または試験管内で本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドで形質感染、形質転換、または感染した細胞を含む。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、組換え宿主細胞、組換え細胞または組換え微生物である。

また、本発明による組換えベクターは、選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｍａｒｋｅｒ）を含むことができるが、前記選択マーカーは、ベクターで形質転換された形質転換体（宿主細胞）を選別するためのものであって、前記選択マーカーが処理された培地で選択マーカーを発現する細胞のみ生存できるため、形質転換された細胞の選別が可能である。前記選択マーカーは、代表例として、カナマイシン、ストレプトマイシン、クロラムフェニコールなどがあるが、これらに限定されるものではない。

本発明の形質転換用組換えベクター内に挿入された遺伝子は、相同組換え交差によってコリネバクテリウム属微生物のような宿主細胞内に置換されていてもよい。

本発明の一具体例によれば、前記宿主細胞は、コリネバクテリウム属菌株であってもよいし、例えば、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）菌株であってもよい。

また、本発明の他の態様は、前記コリネバクテリウムグルタミカム変異株を培地で培養するステップと、前記変異株または変異株が培養された培地からＬ－アルギニンまたはＬ－シトルリンを回収するステップとを含むＬ－アルギニンまたはＬ－シトルリンの生産方法を提供する。

前記培養は、当業界にて知られた適切な培地と培養条件によって行われてもよいし、通常の技術者であれば培地および培養条件を容易に調整して使用可能である。具体的には、前記培地は、液体培地であってもよいが、これに限定されるものではない。培養方法は、例えば、回分式培養（ｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅ）、連続式培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｕｌｔｕｒｅ）、流加式培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅ）、またはこれらの組み合わせ培養を含むことができるが、これに限定されるものではない。

本発明の一具体例によれば、前記培地は、適切な方式で特定菌株の要件を満たさなければならず、通常の技術者によって適宜変形可能である。コリネバクテリウム属微生物に対する培養培地は、公知の文献（ＭａｎｕａｌｏｆＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＧｅｎｅｒａｌＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤ．Ｃ．、ＵＳＡ、１９８１）を参照することができるが、これに限定されるものではない。

本発明の一具体例によれば、培地に多様な炭素源、窒素源および微量元素成分を含むことができる。使用可能な炭素源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースのような糖および炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などのようなオイルおよび脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これらの物質は、個別的にまたは混合物として使用できるが、これに限定されるものではない。使用可能な窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆小麦および尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も、個別的にまたは混合物として使用することができるが、これに限定されるものではない。使用可能なリンの供給源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム－含有塩が含まれてもよいし、これに限定されるものではない。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有することができ、これに限定されるものではない。その他、アミノ酸およびビタミンのような必須成長物質が含まれる。また、培養培地に適切な前駆体が使用できる。前記培地または個別成分は、培養過程で培養液に適切な方式によって回分式または連続式で添加可能であるが、これに限定されるものではない。

本発明の一具体例によれば、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸のような化合物を微生物培養液に適切な方式で添加して培養液のｐＨを調整することができる。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡の生成を抑制することができる。追加的に、培養液の好気状態を維持するために、培養液中に酸素または酸素－含有気体（例、空気）を注入することができる。培養液の温度は、通常２０～４５℃、例えば、２５～４０℃であってもよい。培養期間は、有用物質が所望する生産量で得られるまで継続可能であり、例えば、１０～１６０時間であってもよい。

本発明の一具体例によれば、前記培養された変異株および変異株が培養された培地からＬ－アルギニンまたはＬ－シトルリンを回収するステップは、培養方法により当該分野にて公知の適した方法を用いて培地から生産されたＬ－アルギニンまたはＬ－シトルリンを収集または回収することができる。例えば、遠心分離、濾過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈殿、結晶化、電気泳動、分別溶解（例えば、アンモニウムスルフェート沈殿）、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性およびサイズ排除）などの方法を使用することができるが、これに限定されるものではない。

本発明の一具体例によれば、前記Ｌ－アルギニンまたはＬ－シトルリンを回収するステップは、培養培地を低速遠心分離してバイオマスを除去して得られた上澄液をイオン交換クロマトグラフィーにより分離することができる。

本発明の一具体例によれば、前記Ｌ－アルギニンまたはＬ－シトルリンを回収するステップは、Ｌ－アルギニンまたはＬ－シトルリンを精製する工程を含むことができる。

本発明によるコリネバクテリウム属変異株は、Ｌ－アルギニンの生合成経路に関与するアセチルグルタメートキナーゼの活性を強化することにより、親菌株に比べてＬ－アルギニンまたはＬ－シトルリン生産能の生産収率を向上させることができる。

本発明の一実施例により２５８番目のアミノ酸がグルタミンからロイシンに置換された、アセチルグルタメートキナーゼ遺伝子を含むｐｋ１９ｍｓｂ＋ａｒｇＢ－Ｅ２５８Ｌベクターの構造を示す図である。本発明の一実施例により２５８番目のアミノ酸がグルタミンからアラニンに置換された、アセチルグルタメートキナーゼ遺伝子を含むｐｋ１９ｍｓｂ＋ａｒｇＢ－Ｅ２５８Ａベクターの構造を示す図である。本発明の一実施例により２４５番目のアミノ酸がヒスチジンからアスパラギン酸に置換された、アセチルグルタメートキナーゼ遺伝子を含むｐｋ１９ｍｓｂ＋ａｒｇＢ－Ｈ２４５Ｄベクターの構造を示す図である。

以下、本発明をより詳細に説明する。しかし、このような説明は本発明の理解のために例として提示されたものに過ぎず、本発明の範囲がこのような例示的な説明によって制限されるものではない。

実施例１．コリネバクテリウムグルタミカム変異株の作製
アセチルグルタメートキナーゼの活性が強化されたコリネバクテリウムグルタミカム変異株を製造するために、Ｌ－アルギニン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミカム１４ＧＲ（ＫＣＣＭ１３２１９Ｐ）菌株およびＥ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ（ＨＩＴＣｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌｓ^ＴＭ、ＣａｔＮｏ．ＲＨ６１８）を使用した。

前記コリネバクテリウムグルタミカム１４ＧＲ菌株は、蒸留水１Ｌに９８％Ｇｌｕｃｏｓｅ１０．５ｇ、Ｂｅｅｆｅｘｔｒａｃｔ１ｇ、Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ４ｇ、Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ２ｇ、ＮａＣｌ２ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４４０ｇの組成のＡＲＧ－ｂｒｏｔｈ培地（ｐＨ７．２）で３０℃の温度で培養した。

前記Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａは、蒸留水１Ｌにトリプトン１０．０ｇ、ＮａＣｌ１０．０ｇおよび酵母抽出物５．０ｇの組成のＬＢ培地上で３７℃の温度で培養した。

抗生剤カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社の製品を使用した。

ＤＮＡシーケンシング分析はマクロジェン（株）に依頼して分析した。

１－１．組換えベクター
菌株に生合成経路を強化させるためにアセチルグルタメートキナーゼに変異を誘導した。本実施例で用いた方法は、アセチルグルタメートキナーゼを暗号化しているａｒｇＢ遺伝子の発現を増加するために、当該遺伝子の特定位置に変異を誘発した。ａｒｇＢ遺伝子の２５８番目のアミノ酸をグルタミンからロイシンに置換し、コリネバクテリウムグルタミカムゲノム上でａｒｇＢ遺伝子の真ん中を中心に左アーム１６１４ｂｐ部分と右アーム８５４ｂｐ部分をＰＣＲで増幅して、オーバーラップＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐＰＣＲ）方法で連結した後、ｐｋ１９ｍｓｂベクターにクローニングした。前記プラスミドをｐｋ１９ｍｓｂ＋ａｒｇＢ－Ｅ２５８Ｌと名付けた（図１参照）。前記プラスミドを作製するためにそれぞれの遺伝子断片を増幅するのに下記表１のプライマーを使用した。

以上のプライマーを用いて、下記の条件下でＰＣＲを行った。Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ＴＰ６００、ＴＡＫＡＲＡＢＩＯＩｎｃ．、日本）を用いて、それぞれのデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）１００μＭが添加された反応液にオリゴヌクレオチド１ｐＭ、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡ１０ｎｇを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として用いて、ｐｆｕ－ＸＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｓｏｌｇｅｎｔ）１ユニットの存在下、２５～３０周期（ｃｙｃｌｅ）を行った。ＰＣＲの実施条件は、（ｉ）変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）ステップ：９４℃で３０秒、（ｉｉ）結合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）ステップ：５８℃で３０秒、および（ｉｉｉ）拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ステップ：７２℃で１～２分（１ｋｂあたり２分の重合時間付与）の条件で実施した。

このように製造された遺伝子断片を、ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙｃｌｏｎｉｎｇを用いて、ｐｋ１９ｍｓｂベクターにクローニングした。前記ベクターをＥ．ｃｏｌｉＤＨ５ａに形質転換させ、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ－寒天プレート上に塗抹して、３７℃で２４時間培養した。最終形成されるコロニーを分離して挿入物（ｉｎｓｅｒｔ）が正確にベクターに存在するかを確認した後、このベクターを分離してコリネバクテリウムグルタミカム菌株の組換えに使用した。

前記方法で共通して行われた過程として、当該遺伝子の増幅は、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡからＰＣＲ方法で増幅して、戦略によってｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄｃｌｏｎｉｎｇ方法でｐｋ１９ｍｓｂベクターに挿入してＥ．ｃｏｌｉＤＨ５ａから選別した。染色体の遺伝子塩基置換（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｂａｓｅｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）は、それぞれ断片の遺伝子を個別増幅してオーバーラップＰＣＲで目的ＤＮＡ断片を製造した。遺伝子組換えの際、ＰＣＲ増幅酵素としては、ＥｘＴａｑ重合酵素（Ｔａｋａｒａ）、Ｐｆｕ重合酵素（Ｓｏｌｇｅｎｔ）を用い、各種制限酵素およびＤＮＡｍｏｄｉｆｙｉｎｇ酵素はＮＥＢ製品を使用し、供給されたバッファーおよびプロトコルに従って使用した。

１－２．コリネバクテリウムグルタミカム変異株ＡＢ１
クローニングベクターを用いて、変異菌株であるＡＢ１菌株を製造した。クローニングベクターの最終濃度が１μｇ／μｌ以上となるように用意して、コリネバクテリウムグルタミカム１４ＧＲに電気穿孔法（文献［Ｔａｕｃｈｅｔａｌ．、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｌｅｔｔｅｒｓ１２３（１９９４）３４３－３４７］参照）を用いて１次組換えを誘導した。この時、電気穿孔した菌株をカナマイシンが５０μｇ／μｌ含まれる寒天培地に塗抹してコロニーを分離した後、ゲノム上の誘導した位置に適切に挿入されたかを、ＰＣＲおよび塩基配列分析により確認した。このように分離された菌株を再度２次組換えを誘導するために液体培地に接種し、一晩以上培養して１０％ｓｕｃｒｏｓｅを含有した寒天培地に塗抹してコロニーを分離した。最終分離したコロニー中でカナマイシンに対する耐性の有無を確認した後、抗生剤耐性のない菌株のうちアセチルグルタメートキナーゼに変異が導入されたかを、塩基配列分析により確認した（文献［Ｓｃｈａｆｅｒｅｔａｌ．、Ｇｅｎｅ１４５（１９９４）６９－７３］参照）。最終的に、アセチルグルタメートキナーゼのアミノ酸配列（配列番号２）のうち２５８番目に位置したグルタミンがロイシンに置換された、Ｌ－アルギニンの生産が可能なコリネバクテリウムグルタミカム変異株ＡＢ１を作製した。

実施例２．コリネバクテリウムグルタミカム変異株の作製
ａｒｇＢ遺伝子の２５８番目のアミノ酸をグルタミンからアラニンに置換した組換えベクター（ｐｋ１９ｍｓｂ＋ａｒｇＢ－Ｅ２５８Ａ）を用いたことを除けば、実施例１と同様の方法でアセチルグルタメートキナーゼの活性が強化されたコリネバクテリウムグルタミカム変異株を作製した。

より具体的には、ａｒｇＢ遺伝子の２５８番目のアミノ酸をグルタミンからアラニンに置換し、コリネバクテリウムグルタミカムゲノム上でａｒｇＢ遺伝子の真ん中を中心に左アーム１６１４ｂｐ部分と右アーム８５４ｂｐ部分をＰＣＲで増幅して、オーバーラップＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐＰＣＲ）方法で連結した後、ｐｋ１９ｍｓｂベクターにクローニングした。前記プラスミドをｐｋ１９ｍｓｂ＋ａｒｇＢ－Ｅ２５８Ａと名付けた（図２参照）。前記プラスミドを作製するためにそれぞれの遺伝子断片を増幅するのに下記表２のプライマーを使用した。

最終的に、アセチルグルタメートキナーゼのアミノ酸配列（配列番号２）のうち２５８番目に位置したグルタミンがアラニンに置換された、Ｌ－アルギニンの生産が可能なコリネバクテリウムグルタミカム変異株ＡＢ２を作製した。

実施例３．コリネバクテリウムグルタミカム変異株の作製
ａｒｇＢ遺伝子の２４５番目のアミノ酸をヒスチジンからアスパラギン酸に置換した組換えベクター（ｐｋ１９ｍｓｂ＋ａｒｇＢ－Ｈ２４５Ｄ）を用いたことを除けば、実施例１と同様の方法でアセチルグルタメートキナーゼの活性が強化されたコリネバクテリウムグルタミカム変異株を作製した。

より具体的には、ａｒｇＢ遺伝子の２４５番目のアミノ酸をヒスチジンからアスパラギン酸に置換し、コリネバクテリウムグルタミカムゲノム上でａｒｇＢ遺伝子の真ん中を中心に左アーム１５８３ｂｐ部分と右アーム８８５ｂｐ部分をＰＣＲで増幅して、オーバーラップＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐＰＣＲ）方法で連結した後、組換えベクターであるｐｋ１９ｍｓｂにクローニングした。前記プラスミドをｐｋ１９ｍｓｂ＋ａｒｇＢ－Ｈ２４５Ｄと名付けた（図３参照）。前記プラスミドを作製するためにそれぞれの遺伝子断片を増幅するのに下記表３のプライマーを使用した。

最終的に、アセチルグルタメートキナーゼのアミノ酸配列（配列番号２）のうち２４５番目に位置したヒスチジンがアスパラギン酸に置換された、Ｌ－アルギニンの生産が可能なコリネバクテリウムグルタミカム変異株ＡＢ３を作製した。

実験例１．コリネバクテリウムグルタミカム変異株のＬ－アルギニン生産能評価
親菌株と比較して、実施例１～３で作製されたコリネバクテリウムグルタミカム変異株ＡＢ１～ＡＢ３のＬ－アルギニン生産能を評価した。

各菌株をフラスコ種培地の固体培地にパッチング（ｐａｔｃｈｉｎｇ）して、３０℃で２４時間培養した。培養されたコロニーを１０ｍｌのフラスコ力価培地に接種して、３２℃、２００ｒｐｍ、３０時間培養した。ここで使用された培地の組成は下記表４に示した。培養終了後、培養液を蒸留水で１００倍希釈し、０．４５μｍのフィルタで濾過した後、カラム（ＤｉｏｎｅｘＩｏｎＰａｃ^ＴＭＣＳ１２Ａ）と紫外線検出器（１９５ｍｍ）が装着された高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（ａｇｉｌｅｎｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ１２６０ｉｎｆｉｎｉｔｙ、ａｇｉｌｅｎｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＬ－アルギニンの生産量を分析し、その結果を下記表５に示した。表５のＬ－アルギニン（％）は、各菌株によって生産されたアルギニンの生産量の百分率を意味し、発酵収率（Ｙｐ／ｓ）（％）は、消耗する糖対比で生産されたＬ－アルギニンの量を示す。

前記表５に示したように、コリネバクテリウムグルタミカム変異株ＡＢ１～ＡＢ３は、アセチルグルタメートキナーゼのアミノ酸配列のうち２５８番目または２４５番目のアミノ酸が最適なアミノ酸に置換されることにより、親菌株に比べてＬ－アルギニンの生産性が著しく向上したことが確認された。

実施例４．コリネバクテリウムグルタミカム変異株の作製
実施例１－１のｐｋ１９ｍｓｂ＋ａｒｇＢ－Ｅ２５８Ｌクローニングベクターを、コリネバクテリウムグルタミカム１４ＧＲの代わりに、コリネバクテリウムグルタミカム１５ＧＤ（ＫＣＣＭ１３２２０Ｐ）に導入したことを除けば、実施例１と同様の方法でアセチルグルタメートキナーゼのアミノ酸配列（配列番号２）のうち２５８番目に位置したグルタミンがロイシンに置換された、Ｌ－シトルリンの生産が可能なコリネバクテリウムグルタミカム変異株ＣＢ１を作製した。

実施例５．コリネバクテリウムグルタミカム変異株の作製
実施例２のｐｋ１９ｍｓｂ＋ａｒｇＢ－Ｅ２５８Ａクローニングベクターを、コリネバクテリウムグルタミカム１４ＧＲの代わりに、コリネバクテリウムグルタミカム１５ＧＤに導入したことを除けば、実施例１と同様の方法でアセチルグルタメートキナーゼのアミノ酸配列（配列番号２）のうち２５８番目に位置したグルタミンがアラニンに置換された、Ｌ－シトルリンの生産が可能なコリネバクテリウムグルタミカム変異株ＣＢ２を作製した。

実施例６．コリネバクテリウムグルタミカム変異株の作製
実施例３のｐｋ１９ｍｓｂ＋ａｒｇＢ－Ｈ２４５Ｄクローニングベクターを、コリネバクテリウムグルタミカム１４ＧＲの代わりに、コリネバクテリウムグルタミカム１５ＧＤに導入したことを除けば、実施例１と同様の方法でアセチルグルタメートキナーゼのアミノ酸配列（配列番号２）のうち２４５番目に位置したヒスチジンがアスパラギン酸に置換された、Ｌ－シトルリンの生産が可能なコリネバクテリウムグルタミカム変異株ＣＢ３を作製した。

実験例２．コリネバクテリウムグルタミカム変異株のＬ－シトルリン生産能評価
親菌株と比較して、実施例４～６で作製されたコリネバクテリウムグルタミカム変異株ＣＢ１～ＣＢ３のＬ－シトルリン生産能を評価した。

各菌株をフラスコ種培地の固体培地にパッチング（ｐａｔｃｈｉｎｇ）して、３０℃で２４時間培養した。培養されたコロニーを１０ｍｌのフラスコ力価培地に接種して、３２℃、２００ｒｐｍ、３０時間培養した。ここで使用された培地の組成は下記表６に示した。培養終了後、培養液を蒸留水で１００倍希釈し、０．４５μｍのフィルタで濾過した後、カラム（ＤｉｏｎｅｘＩｏｎＰａｃ^ＴＭＣＳ１２Ａ）と紫外線検出器（１９５ｍｍ）が装着された高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（ａｇｉｌｅｎｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ１２６０ｉｎｆｉｎｉｔｙ、ａｇｉｌｅｎｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＬ－シトルリンの生産量を分析し、その結果を下記表７に示した。表７のＬ－シトルリン（％）は、各菌株によって生産されたシトルリンの生産量の百分率を意味し、発酵収率（Ｙｐ／ｓ）（％）は、消耗する糖対比で生産されたＬ－シトルリンの量を示す。

前記表７に示したように、コリネバクテリウムグルタミカム変異株ＣＢ１～ＣＢ３は、アセチルグルタメートキナーゼのアミノ酸配列のうち２５８番目または２４５番目のアミノ酸が最適なアミノ酸に置換されることにより、親菌株に比べてＬ－シトルリンの生産性が著しく向上したことが確認された。

このような結果は、Ｌ－アルギニンの生合成経路に関与するアセチルグルタメートキナーゼの核酸配列またはアミノ酸配列内の位置特異的変異により酵素活性が強化されることにより、Ｌ－アルギニンおよびＬ－シトルリンの生産性が増加することを示唆する。

以上、本発明についてその好ましい実施例を中心に説明した。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明が本発明の本質的な特性を逸脱しない範囲で変形された形態で実現できることを理解するであろう。そのため、開示された実施例は、限定的な観点ではなく、説明的な観点で考慮されなければならない。本発明の範囲は、上述した説明ではなく、特許請求の範囲に示されており、それと同等範囲内にあるすべての差異は本発明に含まれていると解釈されなければならない。

［受託番号］
寄託機関名：韓国微生物保存センター(KCCM)
受託番号：KCCM13219P
受託日付：20220629
寄託機関名：韓国微生物保存センター(KCCM)
受託番号：KCCM13220P
受託日付：20220629

Claims

配列番号２のアミノ酸配列のうち、２５８番目のアミノ酸においてグルタミンから非極性アミノ酸への置換又は２４５番目のアミノ酸においてヒスチジンからアスパラギン酸への置換を有するアセチルグルタメートキナーゼを発現することで、親株と比べてＬ－アルギニンまたはＬ－シトルリンの生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）変異株。
前記非極性アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファンからなる群より選択された１種である、請求項１に記載のコリネバクテリウムグルタミカム変異株。
請求項１に記載のコリネバクテリウムグルタミカム変異株を培地で培養するステップと、
前記培養された変異株または変異株が培養された培地からＬ－アルギニンまたはＬ－シトルリンを回収するステップとを含むＬ－アルギニンまたはＬ－シトルリンの生産方法。