CN116286364B - 一种促进厌氧微生物分离和培养的复合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物分离培养技术领域，公开了一种促进厌氧微生物分离和培养的复合物及其应用。该复合物按照重量份计，包括以下成分：复苏促进因子4~10份，铁载体4~10份，抗毒物质0~0.5份，生长因子0~0.7份。本发明的复合物能够在较大程度上提高厌氧微生物的分离培养效果，使其在分离培养后能够获得更高的物种丰度和物种多样性。
Description
技术领域
本发明涉及微生物分离培养技术领域，尤其涉及一种促进厌氧微生物分离和培养的复合物及其应用。
背景技术
目前，我国的微生物种质资源尤其是厌氧微生物种质资源十分缺乏。尽管微生物功能多样，开发潜力巨大、前景广阔，但得到应用的仅为冰山一角，环境中超过99％的微生物至今尚不能被分离培养。特别是厌氧微生物，它们对氧气敏感、生长条件苛刻，其种质资源挖掘难度更甚于好氧微生物，据统计，截止2020年，已分离的厌氧微生物数量低于好氧微生物至少一个数量级，仅2100多种，而学界推测原核微生物种水平的多样性可能高达106～1012。其中大部分微生物处于活的但非可培养(VBNC，viable but non-culturable)状态，是限制厌氧微生物分离的因素之一。
专利CN201910708995.X中公开了一种VBNC细菌的复苏培养基及其制备方法与应用，该复苏培养基在基础培养基中添加了含有复苏促进因子(Rpf)的藤黄微球菌菌液，用以促进VBNC细菌的复苏。Rpf虽然能在一定程度上促进VBNC细菌的复苏和分离培养，但单独使用时效果有限。
发明内容
为了解决Rpf单独使用时对VBNC细菌分离培养的促进效果有限的技术问题，本发明提供了一种促进厌氧微生物分离和培养的复合物及其应用。本发明的复合物能够在较大程度上提高厌氧微生物的分离培养效果，使其在分离培养后能够获得更高的物种丰度和物种多样性。
本发明的具体技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种促进厌氧微生物分离和培养的复合物，按照重量份计，包括以下成分：复苏促进因子4～10份，铁载体4～10份，抗毒物质0～0.5份，生长因子0～0.7份。
微生物只能利用Fe2+，难以利用Fe3+，而Fe2+难以在微生物培养环境中稳定存在，为此，本发明将铁载体与复苏促进因子复配，能够利用铁载体吸收环境中微量的溶解性Fe3+并转变成Fe2+，以供细胞生长，从而有效促进厌氧微生物(特别是VBNC细菌)的分离和培养，提高分离培养后获得的物种丰度和物种多样性。此外，抗毒物质能够发挥解毒作用，生长因子可促进微生物生长繁殖，将其添加到复合物中，有利于进一步提高厌氧微生物的分离培养效果。
作为优选，所述复合物按照重量份计，包括以下成分：复苏促进因子4～6份，铁载体4～6份，抗毒物质0.2～0.5份，生长因子0.4～0.7份。
作为优选，所述抗毒物质包括还原型谷胱甘肽。
还原型谷胱甘肽(GSH)主要由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，是一种细胞内重要的调节代谢物质，其既是甘油醛磷酸脱氢酶的辅基，又是乙二醛酶及丙糖脱氢酶的辅酶，参与体内三羧酸循环及糖代谢，并能激活多种酶，如巯基(SH)酶-辅酶等，从而促进糖类、脂肪和蛋白质代谢。还原型GSH分子特点是具有活性巯基(-SH)，是最重要的功能集团，可参与机体多种重要的生化反应，保护体内重要酶蛋白巯基不被氧化、灭活，具有抗氧化作用，保证能量代谢、细胞利用。当发生某些中毒时，可使这些分子中化学基因发生改变引起它们的活性改变或丧失。因此，还原型GSH在生物氧化、氨基酸转运、毒物解毒等过程中起一定作用，能够促进厌氧微生物的分离培养。
作为优选，所述生长因子包括红糖。
红糖因没有经过高度精练，几乎含有蔗汁中的全部成分，除了具备糖的功能外，还含有维生素与微量元素，如铁、锌、锰、铬等，可作为微生物生长的微量元素和生长因子，促进厌氧微生物的分离培养。
作为优选，所述复合物为粉剂或液体制剂。
作为优选，所述铁载体采用微杆菌BAB7发酵制备；所述微杆菌BAB7已在2022年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.24298，微生物分类命名为微杆菌Microbacterium sp.。
微杆菌BAB7菌株提取自东海及南海滩涂泥样，其生理生化特性见实施例1，16SrRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示，与已知种的微生物具有明显不同的分类学特征，故鉴定为微杆菌属(Microbacterium)内的一个新种，暂命名为Microbacterium sp.BAB7。
微杆菌BAB7在限制性铁离子条件下，具有较高的产铁载体的能力。经试验，按体积分数1％接种量将种子液(OD600＝1.0)接种至100mL不含铁离子的基础液体培养基中，发酵培养4～5d后，培养基中铁载体的含量可达6.8mmol/L。并且，经鉴定，其产生的铁载体为异羟肟酸型。
此外，微杆菌BAB7能够耐受较宽的pH范围，特别是对酸性环境的耐受性较高，在pH4.0～9.0下均具有产铁载体能力，在pH 5.0～8.0下能实现较高的产铁载体效率。并且，受限于能够合成的酶的种类，微生物能够利用的碳源类型是有限的，且不同菌种之间、同种内不同菌株之间存在差异，本发明的菌株能够利用的碳源种类较多，大部分碳源(包括乙酸钠、L-阿拉伯糖、柠檬酸钠、甘油、半乳糖、葡萄糖、蔗糖)均能促进其产生铁载体。这种能耐受较宽的pH范围并能利用大部分碳源的特性，能够降低发酵生产铁载体时菌株对于发酵环境的要求。
作为优选，所述铁载体的制备方法包括以下步骤：
(1.1)对微杆菌BAB7进行活化和扩大培养，获得种子液；
(1.2)将种子液接种到微杆菌发酵培养基中，进行微杆菌发酵培养，而后去除微杆菌菌体，干燥，获得铁载体。
本发明中的铁载体采用微生物发酵粗品液干燥后获得，无需经过提纯及基因工程，制作工艺简单，易获得。
进一步地，步骤(1.2)中，所述微杆菌发酵培养基中含有碳源；所述碳源包括乙酸钠、L-阿拉伯糖、柠檬酸钠、甘油、半乳糖、葡萄糖和蔗糖中的一种或多种。
上述碳源均对微杆菌BAB7产铁载体有促进作用，其中，蔗糖最佳，其次为葡萄糖和甘油。
进一步地，步骤(1.2)中，所述微杆菌发酵培养基中Fe3+的含量为0～1.23mmol/L，进一步优选为0mmol/L。
Fe3+会抑制细菌产生铁载体。对于本发明中使用的菌株BAB7而言，当Fe3+含量在0～1.23mmol/L范围内时，产铁载体能力相对较高。
进一步地，步骤(1.2)中，所述微杆菌发酵培养基包括以下浓度的成分：碳源5～12g/L、酵母提取物0.1～0.2g/L、(NH4)2SO4 0.8～1.2g/L、KH2PO4 0.3～0.7g/L、NaCl 4.5～5.5g/L、CaCl20.15～0.25g/L、MgSO4·7H2O 0.2～0.4g/L、ZnSO4·7H2O 5～8mg/L、CuSO4·5H2O 0.3～0.6mg/L、MnSO4·4H2O 0.15～0.25mg/L。
进一步地，步骤(1.2)中，所述微杆菌发酵培养基的pH为5.0～8.0。
微杆菌BAB7能较好地适应pH 5.0～8.0的环境，在该pH范围内产铁载体能力较高，最佳pH为7.0。
进一步地，步骤(1.1)中，所述种子液的OD600为0.8～1.5；步骤(1.2)中，所述种子液在微杆菌发酵培养基中的接种量为1.0～1.5％(即移入种子液的体积为接种后培养液体积的1.0～1.5％)。
进一步地，步骤(1.2)中，所述微杆菌发酵培养的转速为200～220rpm，时间为4～5天。
微杆菌BAB7产铁载体是一个好氧的过程，因此，在一定范围内，发酵培养时转速的提高有利于促进该菌株产生铁载体，而当转速达到200rpm后，继续提高转速对于促进菌株产铁载体的作用不大。
本发明团队关注到，对于菌株BAB7而言，并非发酵培养的时间越长，产生的铁载体就越多；在发酵培养一段时间后，继续延长发酵培养时间，会出现铁载体降解的现象。基于此，本发明将发酵培养时间控制在4～5天，能够实现较高的铁载体产量。
进一步地，步骤(1.2)中，在干燥前，进行灭菌处理。
作为优选，所述复苏促进因子的制备方法包括以下步骤：
(2.1)将藤黄微球菌接种到复活培养基中，进行培养，获得前培养液；
(2.2)将前培养液接种到藤黄微球菌发酵培养基中，进行藤黄微球菌发酵培养，而后去除藤黄微球菌菌体，干燥，获得复苏促进因子。
本发明中的复苏促进因子采用微生物发酵粗品液干燥后获得，无需经过提纯及基因工程，制作工艺简单，易获得。
进一步地，步骤(2.1)中，所述复活培养基包括以下浓度的成分：蛋白胨4～6g/L，酵母提取物2～4g/L，MgSO4·7H2O 0.5～1.3g/L。
进一步地，步骤(2.2)中，所述藤黄微球菌发酵培养基包括以下浓度的成分：NH4Cl3～5g/L、KH2PO4 1.0～1.6g/L、MgSO4 0.05～0.1g/L、CuSO4 0～0.00005g/L、MnCl2 0～0.001g/L、FeSO4 0～0.002g/L、Na2MO4 0～0.00005g/L、ZnSO4 0～0.0001g/L、L-乳酸锂盐8～12g/L、生物素0～0.01g/L、L-蛋氨酸0.01～0.03g/L、硫胺素B1 0.02～0.05g/L、肌苷0.8～1.2g/L。
进一步地，步骤(2.1)中，所述培养的温度为28～33℃，转速为110～130rpm，时间为30～40h。
进一步地，步骤(2.2)中，所述前培养液在藤黄微球菌发酵培养基中的接种量为3.5～6.5％(即移入前培养液的体积为接种后培养液体积的3.5～6.5％)，所述藤黄微球菌发酵培养的温度为28～33℃，转速为110～130rpm，时间为45～50h。
进一步地，步骤(2.2)中，在干燥前，进行灭菌处理。
第二方面，本发明提供了一种采用所述复合物促进厌氧微生物分离和培养的方法，包括以下步骤：将所述复合物添加到培养基中，制成复合培养基；将厌氧微生物接种到复合培养基上，进行分离培养。
第三方面，本发明提供了所述复合物在废水微生物处理中的应用。
本发明中的复合物能够促进厌氧微生物复苏，提高其培养后的丰度，故当用于废水微生物处理中时，能够提高废水处理效果。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明的复合物采用复苏促进因子、铁载体、抗毒物质和生长因子复配，能够提高厌氧微生物的分离和培养效果，获得较高的物种丰度和物种多样性；
(2)本发明在铁载体的制备过程中，采用的微杆菌BAB7是一个新种，具有较高的产异羟肟酸型铁载体的能力，且对发酵过程中pH和碳源种类的要求较低。
附图说明
图1为不同RFGH复合物添加量下，医药化工废水厌氧污泥菌种分离培养后获得的种和疑似新种数量；
图2为碳源类型对微杆菌BAB7铁载体产量的影响；
图3为FeCl3添加量对微杆菌BAB7铁载体产量的影响；
图4为转速对微杆菌BAB7铁载体产量的影响；
图5为pH对微杆菌BAB7铁载体产量的影响；
图6为发酵时间对微杆菌BAB7铁载体产量的影响；
图7为RFGH复合物对难培养微生物的促进作用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
总实施例
一种促进厌氧微生物分离和培养的复合物，按照重量份计，包括以下成分：复苏促进因子4～10份，铁载体4～10份，抗毒物质0～0.5份，生长因子0～0.7份。进一步优选为包括以下成分：复苏促进因子4～6份，铁载体4～6份，抗毒物质0.2～0.5份，生长因子0.4～0.7份。
作为一种具体实施方式，所述抗毒物质包括还原型谷胱甘肽；所述生长因子包括红糖。
作为一种具体实施方式，所述复合物为粉剂或液体制剂。
作为一种具体实施方式，所述铁载体的制备方法包括以下步骤：
(1.1)对微杆菌BAB7进行活化和扩大培养，获得种子液；所述微杆菌BAB7已在2022年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24298，微生物分类命名为微杆菌Microbacterium sp.；
(1.2)将种子液接种到微杆菌发酵培养基中，进行微杆菌发酵培养，而后去除微杆菌菌体，干燥，获得铁载体。
可选地，步骤(1.1)中，所述活化和扩大培养的过程包括以下步骤：将微杆菌菌株接种到LB固体培养基上，进行第一次培养，而后挑取单克隆菌落转接至基础液体培养基中，进行第二次培养，获得种子液。可选地，所述第一次培养的温度为25～33℃，时间为2.5～3.5天；所述第二次培养的温度为27～33℃。
可选地，步骤(1.2)中，所述微杆菌发酵培养基包括以下浓度的成分：碳源5～12g/L、酵母提取物0.1～0.2g/L、(NH4)2SO4 0.8～1.2g/L、KH2PO4 0.3～0.7g/L、NaCl 4.5～5.5g/L、CaCl2 0.15～0.25g/L、MgSO4·7H2O 0.2～0.4g/L、ZnSO4·7H2O 5～8mg/L、CuSO4·5H2O 0.3～0.6mg/L、MnSO4·4H2O 0.15～0.25mg/L。所述碳源优选包括乙酸钠、L-阿拉伯糖、柠檬酸钠、甘油、半乳糖、葡萄糖和蔗糖中的一种或多种，进一步优选为蔗糖。
可选地，步骤(1.2)中，所述微杆菌发酵培养基中Fe3+的含量为0～1.23mmol/L；所述微杆菌发酵培养基的pH为5.0～8.0，进一步优选为7.0。
可选地，步骤(1.2)的具体过程包括以下步骤：将种子液以1.0～1.5％的接种量接种到微杆菌发酵培养基中，以200～220rpm的转速在25～33℃下进行微杆菌发酵培养4～5天。
可选地，步骤(1.2)中，在干燥前，进行灭菌处理。
作为一种具体实施方式，所述复苏促进因子的制备方法包括以下步骤：
(2.1)将藤黄微球菌接种到复活培养基中，进行培养，获得前培养液；
(2.2)将前培养液接种到藤黄微球菌发酵培养基中，进行藤黄微球菌发酵培养，而后去除藤黄微球菌菌体，干燥，获得复苏促进因子。
可选地，步骤(2.1)中，所述复活培养基包括以下浓度的成分：蛋白胨4～6g/L，酵母提取物2～4g/L，MgSO4·7H2O 0.5～1.3g/L。
可选地，步骤(2.2)中，所述藤黄微球菌发酵培养基包括以下浓度的成分：NH4Cl 3～5g/L、KH2PO4 1.0～1.6g/L、MgSO4 0.05～0.1g/L、CuSO4 0～0.00005g/L、MnCl2 0～0.001g/L、FeSO4 0～0.002g/L、Na2MO4 0～0.00005g/L、ZnSO4 0～0.0001g/L、L-乳酸锂盐8～12g/L、生物素0～0.01g/L、L-蛋氨酸0.01～0.03g/L、硫胺素B1 0.02～0.05g/L、肌苷0.8～1.2g/L。
可选地，步骤(2.1)中，所述培养的温度为28～33℃，转速为110～130rpm，时间为30～40h。
可选地，步骤(2.2)中，所述前培养液在藤黄微球菌发酵培养基中的接种量为3.5～6.5％，所述藤黄微球菌发酵培养的温度为28～33℃，转速为110～130rpm，时间为45～50h。
可选地，步骤(2.2)中，在干燥前，进行灭菌处理。
一种采用上述复合物促进厌氧微生物分离和培养的方法，包括以下步骤：将所述复合物添加到培养基中，制成复合培养基；将厌氧微生物接种到复合培养基上，进行分离培养。
上述复合物在废水微生物处理中的应用。
实施例1：微杆菌BAB7的分离、筛选和鉴定
(1)样品来源：
东海及南海滩涂泥样。
(2)LB培养基的配制：
按照以下配方，配制LB培养基：酵母提取物5g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L，溶剂为水；pH 7.0。作固体培养基时，加入琼脂20g/L。
(3)铬天青(CAS)检测液的配制：
溶液A：将60.5mg CAS溶于50mL去离子水中，再加入10mL 1mmol/L FeCl3溶液(含12mmol/L HCl)。
溶液B：将72.9mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶于40mL去离子水中。
将A溶液沿烧杯壁缓缓加入B溶液中，搅拌混匀即得100mL CAS蓝色检测液，保存于干净的聚乙烯瓶中，避光保存备用。
(4)CAS双层平板的配制：
按照以下配方，配制CAS双层平板：下层10mL CAS-Fe3+-CTAB检测液，琼脂20g/L；上层10mL固体LB培养基。
注：CAS琼脂平板检测法是利用铁载体对铁的亲和能力高于CAS，使染料的颜色从蓝色变成橙色，因而成为最为广泛的用于铁载体产生菌的鉴定方法。CAS试剂配制中加入的CTAB对菌体生长有抑制作用，故采用CAS双层平板使菌体利用上层培养基进行生长，而细菌所分泌的铁载体进入下层形成明显的变色圈。若细菌可产铁载体，铁载体渗入下层琼脂，竞争性结合CAS-Fe3+-CTAB蓝色复合物中的Fe3+，复合物解体，染料脱色，形成橙黄色透明变色圈。根据平板变色圈的大小可判断菌株是否产生及产铁载体能力的强弱。
(5)铁载体产生菌的筛选：
取泥样10g在60℃烘箱中干燥0.5～6h，用无菌研钵研磨成细粉，称取1g置于含灭菌玻璃珠的小锥形瓶内，加入10mL生理盐水，置于摇床振荡30min，之后在室温下静置，待粉末自然沉降后取上清按照标准稀释培养法进行梯度稀释制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的样品，然后取每个稀释梯度样品溶液各100μL涂布于CAS双层平板上，待样品吸收后倒置于30℃培养箱中，培养7d，选取CAS双层平板中变色圈大的菌株作为初筛菌株。将初筛菌株多次划线于CAS双层平板上，查看其变色稳定性。用接种环挑取多次稳定变色的菌株至LB固体培养基上进行三线法划线分离，培养皿倒置于30℃培养箱中培养，标记并记录菌落形态。挑取对数生长期的单克隆(第三区)转接至3mL LB液体培养基中，30℃、160rpm振荡培养至出现明显浑浊后，取部分菌液进行菌株保藏，取部分菌液进行基因组提取及16S rRNA基因测序分析。
其中，菌株保藏方法包括甘油法保藏和冷冻干燥保藏，具体如下：
1)甘油法保藏：取OD600达到0.5～0.8时的新鲜菌液0.5mL，加入0.5mL浓度为60％的丙三醇，无菌条件下吹打均匀使菌体悬浮，保藏于-80℃超低温冰箱。
2)冷冻干燥保藏：将OD600达到0.5～0.8时的新鲜菌液涂布于适合生长的琼脂平板上，待菌体生长至对数生长期备用。在110℃、15min的条件下灭菌20％脱脂牛奶，冷却后吸取500～1000μL于长满纯菌落的平板上，轻刮平板表面使菌落悬浮于脱脂牛奶中，将悬浮液转入冻干管中，置于-80℃超低温冰箱冷冻6小时以上。迅速转入冷冻干燥机中干燥过夜。室温下抽真空并使用安培管熔封机熔封冻干管。之后置于4℃冰箱长期保藏。
基因组提取的方法如下：
采用小量DNA抽提试剂盒提取菌株DNA，过程参考相应的说明书进行。
16S rRNA基因测序分析的方法如下：
1)菌株16S rRNA基因序列PCR扩增：
PCR扩增引物序列如下：
27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；
1492R：5’-ACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’。
PCR反应体系见表1。
表1PCR反应体系
| 2×SuperPCR Mix | 12.5μL |
| 引物27F(10μM) | 1.0μL |
| 引物1492R(10μM) | 1.0μL |
| 模板DNA | 1.0μL |
| ddH2O | 9.5μL |
PCR程序如下：
反应条件：98℃预变性5min；98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循环35次；72℃延伸10min；4℃。
2)PCR产物电泳检测：
将1％琼脂糖加热溶解于1×TAE 50mL溶液，加入4～5μL10000×核酸染料DuRed并混合均匀制胶。5μL PCR产物和5μL DL 2000 DNA Marker分别与1μL 6×Loading Buffer混合均匀后上样，110V电泳35min。割胶1.5Kb处条带送至杭州擎科梓熙生物技术有限公司进行测序。通过测序公司测得的基因序列用Bioedit软件打开，序列上传至EzBioCloud(http://www.ezbiocloud.net/identify)数据库和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)数据库进行比。
(6)菌株特性：
筛选得到1株在CAS双层平板上稳定变色的菌株BAB7，对其进行生理生化特性研究，信息如下：
1)形态学和生理生化特征：
菌株BAB7为革兰氏阳性菌，无运动性，细胞形状呈现杆状。
菌株BAB7在LB培养基上培养3d呈菌落呈现淡黄色、表面凸起、边缘光滑、不透明，菌落大小1～2mm。
温度生长范围为15～40℃，最适温度为30℃；pH生长范围为4.0～10.0，最适pH为6.5～7.0；NaCl生长范围为0～6.0％，最适温度为0.5～1.0％。菌株呈过氧化氢酶、氧化酶呈阳性；能降解淀粉、吐温60、吐温80、明胶，尿素、黄嘌呤；不能降解纤维素、熊果苷、鸟嘌呤、次黄嘌呤、酪蛋白、吐温20、吐温40；能利用醋酸盐、L-阿拉伯糖、柠檬酸盐、甘油、半乳糖，葡萄糖、蔗糖、海藻糖和D-木糖作为唯一碳源；不能利用纤维素二糖、糊精、菊粉、α-乳糖、麦芽糖、甘露醇、D-甘露糖、糖原、肌醇、苹果酸作为唯一碳源。
2)化学分类特征：
菌株BAB7的主要呼吸醌为MK-12、MK-13，主要脂肪酸成分为anteiso-C15:0、anteiso-C17:0和iso-C16:0。细胞膜中主要极性脂为双磷脂酰甘油(diphosphatidylglycerol，DPG)，磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol，PG)。
3)基因型特征：
菌株BAB7的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO:1所示，具体如下：
经数据库比对，菌株BAB7的16S rDNA基因序列与最相近的菌株Microbacteriummarinum DSM 24947T相似度为97.8％，DNA G+C含量为70.1mol％。
综上，菌株BAB7鉴定为微杆菌属(Microbacterium)内的新种，暂命名为Microbacterium sp.BAB7。该菌株在2022年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.24298。
实施例2：微杆菌BAB7的产铁载体能力和发酵条件
(1)培养基的选择：
载体的生物合成是受环境中铁含量调控的，在铁充足的条件下铁载体的合成将会受到抑制。铁载体的合成和分泌是微生物为了适应在低铁的限制性条件下生长代谢的需要而产生的一种生物适应现象。试验中所用的LB培养基不可避免的含有微量的铁，这会抑制铁载体的生物合成。故后续实验将在基础培养基中进行试验，查看对铁载体产量的影响。
基础培养基的配方如下：酵母提取物0.1g/L(作必须生长因子)、(NH4)2SO4 1g/L、KH2PO4 0.5g/L、NaCl 5g/L、CaCl2 0.2g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L、ZnSO4·7H2O 6mg/L、CuSO4·5H2O 0.4mg/L、MnSO4·4H2O 0.2mg/L，溶剂为水；pH 7.0。作固体培养基时，加入琼脂20g/L。
(2)种子液的制备：
菌株BAB7采用三线法划线于LB固体培养基上，培养皿倒置于30℃培养箱中培养3d，挑取第三区单克隆菌落转接至3mL基础液体培养基中，于150r/min、30℃条件下培养得至OD600＝1.0，作为种子液。
按体积分数1％接种量将种子液接种至100mL基础液体培养基中，培养一段时间，离心得到上清液，测定铁载体的浓度。
(3)碳源类型对铁载体产量的影响：
按体积分数1％的接种量，将种子液接种到100mL添加有不同碳源(碳源添加量均为10g/L)的基础培养基中，在pH 7.0、150r/min、30℃下培养7d后，8000r/min离心5min得上清液，利用Csαky反应检测铁载体含量(Csαky反应可用于检测含羟胺基团化合物，适用于异羟肟酸型铁载体检测进行铁载体定量测定)，具体检测方法如下：
取发酵液上清1mL，加入1mL 2mol/L H2SO4沸水浴6h。加入3mL醋酸钠溶液、0.5mL碘溶液、1mL对氨基苯磺酸溶液。3～5min后，加入1mL亚砷酸盐溶液。加入1mLα-萘胺溶液，补水至10mL，静置20～30min，测OD526吸光度，以盐酸羟胺为标准品换算铁载体浓度。
检测结果见图2。从图2可以看出：大部分碳源均能促进菌株BAB7产生铁载体，蔗糖最佳，其次为葡萄糖、甘油，蔗糖可使铁载体产量达4.6mmol/L；海藻糖对铁载体的分泌无明显促进作用。
(4)FeCl3添加量对铁载体产量的影响：
按体积分数1％的接种量，将种子液接种到100mL添加有FeCl3(添加量分别为0g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L)的基础培养基中，在pH 7.0、150r/min、30℃下培养7d后，8000r/min离心5min得上清液，利用Csαky反应检测铁载体含量。
检测结果见图3。从图3可以看出：额外添加FeCl3会抑制菌株BAB7产生铁载体，FeCl3添加量越多，抑制程度就越大；当FeCl3添加量为0～0.2g/L(即Fe3+添加量为0～1.23mmol/L)时，菌株产铁载体能力相对较强。
(5)转速对铁载体产量的影响：
按体积分数1％的接种量，将种子液接种到100mL基础培养基中，在pH 7.0、不同转速(0r/min、50r/min、100r/min、150r/min、180r/min、200r/min、220r/min)、30℃下培养7d后，8000r/min离心5min得上清液，利用Csαky反应检测铁载体含量。
检测结果见图4。从图4可以看出：转速越高，铁载体产量越高，最佳转速200r/min。转速影响体系OD，转速越高，一般OD越高，这也说明菌株产铁载体是一个耗氧过程。
(6)pH对铁载体产量的影响：
按体积分数1％的接种量，将种子液接种到100mL基础培养基中，在不同pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)、150r/min、30℃下培养7d后，8000r/min离心5min得上清液，利用Csαky反应检测铁载体含量。
检测结果见图5。从图5可以看出：最佳pH为7.0，在pH 4.0～9.0下均具有产铁载体能力，碱性环境比酸性环境对菌株BAB7产铁载体量的抑制大。
(7)发酵时间对铁载体产量的影响：
综合以上最佳条件，检测发酵时间对铁载体产量的影响，具体方法如下：
按体积分数1％的接种量，将种子液接种到100mL添加有蔗糖(添加量为10g/L)基础培养基中，在pH 7.0、200r/min、30℃下培养，每隔一段时取菌液，8000r/min离心5min得上清液，利用Csαky反应检测铁载体含量。
检测结果见图6。从图6可以看出：菌株BAB7随着发酵时间的延长，上清液中铁载体的含量先升高再降低，发酵4～5d时，铁载体含量达到最大约6.8mmol/L。5d后，铁载体可能有部分降解，使得上清液中测定的铁载体含量下降。
实施例3：RFGH复合物的配制
(1)铁载体：
按照实施例2中的(1)和(2)，配制基础培养基和种子液。按体积分数1％的接种量，将种子液接种到100mL添加有蔗糖(添加量为10g/L)基础培养基中，在pH 7.0、200r/min、30℃下培养4d后，8000r/min离心5min得上清液。将上清液用0.22μm滤膜过滤灭菌两次，获得铁载体粗品液。将铁载体粗品液经真空冷冻干燥，制作成粉剂，获得铁载体。
(2)复苏促进因子：
按照以下配方，配制复活培养基：蛋白胨5g/L，酵母提取物3g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，溶剂为水；pH 7.0。作固体培养基时，加入琼脂20g/L。
按照以下配方，配制LMM培养基：NH4Cl 4g/L、KH2PO4 1.4g/L、MgSO4 0.07g/L、CuSO40.000024g/L、MnCl2 0.0005g/L、FeSO4 0.001g/L、Na2MO4 0.000025g/L、ZnSO40.00005g/L、L-乳酸锂盐10g/L、生物素0.005g/L、L-蛋氨酸0.02g/L、硫胺素B1 0.04g/L、肌苷1g/L，溶剂为水；pH＝7.5。
将藤黄微球菌划线、转接到固体复活培养基中，进行培养，确认其为纯菌株。取2瓶50mL液体复活培养及，各接入2环藤黄微球菌纯菌株，120rpm、30℃摇床内震荡培养36h，使藤黄微球菌处于一致的生长状态，获得前培养液。
按照体积分数5％的接种量，将前培养液于LMM培养基，120rpm、30℃摇床内震荡培养48h，8000rpm离心15min取上清，经pH调整为7.0后，再经0.22μm滤膜过滤灭菌两次，获得Rpf粗品液制备完成。将Rpf粗品液经真空冷冻干燥，制作成粉剂，获得复苏促进因子。
(3)还原性谷胱甘肽：
将还原性谷胱甘肽粉末紫外灭菌后，避光、4℃保存。
(4)红糖：
将红糖固体紫外灭菌后，4℃保存。
(5)RFGH复合物的配制：
按照以下配方，配制RFGH复合物：复苏促进因子5g/L，铁载体5g/L，还原性谷胱甘肽0.3g/L，红糖0.5g/L，溶剂为水。
实施例4：RFGH复合物在厌氧微生物分离培养中的应用
(1)样品：
医药化工废水厌氧污泥。
(2)菌种分离培养和菌种多样性检测：
按照以下配方，配制LB培养基：酵母提取物5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，溶剂为水；pH 7.0。
取医药化工废水厌氧污泥样品100mL接种于含有无菌生理盐水的厌氧瓶中，内置无菌玻璃珠，整个体系置于摇床120r/min震荡混匀30min，以充分释放厌氧污泥中微生物，获得悬浊液。
分别取悬浊液100μL按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀释涂布于添加了RFGH复合物(由实施例3中制得；在LB固体培养基中的添加量分别为0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0g/L)的LB固体培养基上，整个体系置于厌氧工作站内常温培养。待平板上出现明显菌落时，分别挑取菌落至无菌对应液体培养基(RFGH复合物添加量分别为0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0g/L)的内进行厌氧培养，培养条件为30℃，待生长至明显浑浊时，采用甘油保种，菌液与甘油以3：1的体积比混合均匀，置于-80℃冰箱保藏。菌液采用基因组DNA提取试剂盒提取DNA后，采用细菌16S rDNA常用引物(27F、1492R)进行PCR扩增，PCR扩增子送至杭州擎科生物技术有限公司进行测序。获得的序列提交至EzBioCloud数据库进行序列比对，将相似度<97％视为疑似新种，统计各体系中种和疑似新种的数量。
(3)菌种多样性检测结果：
不同RFGH复合物添加量下分离培养后获得的种和疑似新种数量见图1。
从图1可以看出：未添加RFGH复合物的对照组获得了23个种，未分离得到疑似新种，而添加了RFGH复合物的实验组获得了37～46个种，分离得到3～9个疑似新种，且RFGH复合物投加量为0.1g/L时即表现出显现效果，说明RFGH复合物可明显提高厌氧污泥样品中厌氧微生物的分离及培养效果，增加分离菌种的多样性。此外，RFGH复合物投加量为0.1～0.5g/L时，随着投加量的增加，对厌氧微生物分离培养的促进效果提高，而投加量为0.5g/L～3g/L时促进效果相近，故最佳RFGH复合物投加量为0.5g/L。
实施例5：RFGH复合物在厌氧微生物分离培养中的应用
(1)样品：
海洋滩涂样品。
(2)菌种分离培养和菌种多样性检测：
按照以下配方，配制2216培养基：酵母提取物1g/L、胰蛋白胨5g/L、NaCl 19.45g/L、MgCl2·6H2O 12.6g/L、MgSO4·7H2O 6.64g/L、CaCl2 1.8g/L、KCl 0.55g/L、NaHCO30.16g/L、SrCl2 34.00mg/L、KBr 0.08g/L、H3BO3 22.00mg/L、Na2SiO3 4.0mg/L、NaF 2.4mg/L、NH4NO3 1.60mg/L、Na2HPO4 8.0mg/L，柠檬酸铁0.1g/L，溶剂为水；pH 7.2。作固体培养基时，加入琼脂20g/L。
取海洋滩涂样品1g接种于装有100mL添加了RFGH复合物(由实施例3中制得；在2216液体培养基中的添加量分别为0、0.1、0.3、0.5、1.0、2.0、3.0g/L)的2216液体培养基的厌氧瓶中，内置无菌玻璃珠，采用N2除氧后，各体系均于30℃下培养7d。培养结束后，取各体系送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行Illumina HiSeq平台16S rDNA宏基因组测序，调查各体系的Alpha多样性。
分别取上述培养7d后各体系样品100μL按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀释涂布于对应固体培养基(RFGH复合物在2216固体培养基中的添加量分别为0、0.1、0.3、0.5、1.0、2.0、3.0g/L)上，整个体系置于厌氧袋内30℃培养。待平板上出现明显菌落时，分别挑取菌落至无菌对应液体培养基(RFGH复合物在2216液体培养基中的添加量分别为0、0.1、0.3、0.5、1.0、2.0、3.0g/L)内进行厌氧培养，待生长至明显浑浊时，采用甘油保种，菌液与甘油以3：1的体积比混合均匀，置于-80℃冰箱保藏。菌液采用基因组DNA提取试剂盒提取DNA后，采用细菌16S rDNA常用引物(27F、1492R)进行PCR扩增，PCR扩增子送至杭州擎科生物技术有限公司进行测序。获得的序列提交至EzBioCloud数据库进行序列比对，将相似度<97％视为疑似新种，统计各体系中种和疑似新种的数量。
将未添加RFGH复合物的2216固体培养基中难培养的5个菌株(分别编号为A6、A8、A10、A15和A18)，接种于未添加RFGH复合物和添加了3g/L RFGH复合物的2216液体培养基中，于30℃厌氧条件下培养，测定OD600，查看RFGH复合物对微生物的培养情况。
(3)菌种多样性检测结果：
Alpha多样性(Alpha diversity)反映的是单个样品物种丰度(richness)及物种多样性(diversity)，有多种衡量指标：Chao1、Ace、Shannon、Simpson、Coverage、PD_whole_tree。Chao1和Ace指数衡量物种丰度即物种数量的多少。Shannon和Simpson指数用于衡量物种多样性，受样品群落中物种丰度和物种均匀度(Community evenness)的影响。相同物种丰度的情况下，群落中各物种具有越大的均匀度，则认为群落具有越大的多样性，Shannon指数和Simpson指数值越大，说明样品的物种多样性越高。另外还统计了覆盖率(Coverage)，其数值越高，则样本中物种被测出的概率越高，而没有被测出的概率越低。该指数反映本次测序结果是否代表了样本中微生物的真实情况。
不同RFGH复合物添加量下分离培养后的Alpha多样性检测结果见表2。
表2各体系微生物Alpha多样性
| RFGH添加量(g/L) | Feature | ACE | Chaol | Simpson | Shannon | Coverage |
| 0.0 | 35.0 | 35.0 | 35.0 | 0.8 | 3.1 | 1.0 |
| 0.1 | 43.0 | 43.0 | 43.0 | 0.8 | 2.9 | 1.0 |
| 0.3 | 62.0 | 65.7 | 65.0 | 0.9 | 4.3 | 1.0 |
| 0.5 | 64.0 | 66.8 | 67.0 | 0.9 | 3.8 | 1.0 |
| 1.0 | 86.0 | 100.0 | 93.0 | 0.9 | 4.8 | 1.0 |
| 2.0 | 98.0 | 98.8 | 99.0 | 0.9 | 4.7 | 1.0 |
| 3.0 | 98.0 | 98.8 | 99.0 | 0.9 | 4.7 | 1.0 |
注：Feature为特征(OTUs或ASVs)的个数；ACE、Chao1、Simpson、Shannon分别表示各个指数，指数越高，表明样品中物种多样性越高；Coverage是样本文库的覆盖率。
从表2可以看出：添加RFGH复合物(0.1～3.0g/L)可明显促进样品中微生物多样性提升。此外，RFGH复合物投加量2.0g/L与3.0g/L促进效果相似。
不同RFGH复合物添加量下分离培养后获得的种和疑似新种数量见表3。
表3各体系分离培养后获得的种和疑似新种数量
| RFGH添加量(g/L) | 种(个) | 疑似新种(个) |
| 0.0 | 18 | 3 |
| 0.1 | 26 | 6 |
| 0.3 | 45 | 9 |
| 0.5 | 49 | 9 |
| 1.0 | 54 | 9 |
| 2.0 | 54 | 9 |
| 3.0 | 54 | 9 |
从表3可以看出：添加RFGH复合物明显促进了微生物的分离，添加RFGH 0.5g/L组分离到的微生物种类是未添加RFGH的3倍。
5个菌株在未添加RFGH复合物和添加了3g/L RFGH复合物的2216液体培养基中培养后测得的OD600见图7。
从图7可以看出：添加RFGH复合物明显促进了微生物的培养，RFGH复合物添加量为3g/L时能使OD600提高约2～4倍。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (8)
1.一种促进厌氧微生物分离和培养的复合物，其特征在于，按照重量份计，由以下成分组成：复苏促进因子4~6份，铁载体4~6份，抗毒物质0.2~0.5份，生长因子0.4~0.7份；所述抗毒物质为还原型谷胱甘肽；所述生长因子为红糖；
所述铁载体的制备方法包括以下步骤：
（1.1）对微杆菌BAB7进行活化和扩大培养，获得种子液；所述微杆菌BAB7已在2022年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24298，微生物分类命名为微杆菌Microbacterium sp.；
（1.2）将种子液接种到微杆菌发酵培养基中，进行微杆菌发酵培养，而后去除微杆菌菌体，干燥，获得铁载体；
所述复苏促进因子的制备方法包括以下步骤：
（2.1）将藤黄微球菌接种到复活培养基中，进行培养，获得前培养液；
（2.2）将前培养液接种到藤黄微球菌发酵培养基中，进行藤黄微球菌发酵培养，而后去除藤黄微球菌菌体，干燥，获得复苏促进因子。
2.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述复合物为粉剂或液体制剂。
3.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，步骤（1.2）中，所述微杆菌发酵培养基中含有碳源；所述碳源包括乙酸钠、L-阿拉伯糖、柠檬酸钠、甘油、半乳糖、葡萄糖和蔗糖中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，步骤（1.2）中，所述微杆菌发酵培养基中Fe3 +的含量为0~1.23mmol/L。
5.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，步骤（1.2）中，所述微杆菌发酵培养基的pH为5.0~8.0。
6.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，步骤（1.2）中，所述微杆菌发酵培养的转速为200~220rpm，时间为4~5天。
7.一种采用如权利要求1~6之一所述复合物促进厌氧微生物分离和培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述复合物添加到培养基中，制成复合培养基；将厌氧微生物接种到复合培养基上，进行分离培养。
8.如权利要求1~6之一所述复合物在厌氧微生物分离培养中的应用。
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Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8429179D0 (en) * | 1983-12-02 | 1984-12-27 | Grace W R & Co | L-proline producing microorganisms |
| CN102604870A (zh) * | 2012-03-26 | 2012-07-25 | 浙江师范大学 | 复苏可培养化的vbnc节杆菌dsc4菌株及其复苏方法和应用 |
| CN102618464A (zh) * | 2012-03-26 | 2012-08-01 | 浙江师范大学 | 一种能促进vbnc细菌生长并提高分离丰度的复苏培养基及其制备方法和应用 |
| CN105176846A (zh) * | 2015-10-30 | 2015-12-23 | 云南大学 | 产生物铁载体化合物的fedt-866真菌菌株及制备方法 |
| CN106967660A (zh) * | 2017-03-28 | 2017-07-21 | 浙江省环境保护科学设计研究院 | 一种生产复苏促进因子的基因工程菌及其应用 |
| CN110484465A (zh) * | 2019-08-01 | 2019-11-22 | 浙江浩岚投资有限公司 | 一种vbnc细菌的复苏培养基及其制备方法与应用 |
| CN112888776A (zh) * | 2019-04-12 | 2021-06-01 | 绿色地球研究所株式会社 | 转基因微生物及使用其的目标物质的生产方法 |
| CN114107118A (zh) * | 2021-12-02 | 2022-03-01 | 四川农业大学 | 放线菌菌株scaut009及其应用 |
-
2022
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Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8429179D0 (en) * | 1983-12-02 | 1984-12-27 | Grace W R & Co | L-proline producing microorganisms |
| CN102604870A (zh) * | 2012-03-26 | 2012-07-25 | 浙江师范大学 | 复苏可培养化的vbnc节杆菌dsc4菌株及其复苏方法和应用 |
| CN102618464A (zh) * | 2012-03-26 | 2012-08-01 | 浙江师范大学 | 一种能促进vbnc细菌生长并提高分离丰度的复苏培养基及其制备方法和应用 |
| CN105176846A (zh) * | 2015-10-30 | 2015-12-23 | 云南大学 | 产生物铁载体化合物的fedt-866真菌菌株及制备方法 |
| CN106967660A (zh) * | 2017-03-28 | 2017-07-21 | 浙江省环境保护科学设计研究院 | 一种生产复苏促进因子的基因工程菌及其应用 |
| CN112888776A (zh) * | 2019-04-12 | 2021-06-01 | 绿色地球研究所株式会社 | 转基因微生物及使用其的目标物质的生产方法 |
| CN110484465A (zh) * | 2019-08-01 | 2019-11-22 | 浙江浩岚投资有限公司 | 一种vbnc细菌的复苏培养基及其制备方法与应用 |
| CN114107118A (zh) * | 2021-12-02 | 2022-03-01 | 四川农业大学 | 放线菌菌株scaut009及其应用 |
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| GR01 | Patent grant | ||
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