CN115820463B

CN115820463B - 一种基于微生物发酵的铁载体制备方法

Info

Publication number: CN115820463B
Application number: CN202211021112.6A
Authority: CN
Inventors: 苏悦; 张文武; 高辉; 陈璨; 秦彦军; 夏雨; 丁静
Original assignee: Hangzhou Xiuchuan Technology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Xiuchuan Technology Co ltd
Priority date: 2022-08-24
Filing date: 2022-08-24
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2042-08-24
Also published as: CN115820463A

Abstract

本发明涉及铁载体制备技术领域，公开了一种基于微生物发酵的铁载体制备方法，包括以下步骤：（1）对微杆菌菌株进行活化和扩大培养，获得种子液；所述微杆菌菌株命名为BAB7，已在2022年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24298，微生物分类命名为微杆菌Microbacterium sp.；（2）将种子液接种到发酵培养基中，进行发酵培养。本发明的制备方法采用菌株BAB7发酵的方式制备铁载体，能实现较高的产铁载体效率，且对发酵过程中pH和碳源种类的要求较低。

Description

一种基于微生物发酵的铁载体制备方法

技术领域

本发明涉及铁载体制备技术领域，尤其涉及一种基于微生物发酵的铁载体制备方法。

背景技术

铁载体(Siderophore)是一类与Fe³⁺具有螯合性和极高亲和性的低分子量化合物。当处于低铁胁迫的环境时，细菌和真菌等微生物通过将铁载体分泌到细胞外或细胞表面，利用铁载体高效结合周围环境中的铁，来达到应对低铁胁迫、促进植物生长的目的。

目前，铁载体类化合物已经在生物医药、环境污染修复领域展现了巨大的作用和良好的应用前景。例如，已有研究表明，在生物医药领域，铁载体能够用于治疗铁代谢疾病，缓解像B-地中海贫血的铁过量和铝过量症状，且对胃腺癌、乳腺癌和肝癌具有抑制作用，此外还表现出抗病毒、抑菌和抗氧化活性；在环境污染修复领域，铁载体对锕、锰、铅、汞、锌、铬等也具有较强的螯合能力，环境中的铁载体能影响金属和放射性核素的形成、生物利用度及其寿命的长短和污水的有效治理。

目前已报道过一些具有产铁载体能力的菌株，如专利CN114107118A中的菌株Microbacterium testaceum SCAUT009，但这些菌株往往存在产铁载体能力弱、抗逆性差或者能利用的碳源种类有限等限制。因此，筛选和挖掘更多具有产铁载体能力的菌株、丰富产铁载体菌种资源具有重要意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于微生物发酵的铁载体制备方法。该制备方法采用菌株BAB7发酵的方式制备铁载体，能实现较高的产铁载体效率，且对发酵过程中pH和碳源种类的要求较低。

本发明的具体技术方案为：

一种基于微生物发酵的铁载体制备方法，包括以下步骤：

(1)对微杆菌菌株进行活化和扩大培养，获得种子液；所述微杆菌菌株命名为BAB7，已在2022年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24298，微生物分类命名为微杆菌Microbacterium sp.；

(2)将种子液接种到发酵培养基中，进行发酵培养。

本发明中所使用的微杆菌菌株BAB7提取自东海及南海滩涂泥样，其生理生化特性见实施例1，16S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示，鉴定为微杆菌属(Microbacterium)内的一个新种，暂命名为Microbacterium sp.BAB7。

该菌株在限制性铁离子条件(铁离子含量低于1.23mmol/L)下，具有较高的产铁载体的能力。经试验，按体积分数1％接种量将种子液(OD₆₀₀＝1.0)接种至100mL不含铁离子的基础液体培养基中，发酵培养4～5d后，培养基中铁载体的含量可达6.8mmol/L。并且，经鉴定，其产生的铁载体为异羟肟酸型。

此外，本发明的菌株能够耐受较宽的pH范围，特别是对酸性环境的耐受性较高，在pH 4.0～9.0下均具有产铁载体能力，在pH 5.0～8.0下能实现较高的产铁载体效率。并且，受限于能够合成的酶的种类，微生物能够利用的碳源类型是有限的，且不同菌种之间、同种内不同菌株之间存在差异，本发明的菌株能够利用的碳源种类较多，大部分碳源(包括乙酸钠、L-阿拉伯糖、柠檬酸钠、甘油、半乳糖、葡萄糖、蔗糖)均能促进其产生铁载体。这种能耐受较宽的pH范围并能利用大部分碳源的特性，能够降低发酵生产铁载体时菌株对于发酵环境的要求。

作为优选，步骤(1)中，所述种子液的OD₆₀₀为0.8～1.5。

作为优选，步骤(1)中，所述活化和扩大培养的过程包括以下步骤：将微杆菌菌株接种到LB固体培养基上，进行第一次培养，而后挑取单克隆菌落转接至基础液体培养基中，进行第二次培养，获得种子液。

进一步地，所述第一次培养的温度为25～33℃，时间为2.5～3.5天；所述第二次培养的温度为27～33℃。

作为优选，步骤(2)中，所述发酵培养基中含有碳源。

进一步地，所述碳源包括乙酸钠、L-阿拉伯糖、柠檬酸钠、甘油、半乳糖、葡萄糖和蔗糖中的一种或多种，进一步优选为蔗糖、葡萄糖和甘油中的一种或多种。

上述碳源均对菌株BAB7产铁载体有促进作用，其中，蔗糖最佳，其次为葡萄糖和甘油。

作为优选，步骤(2)中，所述发酵培养基中Fe³⁺的含量为0～1.23mmol/L，进一步优选为0mmol/L。

Fe³⁺会抑制细菌产生铁载体。对于本发明中使用的菌株BAB7而言，当Fe³⁺含量在0～1.23mmol/L范围内时，产铁载体能力相对较高。

作为优选，步骤(2)中，所述发酵培养基包括以下浓度的成分：碳源5～12g/L、酵母提取物0.1～0.2g/L、(NH₄)₂SO₄ 0.8～1.2g/L、KH₂PO₄ 0.3～0.7g/L、NaCl 4.5～5.5g/L、CaCl₂ 0.15～0.25g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2～0.4g/L、ZnSO₄·7H₂O 5～8mg/L、CuSO₄·5H₂O0.3～0.6mg/L、MnSO₄·4H₂O 0.15～0.25mg/L。

作为优选，步骤(2)中，所述种子液在发酵培养基中的接种量为1.0～1.5％(即移入种子液的体积为接种后培养液体积的1.0～1.5％)。

作为优选，步骤(2)中，所述发酵培养基的pH为5.0～8.0，进一步优选为7.0。

菌株BAB7能较好地适应pH 5.0～8.0的环境，在该pH范围内产铁载体能力较高，最佳pH为7.0。

作为优选，步骤(2)中，所述发酵培养的转速为200～220rpm，时间为4～5天。

菌株BAB7产铁载体是一个好氧的过程，因此，在一定范围内，发酵培养时转速的提高有利于促进该菌株产生铁载体，而当转速达到200rpm后，继续提高转速对于促进菌株产铁载体的作用不大。

本发明团队关注到，对于菌株BAB7而言，并非发酵培养的时间越长，产生的铁载体就越多；在发酵培养一段时间后，继续延长发酵培养时间，会出现铁载体降解的现象。基于此，本发明将发酵培养时间控制在4～5天，能够实现较高的铁载体产量。

作为优选，步骤(2)中，所述发酵培养的温度为25～33℃。

作为优选，步骤(2)中，在发酵培养之后，进行离心，取上清液，而后过滤除菌，获得含铁载体的溶液。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明中采用的菌株BAB7是微杆菌属内的一个新种，具有较高的产异羟肟酸型铁载体的能力，并且，该菌株能适应较宽的pH范围，且能利用较多的碳源种类，大部分碳源均能促进其产铁载体；

(2)本发明针对菌株BAB7的特性设计发酵工艺，通过对碳源、pH、转速和发酵时间等方面的优化，能够实现较高的铁载体产量。

附图说明

图1为碳源类型对铁载体产量的影响；

图2为FeCl₃添加量对铁载体产量的影响；

图3为转速对铁载体产量的影响；

图4为pH对铁载体产量的影响；

图5为发酵时间对铁载体产量的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

总实施例

一种基于微生物发酵的铁载体制备方法，包括以下步骤：

(1)对微杆菌菌株进行活化和扩大培养，获得OD₆₀₀为0.8～1.5的种子液；所述微杆菌菌株命名为BAB7，已在2022年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24298，微生物分类命名为微杆菌Microbacterium sp.；

(2)将种子液接种到发酵培养基中，进行发酵培养。

作为一种具体实施方式，步骤(1)中，所述活化和扩大培养的过程包括以下步骤：将微杆菌菌株接种到LB固体培养基上，进行第一次培养，而后挑取单克隆菌落转接至基础液体培养基中，进行第二次培养，获得种子液。可选地，所述第一次培养的温度为25～33℃，时间为2.5～3.5天；所述第二次培养的温度为27～33℃。

作为一种具体实施方式，步骤(2)中，所述发酵培养基包括以下浓度的成分：碳源5～12g/L、酵母提取物0.1～0.2g/L、(NH₄)₂SO₄ 0.8～1.2g/L、KH₂PO₄ 0.3～0.7g/L、NaCl 4.5～5.5g/L、CaCl₂ 0.15～0.25g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2～0.4g/L、ZnSO₄·7H₂O 5～8mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.3～0.6mg/L、MnSO₄·4H₂O 0.15～0.25mg/L。所述碳源优选包括乙酸钠、L-阿拉伯糖、柠檬酸钠、甘油、半乳糖、葡萄糖和蔗糖中的一种或多种，进一步优选为蔗糖。

作为一种具体实施方式，步骤(2)中，所述发酵培养基中Fe³⁺的含量为0～1.23mmol/L；所述发酵培养基的pH为5.0～8.0，进一步优选为7.0。

作为一种具体实施方式，步骤(2)的具体过程包括以下步骤：将种子液以1.0～1.5％的接种量接种到发酵培养基中，以200～220rpm的转速在25～33℃下进行发酵培养4～5天。

作为一种具体实施方式，步骤(2)中，在发酵培养之后，进行离心，取上清液，而后过滤除菌，获得含铁载体的溶液。

实施例1：菌株的分离、筛选和鉴定

(1)样品来源：

东海及南海滩涂泥样。

(2)LB培养基的配制：

按照以下配方，配制LB培养基：酵母提取物5g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L，pH7.0。作固体培养基时，加入琼脂20g/L。

(3)铬天青(CAS)检测液的配制：

溶液A：将60.5mg CAS溶于50mL去离子水中，再加入10mL 1mmol/L FeCl₃溶液(含12mmol/L HCl)。

溶液B：将72.9mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶于40mL去离子水中。

将A溶液沿烧杯壁缓缓加入B溶液中，搅拌混匀即得100mL CAS蓝色检测液，保存于干净的聚乙烯瓶中，避光保存备用。

(4)CAS双层平板的配制：

按照以下配方，配制CAS双层平板：下层10mL CAS-Fe³⁺-CTAB检测液，琼脂20g/L；上层10mL固体LB培养基。

注：CAS琼脂平板检测法是利用铁载体对铁的亲和能力高于CAS，使染料的颜色从蓝色变成橙色，因而成为最为广泛的用于铁载体产生菌的鉴定方法。CAS试剂配制中加入的CTAB对菌体生长有抑制作用，故采用CAS双层平板使菌体利用上层培养基进行生长，而细菌所分泌的铁载体进入下层形成明显的变色圈。若细菌可产铁载体，铁载体渗入下层琼脂，竞争性结合CAS-Fe³⁺-CTAB蓝色复合物中的Fe³⁺，复合物解体，染料脱色，形成橙黄色透明变色圈。根据平板变色圈的大小可判断菌株是否产生及产铁载体能力的强弱。

(5)铁载体产生菌的筛选：

取泥样10g在60℃烘箱中干燥0.5～6h，用无菌研钵研磨成细粉，称取1g置于含灭菌玻璃珠的小锥形瓶内，加入10mL生理盐水，置于摇床振荡30min，之后在室温下静置，待粉末自然沉降后取上清按照标准稀释培养法进行梯度稀释制成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6的样品，然后取每个稀释梯度样品溶液各100μL涂布于CAS双层平板上，待样品吸收后倒置于30℃培养箱中，培养7d，选取CAS双层平板中变色圈大的菌株作为初筛菌株。将初筛菌株多次划线于CAS双层平板上，查看其变色稳定性。用接种环挑取多次稳定变色的菌株至LB固体培养基上进行三线法划线分离，培养皿倒置于30℃培养箱中培养，标记并记录菌落形态。挑取对数生长期的单克隆(第三区)转接至3mL LB液体培养基中，30℃、160rpm振荡培养至出现明显浑浊后，取部分菌液进行菌株保藏，取部分菌液进行基因组提取及16S rRNA基因测序分析。

其中，菌株保藏方法包括甘油法保藏和冷冻干燥保藏，具体如下：

1)甘油法保藏：取OD₆₀₀达到0.5～0.8时的新鲜菌液0.5mL，加入0.5mL浓度为60％的丙三醇，无菌条件下吹打均匀使菌体悬浮，保藏于-80℃超低温冰箱。

2)冷冻干燥保藏：将OD₆₀₀达到0.5～0.8时的新鲜菌液涂布于适合生长的琼脂平板上，待菌体生长至对数生长期备用。在110℃、15min的条件下灭菌20％脱脂牛奶，冷却后吸取500～1000μL于长满纯菌落的平板上，轻刮平板表面使菌落悬浮于脱脂牛奶中，将悬浮液转入冻干管中，置于-80℃超低温冰箱冷冻6小时以上。迅速转入冷冻干燥机中干燥过夜。室温下抽真空并使用安培管熔封机熔封冻干管。之后置于4℃冰箱长期保藏。

基因组提取的方法如下：

采用小量DNA抽提试剂盒提取菌株DNA，过程参考相应的说明书进行。

16S rRNA基因测序分析的方法如下：

1)菌株16S rRNA基因序列PCR扩增：

PCR扩增引物序列如下：

27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

1492R：5’-ACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’。

PCR反应体系见表1。

表1PCR反应体系

2×SuperPCR Mix	12.5μL
		引物27F(10μM)	1.0μL
引物1492R(10μM)	1.0μL
		模板DNA	1.0μL
ddH₂O	9.5μL

PCR程序如下：

反应条件：98℃预变性5min；98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循环35次；72℃延伸10min；4℃。

2)PCR产物电泳检测：

将1％琼脂糖加热溶解于1×TAE50 mL溶液，加入4-5μL10000×核酸染料DuRed并混合均匀制胶。5μL PCR产物和5μLDL 2000DNA Marker分别与1μL6×Loading Buffer混合均匀后上样，110V电泳35min。割胶1.5Kb处条带送至杭州擎科梓熙生物技术有限公司进行测序。通过测序公司测得的基因序列用Bioedit软件打开，序列上传至EzBioCloud(http://www.ezbiocloud.net/identify)数据库和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)数据库进行比。

(6)菌株特性：

筛选得到1株在CAS双层平板上稳定变色的菌株BAB7，对其进行生理生化特性研究，信息如下：

1)形态学和生理生化特征：

菌株BAB7为革兰氏阳性菌，无运动性，细胞形状呈现杆状。

菌株BAB7在LB培养基上培养3d呈菌落呈现淡黄色、表面凸起、边缘光滑、不透明，菌落大小1～2mm。

温度生长范围为15～40℃，最适温度为30℃；pH生长范围为4.0～10.0，最适pH为6.5～7.0；NaCl生长范围为0～6.0％，最适温度为0.5～1.0％。菌株呈过氧化氢酶、氧化酶呈阳性；能降解淀粉、吐温60、吐温80、明胶，尿素、黄嘌呤；不能降解纤维素、熊果苷、鸟嘌呤、次黄嘌呤、酪蛋白、吐温20、吐温40；能利用醋酸盐、L-阿拉伯糖、柠檬酸盐、甘油、半乳糖，葡萄糖、蔗糖、海藻糖和D-木糖作为唯一碳源；不能利用纤维素二糖、糊精、菊粉、α-乳糖、麦芽糖、甘露醇、D-甘露糖、糖原、肌醇、苹果酸作为唯一碳源。

2)化学分类特征：

菌株BAB7的主要呼吸醌为MK-12、MK-13，主要脂肪酸成分为anteiso-C15:0、anteiso-C17:0和iso-C16:0。细胞膜中主要极性脂为双磷脂酰甘油(diphosphatidylglycerol，DPG)，磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol，PG)。

3)基因型特征：

菌株BAB7的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO:1所示，具体如下：

经数据库比对，菌株BAB7的16S rDNA基因序列与最相近的菌株Microbacteriummarinum DSM 24947^T相似度为97.8％，DNA G+C含量为70.1mol％。

综上，菌株BAB7鉴定为微杆菌属(Microbacterium)内的新种，暂命名为Microbacterium sp.BAB7。该菌株在2022年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.24298。

实施例2：铁载体类型鉴定

铁载体类型主要有异羟肟酸型、儿茶酚盐型和羧酸盐型，鉴定主要根据螯合铁离子集团的不同及其与不同试剂的不同显色进行鉴定。

(1)高氯酸铁实验：

取发酵上清液0.5mL加入2.5mL 5mol/L的高氯酸铁溶液，溶液变成红色或者橙色，则有异羟肟酸类铁载体；溶液变黄或无，则无异羟肟酸类铁载体。

(2)FeCl₃实验：

取发酵上清液l mL加入l～5mL 2％的FeCI₃溶液，如果颜色变红或变紫说明有铁载体的存在。若用紫外可见分光光度计测得在420～450nm之间有吸收峰，说明有异羟肟酸型铁载体；495nm处有吸收峰，说明有儿茶酚类铁载体。

(3)Arnow实验：

取发酵上清液l mL，依次加入1mL 0.5mol/L盐酸、1mL钼酸盐溶液(亚硝酸钠10g与钼酸钠10g溶解于100mL蒸馏水中)，反应液变成黄色，则含有儿茶酚类铁载体。再加入1mL1mol/L NaOH溶液，若溶液由黄变红并保持15min不变色，则有儿茶酚类铁载体；若在515nm有吸收峰，说明有儿茶酚类铁载体。

注：若上清液中存在儿茶酚型铁载体，则溶液中的亚销酸分解，生成黄色NO配体，溶液颜色变黄。因为亚硝酸在溶液中的分解迅速不利于黄色配体的生成，因此，在溶液中加入钼酸钠，可使亚硝酸分解减慢。钼酸钠加入后还可提高显色的亮度达15倍。NaOH可使溶液由黄变红，并可保持至少1h不变色。

(4)CuSO₄实验：

在1mL发酵上清液中加入1mL 250μmol/L CuSO₄和2mL pH 4.0的醋酸盐缓冲液，在190～280nm波长范围内有吸收峰，说明有羧酸型铁载体。

醋酸盐缓冲液按照以下步骤配制：将847mL 0.1μmol/L的H₃COOH溶液加入到容量瓶内，并加0.1μmol/L的CH₃COONa溶液，定容至1 000mL，盖紧瓶塞振荡混匀。

高氯酸铁实验、FeCl₃实验、Arnow实验和CuSO₄实验的结果见表2。

表2

注：+代表有吸收峰、-代表无吸收峰。

结果表明，菌株Microbacterium sp.BAB7产生的铁载体类型为异羟肟酸型。

实施例3：菌株BAB7的产铁载体能力

(1)培养基的选择：

载体的生物合成是受环境中铁含量调控的，在铁充足的条件下铁载体的合成将会受到抑制。铁载体的合成和分泌是微生物为了适应在低铁的限制性条件下生长代谢的需要而产生的一种生物适应现象。试验中所用的LB培养基不可避免的含有微量的铁，这会抑制铁载体的生物合成。故后续实验将在基础培养基中进行试验，查看对铁载体产量的影响。

基础培养基的配方如下：酵母提取物0.1g/L(作必须生长因子)、(NH₄)₂SO₄ 1g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、NaCl 5g/L、CaCl₂ 0.2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.3g/L、ZnSO₄·7H₂O 6mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.4mg/L、MnSO₄·4H₂O 0.2mg/L，pH 7.0。作固体培养基时，加入琼脂20g/L。

(2)种子液的制备：

菌株BAB7采用三线法划线于LB固体培养基上，培养皿倒置于30℃培养箱中培养3d，挑取第三区单克隆菌落转接至3mL基础液体培养基中，于150r/min、30℃条件下培养得至OD₆₀₀＝1.0，作为种子液。

按体积分数1％接种量将种子液接种至100mL基础液体培养基中，培养一段时间，离心得到上清液，测定铁载体的浓度。

(3)碳源类型对铁载体产量的影响：

按体积分数1％的接种量，将种子液接种到100mL添加有不同碳源(碳源添加量均为10g/L)的基础培养基中，在pH 7.0、150r/min、30℃下培养7d后，8000r/min离心5min得上清液，利用Csαky反应检测铁载体含量(Csαky反应可用于检测含羟胺基团化合物，适用于异羟肟酸型铁载体检测进行铁载体定量测定)，具体检测方法如下：

取发酵液上清1mL，加入1mL 2mol/L H₂SO₄沸水浴6h。加入3mL醋酸钠溶液、0.5mL碘溶液、1mL对氨基苯磺酸溶液。3～5min后，加入1mL亚砷酸盐溶液。加入1mLα-萘胺溶液，补水至10mL，静置20～30min，测OD₅₂₆吸光度，以盐酸羟胺为标准品换算铁载体浓度。

检测结果见图1。从图1可以看出：大部分碳源均能促进菌株BAB7产生铁载体，蔗糖最佳，其次为葡萄糖、甘油，蔗糖可使铁载体产量达4.6mmol/L；海藻糖对铁载体的分泌无明显促进作用。

(4)FeCl₃添加量对铁载体产量的影响：

按体积分数1％的接种量，将种子液接种到100mL添加有FeCl₃(添加量分别为0g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L)的基础培养基中，在pH 7.0、150r/min、30℃下培养7d后，8000r/min离心5min得上清液，利用Csαky反应检测铁载体含量。

检测结果见图2。从图2可以看出：额外添加FeCl₃会抑制菌株BAB7产生铁载体，FeCl₃添加量越多，抑制程度就越大；当FeCl₃添加量为0～0.2g/L(即Fe³⁺添加量为0～1.23mmol/L)时，菌株产铁载体能力相对较强。

(5)转速对铁载体产量的影响：

按体积分数1％的接种量，将种子液接种到100mL基础培养基中，在pH 7.0、不同转速(0r/min、50r/min、100r/min、150r/min、180r/min、200r/min、220r/min)、30℃下培养7d后，8000r/min离心5min得上清液，利用Csαky反应检测铁载体含量。

检测结果见图3。从图3可以看出：转速越高，铁载体产量越高，最佳转速200r/min。转速影响体系OD，转速越高，一般OD越高，这也说明菌株产铁载体是一个耗氧过程。

(6)pH对铁载体产量的影响：

按体积分数1％的接种量，将种子液接种到100mL基础培养基中，在不同pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)、150r/min、30℃下培养7d后，8000r/min离心5min得上清液，利用Csαky反应检测铁载体含量。

检测结果见图4。从图4可以看出：最佳pH为7.0，在pH 4.0～9.0下均具有产铁载体能力，碱性环境比酸性环境对菌株BAB7产铁载体量的抑制大。

(7)发酵时间对铁载体产量的影响：

综合以上最佳条件，检测发酵时间对铁载体产量的影响，具体方法如下：

按体积分数1％的接种量，将种子液接种到100mL添加有蔗糖(添加量为10g/L)基础培养基中，在pH 7.0、200r/min、30℃下培养，每隔一段时取菌液，8000r/min离心5min得上清液，利用Csαky反应检测铁载体含量。

检测结果见图5。从图5可以看出：菌株BAB7随着发酵时间的延长，上清液中铁载体的含量先升高再降低，发酵4～5d时，铁载体含量达到最大约6.8mmol/L。5d后，铁载体可能有部分降解，使得上清液中测定的铁载体含量下降。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.一种基于微生物发酵的铁载体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对微杆菌菌株进行活化和扩大培养，获得种子液；所述微杆菌菌株命名为BAB7，已在2022年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24298，微生物分类命名为微杆菌（Microbacterium sp.）；

（2）将种子液接种到发酵培养基中，进行发酵培养。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述种子液的OD₆₀₀为0.8~1.5。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述发酵培养基中含有碳源。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述碳源为乙酸钠、L-阿拉伯糖、柠檬酸钠、甘油、半乳糖、葡萄糖和蔗糖中的一种或多种。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述发酵培养基中Fe³⁺的含量为0~1.23mmol/L。

6.如权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述发酵培养基包括以下浓度的成分：碳源5~12g/L、酵母提取物0.1~0.2g/L、(NH₄)₂SO₄ 0.8~1.2g/L、KH₂PO₄ 0.3~0.7g/L、NaCl 4.5~5.5g/L、CaCl₂ 0.15~0.25g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2~0.4g/L、ZnSO₄·7H₂O 5~8mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.3~0.6mg/L和MnSO₄·4H₂O 0.15~0.25mg/L。

7.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述将种子液接种到发酵培养基中的过程中，移入种子液的体积为接种后培养液体积的1.0~1.5%。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述发酵培养基的pH为5.0~8.0。

9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述发酵培养的转速为200~220rpm，时间为4~5天。

10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，在发酵培养之后，进行离心，取上清液，而后过滤除菌，获得含铁载体的溶液。