WO2023095896A1 - 遺伝子組換え微生物、及びアスパラギン酸を生産する方法 - Google Patents

遺伝子組換え微生物、及びアスパラギン酸を生産する方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2023095896A1
WO2023095896A1 PCT/JP2022/043626 JP2022043626W WO2023095896A1 WO 2023095896 A1 WO2023095896 A1 WO 2023095896A1 JP 2022043626 W JP2022043626 W JP 2022043626W WO 2023095896 A1 WO2023095896 A1 WO 2023095896A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
genetically modified
condition
aspartic acid
microorganism
modified microorganism
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/043626
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
祐二 石垣
諒 杉本
徹 中屋敷
ヤクフ アマル
Original Assignee
Dic株式会社
Ｇｒｅｅｎ Ｅａｒｔｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dic株式会社, Ｇｒｅｅｎ Ｅａｒｔｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ株式会社 filed Critical Dic株式会社
Priority to JP2023562172A priority Critical patent/JPWO2023095896A1/ja
Publication of WO2023095896A1 publication Critical patent/WO2023095896A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/20—Aspartic acid; Asparagine

Definitions

  • the present invention relates to genetically modified microorganisms and methods for producing aspartic acid.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2021-192344 filed in Japan on November 26, 2021, the content of which is incorporated herein.
  • Bio-derived raw materials tend to have lower yields and higher costs than petroleum-derived raw materials. Therefore, there is a demand for a technique for producing bio-derived raw materials at low cost and with high yield using microorganisms and the like.
  • the present invention can improve the production amount and yield of aspartic acid or a derivative thereof, and can reduce the production amount of by-products (amino acids other than aspartic acid, organic acids, etc.).
  • An object of the present invention is to provide a genetically modified microorganism and a method for producing aspartic acid or a derivative thereof.
  • a genetically modified microorganism that satisfies at least one condition selected from the group consisting of the following conditions (I) and (II): Condition (I) citrate synthase activity is reduced or inactivated compared to a wild-type microorganism corresponding to said genetically modified microorganism; and Condition (II) compared to said wild-type microorganism, oxalo Acetate decarboxylase activity is reduced or inactivated.
  • [9] selected from the group consisting of an amino acid other than aspartic acid and an organic acid, compared to the case where aspartic acid is produced using the cells of a microorganism that does not satisfy the condition (I) or a processed cell thereof;
  • the production and yield of aspartic acid or a derivative thereof can be improved, and the production of by-products (amino acids other than aspartic acid, organic acids, etc.) can be reduced.
  • by-products amino acids other than aspartic acid, organic acids, etc.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of a metabolic pathway involved in the production of aspartic acid;
  • FIG. Glc glucose, PEP: phosphoenolpyruvate, Pyr: pyruvate, Ac-CoA: acetyl-CoA, Ac: acetic acid, Cit: citric acid, ⁇ -keto: ⁇ -ketoglutarate, Fum: fumaric acid, Mal: L-apple acid, OAA: oxaloacetate, Asp: aspartate, Ldh: lactate dehydrogenase, PoxB: pyruvate:quinone oxidoreductase, Odx: oxaloacetate decarboxylase, P1gltA: promoter P1 of the citrate synthase gene, Sdh: succinate dehydrogenase, AspA : aspartate ammonia lyase, mutant Ppc: phosphoenolpyruvate carboxylase.
  • a first aspect of the present invention is a genetically modified microorganism that satisfies at least one condition selected from the group consisting of conditions (I) and (II) below.
  • Condition (I) citrate synthase activity is reduced or inactivated compared to a wild-type microorganism corresponding to said genetically modified microorganism; and
  • Condition (II) compared to said wild-type microorganism, oxalo Acetate decarboxylase activity is reduced or inactivated.
  • the genetically modified microorganism satisfies at least one condition selected from the group consisting of the following conditions (III) to (VI) in addition to the above conditions (I) and/or (II).
  • Condition (III) succinate dehydrogenase activity or fumarate reductase activity is reduced or inactivated compared to the wild-type microorganism;
  • Condition (IV) lactate dehydrogenase activity is reduced or inactivated compared to the wild-type microorganism;
  • Condition (VI) pyruvate:quinone
  • the genetically modified microorganism satisfies condition (I) above. In one embodiment, the genetically modified microorganism satisfies condition (II) above. In one embodiment, the genetically modified microorganism satisfies conditions (I) and (II) above.
  • microorganisms can be prokaryotes such as bacteria, archaea, or cyanobacteria, or eukaryotes such as fungi.
  • microorganisms are preferably fungi or bacteria, more preferably bacteria.
  • the genus Saccharomyces e.g., Saccharomyces cerevisiae
  • the genus Schizosaccharomyces e.g., Schizosaccharomyces pombe
  • the genus Pichia e.g., Pichia pastoris
  • the genus Kluyveromyces Kluyveromyces lactis
  • Hansenula Polymorpha Yarrowia Genus (eg, Yarrowia lipolytica)
  • Cryptococcus eg, Cryptococcus sp.
  • Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, and the like can be conveniently used because genetic recombination techniques and heterologous protein expression systems have been established.
  • Bacteria include, for example, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus, Clostridium thermocellum, Clostridium acetob utylicum), Rhodopseudomonas ( Examples thereof include Rhodopseudomonas palustris), Rhodobacter capsulatus, and coryneform bacteria described later.
  • Bacteria are preferably Escherichia bacteria or coryneform bacteria, more preferably Escherichia coli or coryneform bacteria, and even more preferably Corynebacterium, because gene recombination techniques and protein expression systems have already been established. .
  • the genetically modified microorganism according to this aspect is a Gram-positive bacterium (eg, actinomycete). In some other embodiments, the genetically modified microorganism according to this aspect may be a Gram-negative bacterium.
  • Gram-negative bacteria include, for example, bacteria belonging to the phylum Proteobacteria.
  • the phylum Proteobacteria includes bacteria belonging to the alpha-, beta-, gamma-, delta-, epsilon- or zeta-Proteobacteria classes, and bacteria belonging to the class Oligoflexus.
  • Gram-negative bacteria include, for example, bacteria belonging to the family Enterobacteriaceae, Vibrioceae, or Pseudomonadaceae.
  • Coryneform bacterium refers to a group of bacteria defined in Burgeys Manual of Determinative Bacteriology (Vol. 8, p.599, 1974). Coryneform bacteria include the genus Corynebacterium, the genus Brevibacterium, the genus Arthrobacter, the genus Mycobacterium, the genus Micrococcus, the genus Microbacterium ( Microbacterium) and the like.
  • Corynebacterium includes, for example, the following species and bacterial strains.
  • Corynebacterium glutamicum for example, FERM P-18976 strain, ATCC13032 strain, ATCC31831 strain, ATCC13058 strain, ATCC13059 strain, ATCC13060 strain, ATCC13232 strain, ATCC13286 strain, ATCC13287 strain, ATCC13655 strain, ATCC13745 strain, ATCC13746 strain , ATCC13761 strain, ATCC14020 strain
  • Corynebacterium acetoglutamicum e.g. ATCC15806 strain
  • Corynebacterium acetoacidophilum eg, ATCC13870 strain
  • Corynebacterium melassecola e.g.
  • ATCC 17965 strain ATCC 17965 strain
  • Corynebacterium efficiens eg YS-314 strain, YS-314 T strain (NBRC100395 T strain)
  • Corynebacterium alkanolyticum eg ATCC21511 strain
  • Corynebacterium callunae e.g. ATCC15991 strain, NBRC15359 strain, DSM20147 strain
  • Corynebacterium lilium eg ATCC15990 strain
  • Corynebacterium thermoaminogenes Corynebacterium efficiens
  • Corynebacterium herculis e.g.
  • ATCC13868 strain ATCC13868 strain
  • Corynebacterium ammoniagenes Bactebacterium ammoniagenes
  • ATCC6871 strain, ATCC6872 strain, DSM20306 strain NBRC12071 T strain, NBRC12072 strain, NB RC12612 T strain
  • Corynebacterium pollutisoli Corynebacterium marinum (eg strain DSM44953)
  • Corynebacterium humireducens e.g. strain NBRC106098
  • Corynebacterium halotolerans e.g. strain YIM70093
  • Corynebacterium deserti e.g. strain GIMN 1.010
  • Corynebacterium doosanense e.g. CAU212 strain, DSM45436 strain
  • Corynebacterium maris eg strain DSM45190.
  • Brevibacterium bacteria include, for example, the following species and bacterial strains.
  • Brevibacterium divaricatum eg, ATCC 14020 strain
  • Brevibacterium flavum for example, MJ-233 (FERM BP-1497) strain, MJ-233AB-41 (FERM BP-1498) strain, ATCC13826 strain, ATCC14067 strain, ATCC13826 strain
  • Brevibacterium immariophilum eg, ATCC strain 14068
  • Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) (for example, ATCC 13869 strain); Brevibacterium roseum (eg, ATCC13825 strain); Brevibacterium saccharolyticum (eg, ATCC 14066 strain); Brevibacterium thiogenitalis (eg, ATCC19240 strain); Brevibacterium album (eg ATCC 15111 strain); Brevibacterium cerinum (eg ATCC 15112 strain).
  • Arthrobacter bacteria include, for example, the following species and bacterial strains.
  • Arthrobacter globiformis eg, ATCC8010 strain, ATCC4336 strain, ATCC21056 strain, ATCC31250 strain, ATCC31738 strain, ATCC35698 strain, NBRC3062 strain, NBRC12137T strain
  • Arthrobacter globiformis eg, ATCC8010 strain, ATCC4336 strain, ATCC21056 strain, ATCC31250 strain, ATCC31738 strain, ATCC35698 strain, NBRC3062 strain, NBRC12137T strain
  • Micrococcus bacteria include, for example, Micrococcus freudenreichii [eg, No. 239 (FERM P-13221) strain]; Micrococcus luteus [eg, NCTC 2665 strain, No. 240 (FERM P-13222) strain]; Micrococcus ureae (eg, IAM1010 strain); Micrococcus roseus (eg, IFO3764 strain).
  • Microbacterium bacteria include, for example, Microbacterium ammoniaphilum (for example, ATCC15354 strain) and the like.
  • a coryneform bacterial strain for example, an ATCC strain, can be obtained from the American Type Culture Collection (P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108 USA). Other strains can also be obtained from each microorganism preservation institution that provides those strains.
  • the genetically modified microorganisms according to this aspect can be produced by subjecting microorganisms as exemplified above to predetermined genetic manipulations.
  • the citrate synthase activity is reduced or inactivated compared to the wild-type microorganism corresponding to the genetically modified microorganism
  • condition (I) means that compared to the wild-type microorganism, citrate synthase It means that the activity is significantly reduced or completely inactivated.
  • wild-type microorganism is meant a microorganism that has not been genetically engineered. Wild-type microorganisms may be microorganisms isolated from nature, or may be established microbial strains.
  • a “wild-type microorganism corresponding to a genetically modified microorganism” means a wild-type microorganism that has the same genetic background as the genetically modified microorganism.
  • the genetically modified microorganism of this embodiment is a corresponding wild-type microorganism that has conditions (I) and/or conditions (II), or conditions (I) and/or conditions (II) plus conditions (III) to (VI). ) may be genetically engineered to achieve any one or more of the above.
  • the citrate synthase activity of the genetically modified microorganism is expressed as a relative activity when the citrate synthase activity of the wild-type microorganism is 100, for example, It can be 90 or less, 80 or less, 70 or less, 60 or less, or 50 or less. The same applies to conditions (II) to (IV) and (VI) below.
  • the oxaloacetate decarboxylase activity is reduced or inactivated compared to the wild-type microorganism
  • condition (II) means that the oxaloacetate decarboxylase activity is significantly reduced compared to the wild-type microorganism. or completely inactivated.
  • the succinate dehydrogenase activity or fumarate reductase activity is reduced or inactivated compared to the wild-type microorganism corresponding to the genetically modified microorganism" in condition (III) is compared to the wild-type microorganism , meaning that succinate dehydrogenase or fumarate reductase activity is significantly reduced or completely inactivated.
  • Some bacteria such as Corynebacterium do not have fumarate reductase and succinate dehydrogenase catalyzes this reaction.
  • Some bacteria such as E. coli have both succinate dehydrogenase and fumarate reductase, and fumarate reductase mainly catalyzes the above reaction.
  • lactate dehydrogenase activity is reduced or inactivated compared to the wild-type microorganism
  • condition (IV) means that the lactate dehydrogenase activity is significantly reduced compared to the wild-type microorganism, Or it means that it is completely inactivated.
  • the pyruvate: quinone oxidoreductase activity is reduced or inactivated compared to the wild-type microorganism in condition (VI) means that the pyruvate: quinone oxidoreductase activity is reduced compared to the wild-type microorganism is significantly reduced or completely inactivated.
  • the TCA cycle (citric acid cycle) shown in FIG. Metabolism proceeds, whereas under reducing or anaerobic conditions the TCA cycle proceeds counterclockwise from oxaloacetate.
  • condition (I) When an embodiment that satisfies condition (I) is employed, a larger amount of oxaloacetate accumulates under aerobic conditions because the conversion of oxaloacetate to citric acid is suppressed. As a result, the production of additional metabolites derived from oxaloacetate can be efficiently performed. On the other hand, under reducing or anaerobic conditions, larger amounts of oxaloacetic acid, L-malic acid, fumaric acid, or additional metabolites derived therefrom can be efficiently produced.
  • metabolites derived from the metabolites in the TCA cycle are biosynthesized in genetically modified microorganisms that satisfy condition (I) via metabolic systems possessed by corresponding wild-type microorganisms, Alternatively, it may be biosynthesized through a newly constructed metabolic system by introducing any gene mutation.
  • the genetically modified microorganism satisfies condition (I). In one embodiment, the genetically modified microorganism satisfies condition (I) and further satisfies at least one condition selected from the group consisting of conditions (II)-(IV) and (VI). In this case, the genetically modified microorganism is subject to both conditions (I) and (II), both conditions (I) and (III), both conditions (I) and (IV), conditions (I) and (VI) or conditions (I), (II) and (III), more preferably conditions (I), (II), (III) and (VI), and condition (I ), (II), (III), (IV) and (VI) are more preferably satisfied.
  • the genetically modified microorganism satisfies condition (II). In one embodiment, the genetically modified microorganism satisfies condition (II) and further satisfies at least one condition selected from the group consisting of conditions (I), (III), (IV) and (VI) .
  • the genetically modified microorganism is subjected to both conditions (I) and (II), both conditions (II) and (III), both conditions (II) and (IV), conditions (II) and (VI) or conditions (I), (II) and (IV) are preferably satisfied, more preferably conditions (I), (II), (IV) and (VI) are satisfied, and the condition ( More preferably, all of I), (II), (III), (IV) and (VI) are satisfied.
  • the metabolic pathway from pyruvate to the TCA cycle and metabolism in the TCA cycle proceed efficiently, and oxaloacetate, L-malic acid, fumaric acid, or metabolites derived therefrom in the TCA cycle, This is because it is possible to efficiently produce the metabolites of these metabolites and substances derived from these metabolites by further metabolism.
  • the genetically modified microorganism may further satisfy the following condition (VII).
  • the pyruvate formate lyase activity is reduced or inactivated compared to the wild-type microorganism
  • condition (VII) means that the pyruvate formate lyase activity is significantly reduced compared to the wild-type microorganism or completely inactivated.
  • the genetically modified microorganism is a Gram-negative bacterium, it is preferable to satisfy condition (VII).
  • Gram-negative bacteria express pyruvate formate lyase activity that is not normally found in Gram-positive bacteria. Pyruvate formate lyase activity creates secondary biosynthetic pathways that synthesize organic acids such as formate and acetate from pyruvate. In other words, if the pyruvate formate lyase activity is reduced or inactivated, the secondary biosynthetic pathway can be blocked, so that the metabolic flux to aspartic acid becomes more robust, and efficient aspartic acid production becomes possible. .
  • the pyruvate:quinone oxidoreductase activity according to the condition (VI) and the pyruvate formate lyase activity according to the condition (VII) may be the enzymatic activities of the enzymes shown in the above conditions. More specifically, enzymes can be described by the EC number, which is recognized as a systematic classification according to the type of reaction between the substrate and the enzyme and an international enzyme classification based on the type of reaction. The enzymes responsible for the enzymatic activity under each condition include the enzymes listed in Table 1 below.
  • citrate synthase gene gltA
  • odx oxaloacetate decarboxylase gene
  • sdh succinate dehydrogenase gene
  • frd fumarate reductase gene
  • lactate dehydrogenase gene ldh
  • pyruvate:quinone oxidoreductase gene poxB
  • pyruvate formate lyase gene formate acetyltransferase gene
  • genetic engineering may be performed to express peptides or proteins that inhibit the activity of each enzyme.
  • an enzyme protein capable of conferring each enzymatic activity requires a process of activation by a given endogenous activator in order for each enzymatic activity to be expressed in a microorganism, the endogenous activator is inactivated.
  • each condition may be satisfied by suppressing the expression of each enzyme activity.
  • Gene disruption or mutagenesis techniques are preferably used in that each of the above conditions can be achieved relatively easily and reliably. More specifically, it is preferable to employ any one of the following embodiments (1) to (6).
  • one or more amino acid mutations means amino acid mutations that can reduce or inactivate the activity of each enzyme.
  • Endogenous activators that activate enzymatic activities of enzyme proteins capable of conferring enzymatic activities are inactivated or reduced by any one or more methods described in the above embodiments (1) to (4). an embodiment that satisfies condition (I) and/or condition (II), and optionally any one or more of conditions (III), (IV), and (IV).
  • Embodiments (1) to (5) can be independently employed to achieve reduction or inactivation of each enzyme activity defined in each condition. Additionally, two or more of embodiments (1)-(5) may be employed to satisfy a single condition. For example, embodiments (1) and (2) may be employed to satisfy condition (I). For example, both the coding region and the gene expression regulatory region of the citrate synthase gene may be disrupted to satisfy condition (I). To satisfy any one of conditions (II), conditions (III), conditions (IV), conditions (VI) and conditions (VII) by adopting embodiment (2) in order to satisfy condition (I) Embodiment (1) may be adopted for.
  • all of the multiple enzyme gene coding regions may be destroyed, or only a portion thereof may be destroyed.
  • the expression of the enzyme gene can be reduced without completely stopping the expression of the enzyme gene.
  • the expression level of the enzyme gene may be adjusted to improve the production efficiency of aspartic acid. Disruption of the enzyme gene coding region may be achieved by partial or complete deletion by homologous recombination or the like described later.
  • all of the multiple gene expression regulatory regions may be disrupted, or only a portion may be disrupted. good too.
  • all of the multiple promoter regions may be disrupted, or only a portion of the promoter regions may be disrupted.
  • the expression of the enzyme gene can be reduced without completely stopping the expression of the enzyme gene.
  • the expression level of the enzyme gene may be adjusted to improve the production efficiency of aspartic acid. Disruption of the gene expression regulatory region may be achieved by partial deletion or complete deletion by homologous recombination or the like, which will be described later.
  • all of the multiple gene expression regulatory regions may be changed, or only a portion may be changed. good too.
  • all of the multiple promoter regions may be changed, or only a part of them may be changed.
  • the expression level of the enzyme gene may be adjusted to improve the production efficiency of aspartic acid, depending on the degree of alteration of the gene expression regulatory region. Alteration of the gene expression regulatory region may be realized by homologous recombination or the like described later.
  • the citrate synthase gene has two promoters (promoter P1, promoter P2).
  • promoter P1 and promoter P2 may be disrupted, or only one of promoter P1 and promoter P2 may be disrupted.
  • only the promoter P1 is disrupted in order to satisfy the condition (I), preferably by completely deleting the promoter P1.
  • Target regions Gene coding regions or gene expression regulatory regions (hereinafter collectively referred to as "target regions") in genetically modified microorganisms can be disrupted by known methods.
  • Methods for disrupting the target region include, for example, homologous recombination, genome editing technology (CRISPR/CAS system), transposon method, mutagenesis method and the like.
  • Homologous recombination methods are preferred in that disruption of the target region can be achieved relatively inexpensively and efficiently. Examples of target region disruption methods by homologous recombination are shown below, but are not limited to these.
  • Target region disruption method/target region replacement method by homologous recombination (1) Target Region Determination and Target Region Cloning
  • Many bacteria such as the genera Corynebacterium, Escherichia, Bacillus and Clostridium, and various fungi such as Saccharomyces cerevisiae and Yarrowia lipolytica have their entire genome sequences determined. , its nucleotide sequence and the amino acid sequence of the protein encoded by each gene are also known. For example, in Corynebacterium glutamicum, whole genome sequences have been determined in many bacterial strains such as ATCC13032 strain, R strain, ATCC21831 strain, and ATCC14067 strain.
  • Table 2 shows information such as genes that can be targets for satisfying condition (I) and condition (II) in Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 strain. Information such as genes that can be targeted to satisfy each condition can be obtained from various databases according to the type of microorganism.
  • Tables 3-11 show, but are not limited to, information such as genes that can be targets for satisfying conditions (III), (IV), and (VI) in various microorganisms.
  • citrate synthase (GltA), oxaloacetate decarboxylase (Odx), succinate dehydrogenase (Sdh), fumarate reductase (Frd), lactate dehydrogenase (Ldh), pyruvate:quinone oxidoreductase (Pox or Pqo), and Enzymatic activity of pyruvate formate lyase (Pfl).
  • Proteins related to these enzymes are respectively gltA, odx, sdhCAB (sdhCABD depending on the strain), ldhA, dld and lldD (genes encoding enzyme proteins exhibiting lactate dehydrogenase activity), poxB (pqo), pflABCD and the like. It may be encoded by the indicated gene.
  • citrate synthase GltA
  • oxaloacetate decarboxylase Odx
  • succinate dehydrogenase (Sdh) is encoded by the transmembrane protein (subunit C) encoded by the sdhC gene, the flavoprotein subunit (subunit A) encoded by the sdhA gene, and the sdhB gene.
  • the bacterial genome constitutes an operon.
  • Fumarate reductase (Frd) is a complex composed of subunits D, C, B, and A in bacteria such as Escherichia coli, and is encoded by the frdDCBA gene (operon).
  • Pyruvate formate lyase (Pfl) is a complex composed of subunits A, B, C and D in bacteria such as Escherichia coli, and is encoded by the pflABCD gene (oper
  • the target region (coding region of each enzyme gene, expression control region, etc.) and its It is preferred to use microorganisms whose nucleotide sequence as well as the protein sequence of the surrounding region are known. A genomic region to be disrupted can be easily identified by referring to those known sequences.
  • microorganisms that can be used as starting materials for the production of genetically modified microorganisms include microorganisms in which the enzyme protein coding region and its surrounding regions are unknown.
  • the coding region of each enzyme gene can be appropriately cloned by various genetic engineering techniques, and the nucleotide sequence can be determined as necessary. , the region to be destroyed can be identified and cloned. For example, alignment analysis of the amino acid sequences of known homologous enzyme proteins reveals multiple regions of constant amino acid conservation. Degenerate primers are designed for the amino acid conserved regions found at the N-terminal side and the C-terminal side of the enzyme protein, respectively, and degenerate PCR is performed using the genomic DNA of the microorganism to be cloned as a template.
  • the cloned partial coding region may be subjected to gene disruption to create a genetically modified microorganism that satisfies the desired conditions.
  • the enzyme gene whose nucleotide sequence has been determined as described above can be prepared.
  • the target enzyme gene may be cloned by the various genetic engineering techniques described above.
  • target region disruption/replacement plasmid vector is one that uses a plasmid vector obtained by cloning a target region from a microbial genome.
  • plasmid vectors for target region disruption/replacement include, for example, a target region disruption plasmid vector formed by inserting a drug resistance gene such as a kanamycin resistance gene into the target region of the plasmid vector; Plasmid vectors for target region replacement, etc., in which a replacement sequence (a low expression promoter sequence, an enzyme gene coding sequence added with a degradation-inducing peptide coding sequence, etc.), etc. are inserted into the target region.
  • plasmid vector for target region disruption regions homologous to the region to be disrupted in the microbial genome are present on both sides of the drug resistance gene. Therefore, the target region can be disrupted because homologous recombination occurs between the microbial genome and the plasmid for target region disruption in a form in which the drug resistance gene is inserted into the region desired to be disrupted in the genome of the microorganism. .
  • regions homologous to the region to be disrupted in the microbial genome are present on both sides of the replacement sequence. Therefore, since the replacement sequence is inserted into the region to be replaced in the genome of the microorganism, homologous recombination occurs between the genome of the microorganism and the target region replacement plasmid, so that the target region is replaced with the replacement sequence. It becomes possible.
  • a plasmid vector for target region disruption includes a fragment in which the regions located on both sides of the portion to be disrupted in the microbial genome (that is, the 5′ upstream and 3′ upstream of the region to be removed from the genome) are ligated in tandem. Plasmid vectors can also be used. Such a plasmid for disruption can be obtained, for example, by amplifying the 5' upstream region and the 3' downstream region of the target region by PCR, respectively, and ligating these fragments in tandem. It can be obtained by inserting it at a predetermined location.
  • the entire region from the 5' upstream region to the 3' downstream region of the target region is amplified by PCR, cloned using various plasmid vectors, then reverse primers are designed inside the cloned region, and inverse PCR.
  • a target region-disrupting plasmid vector into which a deletion mutation of the target region has been introduced may be prepared by the method.
  • the sequence length of the region homologous to the microbial genome sequence to be disrupted or replaced is not limited as long as homologous recombination can occur, but is generally about 500 bp. Above, it is better to have about 1000 bp, preferably.
  • the plasmid for target region disruption/replacement can be constructed using Escherichia coli for cloning, which simplifies the construction work.
  • the target region disruption/replacement plasmid preferably does not have a replication origin capable of autonomous replication in the target microorganism for disruption or replacement.
  • the target region disruption/replacement plasmid has a replication origin of the microorganism, it is recommended to remove the replication origin by restriction enzyme treatment or the like before introduction into the microorganism.
  • the target region disruption/replacement plasmid contains a drug resistance gene that enables drug selection and a positive selection such as the SacB gene that can produce a toxin that inhibits the growth of Gram-negative bacteria in the presence of sucrose. A combination with an enabling lethality gene may also be used.
  • strains in which homologous recombination has occurred can be isolated by drug selection, and then selection can be performed by culturing in a medium containing sucrose.
  • Culturing in a sucrose-containing medium enables the isolation of target region-disrupted strains or target region-substituted strains in which the vector portion has been eliminated by the second homologous recombination. Acquisition of shares becomes possible.
  • Introduction of the target region disruption/replacement plasmid vector into microorganisms is not particularly limited, but transformation methods established for various microorganisms may be used.
  • an electric pulse method eg, the method described in Van der Rest et al. Appl. Microbiol Biotechnol 52, pp541-545, 1999.
  • the electric pulse method enables efficient introduction of nucleic acids into coryneform bacterial cells.
  • Confirmation of disruption of the target region of the genome in a genetically modified microorganism can be carried out by PCR, Southern hybridization, various enzymatic activity assays, and the like.
  • condition (V) The genetically modified microorganism according to this aspect further includes, as condition (V), "a modified phosphoenolpyruvate carboxylase activity exhibiting resistance to feedback inhibition by aspartic acid in wild-type phosphoenolpyruvate carboxylase activity, or the wild-type having an exogenous phosphoenolpyruvate carboxylase activity that is more resistant to feedback inhibition by aspartate than the wild-type phosphoenolpyruvate carboxylase activity exhibited by the type microorganism".
  • condition (V) a modified phosphoenolpyruvate carboxylase activity exhibiting resistance to feedback inhibition by aspartic acid in wild-type phosphoenolpyruvate carboxylase activity, or the wild-type having an exogenous phosphoenolpyruvate carboxylase activity that is more resistant to feedback inhibition by aspartate than the wild-type phosphoenolpyruvate carboxylase activity exhibited by the type microorganism.
  • Phosphoenolpyruvate carboxylase activity specifically refers to an enzymatic activity that catalyzes the reaction defined in EC 4.1.1.31, and is widely possessed by a wide variety of plants and microorganisms. enzymatic activity exerted by (PEPC). The metabolic reactions catalyzed by PEPC are shown below.
  • Wild-type phosphoenolpyruvate carboxylase is known to be subjected to allosteric effects by metabolites such as aspartic acid, malic acid, ⁇ -ketoglutarate (2-oxoglutarate), and the enzyme activity is inhibited. , this inhibition of enzymatic activity is called “feedback inhibition” (Chen Z, et al., Appl Environ Microbiol. 2014 Feb;80(4):1388-93.; Wada M, et al., J Biosci 2016 Feb; 121(2):172-7.; Yano M, et al., Eur J Biochem. 1997 Jul 1;247(1):74-81.).
  • the "modified phosphoenolpyruvate carboxylase activity" is compared to the corresponding wild-type microorganism or the wild-type phosphoenolpyruvate carboxylase possessed by the microorganism, while exhibiting phosphoenolpyruvate carboxylase activity, the enzyme It is defined by the enzymatic properties of significantly reduced feedback inhibition by aspartate in activity.
  • exogenous phosphoenolpyruvate carboxylase activity that is more resistant to feedback inhibition by aspartate than the wild-type phosphoenolpyruvate carboxylase activity exhibited by the wild-type microorganism is defined below. That is, the above terms refer to wild-type phosphoenolpyruvate carboxylase possessed by a wild-type microorganism corresponding to the species to which the genetically modified microorganism belongs or a wild-type microorganism used as a starting material for producing the genetically modified microorganism. It means an exogenous phosphoenolpyruvate carboxylase activity that is more resistant to feedback inhibition by aspartate compared to "resistance to feedback inhibition by aspartate" shown.
  • exogenous phosphoenolpyruvate carboxylase activity can be conferred by a heterologous phosphoenolpyruvate carboxylase possessed by a strain strain or organism species different from the "corresponding wild-type host microorganism".
  • biological species different from the wild-type host microorganism includes various biological species such as microorganisms (eg, fungi, prokaryotes such as archaea and bacteria), plants, and animals such as mammals.
  • imparting "exogenous phosphoenolpyruvate carboxylase activity” is more specifically achieved by introducing a nucleic acid encoding a PEPC gene isolated from "a strain strain or species different from the wild-type host microorganism”. can.
  • Satisfaction of condition (V) is not particularly limited, but can be realized in the following manner. That is, by introducing amino acid mutations by genetic engineering techniques into the protein sequences of wild-type phosphoenolpyruvate carboxylase retained by various microorganisms, while maintaining the "phosphoenolpyruvate carboxylase activity", the "wild-type A gene encoding a mutant enzyme that has acquired "resistance to feedback inhibition by aspartic acid in phosphoenolpyruvate carboxylase activity" can be artificially produced.
  • base substitution techniques such as random mutagenesis by error-prone PCR or PCR-based site-directed mutagenesis using mutagenic primers may be utilized.
  • a molecular evolution technique such as DNA shuffling to wild-type PEPC-encoding DNAs of multiple species, more dominant mutant PEPCs may be produced.
  • a genetically modified microorganism that satisfies (V) can be produced by introducing the nucleic acid encoding the mutant PEPC obtained as described above into various microorganisms. More specifically, a nucleic acid encoding a mutant PEPC may be introduced into various microorganisms in a form capable of expressing the mutant PEPC.
  • gene expression systems suitable for each microbial species have already been established for many microbial species including coryneform bacteria.
  • those known techniques may be used to introduce the mutant PEPC into the microorganism.
  • Gene recombination technology and gene expression system technology may be independently developed, and these technologies may be used to introduce mutant PEPC into microorganisms.
  • mutant PEPC that satisfies (V) above is not particularly limited, it is preferably a mutant enzyme obtained by introducing a predetermined mutation into a wild-type PEPC derived from bacteria.
  • Such mutant PEPC is a mutant enzyme obtained by introducing a predetermined mutation into a wild-type PEPC preferably derived from a coryneform bacterium, more preferably a bacterium belonging to the genus Corynebacterium.
  • Table 12 lists examples of PEPCs derived from bacteria that can be used.
  • mutant PEPC that satisfy condition (V) include, for example, the following embodiments (i) and (ii).
  • the range of "one or more” is, for example, 1 to 100, 1 to 50, 1 to 30, preferably at least 2 or more, 2 to 20, more preferably 2 to 10, and even more Preferably 2 to 5, particularly preferably 2 to 4, 2 to 3, for example 2.
  • a chimeric PEPC constructed by combining parts of the amino acid sequences of two or more wild-type PEPCs.
  • a nucleic acid encoding a bacterial-derived mutant phosphoenolpyruvate carboxylase is introduced in a form capable of expressing the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase.
  • the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase has at least one amino acid mutation that satisfies condition (V) for the genetically modified microorganism.
  • the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase is preferably a mutant PEPC derived from a coryneform bacterium, a bacterium belonging to the genus Corynebacterium, or a bacterium belonging to the genus Escherichia, and more preferably a mutant PEPC derived from a bacterium belonging to the genus Corynebacterium.
  • a variant PEPC derived from Corynebacterium glutamicum is particularly preferred.
  • the at least one amino acid mutation in the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase is at least selected from the group consisting of the following (a) to (f) based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 Contains a single amino acid substitution.
  • amino acids shown in (a) to (f) above are intended to specify amino acid substitution sites in the PEPC amino acid sequence to be mutated based on the amino acids contained in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2. That is, the "corresponding amino acid" in (a) to (f) above is, more specifically, ClustalW or ClustalX (Bioinformatics, Vol. 23, Issue 21, November 2008, pp. 2947-2948; Bioinformatics, Volume 23, Issue 21, 1, November 2007, pp2947-2948), etc., based on the identity of the PEPC amino acid sequence to be mutated with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Amino acids that are aligned one-to-one with the amino acids shown in (a) to (f) above when alignment (pairwise alignment) is performed.
  • the "amino acid corresponding to the 299th aspartic acid” in (a) above is aspartic acid (D) in all of the nine wild-type PEPCs belonging to the genus Corynebacterium, and Arthrobacter, a type of coryneform bacterium. threonine (T) in the wild-type PEPC of the globiformis NBRC12137 strain, and glutamic acid (E) in the wild-type PEPC of the Escherichia coli K-12 strain.
  • the "amino acid corresponding to the 653rd lysine" in (b) above is C. elegans for nine wild-type PEPCs belonging to the genus Corynebacterium. arginine (R) in C.
  • the "amino acid corresponding to the 813th lysine” in (c) above is the same as the lysine (K) in the standard sequence in all bacterial strains.
  • the "amino acid corresponding to the 869th serine” in (d) above is the same as the serine (S) in the standard sequence in all bacterial strains.
  • the “amino acid corresponding to the 873rd arginine” in (e) above is the same as the arginine (R) in the standard sequence in all bacterial strains.
  • amino acid corresponding to the 917th asparagine in (f) above is C.I. threonine (T) in C. ammoniagenes; doosanense, it is the valine (V), and in all other strains it is identical at the asparagine (N) in the canonical sequence.
  • T C.I. threonine
  • doosanense it is the valine (V)
  • N valine
  • amino acid notation for amino acid notation, for example, "aspartic acid at position 299” is expressed as "D299” using the one-letter code for amino acids, and "amino acid substitution of aspartic acid at position 299 with asparagine” is expressed as "D299N". It is sometimes expressed as Other amino acids and amino acid substitutions can be designated in a similar fashion.
  • the at least one amino acid mutation in the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase is at least one selected from the group consisting of (g) to (l) below based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 containing amino acid substitutions of (g) amino acid substitution of the amino acid corresponding to aspartic acid at position 299 to asparagine; (h) amino acid substitution of the amino acid corresponding to lysine at position 653 to serine; (i) amino acid substitution of the amino acid corresponding to lysine at position 813 with a predetermined amino acid (provided that the amino acid after substitution shall not be lysine, and is preferably amino acid substitution with glycine or serine); (j) amino acid substitution of the amino acid corresponding to serine at position 869 to glycine; (k) amino acid substitution of the amino acid corresponding to arginine at position 873 to glycine; preferably amino acid substitutions to alanine, phenylalanine, g
  • the at least one amino acid mutation in the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase is an amino acid substitution shown in (g) above and at least one of the amino acid substitutions shown in (h) to (l) above. Including one.
  • the at least one amino acid mutation in the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase comprises at least one of the amino acid substitutions shown in (g) above and the amino acid substitutions shown in (i) to (l) above. including one.
  • the at least one amino acid mutation in the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase comprises the amino acid substitution shown in (g) above and the amino acid substitution shown in (i) or (l) above.
  • the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase may be a mutant PEPC having an amino acid sequence shown in any one of (A) to (C) below.
  • A an amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 2 to 13 (preferably SEQ ID NOs: 2 to 12, more preferably SEQ ID NOs: 2 to 11), selected from the group consisting of (a) to (l) above Amino acid sequence introduced with at least one amino acid substitution (provided that the amino acid before substitution and the amino acid after substitution are different);
  • B An amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and/or added in the amino acid sequence defined in (A) above (provided that at least one amino acid substitution is maintained. );
  • C an amino acid sequence having at least 60% sequence identity to the amino acid sequence defined in (A) above, provided that at least one amino acid substitution is maintained.
  • the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase may be a mutant PEPC having an amino acid sequence shown in any one of (D) to (F) below.
  • D In the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOS: 2-13 (preferably SEQ ID NOS: 2-12, more preferably SEQ ID NOS: 2-11), the amino acid substitution shown in (g) above and the above (h ) to (l) introduced with at least one amino acid substitution (provided that the amino acid before the substitution and the amino acid after the substitution are different);
  • E an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and/or added in the amino acid sequence defined in (D) above (provided that each amino acid substitution is maintained);
  • F An amino acid sequence having at least 60% sequence identity to the amino acid sequence defined in (D) above, provided that each amino acid substitution above is maintained.
  • the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase may be a mutant PEPC having an amino acid sequence shown in any one of (G) to (I) below.
  • G In the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOS: 2-13 (preferably SEQ ID NOS: 2-12, more preferably SEQ ID NOS: 2-11), the amino acid substitution shown in (g) above, and the above (i ) to (l) introduced with at least one amino acid substitution (provided that the amino acid before the substitution and the amino acid after the substitution are different);
  • H an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and/or added in the amino acid sequence defined in (G) above (provided that each amino acid substitution is maintained);
  • I an amino acid sequence having at least 60% sequence identity with the amino acid sequence defined in (G) above (provided that each of the above amino acid substitutions is maintained);
  • the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase may be a mutant PEPC having an amino acid sequence shown in any one of (J) to (L) below.
  • J In the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOS: 2-13 (preferably SEQ ID NOS: 2-12, more preferably SEQ ID NOS: 2-11), the amino acid substitution shown in the above (g), and the above (i ) or an amino acid sequence introduced with the amino acid substitution shown in (l) (however, the amino acid before the substitution and the amino acid after the substitution shall be different);
  • K An amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, and/or added to the amino acid sequence defined in (J) above (provided that each amino acid substitution is maintained);
  • L an amino acid sequence having at least 60% sequence identity with the amino acid sequence defined in (J) above (provided that each of the above amino acid substitutions is maintained);
  • the range of "one or more” is, for example, 1 to 100, 1 to 50, 1 to 30, preferably 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, more preferably 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2 is one.
  • "at least 60%” is preferably at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 85%, 90%, 91% %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%.
  • any one of SEQ ID NOS: 2-13 (preferably SEQ ID NOS: 2-12, more preferably SEQ ID NOS: 2-11)" Particularly preferred are embodiments in which "sequence” is read as "amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2" (ie, the wild-type PEPC amino acid sequence of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 strain).
  • the mutant PEPC having the amino acid sequence specified in any of (A) to (L) above retains phosphoenolpyruvate carboxylase activity and satisfies condition (V). There is no change in one thing.
  • the genetically modified microorganism contains, for example, aspartate dehydrogenase (AspDH, EC 1.4.1.21), aspartate aminotransferase (AspC, EC 2.6.1.1), and The above-mentioned aspartate ammonia lyase (AspA, EC 4.3.1.1) and the like may be enhanced, and genes encoding these enzymes are additionally introduced to enhance the activity of these enzymes.
  • Enzyme genes to be introduced into coryneform bacteria include, for example, enzyme genes disclosed in JP-A-2010-183860, JP-A-2016-516435, and the like. The disclosure content of these prior art documents is also incorporated herein.
  • genetically modified microorganisms appropriately adopting each of the above-described embodiments, starting substrates such as sugars can be used more efficiently to produce aspartic acid (particularly L-aspartic acid) or derivatives thereof. As a result, a significant improvement in production efficiency of aspartic acid or its derivatives can be expected. Therefore, the genetically modified microorganism of each of the above embodiments can be used to produce aspartic acid or derivatives thereof.
  • the term “derivative of aspartic acid” refers to a compound produced by metabolism of aspartic acid in cells of a genetically modified microorganism. Derivatives of aspartic acid include ⁇ -alanine. ⁇ -alanine is a compound produced by decarboxylation of L-aspartic acid. The reaction is catalyzed by aspartate-1-decarboxylase.
  • the genetically modified microorganism of this aspect is characterized in that it produces less by-products than the corresponding wild-type microorganism or the genetically modified microorganism that does not satisfy the conditions (I) and/or conditions (II). have Therefore, an aspartic acid composition or an aspartic acid derivative composition in which the content of by-products is reduced can be obtained. Therefore, the purification cost of aspartic acid or its derivatives can be reduced, and the risk of adverse effects due to by-products when used as industrial raw materials is reduced.
  • By-products include, for example, organic acids and amino acids other than aspartic acid or amino acids other than aspartic acid and its derivatives.
  • Organic acids as by-products include, for example, lactic acid, succinic acid, malic acid, citric acid, cis-ascotic acid, D-isocitric acid, ⁇ -ketoglutaric acid, and succinyl CoA.
  • Amino acids as by-products include, for example, glutamic acid and alanine.
  • By-products that are reduced in the genetically modified microorganism of this aspect particularly include at least one selected from the group consisting of lactic acid, succinic acid, malic acid, glutamic acid, and alanine.
  • the genetically modified microorganism of this aspect has reduced production of lactic acid and alanine compared to the corresponding wild-type microorganism or the genetically modified microorganism that does not satisfy the conditions (I) and/or conditions (II). It is preferable that the amount of production of all lactic acid, succinic acid, malic acid, glutamic acid, and alanine is reduced.
  • a second aspect of the present invention is a method for producing aspartic acid or a derivative thereof, including (p) and (q) below. (p) producing aspartic acid or a derivative thereof using the cell of the genetically modified microorganism according to the first aspect or a processed cell thereof; and (q) recovering the aspartic acid or derivative thereof.
  • aspartic acid or a derivative thereof may be produced by culturing the genetically modified microorganism according to the first aspect under aerobic conditions in which it can grow substantially. Under aerobic conditions, in coryneform bacteria, metabolism proceeds clockwise through the TCA cycle shown in FIG. Therefore, in the genetically modified microorganism according to the first aspect, the amount of oxaloacetate accumulated increases, and the production of aspartic acid or a derivative thereof can proceed efficiently.
  • E. Microorganisms such as bacteria of the genus Escherichia such as E. coli and coryneform bacteria do not grow substantially in a medium or reaction solution under reducing conditions, and their specific metabolic system functions under reducing conditions. Therefore, when the coryneform bacterium or its treated cell body is allowed to react in the medium or reaction solution under reducing conditions, it becomes possible to eliminate the waste of the nutrient source due to the growth and division of the bacterial cell, and the asparagine of the nutrient source can be eliminated. Conversion efficiency to acid can be improved.
  • the genetically modified microorganism according to the first aspect satisfies condition (I) and/or condition (II), and optionally any or all of conditions (III) to (VII). Therefore, it is expected that the efficiency of conversion to aspartic acid, which is a nutrient source, will be significantly improved.
  • the reaction proceeds under reducing conditions where microorganisms do not grow substantially, generation of fermentation heat can be prevented compared to bioprocesses under aerobic conditions involving cell division/proliferation, and sufficient aeration during culture no longer need to ensure Therefore, it is possible to simplify the facilities and reduce the energy required for the bioprocess, which is friendly to the global environment and leads to cost reduction.
  • asparagine is obtained by reacting the cells of the genetically modified microorganism or the processed cells thereof in the reaction medium (X) under reducing conditions in which the genetically modified microorganism does not substantially grow. Acids or derivatives thereof may be produced.
  • step (p') The method according to this aspect comprises, prior to step (p), (p') pre-cultivating and growing the genetically modified microorganism under aerobic conditions in a predetermined medium (Y); The cells of the genetically modified microorganism grown in step (p') or the processed cells thereof may be subjected to step (p).
  • Embodiments including step (p') are also envisaged in embodiments relating to substance production under aerobic conditions, but in particular It is preferably applied when substance production is carried out in the reaction medium (X).
  • the genetically modified microorganism is grown to a certain extent in advance under aerobic conditions, and then, in the step (p), a sufficient amount of the grown genetically modified microorganism is added to the genetically modified microorganism. This is because if substance production proceeds in the reaction medium (X) in which microorganisms do not substantially grow, efficient substance production can be achieved using the genetically modified microorganisms as if they were chemical catalysts.
  • the genetically modified microorganism may optionally be recovered from the reaction medium (X) after substance production in the reaction medium (X) and reused in the reaction of the step (p) after the second cycle. It is possible. Specific configurations and elements that can be employed in these steps will be described in detail below in the order of step (p'), step (p), and step (q).
  • the medium (Y) is not particularly limited, and may be appropriately selected and used according to the type of genetically modified microorganism used in the method. Specifically, as the medium (Y), a natural medium or a synthetic medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, other nutrients, and the like can be used. Components contained in the medium are, for example, as follows.
  • carbon sources include carbohydrates, more specifically carbon-containing substances such as sugars including polysaccharides and monosaccharides, and various materials containing these. Examples include the following components. monosaccharides such as glucose, fructose, mannose, xylose, arabinose and galactose; disaccharides such as sucrose, maltose, lactose, cellobiose, xylobiose and trehalose; polysaccharides such as cellulose, starch, glycogen, agarose, pectin and alginic acid; molasses), etc.; non-edible agricultural waste such as rice straw, forest residue, bagasse, corn stover and non-edible biomass (resources made from non-edible herbaceous and woody plants); switchgrass, napia Saccharified solutions containing multiple sugars such as glucose and xylose obtained by saccharifying energy crops such as grass and miscanthus with saccharifying enzymes; sugar alcohols such as mannitol
  • Nitrogen sources include inorganic or organic ammonium compounds such as ammonium carbonate ((NH 4 ) 2 CO 3 ), ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate and ammonium acetate; urea; aqueous ammonia; inorganic or organic nitric compounds such as sodium nitrate and potassium nitrate. etc. can be used.
  • inorganic or organic nitric compounds such as sodium nitrate and potassium nitrate. etc.
  • corn steep liquor, meat extract, protein hydrolysates (casamino acids, tryptones, peptones, NZ-amines, etc.), nitrogen-containing organic compounds such as amino acids, and the like can also be used.
  • a nitrogen source can be used individually by 1 type or in combination of 2 or more types.
  • the concentration of the nitrogen source in the medium may be appropriately adjusted according to conditions such as the type and properties of the genetically modified microorganism to be employed and the type of nitrogen compound, and is not particularly limited, but may be, for example, about 0. .1-10% (w/v).
  • Inorganic salts include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium sulfate (hydrate), sodium chloride, iron (II) sulfate heptahydrate, ferrous nitrate, manganese sulfate, zinc sulfate, cobalt sulfate, Calcium carbonate etc. are mentioned.
  • An inorganic salt can be used individually by 1 type or in mixture of 2 or more types.
  • the concentration of inorganic salts in the medium may be appropriately adjusted according to conditions such as the type and properties of the genetically modified microorganism to be employed, and the type of inorganic salts, and is not particularly limited, but may be, for example, about 0. .01-1% (w/v).
  • Other nutritional substances include meat extract, peptone, polypeptone, yeast extract, dry yeast, corn steep liquor, skimmed milk powder, defatted soybean hydrochloric acid hydrolyzate, extracts of animals, plants or microbial cells, and decomposition products thereof.
  • concentration of other nutrient substances in the medium may be appropriately adjusted according to conditions such as the type and properties of the genetically modified microorganism and the type of nutrient substance, and is not particularly limited, but is, for example, about 0.00. It can be 1-10% (w/v).
  • Vitamins can also be added to the medium (Y) as needed.
  • vitamins include biotin, thiamine (vitamin B1), pyridoxine (vitamin B6), pantothenic acid, and inositol.
  • an antifoaming agent such as a silicone antifoaming agent or a polyether antifoaming agent may be added. good.
  • the pH of the medium (Y) is not particularly limited as long as the genetically modified microorganism to be employed can grow, but about 6-8 is preferable.
  • the medium (Y) is A medium (Inui, M. et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)), BT medium ( Omumasaba, C.A. et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol.
  • the cells or the processed cells may be obtained and subjected to the step (p).
  • the conditions for culturing the genetically modified microorganism may be set as appropriate so that the genetically modified microorganism can grow sufficiently and a sufficient amount of cells or treated cells thereof can be obtained.
  • the culture temperature can be about 25° C. to 38° C.
  • the culture time can be about 12 hours to 48 hours.
  • the step (p) is carried out by inoculating a solid medium once, and colonies or the like whose growth has been confirmed in the solid medium are further inoculated into the medium (Y) described above.
  • a genetically modified microorganism to be tested can be prepared.
  • step (p) Aspartic acid or a derivative thereof is produced using the cells of the genetically modified microorganism or the processed cells thereof.
  • step (p′) after culturing and growing the genetically modified microorganism in medium (Y), without recovering or separating the genetically modified microorganism from medium (Y), the The medium (Y) containing the genetically modified microorganism may be directly subjected to the step (p).
  • the medium (Y) containing the genetically modified microorganism obtained in the step (p') is optionally added with a carbon source (saccharide), a nitrogen source, inorganic salts, vitamins, a reducing agent, etc. may be added and subjected to step (p).
  • the genetically modified microorganism cultured and grown in the medium (Y) in the step (p') is separated and recovered from the medium (Y), and the obtained microbial cells themselves are used in the step ( p).
  • the treated cells obtained by subjecting the cells to a predetermined physical or chemical treatment may be subjected to step (p).
  • Techniques for separating and recovering genetically modified microorganisms from the medium (Y) include, for example, centrifugation, separation using various filters, and decantation.
  • the "processed microbial cell” is not particularly limited as long as the production reaction of aspartic acid or a derivative thereof in step (p) can be realized, but for example, the collected microbial cells are treated with various chemicals.
  • Material Examples include those obtained by immobilizing the collected cells on carriers such as acrylamide, carrageenan, and other appropriate polymers.
  • Reaction medium (X) may be used when step (p) is carried out under reducing conditions in which the genetically modified microorganism does not substantially grow.
  • the composition of the reaction medium (X) realizes a reaction medium (X) under reducing conditions in which the genetically modified microorganism does not substantially grow and the reaction for producing aspartic acid by the genetically modified microorganism proceeds.
  • the reaction medium (X) contains, for example, a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc., and may be a natural one derived from a living organism or the like, or an artificially synthesized one.
  • Components contained in the reaction medium (X) are, for example, as follows.
  • carbon sources include carbohydrates, more specifically sugars including polysaccharides and monosaccharides, and various materials containing these, such as the following components.
  • monosaccharides such as glucose, fructose, mannose, xylose, arabinose, galactose
  • disaccharides such as sucrose, maltose, lactose, cellobiose, xylobiose, trehalose
  • polysaccharides such as cellulose, starch, glycogen, agarose, pectin, alginic acid
  • molasses molasses
  • non-edible agricultural waste such as rice straw, forest residue, bagasse, corn stover and non-edible biomass (resources made from non-edible herbaceous and woody plants)
  • switchgrass Saccharified solutions containing multiple sugars such as glucose and xylose obtained by saccharifying energy crops such as Napier grass and miscanthus with saccharifying enzymes
  • sugar alcohols such as mannito
  • a carbon source can be used individually by 1 type or in combination of 2 or more types.
  • the concentration of the carbon source in the reaction medium (X) is preferably about 1-20% (w/v), more preferably about 2-10% (w/v), and about 2-5% (w/v). is even more preferred.
  • the concentration of sugars in the reaction medium (X) is, for example, about 1-20% (w/v), more preferably about 2-10% (w/v), even more preferably about 2-5% (w/v ).
  • Nitrogen sources include inorganic or organic ammonium compounds such as ammonium carbonate ((NH 4 ) 2 CO 3 ), ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium acetate; urea; aqueous ammonia; inorganic or organic compounds such as sodium nitrate and potassium nitrate. Nitrate compounds can be used. Nitrogen-containing organic compounds such as corn steep liquor, meat extract, peptone, NZ-amine, protein hydrolysates, and amino acids can also be used. A nitrogen source can be used individually by 1 type or in combination of 2 or more types. The concentration of the nitrogen source in the reaction solution may be appropriately adjusted according to conditions such as the type of genetically modified microorganism to be used, the reaction conditions, and the type of nitrogen compound, and is not particularly limited. .1-10% (w/v).
  • Inorganic salts include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium sulfate (hydrate), sodium chloride, iron (II) sulfate heptahydrate, ferrous nitrate, manganese sulfate, zinc sulfate, cobalt sulfate, Calcium carbonate etc. are mentioned.
  • Inorganic salts can be used singly or in combination of two or more.
  • the concentration of the inorganic salt in the reaction solution may be appropriately adjusted according to conditions such as the type of genetically modified microorganism to be used, the reaction conditions, and the type of inorganic salt. It can be 01-1% (w/v).
  • Vitamins can be added to the reaction medium (X) as necessary.
  • vitamins include biotin, thiamine (vitamin B1), pyridoxine (vitamin B6), pantothenic acid, and inositol.
  • the pH of the reaction medium (X) is not particularly limited as long as the reaction to produce aspartic acid proceeds. .5 to 8.0, for example around 7.5.
  • Specific examples of the basic composition of the reaction medium (X) include the above-mentioned BT medium and the like.
  • the reaction medium (X) can be prepared by appropriately adjusting the concentration of salts, the concentration of vitamins, and the like.
  • Reducing conditions under which the genetically modified microorganism does not substantially grow means, taken literally, that the reaction medium is in a reducing state to the extent that the genetically modified microorganism does not substantially grow, but more specifically may be defined by the redox potential of the reaction medium.
  • the oxidation-reduction potential of the reaction medium (X) is preferably from about -200 mV to -500 mV, more preferably from about -250 mV to -500 mV, and even more preferably from -300 to 400 mmV.
  • the redox potential of the reaction medium (X) can be measured using a redox potentiometer. Since there are commercially available redox potentiometers, these commercially available products may be used to measure the redox potential of the reaction medium (X).
  • the reduction state of the reaction medium (X) can be easily estimated with a resazurin indicator (color changes from blue to colorless if it is in a reduced state). For example, it may be measured using BROADLEY JAMES, ORP Electrodes).
  • the method for preparing the reaction medium (X) under reducing conditions is not particularly limited and various techniques can be used.
  • the following known technique for preparing an aqueous solution for the reaction liquid can be used can. That is, as the solvent for the reaction medium (X), an aqueous reaction liquid solution may be used instead of distilled water or the like.
  • the method for preparing the aqueous solution for the reaction solution is, for example, the method for preparing the culture solution for obligate anaerobic microorganisms such as sulfate-reducing microorganisms (Pfennig, N.
  • distilled water or the like is subjected to heat treatment or pressure reduction treatment to remove the dissolved gas, whereby the aqueous solution for the reaction liquid under reducing conditions can be obtained.
  • under reduced pressure of about 10 mmHg or less, preferably about 5 mmHg or less, more preferably about 3 mmHg or less, for about 1 to 60 minutes, preferably about 5 to 40 minutes, dissolution by treating with distilled water or the like.
  • Gases, particularly dissolved oxygen can be removed to prepare an aqueous reaction solution under reducing conditions (anaerobic conditions).
  • a suitable reducing agent eg, thioglycolic acid, ascorbic acid, cysteine hydrochloride, mercaptoacetic acid, thiolacetic acid, glutathione, sodium sulfide, etc.
  • An appropriate combination of these methods is also a method for preparing an aqueous solution for a reaction solution under effective reducing conditions.
  • reaction medium (X) It is preferable to maintain the reaction medium (X) in a reducing state during the reaction in step (p).
  • a method of enclosing with an inert gas, carbon dioxide gas, or the like As a method of preventing oxygen contamination more effectively, in order to efficiently function the metabolic function in the cells of aerobic bacteria during the reaction, the addition of a pH maintenance adjustment solution to the reaction system and the appropriate addition of various nutrient solutions. In such cases, it is effective to remove oxygen from the additive solution in advance.
  • the medium (Y) in which the genetically modified microorganism has grown in the step (p') is subjected to the predetermined operation and/or a reducing agent is added.
  • the medium (Y) adjusted to satisfy reducing conditions under which the genetically modified microorganism does not substantially grow may be used as the reaction medium (X) in step (p).
  • the reaction temperature in step (p) is not particularly limited as long as it is within a range that produces aspartic acid or a derivative thereof, and may be appropriately set according to the properties of the genetically modified microorganism to be employed. Typically, it is about 20 to 50°C, preferably about 25 to 47°C, more preferably about 27 to 37°C. Within this temperature range, aspartic acid or a derivative thereof can be efficiently produced. .
  • the reaction time may be appropriately adjusted so as to obtain aspartic acid or a derivative thereof, and is not particularly limited. From the point of view, it is preferably about 1 hour to about 3 days, and can be, for example, about 1 hour to 48 hours.
  • the reaction can be batch, fed-batch, or continuous. Among them, a batch system is preferable.
  • Step (p) may be performed under low dissolved oxygen concentration conditions.
  • Low dissolved oxygen concentration conditions include, for example, a dissolved oxygen concentration of 0.5 mg/L or less.
  • Low dissolved oxygen concentration conditions include a dissolved oxygen concentration of 0.4 mg/mL or less, 0.35 mg/mL or less, 0.3 mg/mL or less, or 0.25 mg/mL or less.
  • the range of dissolved oxygen concentration under low dissolved oxygen concentration conditions is, for example, 0.001 to 0.5 mg/L, 0.01 to 0.4 mg/L, 0.05 to 0.3 mg/L, 0.05 to 0.25 mg/L, 0.05-0.2 mg/L, or 0.1-0.2 mg/L.
  • the low dissolved oxygen concentration condition may be defined by a relative value to the saturated dissolved oxygen concentration.
  • the dissolved oxygen concentration may have a relative value of 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, or 5 or less when the saturated dissolved oxygen concentration is 100.
  • the dissolved oxygen concentration under the low dissolved oxygen concentration condition has a relative value of 0.1 to 10, 0.5 to 9, 0.5 to 8, 0.5 to 7, 0.5 to 0.5 to 0.5 to 0.5 to 0.5 when the saturated dissolved oxygen concentration is 100. It may range from 5-6, 0.5-5, 0.5-4, or 1-3.
  • the saturated dissolved oxygen concentration means the saturated concentration of oxygen dissolved in the reaction medium at 1 atmospheric pressure and reaction temperature. At 1 atm and reaction temperature, the reaction medium is aerated, the dissolved oxygen concentration is measured with a dissolved oxygen sensor (DO sensor), and the value when the dissolved oxygen concentration is stabilized can be adopted as the saturated dissolved oxygen concentration.
  • DO sensor dissolved oxygen sensor
  • aspartic acid is produced by reacting the genetically modified microorganism or its treated cells in the reaction medium (X′) having a low dissolved oxygen concentration.
  • the redox potential of the reaction medium (X') with low dissolved oxygen concentration can be about -200 mV to -500 mV. Therefore, the reaction under low dissolved oxygen conditions can also be said to be a reaction under reducing conditions.
  • the reaction medium (X') used under low dissolved oxygen conditions may be the same as the reaction medium (X) used under reducing conditions described above.
  • the redox potential of the reaction medium (X') is preferably about -250 mV to -500 mV, more preferably -300 to 400 mmV.
  • the composition of the reaction medium (X') is not particularly limited as long as it promotes the production reaction of aspartic acid or its derivatives by the genetically modified microorganism.
  • the reaction medium (X′) contains, for example, a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc., and may be a natural one derived from a living organism or the like, or an artificially synthesized one. Examples of the carbon source, nitrogen source, and inorganic salts include those similar to the reaction medium (X).
  • the reaction medium (X') may be the reaction medium (X) excluding the reducing agent.
  • the reaction medium (X') may contain an antibiotic that inhibits the growth of the genetically modified microorganism as long as it does not inhibit the production reaction of aspartic acid by the genetically modified microorganism.
  • antibiotics include chloramphenicol and the like.
  • the pH of the reaction medium (X′) is not particularly limited as long as the reaction to produce aspartic acid or a derivative thereof proceeds, but is generally preferably about 6.0 to 8.5. More preferably 6.5 to 8.5, for example around 8.
  • Specific examples of the basic composition of the reaction medium (X') include those containing a carbon source, a nitrogen source, and an antibiotic, and more specifically those containing glucose, ammonium sulfate, and chloramphenicol. mentioned.
  • the reaction temperature is not particularly limited, but can be, for example, 15 to 50°C, preferably 20 to 47°C, more preferably 20 to 37°C, still more preferably 20 to 30°C.
  • the reaction time is not particularly limited, but can be, for example, about 1 hour to about 7 days, preferably about 1 hour to about 3 days, more preferably about 1 hour to 48 hours.
  • the reaction can be batch, fed-batch, or continuous. Among them, the fed-batch method is preferable.
  • stirring and/or aeration may be performed in order to consume the NADH that accumulates in the cells or treated cells during the reaction.
  • the stirring speed is not particularly limited, but can be, for example, 100 to 800 rpm, preferably 200 to 600 rpm, more preferably 300 to 500 rpm.
  • the aeration rate is not particularly limited. can be done.
  • the dissolved oxygen concentration of the reaction medium (X') can be measured using a dissolved oxygen meter.
  • the oxidation-reduction potential of the reaction medium (X') is preferably adjusted to be about -250 mV to -500 mV.
  • the redox potential of the reaction medium (X') can be measured using a redox potentiometer.
  • Step (p) may be performed under conditions of high density of the genetically modified microorganism.
  • Step (p) can be carried out under high density conditions, both under reducing conditions and under low dissolved oxygen conditions as described above.
  • “Conditions of high density of genetically modified microorganisms” means conditions in which genetically modified microorganisms are present at high density in reaction medium (X) or reaction medium (X′).
  • the cell turbidity at OD 610 in the reaction medium (X) or reaction medium (X') is adjusted to about 150 to 300, preferably about 200 to 250. be able to.
  • OD610 means the optical density of the bacterial fluid measured at a wavelength of 610 nm.
  • step (p) After completion of the reaction in step (p), the genetically modified microorganism or its treated bacterial cells are recovered from the reaction medium (X) or the reaction medium (X') by an appropriate operation such as centrifugation, and the recovered genetically modified microorganism Alternatively, the step (p) may be repeated multiple times by reusing the treated cells. Repeating the step (p) multiple times by reusing the genetically modified microorganism or its treated cells in this manner leads to a reduction in production costs and enables efficient production of aspartic acid.
  • step (q) After producing aspartic acid or a derivative thereof in step (p), aspartic acid or a derivative thereof is recovered in step (q).
  • the term "recovering aspartic acid or derivatives thereof” means recovering aspartic acid or derivatives thereof by collecting genetically modified microorganisms and/or culture media or reaction media containing aspartic acid or derivatives thereof. It is a concept that includes collection.
  • aspartic acid or a derivative thereof may be recovered by collecting a genetically modified microorganism and/or a culture medium or a reaction medium containing aspartic acid or a derivative thereof. Furthermore, aspartic acid or a derivative thereof from a culture medium or reaction medium containing aspartic acid or a derivative thereof (reaction medium (X), reaction medium (X′), etc.), genetically modified microbial cells, or a processed product thereof may be separated and/or purified to recover aspartic acid or a derivative thereof.
  • reaction medium (X), reaction medium (X′), etc. genetically modified microbial cells, or a processed product thereof
  • the process for separating and purifying aspartic acid or a derivative thereof includes the required purity, etc., in consideration of the use of the aspartic acid or a derivative thereof.
  • Appropriate separation/purification techniques may be employed depending on the Examples include, but are not limited to, various crystallization methods; various filtration techniques such as ultrafiltration; various chromatographies such as ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, and reversed-phase chromatography; Techniques; concentration method; dialysis; and activated carbon adsorption method can be appropriately combined to recover aspartic acid or its derivatives.
  • the method according to this aspect may optionally further comprise steps such as washing, drying, crushing, pulverizing or granulating and/or packaging the aspartic acid or derivatives thereof.
  • aspartic acid or a derivative thereof is produced using the genetically modified microorganism according to the first aspect. Therefore, aspartic acid or a derivative thereof can be efficiently produced. Furthermore, the genetically modified microorganism according to the first aspect can reduce the amount of by-products (amino acids other than aspartic acid, organic acids, etc.) produced during the production of aspartic acid. More specifically, the production amount of at least one selected from the group consisting of lactic acid, succinic acid, malic acid, glutamic acid, and alanine can be reduced. Preferably, the amounts of lactic acid and alanine produced can be reduced. More preferably, the amount of production of all of lactic acid, succinic acid, malic acid, glutamic acid, and alanine can be reduced. References herein to "alanine” refer to " ⁇ -alanine" unless otherwise specified.
  • the corresponding wild-type microorganism or genetically modified microorganism that does not satisfy the condition (I) for lactic acid is used.
  • Reduce the relative production amount when the production amount of is 1 or less, 0.8 or less, 0.7 or less, 0.6 or less, 0.5 or less, 0.4 or less, or 0.3 or less can.
  • the corresponding wild-type microorganism or genetically modified microorganism that does not satisfy the condition (I) for succinic acid is used.
  • the relative production amount is 0.9 or less, 0.8 or less, 0.7 or less, 0.6 or less, 0.5 or less, 0.4 or less, 0.3 or less, or can be reduced to 0.2 or less.
  • the relative production amount when using a genetically modified microorganism that satisfies the condition (I), with respect to malic acid, when using a corresponding wild-type microorganism or genetically modified microorganism that does not satisfy the condition (I) Reduce the relative production amount when the production amount is 1 to 0.95 or less, 0.9 or less, 0.89 or less, 0.88 or less, 0.8 or less, 0.7 or less, or 0.6 or less obtain.
  • the relative production amount when the amount is 1 is 0.9 or less, 0.8 or less, 0.7 or less, 0.6 or less, 0.5 or less, 0.4 or less, 0.3 or less, or 0.2 can be reduced to In the method of this aspect, when using a genetically modified microorganism that satisfies the condition (I), with respect to alanine, production when using a corresponding wild-type microorganism or a genetically modified microorganism that does not satisfy the condition (I) The relative production amount when the amount is 1 is 0.95 or less, 0.9 or less, 0.89 or less, 0.88 or less, 0.87 or less, 0.85 or less, 0.84 or less, 0.8 or less , 0.7 or less, or 0.6 or less.
  • the method according to this aspect can reduce the amount of by-products produced, and thus can reduce the content of impurities mixed in aspartic acid or its derivatives. Therefore, the aspartic acid or its derivative obtained by the method according to this aspect can be suitably used as an industrial raw material.
  • aspartic acid or its derivatives obtained by the method according to this aspect are not particularly limited, but include, for example, medical uses, food uses, industrial uses, fuel uses, cosmetic uses, and the like.
  • Aspartic acid or derivatives thereof may be substances actually used in various applications, or may be intermediate raw materials for use in the production of final products.
  • Substantially free of other components means that the content of other components contained in the isolated component is negligible.
  • the content of other components contained in the isolated component is, for example, 10% by mass or less, 5% by mass or less, 4% by mass or less, 3% by mass or less, 2% by mass or less, 1% by mass or less, 0.5% by mass or less. It may be 5% by mass or less, or 0.1% by mass or less.
  • the proteins, nucleic acids, vectors, cells, and microorganisms described herein are isolated proteins, isolated nucleic acids, isolated vectors, isolated cells, and isolated microorganisms. could be. The content of each document referred to in this specification is hereby incorporated by reference as if constituting a part of this specification.
  • GES524/pGE333 strain International Publication No. 2020/208842
  • the GES524/pGE333 strain possesses a mutant ppc gene (ppc fbr ) having an amino acid substitution with a combination of D299N/K813S, and has three genes, the ldh gene, the sdhCAB gene and the poxB gene (pyruvic acid: quinone oxidoreductase). defective (Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ⁇ Idh ⁇ sdh ⁇ poxB pcc fbr ).
  • NC003450.3 of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain was obtained from NCBI. From the genomic sequence, the upstream region (876668-877667) and the downstream region (877827-878826) of the region (877668-877826) containing the gltA promoter P1 (P1gltA) were set as homologous regions.
  • the upstream region and downstream region of the gltA promoter P1 were each amplified by PCR.
  • Primers F1 and R1 were used for amplification of the upstream region.
  • Primers F2 and R2 were used for amplification of the downstream region.
  • Plasmid pGE015 is a plasmid in which the sacB gene is inserted into the BamHI/HindIII site of plasmid pHSG299 (Takara Bio) (International Publication No. 2020/208842). Plasmid pGE015 carries the kanamycin resistance gene and the sacB gene.
  • Plasmid ⁇ P1gltA was introduced into strain GES524/pGE333 by the electric pulse method (2500 V, 25 ⁇ F, 200 ⁇ ; Van der Rest et al. Appl. Microbiol Biotechnol 52, pp541-545, 1999).
  • the sample after the electric pulse method was A agar medium containing 25 ⁇ g/ml of kanamycin (composition in 1 L of medium: urea: 2 g, (NH 4 ) 2 SO 4 : 7 g, KH 2 PO 4 : 0.5 g, K 2 HPO 4 : 0.5 g , MgSO4.7H2O: 0.5 g, FeSO4.7H2O: 6 mg, MnSO4.nH2O : 4.2 mg, D - biotin: 200 ⁇ g , thiamine hydrochloride: 200 ⁇ g, yeast extract : 2 g, casamino acid: 7 g, glucose: 20 g, and agar: 16 g dissolved in 1000 ml of distilled water (pH 6.6), and cultured by a conventional method.
  • the plasmid ⁇ P1gltA Since the plasmid ⁇ P1gltA has a kanamycin resistance gene as a drug resistance marker, in the growing strain grown on the A agar medium containing kanamycin, the plasmid ⁇ P1gltA undergoes one-point homologous recombination with P1gltA on the chromosome, It is a strain integrated into genomic DNA together with the plasmid (see FIG. 2).
  • the growing strain thus obtained was applied to LB agar medium supplemented with 10% sucrose (composition in 1 L of medium: bactopeptone: 10 g, yeast extract: 5 g, sodium chloride: 10 g, agar: 16 g), and It was cultured according to the method.
  • a transformant that retains the SacB gene derived from the plasmid ⁇ P1gltA cannot survive on a medium supplemented with sucrose due to the production of toxic substances.
  • the transformant in which the region derived from the plasmid containing the sacB gene has been dropped by homologous recombination again can survive in a medium supplemented with sucrose. is obtained as a growing strain.
  • the form of the complete plasmid ⁇ P1gltA in which the whole plasmid region is dropped, reverts to the GES524/pGE333 strain phenotype which retains the P1 promoter of the gltA gene intact.
  • Primer F1 and primer R2 are primers designed at the 5' end of the region of about 1000 bp upstream of P1gltA and the 3' end of the region of about 1000 bp downstream of P1gltA. Therefore, if the strain lacks P1gltA, A DNA fragment of approximately 2 kb should be obtained. Therefore, DNA fragments obtained by colony PCR were subjected to agarose electrophoresis (Molecular Cloning, Sambrook et al., 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press), and colony cells confirmed to lack P1gltA were obtained as P1gltA-deficient strains. bottom.
  • K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 .7H 2 O: 0.5 g, FeSO 4 .7H 2 O: 6 mg, MnSO 4 .nH 2 O: 4.2 mg, D-biotin: 200 ⁇ g, thiamine hydrochloride: 200 ⁇ g, yeast extract: 2 g, casamino acid: 7 g, glucose: 20 g), and transferred to a plate (1.5% agar) and cultured overnight in a 33° C. incubator (Panasonic MIR-162PJ). The cells were scraped from the plate, transferred to a test tube containing 10 ml of A medium, and cultured at 33° C.
  • TITEC BR-43FL a shaking incubator
  • the entire amount of the cells in the test tube was transferred to a 500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of A medium, and further cultured at 33° C. and 200 rpm for 12 hours using a shaking incubator (TITEC BR-43FL).
  • Main culture of the cells was carried out using a 10 L jar (BMS-10NP4, ABLE). 6200 ml of water, 800 ml of molasses (Hokkaido Sugar Co., Ltd.), 7 g of KH 2 PO 4 , 5 g of MgSO 4 .7H 2 O, and 10 ml of antifoaming agent (CB-442, NOF) were placed in a vessel and autoclaved. 2 ml of a 50 mg/ml kanamycin solution and 100 ml of A medium were added to the total amount of the cells, and the culture was started.
  • the conditions for jar culture were as follows.
  • the medium components were removed by centrifugation (Beckman coulter Avanti J-26S) to obtain cells.
  • the cells were suspended in 200 ml of water, and water was further added so that the total volume of the cell suspension was 1 L.
  • the reaction is described in Bio Jr. 8 (ABLE) under the following conditions. 2M (NH 4 ) 2 CO 3 was used as the pH adjusting solution.
  • Table 14 shows the production of aspartic acid.
  • Table 15 shows the yield of aspartic acid per gram of glucose.
  • Table 16 shows the amounts of by-products produced.
  • Table 17 shows the amounts of by-products produced per 1 g of glucose.
  • the plasmid ⁇ odx was introduced into the GES524/pGE333 strain by the electric pulse method (2500 V, 25 ⁇ F, 200 ⁇ ; Van der Rest et al. Appl. Microbiol Biotechnol 52, pp541-545, 1999). After the electric pulse method, the sample was spread on an A agar medium containing 25 ⁇ g/ml of kanamycin and cultured by a conventional method.
  • the growth strain growing on the A agar medium containing kanamycin causes the plasmid ⁇ odx to undergo single-point homologous recombination with odx on the chromosome, and each plasmid It is a strain that integrates into genomic DNA.
  • the growing strain thus obtained was spread on LB agar medium supplemented with 10% sucrose and cultured by a conventional method.
  • odx-deficient strains were screened by colony PCR method from bacterial colonies obtained as strains growing on LB agar medium.
  • ⁇ Production of aspartic acid by odx-deficient strain> Cells were cultured and aspartic acid was produced in the same manner as ⁇ Production of aspartic acid by P1gltA-deficient strain> above, except that the P1gltA-deficient strain was replaced with an odx-deficient strain. It was confirmed that the odx-deficient strain increased the production and yield of aspartic acid compared to the odx-non-deficient strain (GES524/pGE333 strain). It was confirmed that the odx-deficient strain had reduced production and yield of alanine compared to the odx-non-deficient strain (GES524/pGE333 strain).

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

条件（Ｉ）及び（ＩＩ）からなる群より選択される少なくとも１つの条件を充足する、遺伝子組換え微生物：条件（Ｉ）前記遺伝子組換え微生物に対応する野生型微生物と比較して、クエン酸シンターゼ活性が低減され又は不活化されていること；及び条件（ＩＩ）前記野生型微生物と比較して、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ活性が低減され又は不活化されていること。

Description

遺伝子組換え微生物、及びアスパラギン酸を生産する方法
　本発明は、遺伝子組換え微生物、及びアスパラギン酸を生産する方法に関する。
　本願は、２０２１年１１月２６日に、日本に出願された特願２０２１－１９２３４４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年の環境意識の高まりから、石油由来原料に替えて、バイオ由来原料を用いることが試みられている。バイオ由来原料では、石油由来原料と比較して、収率が悪くコストが高くなる傾向がある。そのため、微生物等を用いて、低コストで高収率にバイオ由来原料を生産する技術が求められる。
　アスパラギン酸は、ポリマー化することで、紙おむつ用高分子吸収ポリマー、及び化粧品用増粘剤としての利用が検討されている。生物工学的手法によるアスパラギン酸の製造は、主に、フマル酸を原料として、アスパルターゼ活性を有する大腸菌の固定化菌体を用いたバイオリアクターにより行われる。フマル酸より安価なグルコースからアスパラギン酸を生産する技術についての報告は、数少ない。
　例えば、非特許文献１では、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）を欠失させることで、グルコースからのグルタミン酸生成量が増大するとともに、アスパラギン酸が生成されたことが報告されている。
Kazunori Sawada, Susumu Zen-in, Masaru Wada, Atsushi Yokota, Metabolic changes in a pyruvate kinase gene deletion mutant of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. Metabolic Engineering 12 (2010) 401-407.
　微生物発酵により、低コストでアスパラギン酸を製造するためには、アスパラギン酸の収率を向上させることが求められる。また、アスパラギン酸の精製コストの低減のためには、他のアミノ酸及び有機酸等の副生成物の生成量の低減が求められる。
　そこで、本発明は、アスパラギン酸若しくはその誘導体の生産量及び収率を向上させることができ、且つ副生成物（アスパラギン酸以外のアミノ酸、有機酸等）の生成量を低減することが可能な、遺伝子組換え微生物、及びアスパラギン酸若しくはその誘導体の生産方法を提供することを課題とする。
　本発明は、以下の態様を含む。
［１］下記の条件（Ｉ）及び（ＩＩ）からなる群より選択される少なくとも１つの条件を充足する、遺伝子組換え微生物：
　条件（Ｉ）前記遺伝子組換え微生物に対応する野生型微生物と比較して、クエン酸シンターゼ活性が低減され又は不活化されていること；及び
　条件（ＩＩ）前記野生型微生物と比較して、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ活性が低減され又は不活化されていること。
［２］さらに、下記条件（ＩＩＩ）～（ＶＩ）からなる群より選択される少なくとも１つの条件を充足する、［１］に記載の遺伝子組換え微生物：
　条件（ＩＩＩ）前記野生型微生物と比較して、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性又はフマル酸還元酵素活性が低減され又は不活化されていること；
　条件（ＩＶ）前記野生型微生物と比較して、乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低減され又は不活化されていること；
　条件（Ｖ）野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性におけるアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対し抵抗性を示す改変型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性、又は前記野生型微生物が示す野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性よりもアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性が高い外来性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有すること；及び
　条件（ＶＩ）前記野生型微生物と比較して、ピルビン酸：キノンオキシドレダクターゼ活性が低減され又は不活化されていること。
［３］上記条件（Ｉ）を充足する、［１］又は［２］に記載の遺伝子組換え微生物。
［４］グラム陽性細菌に属する遺伝子組換え微生物である、［１］～［３］のいずれか１つに記載の遺伝子組換え微生物。
［５］アスパラギン酸又はその誘導体を生産するための遺伝子組換え微生物である、［１］～［４］のいずれか１つに記載の遺伝子組換え微生物。
［６］前記条件（Ｉ）を充足しない微生物と比較して、アスパラギン酸以外のアミノ酸、及び有機酸からなる群より選択される少なくとも１種の副生成物の生成量が低下している、［５］に記載の遺伝子組換え微生物。
［７］（ｐ）［１］～［６］のいずれか１つに記載の遺伝子組換え微生物の菌体又はその菌体処理物を用いてアスパラギン酸又はその誘導体を生成させること；及び（ｑ）前記アスパラギン酸又はその誘導体を回収すること、を含む、アスパラギン酸又はその誘導体を生産する方法。
［８］前記（ｐ）を溶存酸素濃度が０．５ｍｇ／Ｌ以下である反応媒体中で行う、［７］に記載のアスパラギン酸又はその誘導体を生産する方法。
［９］前記条件（Ｉ）を充足しない微生物の菌体又はその菌体処理物を用いてアスパラギン酸を生産した場合と比較して、アスパラギン酸以外のアミノ酸、及び有機酸からなる群より選択される少なくとも１種の副生成物の生成量が低減される、［７］又は［８］に記載のアスパラギン酸又はその誘導体を生産する方法。
　本発明によれば、アスパラギン酸若しくはその誘導体の生産量及び収率を向上させることができ、且つ副生成物（アスパラギン酸以外のアミノ酸、有機酸等）の生成量を低減することが可能な、遺伝子組換え微生物、及びアスパラギン酸若しくはその誘導体の生産方法が提供される。
アスパラギン酸の生成に関与する代謝経路の一例を示す模式図である。Ｇｌｃ：グルコース、ＰＥＰ：ホスホエノールピルビン酸、Ｐｙｒ：ピルビン酸、Ａｃ－ＣｏＡ：アセチルＣｏＡ、Ａｃ：酢酸、Ｃｉｔ：クエン酸、α－ｋｅｔｏ：αケトグルタル酸、Ｆｕｍ：フマル酸、Ｍａｌ：Ｌ－リンゴ酸、ＯＡＡ：オキサロ酢酸、Ａｓｐ：アスパラギン酸、Ｌｄｈ：乳酸デヒドロゲナーゼ、ＰｏｘＢ：ピルビン酸：キノンオキシドレダクターゼ、Ｏｄｘ：オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ、Ｐ１ｇｌｔＡ：クエン酸シンターゼ遺伝子のプロモーターＰ１、Ｓｄｈ：コハク酸デヒドロゲナーゼ、ＡｓｐＡ：アスパラギン酸アンモニアリアーゼ、変異型Ｐｐｃ：ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ。 実施例で作製したＰ１ｇｌｔＡ欠損株の作製方法を示す模式図である。
＜遺伝子組換え微生物＞
　本発明の第１の態様は、下記の条件（Ｉ）及び（ＩＩ）からなる群より選択される少なくとも１つの条件を充足する、遺伝子組換え微生物である。
　条件（Ｉ）前記遺伝子組換え微生物に対応する野生型微生物と比較して、クエン酸シンターゼ活性が低減され又は不活化されていること；及び
　条件（ＩＩ）前記野生型微生物と比較して、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ活性が低減され又は不活化されていること。
　一実施形態において、遺伝子組換え微生物は、上記条件（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）に加えて、下記条件（ＩＩＩ）～（ＶＩ）からなる群より選択される少なくとも１つの条件を充足する。
　条件（ＩＩＩ）前記野生型微生物と比較して、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性又はフマル酸還元酵素活性が低減され又は不活化されていること；
　条件（ＩＶ）前記野生型微生物と比較して、乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低減され又は不活化されていること；
　条件（Ｖ）野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性におけるアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対し抵抗性を示す改変型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性、又は前記野生型微生物が示す野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性よりもアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性が高い外来性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有すること；及び
　条件（ＶＩ）前記野生型微生物と比較して、ピルビン酸：キノンオキシドレダクターゼ活性が低減され又は不活化されていること。
　一実施形態において、遺伝子組換え微生物は、上記条件（Ｉ）を充足する。
　一実施形態において、遺伝子組換え微生物は、上記条件（ＩＩ）を充足する。
　一実施形態において、遺伝子組換え微生物は、上記条件（Ｉ）及び（ＩＩ）を充足する。
　「遺伝子組換え微生物」は、字義通りに理解すれば足り、微生物に対して、何らかの遺伝子組換え操作を施したものであると理解すればよい。より詳細には、このような遺伝子組換え操作は、第一の態様に係る遺伝子組換え微生物について規定される範囲において、前記条件（Ｉ）若しくは（ＩＩ）、又は前記条件（Ｉ）～（ＶＩ）を任意の組合せで実現せしめるものであり得る。
　「微生物」は、字義どおりに解釈すれば足り、より具体的には、「微生物」は、細菌、古細菌、又はシアノバクテリア等の原核生物、菌類等の真核生物であり得る。「微生物」は、菌類又は細菌類が好ましく、細菌類がより好ましい。
　菌類としては、サッカロミケス属（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミケス属（例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ)、ピチア属（例えば、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイウェロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、ヤロウイア属（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、クリプトコッカス属（例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．　Ｓ－２）、アスペルギルス属(例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ、)、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ属（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ　ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）等が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ等は、遺伝子組換え技術や異種蛋白質発現系が確立されていることから、都合よく利用できる。
　細菌類としては、例えば、エシェリキア属（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、バチルス属（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ラクトバシラス属（例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、クロストリジウム属（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、ロドシュードモナス属（例えば、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、及び後述するコリネ型細菌等が挙げられる。細菌類としては、遺伝子組換え技術やタンパク質発現系が既に確立されていることから、エシェリキア属細菌又はコリネ型細菌が好ましく、エシェリキア・コリ又はコリネ型細菌がより好ましく、コリネバクテリウム属がさらに好ましい。
　いくつかの実施形態において、本態様に係る遺伝子組換え微生物は、グラム陽性細菌（例えば、放線菌）である。別のいくつかの実施形態において、本態様に係る遺伝子組換え微生物は、グラム陰性細菌であってもよい。グラム陰性細菌としては、例えば、プロテオバクテリア門に属する細菌が挙げられる。プロテオバクテリア門細菌は、アルファ－、ベータ－、ガンマ－、デルタ－、イプシロン－若しくはゼータ－プロテオバクテリア綱に属する細菌、及びオリゴフレクサス綱に属する細菌を包含する。グラム陰性細菌としては、例えば、腸内細菌科、ビブリオ科又はシュードモナス科に属する細菌が挙げられる。
　「コリネ型細菌」とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂａｒｇｅｙｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，第８巻，ｐ．５９９、１９７４年）に定義される一群の細菌をいう。
　コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アースロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、マイクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等が挙げられる。
　コリネバクテリウム属としては、例えば以下のような種及び細菌株が挙げられる。
　コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（例えば、ＦＥＲＭ　Ｐ－１８９７６株、ＡＴＣＣ１３０３２株、ＡＴＣＣ３１８３１株、ＡＴＣＣ１３０５８株、ＡＴＣＣ１３０５９株、ＡＴＣＣ１３０６０株、ＡＴＣＣ１３２３２株、ＡＴＣＣ１３２８６株、ＡＴＣＣ１３２８７株、ＡＴＣＣ１３６５５株、ＡＴＣＣ１３７４５株、ＡＴＣＣ１３７４６株、ＡＴＣＣ１３７６１株、ＡＴＣＣ１４０２０株）；
　コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（例えばＡＴＣＣ１５８０６株）；
　コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）（例えばＡＴＣＣ１３８７０株）；
　コリネバクテリウム・メラセコラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）（例えばＡＴＣＣ１７９６５株）；
　コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）（例えばＹＳ－３１４株、ＹＳ－３１４Ｔ株（ＮＢＲＣ１００３９５Ｔ株））；
　コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｌｋａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）（例えばＡＴＣＣ２１５１１株）；
　コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃａｌｌｕｎａｅ）（例えばＡＴＣＣ１５９９１株、ＮＢＲＣ１５３５９株、ＤＳＭ２０１４７株）；
　コリネバクテリウム・リリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｉｌｉｕｍ）（例えばＡＴＣＣ１５９９０株）；
　コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ））（例えばＡＪ１２３４０株、ＦＥＲＭ　ＢＰ１５３９株）；
　コリネバクテリウム・ハーキュリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｒｃｕｌｉｓ）（例えばＡＴＣＣ１３８６８株）；
　コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・スタティオニス）（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）（例えばＡＴＣＣ６８７１株、ＡＴＣＣ６８７２株、ＤＳＭ２０３０６株、ＮＢＲＣ１２０７１Ｔ株、ＮＢＲＣ１２０７２株、ＮＢＲＣ１２６１２Ｔ株）；
　コリネバクテリウム・ポリュティソリ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｏｌｌｕｔｉｓｏｌｉ）；
　コリネバクテリウム・マリナム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｒｉｎｕｍ）（例えばＤＳＭ４４９５３株）；
　コリネバクテリウム・フミリドゥセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）（例えばＮＢＲＣ１０６０９８株）；
　コリネバクテリウム・ハロトレランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）（例えばＹＩＭ７００９３株）；
　コリネバクテリウム・デザーティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｅｓｅｒｔｉ）（例えばＧＩＭＮ１．０１０株）；
　コリネバクテリウム・ドオサネンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｏｏｓａｎｅｎｓｅ）（例えばＣＡＵ２１２株、ＤＳＭ４５４３６株）；
　コリネバクテリウム・マリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｒｉｓ）（例えばＤＳＭ４５１９０株）。
　ブレビバクテリウム属細菌としては、例えば以下の種及び細菌株が挙げられる。
　ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）（例えばＡＴＣＣ１４０２０株）；
　ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）［例えば、ＭＪ－２３３（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１４９７）株、ＭＪ－２３３ＡＢ－４１（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１４９８）株、ＡＴＣＣ１３８２６株、ＡＴＣＣ１４０６７株、ＡＴＣＣ１３８２６株］；
　ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）（例えばＡＴＣＣ１４０６８株）；
　ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））（例えばＡＴＣＣ１３８６９株）；
　ブレビバクテリウム・ロゼウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｏｓｅｕｍ）（例えばＡＴＣＣ１３８２５株）；
　ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）（例えばＡＴＣＣ１４０６６株）；
　ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ）（例えばＡＴＣＣ１９２４０株）；
　ブレビバクテリウム・アルバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｌｂｕｍ）（例えばＡＴＣＣ１５１１１株）；
　ブレビバクテリウム・セリナム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃｅｒｉｎｕｍ）（例えばＡＴＣＣ１５１１２株）。
　アースロバクター属細菌としては、例えば以下のような種及び細菌株が挙げられる。
　アースロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、ＡＴＣＣ８０１０株、ＡＴＣＣ４３３６株、ＡＴＣＣ２１０５６株、ＡＴＣＣ３１２５０株、ＡＴＣＣ３１７３８株、ＡＴＣＣ３５６９８株、ＮＢＲＣ３０６２株、ＮＢＲＣ１２１３７Ｔ株）等が挙げられる。
　マイクロコッカス属細菌としては、例えば、マイクロコッカス・フロイデンライヒ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）［例えば、Ｎｏ．２３９（ＦＥＲＭ　Ｐ－１３２２１）株］；マイクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｕｔｅｕｓ）［例えば、ＮＣＴＣ２６６５株、Ｎｏ．２４０（ＦＥＲＭ　Ｐ－１３２２２）株］；マイクロコッカス・ウレアエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｕｒｅａｅ）（例えば、ＩＡＭ１０１０株）；マイクロコッカス・ロゼウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｏｓｅｕｓ）（例えば、ＩＦＯ３７６４株）等が挙げられる。
　マイクロバクテリウム属細菌としては、例えば、マイクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）（例えばＡＴＣＣ１５３５４株）等が挙げられる。
　コリネ型細菌株は、例えばＡＴＣＣ株であれば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ　１５４９　Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　２０１０８　ＵＳＡ）から分譲を受けることができる。その他の菌株についても、それら菌株を提供している各微生物保存機関から分譲を受けることができる。
　本態様に係る遺伝子組換え微生物は、上記に例示されるような微生物に対して所定の遺伝子操作を施すことにより作製することができる。
（条件（Ｉ）～（ＩＶ）、及び（ＶＩ）について）
　条件（Ｉ）における「遺伝子組換え微生物に対応する野生型微生物と比較して、クエン酸シンターゼ活性が低減され又は不活化されていること」とは、野生型微生物と比較して、クエン酸シンターゼ活性が有意に低減されているか、又は完全に不活化していることを意味する。「野生型微生物」とは、遺伝子操作が行われていない微生物を意味する。野生型微生物は、自然界から単離された微生物でよく、樹立された微生物株であってもよい。「遺伝子組換え微生物に対応する野生型微生物」とは、遺伝子組換え微生物と同じ遺伝背景を有する野生型微生物を意味する。本態様の遺伝子組換え微生物は、対応する野生型微生物に、条件（Ｉ）及び／又は条件（ＩＩ）、あるいは条件（Ｉ）及び／又は条件（ＩＩ）に加えて条件（ＩＩＩ）～（ＶＩ）のいずれか１以上を実現するような遺伝子操作が施されたものであってよい。野生型微生物と比較して、クエン酸シンターゼ活性が低減されている場合、遺伝子組換え微生物のクエン酸シンターゼ活性は、野生型微生物のクエン酸シンターゼ活性を１００としたときの相対活性として、例えば、９０以下、８０以下、７０以下、６０以下、又は５０以下であり得る。以下、条件（ＩＩ）～（ＩＶ）、及び（ＶＩ）についても同様である。
　条件（ＩＩ）における「野生型微生物と比較して、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ活性が低減され又は不活化されていること」とは、野生型微生物と比較して、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ活性が有意に低減されているか、又は完全に不活化していることを意味する。
　条件（ＩＩＩ）における「遺伝子組換え微生物に対応する野生型微生物と比較して、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性又はフマル酸還元酵素活性が低減され又は不活化されていること」とは、野生型微生物と比較して、コハク酸デヒドロゲナーゼ又はフマル酸還元酵素活性が有意に低減されているか、又は完全に不活化していることを意味する。コリネバクテリウム属等の一部の細菌では、フマル酸還元酵素はもっておらず、コハク酸デヒドロゲナーゼがこの反応を触媒する。大腸菌等の一部の細菌では、コハク酸デヒドロゲナーゼとフマル酸還元酵素の両方の酵素を有しており、主にフマル酸還元酵素が上記の反応を触媒する。
　条件（ＩＶ）における「野生型微生物と比較して、乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低減され又は不活化されていること」とは、野生型微生物と比較して、乳酸デヒドロゲナーゼ活性が有意に低減されているか、又は完全に不活化していることを意味する。
　条件（ＶＩ）における「野生型微生物と比較して、ピルビン酸：キノンオキシドレダクターゼ活性が低減され又は不活化されていること」とは、野生型微生物と比較して、ピルビン酸：キノンオキシドレダクターゼ活性が有意に低減されているか、又は完全に不活化していることを意味する。
　条件（Ｉ）～（ＩＶ）、及び（ＶＩ）の意義は、図１に示す通り、それぞれ順に、微生物の代謝経路において、オキサロ酢酸（ＯＡＡ）からクエン酸（Ｃｉｔ）への代謝、オキサロ酢酸（ＯＡＡ）からピルビン酸（Ｐｙｒ）への代謝、コハク酸からフマル酸（Ｆｕｍ）への代謝又はその逆代謝、ピルビン酸（Ｐｙｒ）から乳酸への代謝、及びピルビン酸（Ｐｙｒ）から酢酸（Ａｃ）への代謝が有意に抑制又は不活化されていることを意味する。
　好気条件下で増殖可能であり、かつ還元条件（嫌気条件）下では増殖しない微生物においては、一般に、好気条件下では図１に示すＴＣＡサイクル（クエン酸回路）はオキサロ酢酸から右回りに代謝が進み、他方、還元条件又は嫌気条件下ではＴＣＡサイクルはオキサロ酢酸から左回りに代謝が進む。
　条件（Ｉ）を充足する実施形態が採用された場合、好気条件下では、オキサロ酢酸からクエン酸への変換が抑制されることから、より多量のオキサロ酢酸が蓄積する。その結果、オキサロ酢酸から誘導される更なる代謝産物の生産を効率的に行うことができる。一方、還元条件又は嫌気条件下では、より多量のオキサロ酢酸、Ｌ－リンゴ酸、フマル酸又はこれらから誘導される更なる代謝産物を効率的に産生させることができる。ＴＣＡサイクルにおける前記代謝産物から誘導される更なる代謝産物は、条件（Ｉ）を充足する遺伝子組換え微生物において、対応する野生型微生物が保持する代謝系を介して生合成されるものであってもよいし、さらに任意の遺伝子変異を導入することで新たに構築された代謝系を介して生合成されるものであってもよい。
　条件（ＩＩ）を充足する実施形態が採用された場合、オキサロ酢酸からピルビン酸への変換が抑制されることから、条件（Ｉ）を充足する実施形態と同様に、より多量のオキサロ酢酸が蓄積する。その結果、オキサロ酢酸から誘導される更なる代謝産物の生産を効率的に行うことができる。
　条件（ＩＩＩ）を充足する実施形態が採用された場合、好気条件下では、コハク酸からフマル酸への変換が抑制されることから、より多量のクエン酸、ｃｉｓ－アコニット酸、Ｄ－イソクエン酸、α－ケトグルタル酸、スクシニルＣｏＡ、コハク酸又はこれらから誘導される更なる代謝産物を効率的に産生させることができる。一方、還元条件又は嫌気条件下では、より多量のオキサロ酢酸、Ｌ－リンゴ酸、フマル酸又はこれらから誘導される更なる代謝産物を効率的に産生させることができる。
　条件（ＩＶ）を充足する実施形態が採用された場合、ピルビン酸から乳酸への変換が抑制されることから、ピルビン酸からオキサロ酢酸への代謝経路が効率的に進む。その結果、オキサロ酢酸、Ｌ－リンゴ酸、フマル酸又はこれらから誘導される更なる代謝産物の生産を効率的に行うことができる。
　条件（ＶＩ）を充足する実施形態が採用された場合、ピルビン酸から酢酸への変換が抑制されることから、条件（ＩＶ）を充足する実施形態と同様に、ピルビン酸からオキサロ酢酸への代謝経路が効率的に進む。その結果、オキサロ酢酸、Ｌ－リンゴ酸、フマル酸又はこれらから誘導される更なる代謝産物の生産を効率的に行うことができる。
　条件（ＩＶ）及び（ＶＩ）の両方を充足する実施形態は、より一層、オキサロ酢酸、Ｌ－リンゴ酸、フマル酸又はこれらから誘導される更なる代謝産物の生産効率を向上できるため、好ましい。
　一実施形態において、遺伝子組換え微生物は、条件（Ｉ）を充足する。
　一実施形態において、遺伝子組換え微生物は、条件（Ｉ）を充足し、さらに条件（ＩＩ）～（ＩＶ）、及び（ＶＩ）からなる群より選択される少なくとも１つの条件を充足する。この場合、遺伝子組換え微生物は、条件（Ｉ）及び（ＩＩ）の両方、条件（Ｉ）及び（ＩＩＩ）の両方、条件（Ｉ）及び（ＩＶ）の両方、条件（Ｉ）及び（ＶＩ）の両方、又は条件（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）を充足することが好ましく、条件（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＶＩ）を充足することがより好ましく、条件（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）及び（ＶＩ）の全てを充足することがより好ましい。
　一実施形態において、遺伝子組換え微生物は、条件（ＩＩ）を充足する。
　一実施形態において、遺伝子組換え微生物は、条件（ＩＩ）を充足し、さらに条件（Ｉ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）及び（ＶＩ）からなる群より選択される少なくとも１つの条件を充足する。この場合、遺伝子組換え微生物は、条件（Ｉ）及び（ＩＩ）の両方、条件（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の両方、条件（ＩＩ）及び（ＩＶ）の両方、条件（ＩＩ）及び（ＶＩ）の両方、又は条件（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＶ）を充足することが好ましく、条件（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＶ）、及び（ＶＩ）を充足することがより好ましく、条件（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）及び（ＶＩ）の全てを充足することがより好ましい。
　このような実施形態において、ピルビン酸からＴＣＡサイクルに向かう代謝経路並びにＴＣＡサイクルにおける代謝が効率的に進み、ＴＣＡサイクルにおけるオキサロ酢酸、Ｌ－リンゴ酸、フマル酸又はこれらから誘導される代謝産物、これらの代謝産物やこれらの代謝産物から更なる代謝により誘導される物質の生産を効率的に達成することができるからである。
　遺伝子組換え微生物は、上記条件に加えて、さらに、下記条件（ＶＩＩ）を充足してもよい。
　条件（ＶＩＩ）：野生型微生物と比較して、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性が低減され又は不活化されていること。
　条件（ＶＩＩ）における「野生型微生物と比較して、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性が低減され又は不活化されていること」とは、野生型微生物と比較して、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性が有意に低減されているか、又は完全に不活化していることを意味する。
　遺伝子組換え微生物がグラム陰性細菌である場合、条件（ＶＩＩ）を充足することが好ましい。グラム陰性細菌は、グラム陽性細菌では通常見られないピルビン酸ギ酸リアーゼ活性を発現する。ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性は、ピルビン酸からギ酸及び酢酸などの有機酸を合成する副次的生合成経路を作り出す。つまり、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性を低減し又は不活化すれば、副次的生合成経路を遮断できることから、アスパラギン酸への代謝フラックスをより強固なものとし、効率的なアスパラギン酸生産が可能となる。
　条件（Ｉ）に係るクエン酸シンターゼ活性、条件（ＩＩ）に係るオキサロ酢酸デカルボキシラーゼ活性、条件（ＩＩＩ）に係るコハク酸デヒドロゲナーゼ活性又はフマル酸還元酵素活性、条件（ＩＶ）に係る乳酸デヒドロゲナーゼ活性、条件（ＶＩ）に係るピルビン酸：キノンオキシドレダクターゼ活性、及び条件（ＶＩＩ）に係るピルビン酸ギ酸リアーゼ活性とは、前記各条件に示される各酵素の各酵素活性であってよい。より具体的には、酵素は、基質と酵素との反応の種類による系統的分類及び反応種別に基づく国際的な酵素分類として認知されているＥＣ番号によって記述することができる。各条件の酵素活性を担う酵素としては、下記表１に記載する酵素が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　各条件の充足は、遺伝子工学的各種手法を用いて実現すればよい。例えば、クエン酸シンターゼ遺伝子（ｇｌｔＡ）、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｏｄｘ）、コハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｓｄｈ）若しくはフマル酸還元酵素遺伝子（ｆｒｄ）、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈ）、ピルビン酸：キノンオキシドレダクターゼ遺伝子（ｐｏｘＢ）、又はピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子（ギ酸アセチルトランスフェラーゼ遺伝子）（ｐｌｆ）に対して、ゲノムにおけるこれら遺伝子若しくはプロモーターを標的とする遺伝子破壊若しくはプロモーター破壊、低発現プロモーターへの変更、変異導入による手法、ｍＲＮＡ発現レベルでのアンチセンス阻害（アンチセンスＲＮＡ）による手法等が採用できる。あるいは、各酵素活性を阻害するペプチド又はタンパク質を発現するように遺伝子操作を施してもよい。あるいは、微生物において各酵素活性が発現するために、各酵素活性を付与し得る酵素タンパク質が、所定の内因性アクチベーターによる活性化のプロセスを必要とする場合、該内因性アクチベーターを不活化することにより、各酵素活性の発現を抑制させて各条件の充足を実現してもよい。
　上記各条件を、比較的簡便かつより確実に実現できる点では、遺伝子破壊又は変異導入の手法を用いることが好ましい。より具体的には、下記の実施形態（１）～（６）の何れかを採用することが好ましい。
（１）遺伝子組換え微生物のゲノム（染色体ＤＮＡ）において、各酵素活性を付与し得る酵素遺伝子コード領域が完全に又は部分的に破壊されていることにより、条件（Ｉ）及び／又は条件（ＩＩ）、並びに任意に条件（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、及び（ＶＩ）のいずれか１つ以上を充足する実施形態。
（２）遺伝子組換え微生物のゲノムにおいて、各酵素活性を付与し得る酵素遺伝子コード領域の上流に存在する遺伝子発現調節領域（例えばプロモーター領域）が完全に又は部分的に破壊されていることにより、条件（Ｉ）及び／又は条件（ＩＩ）、並びに任意に条件（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、及び（ＩＶ）のいずれか１つ以上を充足する実施形態。
（３）遺伝子組換え微生物のゲノムにおいて、各酵素活性を付与し得る酵素遺伝子コード領域の上流に存在する遺伝子発現調節領域（例えばプロモーター領域）が酵素遺伝子の発現を低減させる遺伝子発現調節領域に変更されていることにより、条件（Ｉ）及び／又は条件（ＩＩ）、並びに任意に条件（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、及び（ＩＶ）のいずれか１つ以上を充足する実施形態。
（４）遺伝子組換え微生物のゲノムにおいて、各酵素活性を付与し得る酵素遺伝子コード領域に対して、それぞれ、１又は複数のアミノ酸変異を誘発するヌクレオチド変異が導入されていることにより、条件（Ｉ）及び／又は条件（ＩＩ）、並びに任意に条件（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、及び（ＩＶ）のいずれか１つ以上を充足する実施形態。ここで、「１又は複数のアミノ酸変異」は、各酵素活性の低減又は不活化を生じ得るアミノ酸変異を意味する。
（５）各酵素活性を付与し得る酵素タンパク質の酵素活性を活性化させる内因性アクチベーターが、上記実施形態（１）～（４）に記載のいずれか１つ以上の方法により不活化又は低減されることにより、条件（Ｉ）及び／又は条件（ＩＩ）、並びに任意に条件（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、及び（ＩＶ）のいずれか１つ以上を充足する実施形態。
　実施形態（１）～（５）は、各条件に規定される各酵素活性の低減又は不活化を実現するために、それぞれ独立に採用され得る。加えて、１つの条件を充足させるために、実施形態（１）～（５）のうち２つ以上を採用してもよい。例えば、条件（Ｉ）を充足するために、実施形態（１）及び（２）を採用してもよい。例えば、条件（Ｉ）を充足するために、クエン酸シンターゼ遺伝子のコード領域と遺伝子発現調節領域との両方を破壊してもよい。条件（Ｉ）を充足させるために、実施形態（２）を採用し、条件（ＩＩ）、条件（ＩＩＩ）、条件（ＩＶ）、条件（ＶＩ）及び条件（ＶＩＩ）のいずれかを充足させるために実施形態（１）を採用してもよい。
　実施形態（１）を採用する場合において、酵素遺伝子コード領域が複数コピー存在する場合、複数の酵素遺伝子コード領域の全てを破壊してもよく、一部のみを破壊してもよい。複数の酵素遺伝子コード領域の一部のみを破壊することにより、酵素遺伝子の発現を完全に停止させることなく、酵素遺伝子の発現を低減させ得る。複数の酵素遺伝子コード領域の破壊の程度により、酵素遺伝子の発現量を調整し、アスパラギン酸の産生効率が向上するようにしてもよい。酵素遺伝子コード領域の破壊は、後述の相同組換え等により、部分的に欠損させることにより実現してもよく、完全に欠損させることにより実現してもよい。
　実施形態（２）を採用する場合において、酵素遺伝子コード領域の上流に遺伝子発現調節領域が複数存在する場合、複数の遺伝子発現調節領域の全てを破壊してもよく、一部のみを破壊してもよい。例えば、酵素遺伝子コード領域の上流に当該酵素遺伝子の発現を制御するプロモーター領域が複数存在する場合、複数のプロモーター領域の全てを破壊してもよく、一部のみを破壊してもよい。プロモーター領域の一部のみを破壊することにより、酵素遺伝子の発現を完全に停止させることなく、酵素遺伝子の発現を低減させ得る。遺伝子発現調節領域の破壊の程度により、酵素遺伝子の発現量を調整し、アスパラギン酸の産生効率が向上するようにしてもよい。遺伝子発現調節領域の破壊は、後述の相同組換え等により、部分的に欠損させることにより実現してもよく、完全に欠損させることにより実現してもよい。
　実施形態（３）を採用する場合において、酵素遺伝子コード領域の上流に遺伝子発現調節領域が複数存在する場合、複数の遺伝子発現調節領域の全てを変更してもよく、一部のみを変更してもよい。例えば、酵素遺伝子コード領域の上流に当該酵素遺伝子の発現を制御するプロモーター領域が複数存在する場合、複数のプロモーター領域の全てを変更してもよく、一部のみを変更してもよい。遺伝子発現調節領域の変更の程度により、酵素遺伝子の発現量を調整し、アスパラギン酸の産生効率が向上するようにしてもよい。遺伝子発現調節領域の変更は、後述の相同組換え等により実現してもよい。
　条件（Ｉ）を充足させるためには、実施形態（２）を採用することが好ましい。例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌では、クエン酸シンターゼ遺伝子は、２つのプロモーター（プロモーターＰ１、プロモーターＰ２）を有している。条件（Ｉ）を充足させるために、プロモーターＰ１及びプロモーターＰ２の両方を破壊してもよく、プロモーターＰ１及びプロモーターＰ２のいずれか一方のみを破壊してもよい。好ましい実施形態では、条件（Ｉ）を充足させるために、プロモーターＰ１のみが破壊されており、前記破壊はプロモーターＰ１を完全に欠損させることにより行われていることが好ましい。
　遺伝子組換え微生物における遺伝子コード領域又は遺伝子発現調節領域（以下、まとめて「標的領域」ともいう）の破壊は、公知の方法により行うことができる。標的領域の破壊方法としては、例えば、相同組換え法、ゲノム編集技術（ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステム）、トランスポゾン法、変異導入法等が挙げられる。標的領域の破壊を比較的安価かつ効率的に達成できる点で、相同組換え法が好ましい。以下、相同組換えによる標的領域破壊法の例を示すが、これらに限定されない。
（相同組換えによる標的領域破壊法／標的領域置換法）
（１）標的領域の決定と標的領域のクローニング
　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属等の多くの細菌類、並びにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＹａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ等の各種菌類は、全ゲノム配列が決定されており、そのヌクレオチド配列及び各遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列も既知である。
　例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍでは、ＡＴＣＣ１３０３２株、Ｒ株、ＡＴＣＣ２１８３１株、ＡＴＣＣ１４０６７株等の多数の細菌株において全ゲノム配列が決定されている。
　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ　ＹＳ－３１４株；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃａｌｌｕｎａｅ　ＤＳＭ２０１４７株；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ　ＤＳＭ２０３０６株；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｒｉｎｕｍ　ＤＳＭ４４９５３株；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ　ＮＢＲＣ１０６０９８株（ＤＳＭ４５３９２株）；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ　ＹＩＭ７００９３株（ＤＳＭ４４６８３株）；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｅｓｅｒｔｉ　ＧＩＭＮ１．０１０株；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｒｉｓ　ＤＳＭ４５１９０株；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｏｏｓａｎｅｎｓｅ　ＣＡＵ２１２株（ＤＳＭ４５４３６株）等のコリネバクテリウム属の細菌株についても、全ゲノム配列が決定されている。
　全ゲノム配列が決定されていないにしても、上記各条件に係る各酵素活性を有する各酵素の遺伝子配列並びに前記酵素のアミノ酸配列が既知である微生物も存在する。
　これら既知のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｓｕｐｐｏｒｔ　Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＣＢＩ）（アメリカ合衆国メリーランド州ベセスダ・ロックビルパイク８６００）がインターネット上で公開するデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）等の各種データベースから容易に入手可能である。
　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３０３２株における条件（Ｉ）、及び条件（ＩＩ）を充足するための標的となり得る遺伝子等の情報を表２に示す。各条件を充足するために標的となり得る遺伝子等の情報は、微生物の種類に応じて、各種データベースから入手可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　各種微生物において、条件（ＩＩＩ）、条件（ＩＶ）、及び条件（ＶＩ）と充足するための標的となり得る遺伝子等の情報を表３～１１に示すが、これらに限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　クエン酸シンターゼ活性、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ活性、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性、フマル酸還元酵素活性、乳酸デヒドロゲナーゼ活性、ピルビン酸：キノンオキシドレダクターゼ活性、及びピルビン酸ギ酸リアーゼ活性は、それぞれ順に、野生型微生物において見いだされるクエン酸シンターゼ（ＧｌｔＡ）、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（Ｏｄｘ）、コハク酸デヒドロゲナーゼ（Ｓｄｈ）、フマル酸還元酵素（Ｆｒｄ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｌｄｈ）、ピルビン酸：キノンオキシドレダクターゼ（Ｐｏｘ又はＰｑｏ）、及びピルビン酸ギ酸リアーゼ（Ｐｆｌ）が示す酵素活性である。これら酵素に係るタンパク質はそれぞれ、ｇｌｔＡ、ｏｄｘ、ｓｄｈＣＡＢ（菌種によってはｓｄｈＣＡＢＤ）、ｌｄｈＡ、ｄｌｄ及びｌｌｄＤ等（乳酸デヒドロゲナーゼ活性を示す酵素タンパク質をコードする遺伝子）、ｐｏｘＢ（ｐｑｏ）、並びにｐｆｌＡＢＣＤ等と表記される遺伝子によりコードされ得る。
　細菌においては、一般的に、クエン酸シンターゼ（ＧｌｔＡ）は、ホモ二量体を形成している。コリネ型細菌においては、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（Ｏｄｘ）は、ホモ二量体を形成している。
　細菌においては、コハク酸デヒドロゲナーゼ（Ｓｄｈ）は、ｓｄｈＣ遺伝子にコードされる膜貫通タンパク質（サブユニットＣ）、ｓｄｈＡ遺伝子にコードされるフラビンタンパク質サブユニット（サブユニットＡ）、及びｓｄｈＢ遺伝子にコードされるＦｅ－Ｓタンパク質（サブユニットＢ）の３つのサブユニットタンパク質、並びに場合によってはＳｄｈＤ（サブユニットＤ）から構成される複合体であり、これらサブユニットをコードする各遺伝子は、原核生物の場合、細菌ゲノムでオペロンを構成している。フマル酸還元酵素（Ｆｒｄ）は、例えばエシェリキア・コリ等の細菌では、サブユニットＤ、Ｃ、Ｂ、Ａから構成される複合体であり、ｆｒｄＤＣＢＡ遺伝子（オペロン）によりコードされている。ピルビン酸ギ酸リアーゼ（Ｐｆｌ）は、例えばエシェリキア・コリ等の細菌では、サブユニットＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄから構成される複合体であり、ｐｆｌＡＢＣＤ遺伝子（オペロン）によりコードされている。
　条件（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＶＩ）、及び（ＶＩＩ）のうち、充足させる条件に係る標的領域（各酵素遺伝子のコード領域、発現制御領域等）及びその周辺領域のヌクレオチド配列並びにタンパク質配列が既知である微生物を用いることが好ましい。それら既知配列を参照することにより破壊すべきゲノム領域を容易に特定することができる。しかしながら、遺伝子組換え微生物を作製する上で、出発材料として利用され得る微生物は、該酵素タンパク質コード領域やその周辺領域が未知である微生物も利用可能である。
　各酵素タンパク質コード領域やその周辺領域が未知である微生物を利用する場合、例えば、各酵素遺伝子のコード領域を、各種遺伝子工学技術の手法により適宜クローニングし、必要に応じてヌクレオチド配列を決定すれば、破壊すべき領域を特定し、クローン化できる。例えば、既知であるホモログ酵素タンパク質のアミノ酸配列に対するアライメント解析を行うと、一定のアミノ酸保存領域が複数見出される。当該酵素タンパク質のＮ末端側とＣ末端側に見出されるアミノ酸保存領域にそれぞれディジェネレートプライマーを設計し、クローニングの対象とする微生物のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ディジェネレートＰＣＲ法を行う。これにより、対象とする酵素遺伝子の一部のコード領域を増幅及びクローニングすることができる。その後、この一部コード領域のヌクレオチド配列を適宜決定する。次いで、クローニングした一部コード領域を遺伝子破壊の対象として遺伝子破壊を行い、所望の条件を充足せしめる遺伝子組換え微生物を作製すればよい。一方、対象の酵素遺伝子全長のコード領域及び／又はその周辺の遺伝子発現調節領域の全域に渡って破壊された遺伝子組換え微生物を作製したい場合には、上記のとおりヌクレオチド配列を決定した酵素遺伝子の一部コード領域の内部において、逆向きにプライマーを適宜設計し、インバースＰＣＲ法等の手法を用いて対象の酵素遺伝子全長のコード領域及び／又はその周辺領域をクローニングし、それら領域のヌクレオチド配列を決定することとしてもよい。その他の手法として、対象とする微生物の遺伝子ライブラリーを作製し、適当なプローブを設計して各種ハイブリダイゼーション法により、破壊の対象とする酵素遺伝子及びその周辺領域をクローニングし、それらのヌクレオチド配列を決定してもよい。さらに、ホモログ遺伝子の配列が利用できない微生物種については、従来法に従って、タンパク質精製技術と各酵素活性測定法とを組合せ、標的酵素を同定し、部分的にペプチド配列を決定する等した上で、上記各種遺伝工学的手法により標的酵素遺伝子をクローニングしてもよい。
（２）標的領域破壊用／置換用プラスミドベクターの作製及び相同組換えによる標的領域（酵素遺伝子コード領域／発現制御領域等）破壊／置換
　次いで、上記各条件に係る標的領域（酵素遺伝子コード領域、発現制御領域等）の破壊又は置換に関し、相同組換え法を用いた標的領域破壊株又は標的領域置換株の作製方法について説明する。
　まず、微生物ゲノムにおける標的領域と相同組換えを生じ得る標的領域破壊用／置換用プラスミドベクターを作製する。
　このような標的領域破壊用／置換用プラスミドベクターの一例として、微生物ゲノムから標的領域をクローニングして得たプラスミドベクターを利用したものが挙げられる。標的領域破壊用／置換用プラスミドベクターとしては、例えば、前記プラスミドベクターの前記標的領域の内部に、カナマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を挿入してなる標的領域破壊用プラスミドベクター；及び前記プラスミドベクターの前記標的領域の内部に、置換配列（低発現プロモーター配列、分解誘導性ペプチドコード配列を付加した酵素遺伝子コード配列等）等を挿入してなる標的領域置換用プラスミドベクター等が挙げられる。このような標的領域破壊用プラスミドベクターでは、薬剤耐性遺伝子の両側にはそれぞれ、微生物のゲノムにおいて破壊したい領域と相同な領域が存在する。したがって、微生物のゲノムにおいて破壊したい領域に対して、薬剤耐性遺伝子が挿入される形態で、微生物ゲノムと標的領域破壊用プラスミドとの間において相同組換えを起こすため、標的領域の破壊が可能となる。加えて、当該薬剤耐性遺伝子に係る薬剤を培地に添加することにより、遺伝子破壊株を効率的にセレクションすることも可能である。また、上記のような標的領域置換用プラスミドベクターでは、置換配列の両側にはそれぞれ、微生物のゲノムにおいて破壊したい領域と相同な領域が存在する。したがって、微生物のゲノムにおいて置換したい領域に対して、置換配列が挿入される形態で、微生物ゲノムと標的領域置換用プラスミドとの間において相同組換えを起こすため、標的領域の置換配列への置換が可能となる。
　標的領域破壊用プラスミドベクターの別の例として、微生物ゲノムにおいて破壊したい部分の両側に位置する領域（つまり、ゲノムから除去したい領域の５’上流と３’上流）がタンデムに連結された断片を含むプラスミドベクターを利用することも可能である。このような破壊用プラスミドは、例えば、標的領域の５’上流領域と３’下流領域とをＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、それら断片がタンデムに連結された形態において、プラスミドベクターのマルチクローニングサイト等の所定の箇所に挿入することで取得することができる。あるいは、標的領域の５’上流領域から３’下流領域までの全域をＰＣＲ法により増幅し、各種プラスミドベクターを用いてクローニングした後、クローニングした領域の内部に逆向きのプライマーを設計し、インバースＰＣＲ法により、当該標的領域の欠損変異が導入された標的領域破壊用プラスミドベクターを作製してもよい。
　標的領域破壊用／置換用プラスミドにおいて、破壊又は置換の対象とする微生物ゲノム配列と相同となる領域の配列長は、相同組換えを生じ得る限り限定されるものでもないが、一般には、約５００ｂｐ以上、好ましくは約１０００ｂｐ程度あった方がよい。さらに、標的領域破壊用／置換用プラスミドは、クローニング用大腸菌を用いて構築可能とすると構築作業が簡便になるため、大腸菌の複製起点を有するものが便利である。さらに、標的領域破壊用／置換用プラスミドは、破壊又は置換の標的とする微生物において自律複製し得る複製起点が存在しないものであることが好ましい。もし、標的領域破壊用／置換用プラスミドに、該微生物の複製起点がある場合には、制限酵素処理等により該複製起点を除去してから、微生物に導入することが推奨される。さらに加えて、標的領域破壊用／置換用プラスミドは、薬剤によるセレクションを可能とする薬剤耐性遺伝子と、スクロース存在下でグラム陰性細菌の生育を阻害する毒素を産生し得るＳａｃＢ遺伝子等のポジティブセレクションを可能にする致死性遺伝子とを組合せたものを用いてもよい。このような標的領域破壊用／置換用プラスミドを用いると、薬剤によるセレクションにより相同組換えを起こした菌株を単離し、その後、スクロースを含有する培地での培養によるセレクションを行うことができる。スクロース含有培地での培養により、２度目の相同組換えでベクター部分が排除された標的領域破壊株又は標的領域置換株の単離が可能となるので、効率的な標的領域破壊株又は標的領域置換株の取得が可能となる。
　微生物への標的領域破壊用／置換用プラスミドベクターの導入は、特に限定されるものでもないが、各種微生物に応じて確立されている形質転換方法を用いればよい。例えば、コリネ型細菌では、電気パルス法（例えば、Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｒｅｓｔ　ｅｔ　ａｌ．　Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　５２，ｐｐ５４１－５４５，１９９９に記載の方法）を用いることが好ましい。電気パルス法によれば、コリネ型細菌細胞内への核酸の効率的な導入が可能となる。
　遺伝子組換え微生物におけるゲノムの標的領域の破壊の確認は、ＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法、各種酵素活性測定法等により実施できる。
（条件（Ｖ）について）
　本態様に係る遺伝子組換え微生物は、さらに、条件（Ｖ）として「野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性におけるアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対し抵抗性を示す改変型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性、又は上記野生型微生物が示す野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性よりもアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性が高い外来性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有すること」を充足してもよい。
　条件（Ｖ）における「野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性におけるアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性」の意義は、以下に説明の通りである。
　「ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性」とは、具体的にはＥＣ４．１．１．３１に規定される反応を触媒する酵素活性を言い、多種多様な植物や微生物が広く保有するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）により発揮される酵素活性である。以下に、ＰＥＰＣが触媒する代謝反応を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、アスパラギン酸、リンゴ酸、α－ケトグルタル酸（２－オキソグルタル酸）等の代謝産物によって、アロステリックな効果を受け、当該酵素活性が阻害されることが知られており、この酵素活性の阻害は「フィードバック阻害」と呼ばれている（Chen Z,et al., Appl Environ Microbiol. 2014 Feb;80(4):1388-93.; Wada M, et al., J Biosci Bioeng. 2016 Feb; 121(2):172-7.; Yano M,et al., Eur J Biochem. 1997 Jul 1;247(1):74-81.）。即ち、「改変型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性」は、対応する野生型微生物ないし当該微生物が保有する野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼと比較して、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を示しつつも、当該酵素活性においてアスパラギン酸によるフィードバック阻害が有意に低減された酵素特性によって定義されるものである。
　「野生型微生物が示す野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性よりもアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性が高い外来性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性」の用語の意義は、下記のとおりである。
　即ち、上記の用語は、遺伝子組換え微生物が属する種に対応する野生型微生物、又は遺伝子組換え微生物を作製する上で出発材料として用いられる野生型微生物が保有する野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが示す「アスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性」と比較して、アスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性がより高い外来性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を意味する。このような外来性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性は、具体的には、上記「対応する野生型宿主微生物」とは異なる菌株系統又は生物種が保有する異種性のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼによって付与され得る。「野生型宿主微生物とは異なる生物種」は、微生物（例えば、菌類、古細菌や細菌等の原核生物）、植物、哺乳類等の動物などの各種生物種を含む。さらに、「外来性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性」の付与は、より具体的には「野生型宿主微生物とは異なる菌株系統又は生物種」から単離されたＰＥＰＣ遺伝子をコードする核酸の導入により実現できる。
　「改変型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（活性）」が「野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性におけるアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性を示す」こと、並びに「外来性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（活性）」が「野生型微生物が示す野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性よりもアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性が高い」ことについては、例えば、文献（Chen Z,et al., Appl Environ Microbiol. 2014 Feb;80(4):1388-93.; Wada M, et al., J Biosci Bioeng. 2016 Feb; 121(2):172-7.; Yano M,et al., Eur J Biochem. 1997 Jul 1;247(1):74-81.）に記載の測定方法、Yoshinaga,T.Izui,K and Katsuki,H J.Biochem,68,747-750(1970）に記載の測定方法等を利用することにより、確認することができる。
　本明細書では、「ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ」を「ＰＥＰＣ」、又は「ｐｐｃ」と表すことがある。
　条件（Ｖ）の充足は、特に限定されるものでもないが、次のような態様で実現することができる。即ち、各種微生物が保持する野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのタンパク質配列に対して、遺伝子工学的手法によりアミノ酸変異を導入することにより、「ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性」を維持しつつも、「野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性におけるアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対し抵抗性」を獲得した変異型酵素をコードする遺伝子を人為的に作製すればよい。例えば、エラープローンＰＣＲによるランダム変異導入法、又は変異プライマーを用いたＰＣＲベースの部位特異的変異導入法等の塩基置換技術を利用してもよい。複数種の野生型ＰＥＰＣコードＤＮＡに対してＤＮＡシャッフリング等の分子進化の手法を適用することにより、より優位性の高い変異型ＰＥＰＣを作製してもよい。
　上述のとおり取得した変異型ＰＥＰＣをコードする核酸を、各種微生物に導入し、（Ｖ）を充足する遺伝子組換え微生物を作製することができる。より具体的には、各種微生物に、変異型ＰＥＰＣをコードする核酸を、当該変異型ＰＥＰＣを発現可能な形態で導入すればよい。当該技術分野においては、コリネ型細菌をはじめとして多くの微生物種において、各微生物種に好適な遺伝子発現システムが既に確立されている。それら既知の遺伝子発現システムに係る技術を利用可能な微生物については、当該微生物への上記変異型ＰＥＰＣの導入ため、それら既知技術を利用してもよい。独自に遺伝子組換え技術や遺伝子発現システム技術を開発し、それら技術を、微生物への変異型ＰＥＰＣの導入に利用してもよい。
　上記（Ｖ）を充足せしめる変異型ＰＥＰＣは、特に限定されるものでもないが、細菌由来の野生型ＰＥＰＣに対して、所定の変異を導入してなる変異型酵素であることが好ましい。かかる変異型ＰＥＰＣは、好ましくはコリネ型細菌、より好ましくはコリネバクテリウム属細菌由来の野生型ＰＥＰＣに対して、所定の変異を導入してなる変異型酵素である。
　以下の表１２に、利用可能な細菌由来のＰＥＰＣの例を挙げる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　条件（Ｖ）を充足せしめる変異型ＰＥＰＣの具体的構成としては、例えば、下記の実施形態（ｉ）及び（ii）が挙げられる。
（ｉ）野生型ＰＥＰＣのアミノ酸配列に対して、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加されてなる変異型ＰＥＰＣ。ここで、「１又は複数」の範囲は、例えば１から１００個、１から５０個、１から３０個、好ましくは少なくとも２個以上、２から２０個、より好ましくは２から１０個、さらにより好ましくは２から５個、特に好ましくは２から４個、２から３個、例えば２個である。
（ii）２種以上の野生型ＰＥＰＣのアミノ酸配列の一部を組合せて構成したキメラ型ＰＥＰＣ。
　幾つかの実施形態に係る遺伝子組換え微生物においては、細菌由来の変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸が、該変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを発現可能な形態で導入されている。該変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、前記遺伝子組換え微生物に対して条件（Ｖ）を充足せしめる少なくとも１つのアミノ酸変異を有する。前記変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、好ましくは、コリネ型細菌若しくはコリネバクテリウム属細菌又はエシェリキア属細菌に由来する変異型ＰＥＰＣであり、より好ましくはコリネバクテリウム属細菌に由来する変異型ＰＥＰＣであり、特に好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムに由来する変異型ＰＥＰＣである。
　幾つかの実施形態において、前記変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼにおける前記少なくとも１つのアミノ酸変異は、配列番号２に示すアミノ酸配列を基準として下記（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸置換を含む。
（ａ）第２９９番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換（ただし、置換後のアミノ酸はアスパラギン酸ではないものとし、好ましくはアラニン、アスパラギン、グリシン又はセリンへのアミノ酸置換である。）；
（ｂ）第６５３番目のリシンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換（ただし、置換後のアミノ酸はリシンではないものとし、好ましくはアラニン、アスパラギン、又はセリンへのアミノ酸置換である。）；
（ｃ）第８１３番目のリシンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換（ただし、置換後のアミノ酸はリシンではないものとし、好ましくはアラニン、アスパラギン、グリシン又はセリンへのアミノ酸置換である。）；
（ｄ）第８６９番目のセリンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換（ただし、置換後のアミノ酸はセリンではないものとし、好ましくはアラニン、アスパラギン、又はグリシンへのアミノ酸置換である。）；
（ｅ）第８７３番目のアルギニンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換（ただし、置換後のアミノ酸はアルギニンではないものとし、好ましくはアラニン、フェニルアラニン、グリシン又はセリンへのアミノ酸置換である。）；及び
（ｆ）第９１７番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換（ただし、置換後のアミノ酸はアスパラギンではないものとし、好ましくはアラニン、フェニルアラニン、グリシン又はセリンへのアミノ酸置換である。）。
　上記（ａ）～（ｆ）において、置換前のアミノ酸と置換後のアミノ酸とは異なるものとする。
　上記（ａ）～（ｆ）に示すアミノ酸は、配列番号２に示すアミノ酸配列に含まれるアミノ酸を基準に、変異導入の対象とするＰＥＰＣアミノ酸配列においてアミノ酸置換部位を特定する趣旨である。即ち、上記（ａ）～（ｆ）における「相当するアミノ酸」とは、より具体的には、ＣｌｕｓｔａｌＷ又はＣｌｕｓｔａｌＸ（バイオインフォマティクス，第２３巻、イシュー２１、２００８年１１月、第２９４７－２９４８頁；Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，　Ｖｏｌｕｍｅ２３，Ｉｓｓｕｅ　２１，１　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２００７，ｐｐ２９４７－２９４８）等の手法により、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して、変異導入の対象となるＰＥＰＣアミノ酸配列の同一性に基いて、１対１の整列（ペアワイズアラインメント）を行った場合に、上記（ａ）～（ｆ）に示すアミノ酸と１対１で整列されるアミノ酸を言う。
　上記（ａ）における「第２９９番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸」は、コリネバクテリウム属に属する９種の野生型ＰＥＰＣにおいて何れもアスパラギン酸（Ｄ）であり、コリネ型細菌の一種であるＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ　ＮＢＲＣ１２１３７株の野生型ＰＥＰＣにおいてはトレオニン（Ｔ）であり、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ－１２株の野生型ＰＥＰＣにおいてはグルタミン酸（Ｅ）である。上記（ｂ）における「第６５３番目のリシンに相当するアミノ酸」は、コリネバクテリウム属に属する９種の野生型ＰＥＰＣについては、Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓにおいてはアルギニン（Ｒ）であり、Ｃ．ｄｏｏｓａｎｅｎｓｅにおいてはヒスチジン（Ｈ）であるが、その他の菌種では全て、基準となる配列におけるリシン（Ｋ）に同一である。上記（ｃ）における「第８１３番目のリシンに相当するアミノ酸」は、全ての菌種において、基準となる配列におけるリシン（Ｋ）で同一である。上記（ｄ）における「第８６９番目のセリンに相当するアミノ酸」は、全ての菌種において、基準となる配列におけるセリン（Ｓ）で同一である。上記（ｅ）における「第８７３番目のアルギニンに相当するアミノ酸」は、全ての菌種において、基準となる配列におけるアルギニン（Ｒ）で同一である。上記（ｆ）における「第９１７番目のアスパラギンに相当するアミノ酸」は、Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓにおいてはトレオニン（Ｔ）であり、Ｃ．ｄｏｏｓａｎｅｎｓｅにおいてはバリン（Ｖ）であり、その他の菌種では全て、基準となる配列におけるアスパラギン（Ｎ）で同一である。
　アミノ酸の表記は、例えば、「第２９９番目のアスパラギン酸」を、アミノ酸の１文字表記を利用して「Ｄ２９９」と表し、「第２９９番目のアスパラギン酸のアスパラギンへのアミノ酸置換」を「Ｄ２９９Ｎ」と表すことがある。その他のアミノ酸及びアミノ酸置換も同様の方法で表記され得る。
　好ましい実施形態において、前記変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼにおける前記少なくとも１つのアミノ酸変異は、配列番号２に示すアミノ酸配列を基準として下記（ｇ）～（ｌ）からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸置換を含む。
（ｇ）第２９９番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸のアスパラギンへのアミノ酸置換；
（ｈ）第６５３番目のリシンに相当するアミノ酸のセリンへのアミノ酸置換；
（ｉ）第８１３番目のリシンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換（ただし、置換後のアミノ酸はリシンではないものとし、好ましくはグリシン又はセリンへのアミノ酸置換である。）；
（ｊ）第８６９番目のセリンに相当するアミノ酸のグリシンへのアミノ酸置換；
（ｋ）第８７３番目のアルギニンに相当するアミノ酸のグリシンへのアミノ酸置換；及び
（ｌ）第９１７番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の所定のアミノ酸へのアミノ酸置換（ただし、置換後のアミノ酸はアスパラギンではないものとし、好ましくはアラニン、フェニルアラニン、グリシン又はセリンへのアミノ酸置換である。）。
　より好ましい実施形態において、上記変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼにおける前記少なくとも１つのアミノ酸変異は、上記（ｇ）に示すアミノ酸置換と、上記（ｈ）～（ｌ）に示すアミノ酸置換のうちの少なくとも１つとを含む。
　別の好ましい実施形態において、上記変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼにおける上記少なくとも１つのアミノ酸変異は、上記（ｇ）に示すアミノ酸置換と、上記（ｉ）～（ｌ）に示すアミノ酸置換のうちの少なくとも１つとを含む。
　さらに好ましい実施形態において、上記変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼにおける上記少なくとも１つのアミノ酸変異は、上記（ｇ）に示すアミノ酸置換と、上記（ｉ）又は（ｌ）に示すアミノ酸置換とを含む。
　別の実施形態において、上記変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが、下記（Ａ）～（Ｃ）の何れか１つに示すアミノ酸配列を有する変異型ＰＥＰＣであってもよい。
（Ａ）配列番号２～１３（好ましくは配列番号２～１２、より好ましくは配列番号２～１１）の何れか１つに示すアミノ酸配列において、上記（ａ）～（ｌ）からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸置換を導入してなるアミノ酸配列（ただし、置換前のアミノ酸と置換後のアミノ酸は異なるものとする。）；
（Ｂ）上記（Ａ）に規定のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列（但し、上記少なくとも１つのアミノ酸置換は維持されているものとする。）；
（Ｃ）上記（Ａ）に規定のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列（但し、上記少なくとも１つのアミノ酸置換は維持されているものとする。）。
　別の実施形態において、上記変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが、下記（Ｄ）～（Ｆ）の何れか１つに示すアミノ酸配列を有する変異型ＰＥＰＣであってもよい。
（Ｄ）配列番号２～１３（好ましくは配列番号２～１２、より好ましくは配列番号２～１１）の何れか１つに示すアミノ酸配列において、上記（ｇ）に示すアミノ酸置換と、上記（ｈ）～（ｌ）に示すアミノ酸置換のうちの少なくとも１つとを導入してなるアミノ酸配列（ただし、置換前のアミノ酸と置換後のアミノ酸は異なるものとする。）；
（Ｅ）上記（Ｄ）に規定のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列（但し、上記各アミノ酸置換は維持されているものとする。）；
（Ｆ）上記（Ｄ）に規定のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列（但し、上記各アミノ酸置換は維持されているものとする。）。
　別の実施形態において、上記変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが、下記（Ｇ）～（Ｉ）の何れか１つに示すアミノ酸配列を有する変異型ＰＥＰＣであってもよい。
（Ｇ）配列番号２～１３（好ましくは配列番号２～１２、より好ましくは配列番号２～１１）の何れか１つに示すアミノ酸配列において、上記（ｇ）に示すアミノ酸置換と、上記（ｉ）～（ｌ）に示すアミノ酸置換のうちの少なくとも１つとを導入してなるアミノ酸配列（ただし、置換前のアミノ酸と置換後のアミノ酸は異なるものとする。）；
（Ｈ）上記（Ｇ）に規定のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列（但し、上記各アミノ酸置換は維持されているものとする。）；
（Ｉ）上記（Ｇ）に規定のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列（但し、上記各アミノ酸置換は維持されているものとする。）。
　別の実施形態において、上記変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが、下記（Ｊ）～（Ｌ）の何れか１つに示すアミノ酸配列を有する変異型ＰＥＰＣであってもよい。
（Ｊ）配列番号２～１３（好ましくは配列番号２～１２、より好ましくは配列番号２～１１）の何れか１つに示すアミノ酸配列において、上記（ｇ）に示すアミノ酸置換と、上記（ｉ）又は（ｌ）に示すアミノ酸置換とを導入してなるアミノ酸配列（ただし、置換前のアミノ酸と置換後のアミノ酸は異なるものとする。）；
（Ｋ）上記（Ｊ）に規定のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列（但し、上記各アミノ酸置換は維持されているものとする。）；
（Ｌ）上記（Ｊ）に規定のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列（但し、上記各アミノ酸置換は維持されているものとする。）。
　上記（Ｂ）、（Ｅ）、（Ｈ）及び（Ｋ）において、「１又は複数」の範囲は、例えば１から１００個、１から５０個、１から３０個、好ましくは１から２０個、１から１５個、１から１０、より好ましくは１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個である。
　上記（Ｃ）、（Ｆ）、（Ｉ）及び（Ｌ）において、「少なくとも６０％」は、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％と読み替えられる。
　上記（Ａ）、（Ｄ）、（Ｇ）及び（Ｊ）において、「配列番号２～１３（好ましくは配列番号２～１２、より好ましくは配列番号２～１１）の何れか１つに示すアミノ酸配列」は、「配列番号２に示すアミノ酸配列」（即ち、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の野生型ＰＥＰＣアミノ酸配列）と読み替える実施形態は、特に好ましい。
　上述の各実施形態において、上記（Ａ）～（Ｌ）の何れかに規定のアミノ酸配列を有する変異型ＰＥＰＣが、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を保持し、かつ条件（Ｖ）を充足せしめる趣旨であることに変わりは無い。
　幾つかの実施形態において、遺伝子組換え微生物は、例えば、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ（ＡｓｐＤＨ、ＥＣ １．４.１．２１）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡｓｐＣ、ＥＣ２．６．１．１）、及び上記アスパラギン酸アンモニアリアーゼ（ＡｓｐＡ、ＥＣ４．３.１．１）等が強化されたものであってもよく、これら酵素活性の強化のために、これら酵素をコードする遺伝子が追加的に導入されていてもよい。コリネ型細菌に導入される酵素遺伝子としては、例えば、特開２０１０－１８３８６０号公報、特開２０１６－５１６４３５号公報等に開示されるような酵素遺伝子が挙げられる。これら先行技術文献の開示内容は、本明細書においても援用されるものである。
　上述の各実施形態を適宜に採用した遺伝子組換え微生物によれば、糖類等の出発基質を、より効率的にアスパラギン酸（特に、Ｌ－アスパラギン酸）又はその誘導体の生産に利用することが可能となり、アスパラギン酸又はその誘導体の生産効率の顕著な向上が期待できる。したがって、上記各実施形態の遺伝子組換え微生物は、アスパラギン酸又はその誘導体を生産するために用いることができる。「アスパラギン酸の誘導体」とは、遺伝子組換え微生物の細胞内で、アスパラギン酸が代謝されることにより生じる化合物をいう。アスパラギン酸の誘導体としては、β－アラニンが挙げられる。β－アラニンは、Ｌ－アスパラギン酸の脱炭酸反応によって生じる化合物である。当該反応は、アスパラギン酸－１－デカルボキシラーゼにより触媒される。
　さらに、本態様の遺伝子組換え微生物は、対応する野生型微生物又は条件（Ｉ）及び／又は条件（ＩＩ）を充足しない遺伝子組換え微生物と比較して、副生成物の生成量が少ないという特徴を有する。そのため、副生成物の含有量が低減されたアスパラギン酸組成物又はアスパラギン酸誘導体組成物を得ることができる。したがって、アスパラギン酸又はその誘導体の精製コストを低減することができ、工業用原料として使用した際に、副生成物による悪影響のリスクが低減される。
　副生成物としては、例えば、有機酸、並びにアスパラギン酸以外のアミノ酸又はアスパラギン酸及びその誘導体以外のアミノ酸が挙げられる。副生成物としての有機酸としては、例えば、乳酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、ｃｉｓ－アスコット酸、Ｄ－イソクエン酸、α－ケトグルタル酸、及びスクシニルＣｏＡ等が挙げられる。副生成物としてのアミノ酸としては、例えば、グルタミン酸、及びアラニン等が挙げられる。本態様の遺伝子組換え微生物において低減される副生成物としては、特に、乳酸、コハク酸、リンゴ酸、グルタミン酸、及びアラニンからなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。本態様の遺伝子組換え微生物は、対応する野生型微生物又は条件（Ｉ）及び／又は条件（ＩＩ）を充足しない遺伝子組換え微生物と比較して、乳酸、及びアラニンの生成量が低下していることが好ましく、乳酸、コハク酸、リンゴ酸、グルタミン酸、及びアラニンの全ての生成量が低下していることがより好ましい。
＜アスパラギン酸又はその誘導体を生産する方法＞
　本発明の第２の態様は、下記（ｐ）及び（ｑ）を含む、アスパラギン酸又はその誘導体を生産する方法である。
（ｐ）第１の態様に係る遺伝子組換え微生物の菌体又はその菌体処理物を用いてアスパラギン酸又はその誘導体を生成させること；及び
（ｑ）前記アスパラギン酸又はその誘導体を回収すること。
　工程（ｐ）では、第１の態様に係る遺伝子組換え微生物を、実質的に増殖可能である好気条件下において培養することにより、アスパラギン酸又はその誘導体を産生させてもよい。好気条件下では、コリネ型細菌においては、図１に示すＴＣＡサイクルが時計回りに代謝が進む。そのため、第１の態様に係る遺伝子組換え微生物では、オキサロ酢酸の蓄積量が増大し、アスパラギン酸又はその誘導体の産生が効率的に進み得る。
　他方、例えばＥ．ｃｏｌｉ等のエシェリキア属細菌やコリネ型細菌等の微生物は、還元条件下の培地や反応液では、実質的な増殖は伴わずに、還元条件下での特有な代謝系が機能する。したがって、このように還元条件下の培地や反応液においてコリネ型細菌又はその菌体処理物を反応させると、菌体細胞の増殖分裂による栄養源の浪費を取り除くことが可能となり、栄養源のアスパラギン酸への変換効率を向上させることができる。加えて、第１の態様に係る遺伝子組換え微生物は、条件（Ｉ）及び／又は条件（ＩＩ）を充足し、任意に条件（ＩＩＩ）～（ＶＩＩ）のいずれか又は全部を充足していることから、栄養源のアスパラギン酸への変換効率において格別顕著な向上が見込める。微生物が実質的に増殖しない還元条件下で反応を進める場合、細胞の分裂／増殖を伴う好気条件下でのバイオプロセスと比較して、発酵熱の発生を防止でき、培養時における十分なエアレーションを確保する必要も無くなる。そのため、バイオプロセスに要する設備の単純化及びエネルギーの低減が可能となり、地球環境に優しく、コスト削減にもつながる。
　したがって、工程（ｐ）において、遺伝子組換え微生物が実質的に増殖しない還元条件下の反応媒体（Ｘ）中で、該遺伝子組換え微生物の菌体又はその菌体処理物を反応させることによりアスパラギン酸又はその誘導体を産生させてもよい。
工程（ｐ’）について：
　本態様に係る方法は、工程（ｐ）の前に、
　（ｐ’）所定の培地（Ｙ）中で、好気条件下に、上記遺伝子組換え微生物を予め培養し及び増殖させること、をさらに含み、
　工程（ｐ’）において増殖させた該遺伝子組換え微生物の菌体又はその菌体処理物を工程（ｐ）に供してもよい。
　工程（ｐ’）を含める実施形態は、好気条件下での物質生産に係る実施形態においても想定される実施形態であるが、特に、遺伝子組換え微生物が実質的に増殖しない還元条件下の反応媒体（Ｘ）中で物質生産を行う場合に好ましく適用される。工程（ｐ’）として、好気条件下で、予め、遺伝子組換え微生物を一定程度まで増殖させ、次いで、工程（ｐ）において、増殖させた十分量の遺伝子組換え微生物を、該遺伝子組換え微生物が実質的に増殖しない反応媒体（Ｘ）において物質生産を進めれば、該遺伝子組換え微生物を、恰も化学触媒の如く利用して効率的な物質生産ができるからである。さらに加えて、該遺伝子組換え微生物は、反応媒体（Ｘ）における物質生産の後、場合によっては反応媒体（Ｘ）から回収し、２サイクル以降の工程（ｐ）の反応に再利用することも可能である。
　以下、工程（ｐ’）、工程（ｐ）、工程（ｑ）の順に、これらの工程で採用され得る具体的構成及び要素について詳述する。
（培地（Ｙ）を構成する基本培地）
　培地（Ｙ）は、特に限定されるものではなく、方法において用いる遺伝子組換え微生物の種類に応じて、適当なもので選択して用いれば良い。具体的には、培地（Ｙ）としては、炭素源、窒素源、無機塩類およびその他栄養物質等を含有する天然培地または合成培地を用いることができる。培地中に含まれる成分は、例えば以下のとおりである。
　炭素源としては、炭水化物、より具体的には多糖類、単糖類を含む糖類等の炭素含有物質、さらにこれらを含む各種材料等が挙げられ、例えば以下の成分が挙げられる。
　グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトース等の単糖類；スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロース等の二糖類；セルロース、デンプン、グリコーゲン、アガロース、ペクチン、アルギン酸等の多糖類；糖蜜（モラセス）等；稲わら、林地残材、バガス、コーンストーバー等の非可食農産廃棄物及び非可食性バイオマス（非可食性の草本植物や木本植物を原料とした資源）；スイッチグラス、ネピアグラス、ミスキャンサス等のエネルギー作物を糖化酵素などで糖化したグルコース及びキシロース等の複数の糖類を含む糖化液；マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリン等の糖アルコール；酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸等の有機酸；エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール；ノルマルパラフィン等の炭化水素。
　炭素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。
　窒素源としては、炭酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＣＯ３）、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機又は有機アンモニウム化合物；尿素；アンモニア水；硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の無機又は有機硝酸化合物等を使用できる。さらに、コーンスティープリカー、肉エキス、蛋白質加水分解物（カザミノ酸、トリプトン、ペプトン、ＮＺ－アミン等）、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。
　窒素源は、１種を単独で又は２種以上を組合せて用いることができる。窒素源の培地中の濃度は、採用する遺伝子組換え微生物の種類及びその性質、並びに窒素化合物の種類等の条件に応じて適宜調整すればよく、特に限定されるものでもないが、例えば約０．１～１０％（ｗ／ｖ）とすることができる。
　無機塩類としては、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム（水和物）、塩化ナトリウム、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。
　無機塩は、１種を単独で又は２種以上を混合して使用できる。無機塩類の培地中の濃度は、採用する遺伝子組換え微生物の種類及びその性質、並びに無機塩類の種類等の条件に応じて適宜調整すればよく、特に限定されるものでもないが、例えば約０．０１～１％（ｗ／ｖ）とすることができる。
　その他栄養物質としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、動植物又は微生物菌体のエキス、及びそれらの分解物等が挙げられる。その他栄養物質の培地中の濃度は、遺伝子組換え微生物の種類及びその性質、並びに栄養物質の種類等の条件に応じて適宜調整すればよく、特に限定されるものでもないが、例えば約０．１～１０％（ｗ／ｖ）とすることができる。
　培地（Ｙ）には、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、イノシトール等が挙げられる。
　必要に応じて、シリコーン系消泡剤やポリエーテル系消泡剤等の消泡剤を添加してもよく、細菌培地用の各種消泡剤が市販されているので、それらを利用してもよい。
　培地（Ｙ）のｐＨは、採用する遺伝子組換え微生物が生育できる程度であれば特に限定されるものでもないが、約６～８が好ましい。
　遺伝子組換え微生物がコリネ型細菌である場合、培地（Ｙ）として、Ａ培地（Inui,M. et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)）、ＢＴ培地（Omumasaba, C.A. et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol.8:91-103(2004)）、ＮＡ培地等が好ましく利用できる。
　このように、第１の態様に係る遺伝子組換え微生物を上述の如き培地（Ｙ）で培養し増殖させることにより菌体又はその菌体処理物を取得し、工程（ｐ）に供すればよい。
　遺伝子組換え微生物の培養条件については、該遺伝子組換え微生物が十分に増殖し、十分な量の菌体又はその菌体処理物が得られるように適宜設定すればよい。例えば、好気条件下で培養温度を約２５℃～３８℃とし、培養時間を約１２時間～４８時間培養させることができる。凍結乾燥や冷凍保存による菌体ストックについては、一度、固形培地に播種し、該固形培地で生育が確認されたコロニー等をさらに上述の培地（Ｙ）に植菌することにより工程（ｐ）に供試する遺伝子組換え微生物を調製することができる。
工程（ｐ）について：
　工程（ｐ）では、遺伝子組換え微生物の菌体又はその菌体処理物を用いてアスパラギン酸又はその誘導体を生成させる。
　「菌体又はその菌体処理物」の具体的形態については、アスパラギン酸又はその誘導体を産生できる状態のものであればよく、特に限定されるものでもない。
　いくつかの実施形態において、工程（ｐ’）で、培地（Ｙ）中で遺伝子組換え微生物を培養及び増殖させた後、培地（Ｙ）から遺伝子組換え微生物を回収又は分離することなく、該遺伝子組換え微生物を含む培地（Ｙ）をそのまま、工程（ｐ）に供してもよい。工程（ｐ）に先立ち、工程（ｐ’）で取得した遺伝子組換え微生物を含む培地（Ｙ）に、必要に応じて、炭素源（糖類）、窒素源、無機塩類、ビタミン類、還元剤等を追加し、工程（ｐ）に供してもよい。
　別の実施形態においては、工程（ｐ’）において培地（Ｙ）中で培養し及び増殖させた遺伝子組換え微生物を、培地（Ｙ）から分離及び回収し、取得した菌体そのものを、工程（ｐ）に供してもよい。あるいは、その菌体に所定の物理的又は化学的処理を施して得た菌体処理物を、工程（ｐ）に供してもよい。培地（Ｙ）から遺伝子組換え微生物を分離及び回収する手法としては、例えば、遠心分離、各種フィルターによる分離、デカンテーション等が挙げられる。「菌体処理物」は、工程（ｐ）のアスパラギン酸又はその誘導体の産生反応を実現できる限り、特に限定されるものでもないが、例えば、回収した菌体に対して各種薬剤処理を加えたもの；回収した菌体をアクリルアミド、カラギーナン、その他適当な高分子等のキャリアに固定化したもの等が挙げられる。
（還元条件下での反応）
≪反応媒体（Ｘ）の組成≫
　工程（ｐ）を、遺伝子組換え微生物が実質的に増殖しない還元条件下で実施する場合、反応媒体（Ｘ）を用いてもよい。反応媒体（Ｘ）の組成は、遺伝子組換え微生物が実質的に増殖せず、かつ遺伝子組換え微生物によるアスパラギン酸の産生反応を進行させる還元条件下の反応媒体（Ｘ）を実現するものである限り、特に限定されない。反応媒体（Ｘ）は、例えば炭素源、窒素源、及び無機塩類等を含有し、生物体等に由来する天然のものであってもよく、人工的に合成したものであってもよい。反応媒体（Ｘ）中に含まれる成分は、例えば以下のとおりである。
　炭素源としては、炭水化物、より具体的には多糖類、単糖類を含む糖類、さらにこれらを含む各種材料が挙げられ、例えば以下の成分が挙げられる。
　グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースのような単糖類；スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロース等の二糖類；セルロース、デンプン、グリコーゲン、アガロース、ペクチン、アルギン酸等の多糖類；糖蜜（モラセス）等；稲わら、林地残材、バガス、コーンストーバー等の非可食農産廃棄物及び非可食性バイオマス（非可食性の草本植物や木本植物を原料とした資源）；スイッチグラス、ネピアグラス、ミスキャンサス等のエネルギー作物を糖化酵素などで糖化したグルコース及びキシロース等の複数の糖類を含む糖化液；マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリン等の糖アルコール；酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸等の有機酸；エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール；ノルマルパラフィン等の炭化水素。
　これらの中でも、単糖類が好ましく、グルコースがより好ましい。グルコースを含む糖類（二糖、オリゴ糖、多糖）も好ましい。炭素源は、１種を単独で又は２種以上を組合せて用いることができる。反応媒体（Ｘ）中の炭素源の濃度は、約１～２０％（ｗ／ｖ）が好ましく、約２～１０（ｗ／ｖ％）がより好ましく、約２～５％（ｗ／ｖ）がさらにより好ましい。反応媒体（Ｘ）における糖類の濃度は、例えば約１～２０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは約２～１０％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは約２～５％（ｗ／ｖ）である。
　窒素源としては、炭酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＣＯ３）、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のような無機又は有機アンモニウム化合物；尿素；アンモニア水；硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の無機又は有機硝酸化合物を使用できる。コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、ＮＺ－アミン、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。
　窒素源は、１種を単独で又は２種以上を組合せて用いることができる。窒素源の反応液中の濃度は、用いる遺伝子組換え微生物の種類、反応条件、窒素化合物の種類等の条件に応じて適宜調整すればよく、特に限定されるものでもないが、例えば、約０．１～１０％（ｗ／ｖ）に調整することができる。
　無機塩類としては、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム（水和物）、塩化ナトリウム、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。
　無機塩類は、１種を単独で又は２種以上を組合せて用いることができる。無機塩類の反応液中の濃度は、用いる遺伝子組換え微生物の種類、反応条件、無機塩類の種類等の条件に応じて適宜調整すればよく、特に限定されるものでもないが、例えば約０．０１～１％（ｗ／ｖ）とすることができる。
　反応媒体（Ｘ）は、必要に応じて、ビタミン類を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、イノシトール等が挙げられる。
　反応媒体（Ｘ）のｐＨは、アスパラギン酸を生成する反応が進行する範囲となれば特に限定されるものでもないが、一般的には約６．０～８．０が好ましく、より好ましくは６．５～８．０、例えば７．５前後である。
　反応媒体（Ｘ）の基本組成の具体例としては、上述のＢＴ培地等が挙げられ、これらの培地の組成をベースとして、上述のとおり、炭素源（糖類）の濃度、窒素源の濃度、無機塩類の濃度、ビタミン類の濃度等を適宜調整することにより反応媒体（Ｘ）を調製することができる。
≪還元条件≫
　遺伝子組換え微生物が実質的に増殖しない還元条件とは、字義どおりに解釈して遺伝子組換え微生物が実質的に増殖しない程度に反応媒体が還元状態にあることを意味するが、より具体的には反応媒体の酸化還元電位で規定してもよい。反応媒体（Ｘ）の酸化還元電位は、約－２００ｍＶ～－５００ｍＶが好ましく、約－２５０ｍＶ～－５００ｍＶがより好ましく、－３００～４００ｍｍＶがさらに好ましい。
　反応媒体（Ｘ）の酸化還元電位は、酸化還元電位差計を用いて測定することができる。酸化還元電位差計は、市販品も存在することから、反応媒体（Ｘ）の酸化還元電位の測定には、それら市販品を利用してもよい。
　反応媒体（Ｘ）の還元状態は、簡便な方法としては、レサズリン指示薬（還元状態であれば、青色から無色への脱色）で推定できるが、より正確に制御したい場合は、酸化還元電位差計（例えば、ＢＲＯＡＤＬＥＹ　ＪＡＭＥＳ社製、ＯＲＰ　Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ）を用いて測定してもよい。
　還元条件にある反応媒体（Ｘ）の調製方法は、特に制限されることもなく各種手法を用いることができ、例えば、次のような反応液用水溶液を調製する公知の手法を利用することができる。
　即ち、反応媒体（Ｘ）の溶媒として、蒸留水等の代わりに反応液用水溶液を使用してもよい。反応液用水溶液の調製方法は、例えば硫酸還元微生物などの絶対嫌気性微生物用の培養液調製方法（Pfennig, N. et al., (1981) : The dissimilatory sulfate-reducing bacteria,In The Prokaryotes,A Handbook on Habitats Isolation and Identification of Bacteria,Ed.by Starr,M.P.et al., p926-940, Berlin,Springer Verlag.）及び「農芸化学実験書　第三巻、京都大学農学部　農芸化学教室編、１９９０年第２６刷、産業図書株式会社出版」などが参考となり、所望の還元条件下の水溶液を得ることができる。
　具体的には、蒸留水などを加熱処理や減圧処理して溶解ガスを除去することにより、還元条件の反応液用水溶液を得ることができる。この場合、約１０ｍｍＨｇ以下、好ましくは約５ｍｍＨｇ以下、より好ましくは約３ｍｍＨｇ以下の減圧下で、約１～６０分程度、好ましくは約５～４０分程度、蒸留水などを処理することにより、溶解ガス、特に溶解酸素を除去して還元条件下（嫌気状態）の反応液用水溶液を作成することができる。
　適当な還元剤（例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオン、硫化ソーダ等）を添加して還元条件の反応液用水溶液を調製することもできる。
　これらの方法を適宜組み合わせることも、有効な還元条件の反応液用水溶液の調製方法である。
　工程（ｐ）における反応中も、反応媒体（Ｘ）の還元状態を維持することが好ましい。反応中、継続的に反応媒体（Ｘ）の還元状態を維持するためには、反応系外からの酸素の混入を可能な限り防止することが望ましく、具体的には、反応系を窒素ガス等の不活性ガスや炭酸ガス等で封入する方法が挙げられる。酸素混入をより効果的に防止する方法としては、反応途中において好気性細菌の菌体内の代謝機能を効率よく機能させるために、反応系のｐＨ維持調整液の添加や各種栄養素溶解液を適宜添加する必要が生じる場合もあるが、このような場合には添加溶液から酸素を予め除去しておくことが有効である。
　本発明の方法が、工程（ｐ’）を含む場合において、工程（ｐ’）により遺伝子組換え微生物が増殖した培地（Ｙ）に対して、上記所定の操作を施し及び／又は還元剤を添加する等して、当該遺伝子組換え微生物が実質的に増殖しない還元条件を充足するように調整した当該培地（Ｙ）を、工程（ｐ）において反応媒体（Ｘ）として用いてもよい。
≪反応条件≫
　工程（ｐ）における反応温度は、アスパラギン酸又はその誘導体を生成する範囲であればよく、採用する遺伝子組換え微生物の性質等に応じて適宜に設定すればよく、特に限定されるものではない。典型的には、約２０～５０℃、好ましくは約２５～４７℃であり、より好ましくは約２７～３７℃であり、このような温度範囲であれば効率良くアスパラギン酸又はその誘導体を製造できる。
　反応時間は、アスパラギン酸又はその誘導体が得られるように適宜調整すればよく、特に限定されるものでもないが、例えば約１時間～約７日間、より効率的なアスパラギン酸又はその誘導体の生産の観点から約１時間～約３日間が好ましく、例えば約１時間～４８時間とすることができる。
　反応は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、バッチ式が好ましい。
（低溶存酸素濃度条件下での反応）
≪反応媒体（Ｘ’）の組成≫
　工程（ｐ）は、低溶存酸素濃度条件下で行ってもよい。低溶存酸素濃度条件としては、例えば、溶存酸素濃度０．５ｍｇ／Ｌ以下が挙げられる。低溶存酸素濃度条件としては、溶存酸素濃度が、０．４ｍｇ／ｍＬ以下、０．３５ｍｇ／ｍＬ以下、０．３ｍｇ／ｍＬ以下、又は０．２５ｍｇ／ｍＬ以下が挙げられる。低溶存酸素濃度条件における溶存酸素濃度の範囲としては、例えば、０．００１～０．５ｍｇ／Ｌ、０．０１～０．４ｍｇ／Ｌ、０．０５～０．３ｍｇ／Ｌ、０．０５～０．２５ｍｇ／Ｌ、０．０５～０．２ｍｇ／Ｌ、又は０．１～０．２ｍｇ／Ｌが挙げられる。低溶存酸素濃度条件は、飽和溶存酸素濃度に対する相対値で規定されてもよい。例えば、低溶存酸素濃度条件において、溶存酸素濃度は、飽和溶存酸素濃度を１００としたときの相対値が１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、又は５以下であってもよい。低溶存酸素濃度条件における溶存酸素濃度は、飽和溶存酸素濃度を１００としたときの相対値が０．１～１０、０．５～９、０．５～８、０．５～７、０．５～６、０．５～５、０．５～４、又は１～３の範囲であってもよい。前記飽和溶存酸素濃度は、１気圧、反応温度で、反応媒体に溶け込む酸素の飽和濃度を意味する。１気圧、反応温度で、反応媒体に通気を行い、溶存酸素センサー（ＤＯセンサー）で溶存酸素濃度を測定し、溶存酸素濃度が安定したときの値を飽和溶存酸素濃度として採用することができる。
　工程（ｐ）を低溶存酸素条件下で行う場合、低溶存酸素濃度である反応媒体（Ｘ’）中で、遺伝子組換え微生物又はその菌体処理物を反応させることによりアスパラギン酸を産生させてもよい。低溶存酸素濃度である反応媒体（Ｘ’）の酸化還元電位は、約－２００ｍＶ～－５００ｍＶであり得る。したがって、低溶存酸素条件下での反応は、還元条件下での反応であるともいえる。低溶存酸素条件下で用いる反応媒体（Ｘ’）は、上述の還元条件下で用いる反応媒体（Ｘ）と同じであってもよい。反応媒体（Ｘ’）の酸化還元電位は、約－２５０ｍＶ～－５００ｍＶが好ましく、－３００～４００ｍｍＶがより好ましい。
　反応媒体（Ｘ’）の組成は、遺伝子組換え微生物によるアスパラギン酸又はその誘導体の産生反応を進行させるものである限り、特に限定されない。反応媒体（Ｘ’）は、例えば炭素源、窒素源、及び無機塩類等を含有し、生物体等に由来する天然のものであってもよく、人工的に合成したものであってもよい。炭素源、窒素源、及び無機塩類としては、反応媒体（Ｘ）と同様のものが挙げられる。反応媒体（Ｘ’）は、反応媒体（Ｘ）から還元剤を除いたものであってもよい。反応媒体（Ｘ’）は、遺伝子組換え微生物によるアスパラギン酸の産生反応を阻害しない限り、遺伝子組換え微生物の増殖を阻害する抗生物質を含んでもよい。抗生物質としては、例えば、クロラムフェニコール等が挙げられる。
　反応媒体（Ｘ’）のｐＨは、アスパラギン酸又はその誘導体を生成する反応が進行する範囲となれば特に限定されるものでもないが、一般的には約６．０～８．５が好ましく、より好ましくは６．５～８．５、例えば８前後である。
　反応媒体（Ｘ’）の基本組成の具体例としては、炭素源、窒素源、及び抗生物質を含むものが挙げられ、より具体的には、グルコース、硫酸アンモニウム、及びクロラムフェニコールを含むものが挙げられる。
≪反応条件≫
　反応温度は、特に限定されないが、例えば、１５～５０℃、好ましくは２０～４７℃、より好ましくは２０～３７℃、さらに好ましくは２０～３０℃とすることができる。
　反応時間は、特に限定されないが、例えば、約１時間～約７日間、好ましくは約１時間～約３日間、より好ましくは約１時間～４８時間とすることができる。
　反応は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、流加式が好ましい。
　低溶存酸素条件下での反応では、反応中に菌体又は菌体処理物中に蓄積するＮＡＤＨを消費させるために、撹拌及び／又は通気を行ってもよい。撹拌を行う場合、撹拌速度は、特に限定されないが、例えば、１００～８００ｒｐｍ、好ましくは２００～６００ｒｐｍ、より好ましくは３００～５００ｒｐｍとすることができる。通気を行う場合、通気速度は、特に限定されないが、例えば、１～２０ｍＬ／分、好ましくは２～１５ｍＬ／分、より好ましくは３～１０ｍＬ／分、さらに好ましくは３～８ｍＬ／分とすることができる。撹拌及び／又は通気を行う場合、反応媒体（Ｘ’）の溶存酸素濃度が０．５ｍｇ／Ｌ以下となるように調整することが好ましい。反応媒体（Ｘ’）の溶存酸素濃度は、溶存酸素計を用いて測定することができる。反応媒体（Ｘ’）の酸化還元電位は、約－２５０ｍＶ～－５００ｍＶとなるように調整することが好ましい。反応媒体（Ｘ’）の酸化還元電位は、酸化還元電位差計を用いて測定することができる。
（高密度条件）
　工程（ｐ）は、遺伝子組換え微生物の高密度条件下で実施されてもよい。上述の還元条件下及び低溶存酸素条件下のいずれにおいても、工程（ｐ）を高密度条件下で実施することができる。「遺伝子組換え微生物の高密度条件下」とは、反応媒体（Ｘ）又は反応媒体（Ｘ’）中に遺伝子組換え微生物が高密度で存在する状態を意味する。高密度条件下での反応では、例えば、反応媒体（Ｘ）又は反応媒体（Ｘ’）におけるＯＤ６１０における菌体濁度が、１５０～３００程度、好ましくは２００～２５０程度となるように調整することができる。「ＯＤ６１０」は、波長６１０ｎｍで測定される菌液の光学密度を意味する。
　工程（ｐ）の反応終了後、反応媒体（Ｘ）又は反応媒体（Ｘ’）から遺伝子組換え微生物又はその菌体処理物を遠心分離等の適当な操作により回収し、回収した遺伝子組換え微生物又はその菌体処理物を再利用して工程（ｐ）を複数回繰り返してもよい。このように遺伝子組換え微生物又はその菌体処理物を再利用して工程（ｐ）を複数回繰り返すことは、生産コストの削減に繋がり、効率的なアスパラギン酸の生産を実現できる。
工程（ｑ）について：
　工程（ｐ）においてアスパラギン酸又はその誘導体を生成させた後、工程（ｑ）として、アスパラギン酸又はその誘導体を回収する。「アスパラギン酸又はその誘導体を回収する（こと）」と言う用語は、アスパラギン酸又はその誘導体を含有する遺伝子組換え微生物及び／又は培養液若しくは反応媒体を採取することにより、アスパラギン酸又はその誘導体を回収することを包含する概念である。
　工程（ｑ）では、アスパラギン酸又はその誘導体を含有する遺伝子組換え微生物及び／又は培養液若しくは反応媒体を採取することにより、アスパラギン酸又はその誘導体を回収してもよい。さらに、アスパラギン酸又はその誘導体を含有する培養液若しくは反応媒体（反応媒体（Ｘ）、反応媒体（Ｘ’）等）又は遺伝子組換え微生物菌体若しくはその菌体処理物から、アスパラギン酸又はその誘導体を分離及び／又は精製するなどして、アスパラギン酸又はその誘導体を回収してもよい。
　アスパラギン酸又はその誘導体の分離及び／又は精製プロセスを採用する実施形態において、アスパラギン酸又はその誘導体の分離及び精製プロセスには、アスパラギン酸又はその誘導体の用途を考慮して、必要とされる純度等に応じて、適当な分離／精製技術を採用すればよい。特に限定されるものでもないが、例えば、各種晶析法；限外濾過法等の各種濾過技術；イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、及び逆相クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー技術；濃縮法；透析；並びに活性炭吸着法等を適宜組み合わせて、アスパラギン酸又はその誘導体を回収することができる。これら物質の分離精製技術は各種のものが知られているので、それらを適宜利用すればよい。
　さらに、本態様にかかる方法は、任意にアスパラギン酸又はその誘導体を洗浄し、乾燥し、破砕し、粉体化又は粒状化し、及び／又は梱包する等の工程をさらに含んでも良い。
　本態様にかかる方法では、第１の態様に係る遺伝子組換え微生物を用いてアスパラギン酸又はその誘導体の生産を行う。そのため、アスパラギン酸又はその誘導体を効率よく生産することができる。さらに、第１の態様に係る遺伝子組換え微生物は、アスパラギン酸の生産の際に生じる副生成物（アスパラギン酸以外のアミノ酸、有機酸等）の生成量を低減することができる。より具体的には、乳酸、コハク酸、リンゴ酸、グルタミン酸、及びアラニンからなる群より選択される少なくとも１種の生成量を低減することができる。好ましくは、乳酸、及びアラニンの生成量を低減することができる。より好ましくは、乳酸、コハク酸、リンゴ酸、グルタミン酸、及びアラニンの全ての生成量を低減することができる。本明細書において「アラニン」と記載する場合、特に明記しない限り、「α－アラニン」を指す。
　例えば、本態様の方法では、条件（Ｉ）を充足する遺伝子組換え微生物を用いた場合、乳酸に関し、条件（Ｉ）を充足していない対応する野生型微生物又は遺伝子組換え微生物を用いたときの生成量を１としたときの相対生成量を０．９以下、０．８以下、０．７以下、０．６以下、０．５以下、０．４以下、又は０．３以下に低減し得る。
　例えば、本態様の方法では、条件（Ｉ）を充足する遺伝子組換え微生物を用いた場合、コハク酸に関し、条件（Ｉ）を充足していない対応する野生型微生物又は遺伝子組換え微生物を用いたときの生成量を１としたときの相対生成量を０．９以下、０．８以下、０．７以下、０．６以下、０．５以下、０．４以下、０．３以下、又は０．２以下に低減し得る。
　本態様の方法では、条件（Ｉ）を充足する遺伝子組換え微生物を用いた場合、リンゴ酸に関し、条件（Ｉ）を充足していない対応する野生型微生物又は遺伝子組換え微生物を用いたときの生成量を１としたときの相対生成量を０．９５以下、０．９以下、０．８９以下、０．８８以下、０．８以下、０．７以下、又は０．６以下に低減し得る。
　本態様の方法では、条件（Ｉ）を充足する遺伝子組換え微生物を用いた場合、グルタミン酸に関し、条件（Ｉ）を充足していない対応する野生型微生物又は遺伝子組換え微生物を用いたときの生成量を１としたときの相対生成量を０．９以下、０．８以下、０．７以下、０．６以下、０．５以下、０．４以下、０．３以下、又は０．２以下に低減し得る。
　本態様の方法では、条件（Ｉ）を充足する遺伝子組換え微生物を用いた場合、アラニンに関し、条件（Ｉ）を充足していない対応する野生型微生物又は遺伝子組換え微生物を用いたときの生成量を１としたときの相対生成量を０．９５以下、０．９以下、０．８９以下、０．８８以下、０．８７以下、０．８５以下、０．８４以下、０．８以下、０．７以下、又は０．６以下に低減し得る。
　本態様にかかる方法では、上記のように、副生成物の生成量を低減できるため、アスパラギン酸又はその誘導体に混入する不純物の含有量を低減することができる。そのため、本態様にかかる方法で得られたアスパラギン酸又はその誘導体は、工業用原料として好適に用いることができる。
　本態様にかかる方法により得られるアスパラギン酸又はその誘導体の用途は、特に限定されないが、例えば、医薬用途、食品用途、工業用途、燃料用途、化粧品用途等が挙げられる。アスパラギン酸又はその誘導体は、各種用途に実際に使用される物質であってもよく、又は最終産物の製造に用いるための中間原料であってもよい。
　以上、本発明の具体的な実施形態について詳述したが、本発明は上述の実施形態に限定されるものではない。本発明の要旨から逸脱しない範囲において各構成、要素及び特徴について種々の改変、修正、組合せが採用され得る。本発明は前述した説明によって限定されることはなく、添付のクレームの範囲によってのみ限定される。
　「含む」及び「有する」の語はそれぞれ、特に断わりのない限り、これらの語が目的語として言及する要素以外の要素の存在を排除するものではなく、これらの用語は混用される。
　タンパク質、核酸、ベクター、細胞、及び微生物は、単離されたものであり得る。「単離された」とは、天然状態又は他の成分から分離された状態を意味する。「単離された」ものは、他の成分を実質的に含まないものであり得る。「他の成分を実質的に含まない」とは、単離された成分に含まれる他の成分の含有量が無視できる程度であることを意味する。単離された成分に含まれる他の成分の含有量は、例えば、１０質量％以下、５質量％以下、４質量％以下、３質量％以下、２質量％以下、１質量％以下、０．５質量％以下、又は０．１質量％以下であり得る。本明細書に記載されるタンパク質、核酸、ベクター、細胞、及び微生物は、単離されたタンパク質、単離された核酸、単離されたベクター、単離された細胞、及び単離された微生物であり得る。
　本明細書において言及される各文献の内容は、本明細書の一部を構成するものとしてここに援用される。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜クエン酸シンターゼ活性の低減株の作出＞
　コリネバクテリウム・グルタミカム　ＡＴＣＣ１３０３２株をから作製されたＧＥＳ５２４／ｐＧＥ３３３株（国際公報第２０２０／２０８８４２号）を出発材料として、クエン酸シンターゼ活性の低減株を作出した。ＧＥＳ５２４／ｐＧＥ３３３株は、Ｄ２９９Ｎ／Ｋ８１３Ｓの組合せによるアミノ酸置換を有する変異型ｐｐｃ遺伝子（ｐｐｃｆｂｒ）を保有し、かつｌｄｈ遺伝子、ｓｄｈＣＡＢ遺伝子並びにｐｏｘＢ遺伝子（ピルビン酸：キノンオキシドレダクターゼ）の３つの遺伝子を欠損している（コリネバクテリウム・グルタミカム　ＡＴＣＣ１３０３２　ΔＩｄｈΔｓｄｈΔｐｏｘＢ　ｐｃｃｆｂｒ）。
　ＮＣＢＩより、コリネバクテリウム・グルタミカム　ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノム配列（ＮＣ００３４５０．３）を取得した。前記ゲノム配列から、ｇｌｔＡのプロモーターＰ１（Ｐ１ｇｌｔＡ）を含む領域（８７７６６８～８７７８２６）の上流領域（８７６６６８～８７７６６７）及び下流領域（８７７８２７～８７８８２６）を相同領域として設定した。ＧＥＳ５２４／ｐＧＥ３３３株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより、ｇｌｔＡのプロモーターＰ１の上流領域及び下流領域をそれぞれ増幅した。上流領域の増幅には、プライマーＦ１及びＲ１を用いた。下流領域の増幅には、プライマーＦ２及びＲ２を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　Ｐ１ｇｌｔＡの上流領域及び下流領域のＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩで制限酵素処理することにより線状化したプラスミドｐＧＥ０１５に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて連結し、クローニングした。このようにして得られたプラスミドを、プラスミドΔＰ１ｇｌｔＡと命名した。
　プラスミドｐＧＥ０１５は、プラスミドｐＨＳＧ２９９（タカラバイオ）のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに、ｓａｃＢ遺伝子を挿入したプラスミドである（国際公報第２０２０／２０８８４２号）。プラスミドｐＧＥ０１５は、カナマイシン耐性遺伝子及びｓａｃＢ遺伝子を有する。
　プラスミドΔＰ１ｇｌｔＡを、電気パルス法（２５００Ｖ，２５μＦ，２００Ω；Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｒｅｓｔ　ｅｔ　ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　５２，ｐｐ５４１－５４５，１９９９）により、ＧＥＳ５２４／ｐＧＥ３３３株へ導入した。電気パルス法後の試料は、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＡ寒天培地（培地１Ｌ中の組成：尿素：２ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４：７ｇ，ＫＨ２ＰＯ４：０．５ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４：０．５ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：６ｍｇ，ＭｎＳＯ４・ｎＨ２Ｏ：４．２ｍｇ，Ｄ－ビオチン：２００μｇ，塩酸チアミン：２００μｇ，酵母エキス：２ｇ，カザミノ酸：７ｇ，グルコース：２０ｇ，寒天：１６ｇを蒸留水に１０００ｍｌ溶解（ｐＨ６．６））に塗布し、常法により培養した。
　プラスミドΔＰ１ｇｌｔＡは、薬剤耐性マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を有していることから、カナマイシンを含むＡ寒天培地上で増殖した生育株は、プラスミドΔＰ１ｇｌｔＡが染色体上のＰ１ｇｌｔＡと１点相同組換えを起こして、前記プラスミドごとゲノムＤＮＡに組み込まれた株である（図２参照）。
　このようにして取得した生育株を、１０％スクロースを添加したＬＢ寒天培地（培地１Ｌ中の組成：バクトペプトン：１０ｇ、酵母エキス：５ｇ、塩化ナトリウム：１０ｇ、寒天：１６ｇ）に塗布し、常法により培養した。プラスミドΔＰ１ｇｌｔＡに由来のＳａｃＢ遺伝子が保持された形質転換体は、スクロースを添加した培地上では、毒性物質が産生されることから生存することができない。一方、再度の相同組換えによりｓａｃＢ遺伝子を含むプラスミド由来の領域が抜け落ちた形質転換体は、スクロースが添加された培地でも生存できることから、プラスミド由来の領域が抜け落ち、かつＰ１ｇｌｔＡが欠損した形質転換体が生育株として得られる。再度の相同組換えの際に、完全なプラスミドΔＰ１ｇｌｔＡの形態でプラスミド全領域が抜け落ちるものは、ｇｌｔＡ遺伝子のＰ１プロモーターをインタクトに保持するＧＥＳ５２４／ｐＧＥ３３３株の形質に戻る。
　上記のとおりＬＢ寒天培地上で生育株として取得された菌体コロニーの中から、プライマーＦ１及びプライマーＲ２を用いたコロニーＰＣＲ法により、Ｐ１ｇｌｔＡ欠損株をスクリーニングした。
　プライマーＦ１及びプライマーＲ２は、Ｐ１ｇｌｔＡの上流約１０００ｂｐの領域の５’端と、Ｐ１ｇｌｔＡの下流約１０００ｂｐの領域の３’端にそれぞれ設計したプライマーであることから、Ｐ１ｇｌｔＡを欠損した菌株であれば、約２ｋｂのＤＮＡ断片が得られるはずである。そこで、コロニーＰＣＲで得られたＤＮＡ断片のアガロース電気泳動法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８９　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）を行い、Ｐ１ｇｌｔＡの欠損が確認されたコロニー菌体をＰ１ｇｌｔＡ欠損株として取得した。
＜Ｐ１ｇｌｔＡ欠損株によるアスパラギン酸の製造＞
（菌体の培養）
　Ｐ１ｇｌｔＡ欠損株又はＧＥＳ５２４／ｐＧＥ３３３株を、－８０℃のグリセロールストックからかき取って、Ａ培地（１Ｌの組成：尿素：２ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４：７ｇ，ＫＨ２ＰＯ４：０．５ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４：０．５ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：６ｍｇ，ＭｎＳＯ４・ｎＨ２Ｏ：４．２ｍｇ，Ｄ－ビオチン：２００μｇ，塩酸チアミン：２００μｇ，酵母エキス：２ｇ，カザミノ酸：７ｇ，グルコース：２０ｇ）のプレート（１．５％寒天）に植え継ぎ、３３℃の培養器（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ　ＭＩＲ－１６２ＰＪ）で一晩培養した。プレートから菌体をかき取り、１０ｍｌのＡ培地を入れた試験管に植え継ぎ、振盪培養器（ＴＩＴＥＣ　ＢＲ－４３ＦＬ）を用いて、３３℃、２００ｒｐｍで１２時間培養した。培養後、試験管中の菌体を全量、１００ｍｌのＡ培地をいれた５００ｍｌの三角フラスコに移し、さらに振盪培養器（ＴＩＴＥＣ　ＢＲ－４３ＦＬ）を用いて、３３℃、２００ｒｐｍで１２時間培養した。
　菌体の本培養は１０Ｌジャー（ＢＭＳ－１０ＮＰ４，ＡＢＬＥ）を用いて行った。ベッセルに水６２００ｍｌ、モラセス（北海道糖業）８００ｍｌ、ＫＨ２ＰＯ４　７ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　５ｇ、消泡剤（ＣＢ－４４２，日油）１０ｍｌを入れてオートクレーブ滅菌した。これに、２ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌカナマイシン溶液と１００ｍｌのＡ培地で培養した菌体を全量入れて培養をスタートした。ジャー培養の条件は以下の通りとした。
　温度：３５℃
　ｐＨ：７．０
　攪拌：６００ｒｐｍ
　通気：５Ｌ／分
　ｐＨ調整液：１６Ｎ　ＮＨ３
　２０～２４時間培養し、ＯＤ６１０＝６０に達した段階で培養を終了した。遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ　ｃｏｕｌｔｅｒ　Ａｖａｎｔｉ　Ｊ－２６Ｓ）により培地成分を除去して、菌体を得た。菌体は２００ｍｌの水で懸濁し、菌体懸濁液の全量が１Ｌになるようにさらに水を添加した。
（アスパラギン酸の製造）
　上記のように調製した菌体懸濁液を用いて、下記の反応液を調製し、アスパラギン酸の製造を行った。
　菌体懸濁液：５０ｍｌ
　５０％（ｗ／ｖ）　Ｇｌｕｃｏｓｅ：１０ｍｌ
　２Ｍ　（ＮＨ４）２ＳＯ４：１０ｍｌ
　５０ｍｇ／ｍｌ　クロラムフェニコール：２５μｌ
　水：３０ｍｌ
　上記のように反応液を調製したところ、反応液の菌体の濁度はＯＤ６１０＝２００～２５０程度となった。反応は、Ｂｉｏ　Ｊｒ．８（ＡＢＬＥ）を用いて、以下の条件で行なった。ｐＨ調整液には、２Ｍの（ＮＨ４）２ＣＯ３を使用した。
　温度：２１℃
　ｐＨ：８．０
　攪拌：４００ｒｐｍ
　通気：５ｍｌ／分
　反応液の酸化還元電位を反応開始時（０時間）、並びに反応開始から１６時間後及び２４時間後に測定した。その結果、反応液の酸化還元電位は、－３９８～－３３５ｍＶであった。反応期間中の反応液の溶存酸素濃度は、０．５ｍｇ／Ｌ以下で維持されると考えられた。
　反応開始から１６時間後及び２４時間後に、反応液を０．５ｍｌずつ採取し、遠心分離して上清を回収した。回収した上清は、グルコース濃度、アミノ酸濃度、及び有機酸濃度を測定に供した。グルコース濃度の測定は、バイオセンサ（王子計測機器ＢＦ－７）を用いて行った。アミノ酸の測定は、アミノ酸分析システムＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ　（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いて行った。有機酸の測定は、ＴＳＫｇｅｌ　ＯＡｐａｋ－Ａ　（ＴＯＳＯＨ）のカラムを用いて、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ　（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）のＨＰＬＣシステムにより行った。
（結果）
　結果を表１４～１７に示す。アスパラギン酸の生産量を表１４に示す。グルコース１ｇ当たりのアスパラギン酸の収率を表１５に示す。副生成物の生成量を表１６に示す。グルコース１ｇ当たりの副生成物の生成量を表１７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　表１４～１５に示す結果より、Ｐ１ｇｌｔＡ欠損株では、Ｐ１ｇｌｔＡ非欠損株（ＧＥＳ５２４／ｐＧＥ３３３株）と比較して、アスパラギン酸の生産量及び収率が増加することが確認された。また、表１６～１７に示す結果より、Ｐ１ｇｌｔＡ欠損株では、Ｐ１ｇｌｔＡ非欠損株（ＧＥＳ５２４／ｐＧＥ３３３株）と比較して、副生成物の生成量及び収率が低減することが確認された。
　ＧｌｔＡの活性抑制はＴＣＡ回路への炭素源の供給を抑制するため、一般的にはその上流にあるピルビン酸由来の乳酸やアラニンの生成量が増加すると予想される。実際に、ＧｌｔＡ経由で生成されるＴＣＡ回路の代謝産物であるコハク酸やグルタミン酸生成量及び収率は大きく減少したことから（表１６～１７）、ＧｌｔＡの活性抑制によりＴＣＡ回路への炭素源の供給が阻害されることが確認された。興味深いことに、Ｐ１ｇｌｔＡ欠損株では、非欠損株（ＧＥＳ５２４／ｐＧＥ３３３株）と比較して、乳酸及びアラニンの生成量及び収率が低減していた（表１６～１７）。これは予想と異なった結果であり、このような効果を記載した先行文献はほとんど存在しない。
＜オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ活性の低減株の作出＞
　コリネバクテリウム・グルタミカム　ＡＴＣＣ１３０３２株をから作製されたＧＥＳ５２４／ｐＧＥ３３３株（国際公報第２０２０／２０８８４２号）を出発材料として、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ活性の低減株を作出した。
　コリネバクテリウム・グルタミカム　ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノム配列（ＮＣ００３４５０．３）から、ｏｄｘを含む領域（１３５８２５９～１３５９０６５）の上流領域及び下流領域を相同領域として設定した。ＧＥＳ５２４／ｐＧＥ３３３株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより、ｏｄｘの上流領域及び下流領域をそれぞれ増幅した。
　ｏｄｘの上流領域及び下流領域のＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩで制限酵素処理することにより線状化したプラスミドｐＧＥ０１５に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて連結し、クローニングした。このようにして得られたプラスミドを、プラスミドΔｏｄｘと命名した。
　プラスミドΔｏｄｘを、電気パルス法（２５００Ｖ，２５μＦ，２００Ω；Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｒｅｓｔ　ｅｔ　ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　５２，ｐｐ５４１－５４５，１９９９）により、ＧＥＳ５２４／ｐＧＥ３３３株へ導入した。電気パルス法後の試料は、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＡ寒天培地に塗布し、常法により培養した。
　プラスミドΔｏｄｘは、薬剤耐性マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を有することから、カナマイシンを含むＡ寒天培地上で増殖する生育株は、プラスミドΔｏｄｘが染色体上のｏｄｘと１点相同組換えを起こして、前記プラスミドごとゲノムＤＮＡに組み込まれる株である。このようにして取得する生育株を、１０％スクロースを添加したＬＢ寒天培地に塗布し、常法により培養した。ＬＢ寒天培地上で生育株として取得された菌体コロニーの中から、コロニーＰＣＲ法により、ｏｄｘ欠損株をスクリーニングした。
＜ｏｄｘ欠損株によるアスパラギン酸の製造＞
　Ｐ１ｇｌｔＡ欠損株に替えてｏｄｘ欠損株を用いること以外は、上記＜Ｐ１ｇｌｔＡ欠損株によるアスパラギン酸の製造＞と同様に、菌体の培養、及びアスパラギン酸の製造を行った。ｏｄｘ欠損株では、ｏｄｘ非欠損株（ＧＥＳ５２４／ｐＧＥ３３３株）と比較して、アスパラギン酸の生産量及び収率が増加することが確認された。ｏｄｘ欠損株では、ｏｄｘ非欠損株（ＧＥＳ５２４／ｐＧＥ３３３株）と比較して、アラニンの生成量及び収率が低減することが確認された。

Claims (9)

  1. 　下記の条件（Ｉ）及び（ＩＩ）からなる群より選択される少なくとも１つの条件を充足する、遺伝子組換え微生物：
    　条件（Ｉ）前記遺伝子組換え微生物に対応する野生型微生物と比較して、クエン酸シンターゼ活性が低減され又は不活化されていること；及び
    　条件（ＩＩ）前記野生型微生物と比較して、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ活性が低減され又は不活化されていること。
  2. 　さらに、下記条件（ＩＩＩ）～（ＶＩ）からなる群より選択される少なくとも１つの条件を充足する、請求項１に記載の遺伝子組換え微生物：
    　条件（ＩＩＩ）前記野生型微生物と比較して、コハク酸デヒドロゲナーゼ活性又はフマル酸還元酵素活性が低減され又は不活化されていること；
    　条件（ＩＶ）前記野生型微生物と比較して、乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低減され又は不活化されていること；
    　条件（Ｖ）野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性におけるアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対し抵抗性を示す改変型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性、又は前記野生型微生物が示す野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性よりもアスパラギン酸によるフィードバック阻害に対する抵抗性が高い外来性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有すること；及び
    　条件（ＶＩ）前記野生型微生物と比較して、ピルビン酸：キノンオキシドレダクターゼ活性が低減され又は不活化されていること。
  3. 　上記条件（Ｉ）を充足する、請求項１又は２に記載の遺伝子組換え微生物。
  4. 　グラム陽性細菌に属する遺伝子組換え微生物である、請求項１又は２に記載の遺伝子組換え微生物。
  5. 　アスパラギン酸又はその誘導体を生産するための遺伝子組換え微生物である、請求項１又は２に記載の遺伝子組換え微生物。
  6. 　前記条件（Ｉ）を充足しない微生物と比較して、アスパラギン酸以外のアミノ酸、及び有機酸からなる群より選択される少なくとも１種の副生成物の生成量が低下している、請求項５に記載の遺伝子組換え微生物。
  7. 　（ｐ）請求項１又は２に記載の遺伝子組換え微生物の菌体又はその菌体処理物を用いてアスパラギン酸又はその誘導体を生成させること；及び
    　（ｑ）前記アスパラギン酸又はその誘導体を回収すること、
    　を含む、アスパラギン酸又はその誘導体を生産する方法。
  8. 　前記（ｐ）を溶存酸素濃度が０．５ｍｇ／Ｌ以下である反応媒体中で行う、請求項７に記載のアスパラギン酸又はその誘導体を生産する方法。
  9. 　前記条件（Ｉ）を充足しない微生物の菌体又はその菌体処理物を用いてアスパラギン酸を生産した場合と比較して、アスパラギン酸以外のアミノ酸、及び有機酸からなる群より選択される少なくとも１種の副生成物の生成量が低減される、
    　請求項７に記載のアスパラギン酸又はその誘導体を生産する方法。
PCT/JP2022/043626 2021-11-26 2022-11-25 遺伝子組換え微生物、及びアスパラギン酸を生産する方法 WO2023095896A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023562172A JPWO2023095896A1 (ja) 2021-11-26 2022-11-25

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021-192344 2021-11-26
JP2021192344 2021-11-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023095896A1 true WO2023095896A1 (ja) 2023-06-01

Family

ID=86539606

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/043626 WO2023095896A1 (ja) 2021-11-26 2022-11-25 遺伝子組換え微生物、及びアスパラギン酸を生産する方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2023095896A1 (ja)
WO (1) WO2023095896A1 (ja)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58170488A (ja) * 1982-03-31 1983-10-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−アスパラギン酸の製造法
WO2007019301A2 (en) * 2005-08-05 2007-02-15 Michigan State University Genes from actinobacillus succinogenes 13oz (atcc 55618) for production of chemicals from the a. succinogenes c4-pathway
JP2013516958A (ja) * 2010-01-15 2013-05-16 味の素株式会社 Ｌ−アスパラギン酸又はｌ−アスパラギン酸より誘導される代謝産物を生産する腸内細菌科の細菌、及びｌ−アスパラギン酸又はｌ−アスパラギン酸より誘導される代謝産物の製造方法
WO2020208842A1 (ja) * 2019-04-12 2020-10-15 Ｇｒｅｅｎ Ｅａｒｔｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ 株式会社 遺伝子組換え微生物及びこれを用いた目的物質の生産方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58170488A (ja) * 1982-03-31 1983-10-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−アスパラギン酸の製造法
WO2007019301A2 (en) * 2005-08-05 2007-02-15 Michigan State University Genes from actinobacillus succinogenes 13oz (atcc 55618) for production of chemicals from the a. succinogenes c4-pathway
JP2013516958A (ja) * 2010-01-15 2013-05-16 味の素株式会社 Ｌ−アスパラギン酸又はｌ−アスパラギン酸より誘導される代謝産物を生産する腸内細菌科の細菌、及びｌ−アスパラギン酸又はｌ−アスパラギン酸より誘導される代謝産物の製造方法
WO2020208842A1 (ja) * 2019-04-12 2020-10-15 Ｇｒｅｅｎ Ｅａｒｔｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ 株式会社 遺伝子組換え微生物及びこれを用いた目的物質の生産方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHRISTIAN RIEDEL, DORIS RITTMANN, PETRA DANGEL, BETTINA MÖCKEL, SÖREN PETERSEN, HERMANN SAHM, BERNHARD J. EIKMANNS: "Characterization of the phosphoenolpyruvate carboxykinase gene from Corynebacterium glutamicum and significance of the enzyme for growth and amino acid production", JOURNAL OF MOLECULAR MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, KARGER, CH, vol. 3, no. 4, 1 January 2001 (2001-01-01), CH , pages 573 - 583, XP001031161, ISSN: 1464-1801 *
S. KLAFFL, B. J. EIKMANNS: "Genetic and Functional Analysis of the Soluble Oxaloacetate Decarboxylase from Corynebacterium glutamicum", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY ¬ETC.|, vol. 192, no. 10, 15 May 2010 (2010-05-15), pages 2604 - 2612, XP055189777, ISSN: 00219193, DOI: 10.1128/JB.01678-09 *
YANASE MASAKI; AIKOH TOHRU; SAWADA KAZUNORI; OGURA KOTARO; HAGIWARA TAKUYA; IMAI KEITA; WADA MASARU; YOKOTA ATSUSHI: "Pyruvate kinase deletion as an effective phenotype to enhance lysine production inCorynebacterium glutamicumATCC13032: Redirecting the carbon flow to a precursor metabolite", JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 122, no. 2, 13 March 2016 (2016-03-13), NL , pages 160 - 167, XP029621596, ISSN: 1389-1723, DOI: 10.1016/j.jbiosc.2015.12.023 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2023095896A1 (ja) 2023-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107034250B (zh) 谷氨酸类l-氨基酸的制造方法
JP4427878B2 (ja) 析出を伴う発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法
CN103396976B (zh) L-谷氨酸类氨基酸生产微生物以及氨基酸的生产方法
TWI573869B (zh) 導入有二氧化碳固定循環之微生物
CN112888776B (zh) 生产目标物质的方法
JP6327653B2 (ja) コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いる４−ヒドロキシ安息香酸又はその塩の製造方法
RU2691303C1 (ru) Микроорганизм, продуцирующий путресцин или орнитин, и способ получения путресцина или орнитина с использованием этого микроорганизма
JP6327654B2 (ja) 高活性変異型酵素を高発現させたコリネ型細菌形質転換体、及びそれを用いる４−ヒドロキシ安息香酸又はその塩の製造方法
WO2014115815A1 (ja) 二酸化炭素固定回路を導入した微生物
JPWO2020208842A5 (ja)
WO2007024010A1 (ja) Ｌ−グルタミン酸生産菌及びｌ−グルタミン酸の製造方法
WO2012108493A1 (ja) 発酵法による目的物質の製造法
RU2696504C2 (ru) Микроорганизм для продуцирования диамина и способ получения диамина с его использованием
RU2672323C2 (ru) Микроорганизм для продуцирования диамина и способ получения диамина с его использованием
WO2023095896A1 (ja) 遺伝子組換え微生物、及びアスパラギン酸を生産する方法
KR102005664B1 (ko) 아미노레불린산 생산용 형질전환메탄자화균 및 이의 용도
WO2020130095A1 (ja) コリネ型細菌形質転換体およびそれを用いる２－フェニルエタノールの製造方法
JP2007175016A (ja) Ｌ−グルタミン酸生産菌及びｌ−グルタミン酸の製造方法
TWI631213B (zh) 生產由乙醯輔酶ａ衍生之化學物質的微生物
JP7475408B2 (ja) Ｌ－アルギニンまたはｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物およびこれを用いたｌ－アルギニンまたはｌ－シトルリンの生産方法
WO2022092018A1 (ja) Ｌ－アミノ酸の製造法
WO2022255160A1 (ja) 組換え微生物及びこれを用いたｌ－ロイシンを製造する方法
KR20200008997A (ko) 피루브산 카르복실라제 및 피루브산 카르복실라제 암호화 dna, 상기 dna를 함유한 플라스미드 및 그 생산을 위한 미생물, 그리고 자체의 생합성에서 전구체로서 옥살로아세테이트가 포함되는 것인 생성물의 제조 방법, 그리고 염색체
JP7475409B2 (ja) Ｌ－アルギニンまたはｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物およびこれを用いたｌ－アルギニンまたはｌ－シトルリンの生産方法
US12006527B2 (en) Coryneform bacterium transformant and method for producing 2-phenylethanol using same

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22898678

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023562172

Country of ref document: JP