WO2014115815A1 - 二酸化炭素固定回路を導入した微生物 - Google Patents

二酸化炭素固定回路を導入した微生物 Download PDF

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亮太 藤井
松本　佳子
アンジャリ マダヴァン、
スー サン チョン、
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    • C12Y602/01009—Malate--CoA ligase (6.2.1.9)

Definitions

  • the present invention relates to a microorganism into which a carbon dioxide fixing circuit is introduced, and a substance production method using the microorganism.
  • Acetyl CoA is one of the most important intermediates in the metabolic pathway of microorganisms.
  • Various metabolites are produced via acetyl CoA.
  • substances produced via acetyl CoA include, for example, amino acids such as L-glutamic acid, L-glutamine, L-proline, L-arginine, L-leucine, L-isoleucine; acetic acid, propionic acid, butyric acid , Organic acids such as caproic acid, citric acid, 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxyisobutyric acid, 3-aminoisobutyric acid, 2-hydroxyisobutyric acid, methacrylic acid, poly-3-hydroxybutyric acid; isopropyl alcohol, ethanol, butanol, etc. Alcohols; acetone; polyglutamic acid; and the like are known.
  • acetyl CoA is produced using a sugar such as glucose as a carbon source.
  • Sugar is converted into pyruvate through metabolic pathways called glycolytic pathways such as the Emden-Meyerhof pathway, Entner-Doudoroff pathway, and pentose-phosphate pathway, and pyruvate is converted to pyruvate decarboxylase, pyruvate-formate. It is converted into acetyl CoA by the action of lyase or the like.
  • carbon dioxide (CO 2 ) and formic acid are produced as by-products, not all of the carbon derived from the sugar is fixed as acetyl CoA.
  • CO 2 carbon dioxide
  • formic acid are produced as by-products, not all of the carbon derived from the sugar is fixed as acetyl CoA.
  • CO 2 is fixed and used as a carbon source in the body of microorganisms
  • a Calvin Benson circuit a reductive TCA circuit, a Wood-Ljungdahl pathway, a 3-hydroxypropionic acid circuit, and a 4-hydroxybutyric acid circuit.
  • the Calvin Benson circuit is a CO 2 fixation circuit consisting of about 12 enzymes present in plants and photosynthetic bacteria.
  • CO 2 is fixed by ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase (RubisCO). Glyceraldehyde 3-phosphate is produced.
  • the reductive TCA circuit is a circuit found in anaerobic bacteria and microaerobic bacteria including green sulfur bacteria, and is composed of 11 kinds of enzymes, and a CO 2 -fixing enzyme (acetyl CoA carboxylase 2 -Oxoglutarate synthase), and produces pyruvic acid from CO 2 by a reverse reaction of the normal TCA cycle.
  • the Wood-Ljungdahl pathway is found in anaerobic microorganisms such as acetic acid producing bacteria and consists of nine enzymes. Formate dehydrogenase, CO dehydrogenase, etc. reduce formic acid on CO 2 or coenzyme, and finally acetyl Convert to CoA.
  • the 3-hydroxypropionic acid circuit is a circuit found in chloroflexus bacteria and the like, and consists of 13 enzymes. CO 2 is fixed by the action of acetyl CoA (propionyl CoA) carboxylase, and acetylated via malonyl CoA and the like. Produce CoA.
  • the 4-hydroxybutyric acid cycle is a pathway existing in archaea and the like, and CO 2 is fixed by the reaction of pyruvate synthase, acetyl CoA (propionyl CoA) carboxylase, and phosphoenolpyruvate carboxylase, and 4-hydroxybutyryl CoA, etc. To produce acetyl-CoA.
  • 2011/099006 proposes a circuit for fixing CO 2 via a carbonic acid fixing reaction on acetyl CoA or a reduction reaction of malonyl CoA.
  • German Offenlegungsschrift 102007059248 proposes acetyl CoA production by a route similar to the 4-hydroxybutyric acid cycle.
  • the Wood-Ljungdahl route, the route disclosed in WO2009 / 094485, the route disclosed in WO2010 / 071697, and the route disclosed in WO2009 / 046929 are CO 2 including a path for reducing 2 to CO or formic acid, thus strong enzyme reduction reaction catalyzing often do not act only in a reducing environment, the reduction reaction on difficult under normal conditions In addition, it is not easy to introduce the enzyme other than absolutely anaerobic microorganisms. In the reductive TCA circuit, the reduction reaction by pyruvate synthase and the reduction reaction by 2-oxoglutarate synthase require a strong reducing power using ferredoxin as an electron acceptor, and the progress of the reaction is not easy.
  • the 4-hydroxybutyric acid cycle, the 3-hydroxypropionic acid cycle, the route described in WO 2009/046929, and the route described in WO 2011/099006 are succinyl CoA reduction or malonyl CoA.
  • the reduction reaction of carboxylic acid or its (thio) ester is used, such as reduction, such a reaction is generally difficult as an enzyme reaction, and it is desirable to avoid it as much as possible as a fermentation route.
  • the 4-hydroxybutyric acid cycle goes through a dehydration reaction such as the dehydration of 4-hydroxybutyryl CoA or the dehydration of 3-hydroxypropionic acid. There is a problem of competing with.
  • the 4-hydroxybutyric acid cycle, the 3-hydroxypropionic acid cycle, and the reductive TCA cycle convert maltyl-CoA synthase and pyruvate synthase into acetyl-CoA produced in the circuit to another substance. Therefore, it is not necessarily efficient from the viewpoint of production of acetyl CoA.
  • the present invention was made under the above situation.
  • An object of the first invention is to provide a microorganism useful for efficiently producing acetyl CoA using carbon dioxide. Another object of the first invention is to provide a method for producing acetyl-CoA and useful metabolites derived from acetyl-CoA in a high yield using the microorganism.
  • An object of the second invention is to provide a microorganism of the genus Aspergillus or Capriavidas that can efficiently convert carbon dioxide into a useful metabolite via acetyl CoA.
  • the second invention is to provide a method for producing a useful metabolite using the microorganism.
  • the first invention for solving the above-mentioned problems is as follows.
  • a microorganism having none of the following (a), (b), (c), (d), and (e) is added to the following (a), (b), (c), and (d): Without giving any, or giving one or more of the following (a), (b), (c) and (d), without exerting its function, malate thiokinase, malyl CoA lyase, glyoxylic acid
  • a microorganism having an acetyl CoA production circuit obtained by imparting at least one enzyme activity selected from the group consisting of carboligase, 2-hydroxy-3-oxopropionate reductase and hydroxypyruvate reductase, Pyruvate kinase, pyruvate carboxylase, phosphoenolpyruvate carboxylase, phosphoenolpyruvate carboxykinase, malate dehydrogenase , Malate thiokinase, malyl CoA lyase, gly
  • Acetyl CoA-producing microorganism (a) a carbonic acid fixation circuit having an enzymatic reaction from malonyl CoA to malonic acid semialdehyde or 3-hydroxypropionic acid, (b) a charcoal having an enzymatic reaction from acetyl CoA and CO 2 to pyruvic acid Acid fixing circuit, (c) carbonic acid fixing circuit having an enzymatic reaction from crotonyl CoA and CO 2 to ethylmalonyl CoA or glutaconyl CoA, (d) a carbonic acid fixing circuit having an enzymatic reaction from CO 2 to formic acid, (e) Malay At least one selected from the group consisting of tothiokinase and malyl-CoA lyase;
  • [A3] The acetyl-CoA-producing microorganism according to [A1] or [A2], to which enzyme activities of malate thiokinase and malyl-CoA lyase are imparted.
  • [A4] The acetyl-CoA-producing microorganism according to any one of [A1] to [A3], wherein the enzyme activities of 2-hydroxy-3-oxopropionate reductase and glycerate 3-kinase are enhanced.
  • [A5] Phosphoenolpyruvate or pyruvate is converted to oxaloacetate, which is converted to 2-hydroxy-3-oxopropionic acid by malate thiokinase, malyl CoA lyase and glyoxylate carboligase, Any one of [A1] to [A4] having an acetyl CoA production circuit in which -3-oxopropionic acid is converted to 2-phosphoglyceric acid and 2-phosphoglyceric acid is converted to phosphoenolpyruvate An acetyl-CoA-producing microorganism according to item 2.
  • [A6] [A1] to [A5 having an acetyl CoA production circuit including the following (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l) and (m) ] At least one selected from the group consisting of (f) pyruvate kinase and pyruvate carboxylase, phosphoenolpyruvate carboxylase, and phosphoenolpyruvate carboxykinase (G) malate dehydrogenase, (h) malate thiokinase, (i) malyl CoA lyase, (j) glyoxylate carboligase, (k) 2-hydroxy-3-oxopropionate reductase, and hydroxypyruvate isomerase And at least one selected from the group consisting of hydroxypyruvate reductase, ( 1) at least one selected from the group consisting of glycerate 2-kinase, glycerate 3-kinase and
  • the microorganism not having any of (a), (b), (c), (d) and (e) is a microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae or a microorganism belonging to the coryneform bacterium, The acetyl-CoA-producing microorganism according to any one of [A1] to [A6].
  • [A8] A microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae, wherein the microorganism not having any of (a), (b), (c), (d) and (e) is an Escherichia or Pantoea bacterium, Alternatively, the acetyl-CoA-producing microorganism according to any one of [A1] to [A7], which is a microorganism belonging to a coryneform bacterium that is a genus Corynebacterium.
  • a method for producing acetyl CoA comprising a recovery step.
  • the acetyl CoA according to [A9] further comprising a supply step of supplying at least one selected from the group consisting of carbonate ions, hydrogen carbonate ions, carbon dioxide gas, and a reducing agent to a medium used for culture. Production method.
  • the acetyl-CoA production method according to [A9] or [A10] further including a gas supply step of collecting a gas containing carbon dioxide generated by the culture and supplying the gas to a medium used for the culture.
  • [A12] A culturing step in which the acetyl-CoA-producing microorganism according to any one of [A1] to [A8] and a carbon source material are brought into contact with each other, and the acetyl-CoA obtained by the contact is intermediated
  • the acetyl CoA according to [A12] further comprising a supply step of supplying at least one selected from the group consisting of carbonate ions, hydrogen carbonate ions, carbon dioxide gas, and a reducing agent to a medium used for culture.
  • a method for producing metabolites having an intermediate are provided.
  • the intermediate comprising the acetyl CoA according to [A12] or [A13], further comprising a gas supply step of collecting a gas containing carbon dioxide generated by the culture and supplying the gas to a culture medium used for the culture.
  • Metabolite production method [A15]
  • a microorganism having none of the following (a), (b), (c), (d), and (e) is added to the following (a), (b), (c), and (d):
  • [A17] The method for producing acetyl CoA according to [A16], further comprising a gas supply step of collecting a gas containing carbon dioxide generated by the culture and supplying the gas to a medium used for the culture.
  • phosphoenolpyruvate or pyruvate is converted to oxaloacetate, and oxaloacetate is converted to 2-hydroxy-3-oxopropionic acid by malate thiokinase, malyl CoA lyase and glyoxylate carboligase.
  • the acetyl-CoA-producing microorganism has an acetyl-CoA production circuit including the following (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), and (m).
  • acetyl CoA according to any one of [A16] to [A18], which is an acetyl-CoA-producing microorganism: (f) pyruvate kinase and pyruvate carboxylase, phosphoenolpyruvate carboxylase, and phosphoenolpyruvate Carboxykinase and at least one selected from the group consisting of: (g) malate dehydrogenase, (h) malate thiokinase, (i) malyl CoA lyase, (j) glyoxylate carboligase, (k) 2-hydroxy -3-oxopropionate reductase and hydroxypyruvate isomerase At least one selected from the group consisting of rubate reductase, (l) at least one selected from the group consisting of glycerate 2-kinase, glycerate 3-kinase and phosphoglycerate mutase,
  • the microorganism which does not have any of the above (a), (b), (c), (d) and (e) is a microorganism belonging to the family Enterobacteriaceae or a microorganism belonging to the coryneform bacterium, The method for producing acetyl CoA according to any one of [A16] to [A19].
  • [A22] An isopropyl alcohol production method in which an acetyl CoA-producing microorganism produces isopropyl alcohol using acetyl CoA produced by the acetyl CoA production method according to any one of [A16] to [A21] as an intermediate.
  • [A23] An acetone production method in which an acetyl-CoA-producing microorganism produces acetone using the acetyl-CoA produced by the acetyl-CoA production method according to any one of [A16] to [A21] as an intermediate.
  • a glutamic acid production method in which an acetyl CoA-producing microorganism produces glutamic acid using acetyl CoA produced by the acetyl CoA production method according to any one of [A16] to [A21] as an intermediate.
  • a culture step in which the acetyl-CoA-producing microorganism according to any one of [A1] to [A8] is brought into contact with a carbon source material for cultivation, and isopropyl alcohol obtained by the contact is recovered. And a recovery step.
  • [A26] A culture step in which the acetyl-CoA-producing microorganism according to any one of [A1] to [A8] and a carbon source material are brought into contact with each other, and a recovery for recovering acetone obtained by the contact And a process for producing acetone.
  • [A27] A culturing step of culturing the acetyl-CoA-producing microorganism according to any one of [A1] to [A8] and a carbon source material in contact, and recovery for recovering glutamic acid obtained by the contact And a method for producing glutamic acid, comprising: a step.
  • the second invention for solving the above-mentioned problems is as follows.
  • [B2] The microorganism according to [B1], which has an ability to produce acetyl CoA.
  • [B4] Phosphoenolpyruvate or pyruvate is converted to oxaloacetate, which is converted to 2-hydroxy-3-oxopropionic acid by malate thiokinase, malyl CoA lyase and glyoxylate carboligase, Any one of [B1] to [B3] having an acetyl CoA production circuit in which hydroxy-3-oxopropionic acid is converted to 2-phosphoglyceric acid and 2-phosphoglyceric acid is converted to phosphoenolpyruvate Microorganism according to one.
  • [B6] at least one enzyme reaction selected from the group consisting of the following (a3) and (b3), and the following (c3), (d3), (e3), (f3) and (g3) enzyme reactions;
  • the following (h3) enzyme reaction, the following (i3), (j3), (k3) and (n3) enzyme reactions, and the following (i3), (j3), (l3), (m3) and (n3) A microorganism according to any one of [B1] to [B5], having a pathway comprising: at least one selected from the group consisting of an enzymatic reaction: (a3) an enzyme from phosphoenolpyruvate to oxaloacetate Reaction, (b3) enzyme reaction from pyruvate to oxaloacetate, (c3) enzyme reaction from oxaloacetate to malate, (d3) enzyme reaction from malate to malyl-CoA, (e3) malyl-CoA to glyoxylate and Acetyl Enzymatic reaction to CoA, (
  • [B7] At least one enzyme selected from the group consisting of the following (a4) and (b4), the following enzymes (c4), (d4), (e4), (f4) and (g4); h4), the following (i4), (j4), (k4) and (n4) enzymes, and the following (i4), (j4), (l4), (m4) and (n4) enzymes
  • the microorganism that does not have any of (a2), (b2), (c2), (d2), and (e2) is Aspergillus niger, Aspergillus tereus, or Capriavidas necatol, [B1] The microorganism according to any one of [B7].
  • a culture step of culturing the microorganism according to any one of [B1] to [B8] and a carbon source material in contact, and a recovery step of recovering a target product obtained by the contact A method for producing acetyl CoA, comprising: [B10] The acetyl CoA according to [B9], further comprising a supply step of supplying at least one selected from the group consisting of carbonate ions, hydrogen carbonate ions, carbon dioxide gas, and a reducing agent to a medium used for culture. Production method.
  • [B12] A method for producing citric acid comprising producing citric acid from a carbon source material using the microorganism according to any one of [B1] to [B8].
  • a microorganism useful for efficiently producing acetyl CoA using carbon dioxide is provided.
  • the method of manufacturing the useful metabolite derived from acetyl-CoA and acetyl-CoA in the high yield using the said microorganisms is provided.
  • a microorganism of the genus Aspergillus or Capriavidas that can efficiently convert carbon dioxide into a useful metabolite via acetyl CoA is provided.
  • the manufacturing method of the useful metabolite using the said microorganisms is provided.
  • the acetyl-CoA producing microorganism according to the first invention includes the following (a), (b), (c), (d) and (e): , (C) and (d) are not applied, or even if one or more of the following (a), (b), (c) and (d) is applied, the function is not exerted.
  • a microorganism having a production circuit comprising pyruvate kinase, pyruvate carboxylase, phosphoenolpyruvate carboxylase, phosphoenolpyruvate carboxylate Kinase, malate dehydrogenase, malate thiokinase, malyl CoA lyase, glyoxylate carboligase, 2-hydroxy-3-oxopropionate reductase, hydroxypyruvate isomerase, hydroxypyruvate reductase, glycerate 2-kinase, glycerate 3- At least one enzyme activity selected from the group consisting of kinase
  • a carbonic acid fixation circuit having an enzymatic reaction from malonyl CoA to malonic acid semialdehyde or 3-hydroxypropionic acid (B) A carbonic acid fixation circuit having an enzymatic reaction from acetyl CoA and CO 2 to pyruvic acid. (C) A carbonic acid fixation circuit having an enzymatic reaction from crotonyl CoA and CO 2 to ethylmalonyl CoA or glutaconyl CoA. (D) A carbonic acid fixation circuit having an enzymatic reaction from CO 2 to formic acid. (E) At least one selected from the group consisting of malate thiokinase and malyl-CoA lyase.
  • Microorganism according to the first invention by a predetermined enzyme activity has been granted, the CO 2 and CO 2 that is supplied from the outside occurs in sugar metabolism have carbon dioxide fixing circuit which can be converted into acetyl-CoA Furthermore, the predetermined enzyme activity is enhanced and / or the predetermined enzyme activity is inactivated or reduced, so that CO 2 can be efficiently converted into acetyl CoA.
  • One aspect of the acetyl-CoA production method according to the first invention is an acetyl-CoA production method that can efficiently convert CO 2 into acetyl-CoA using the microorganism according to the first invention.
  • Another aspect of the method for producing acetyl-CoA according to the first aspect of the present invention provides a microorganism that does not have any of the above (a), (b), (c), (d) and (e), ), (B), (c) and (d) are not applied, or even if one or more of (a), (b), (c) and (d) is applied Without imparting at least one enzyme activity selected from the group consisting of malate thiokinase, malyl CoA lyase, glyoxylate carboligase, 2-hydroxy-3-oxopropionate reductase and hydroxypyruvate reductase
  • At least one selected from the group consisting of carbonate ions, hydrogen carbonate ions, carbon dioxide gas, and sodium sulfite is supplied to the medium using a microorganism in which a carbon dioxide fixing circuit is constructed.
  • acetyl-CoA and useful metabolites derived from acetyl-CoA for example, isopropyl alcohol
  • Ethanol for example, isopropyl alcohol
  • acetone for example, isopropyl alcohol
  • citric acid itaconic acid
  • acetic acid butyric acid
  • poly 3-hydroxybutyric acid
  • 3-hydroxyisobutyric acid 3-aminoisobutyric acid
  • 2-hydroxyisobutyric acid methacrylic acid
  • poly glutamic acid, glutamine, Arginine, ornithine, citrulline, leucine, isoleucine, proline, etc.
  • the microorganism according to the second invention includes the following (a2), (b2), (c2), (b2), (c2), (d2), and (e2). ) And (d2) are not imparted, or malate thiokinase and one of the following (a2), (b2), (c2) and (d2) are imparted without exerting their functions. It is a microorganism of the genus Aspergillus or Capriavidas obtained by imparting at least one enzyme activity selected from the group consisting of malyl-CoA lyase.
  • A2 A carbonic acid fixation circuit having an enzymatic reaction from malonyl CoA to malonic acid semialdehyde or 3-hydroxypropionic acid.
  • B2 A carbonic acid fixation circuit having an enzymatic reaction from acetyl CoA and CO 2 to pyruvic acid.
  • C2 A carbonic acid fixation circuit having an enzymatic reaction from crotonyl CoA and CO 2 to ethylmalonyl CoA or glutaconyl CoA.
  • D2 A carbonic acid fixation circuit having an enzymatic reaction from CO 2 to formic acid.
  • E2 At least one selected from the group consisting of malate thiokinase and malyl-CoA lyase.
  • Microorganism according to the second invention has a path including a given enzyme reaction can efficiently immobilize CO 2 and CO 2 that is supplied from the outside occurs in the glucose metabolism. Further, the microorganism according to the second invention can efficiently convert CO 2 into acetyl CoA.
  • the acetyl CoA production method according to the second invention is an acetyl CoA production method capable of efficiently converting CO 2 to acetyl CoA using the microorganism according to the second invention.
  • acetyl-CoA and useful metabolites derived from acetyl-CoA for example, citric acid
  • Itaconic acid for example, citric acid
  • poly-3hydroxybutyric acid proline, leucine, isoleucine, valine, arginine, citrulline, ornithine
  • acetic acid for example, citric acid
  • poly-3hydroxybutyric acid proline, leucine, isoleucine, valine, arginine, citrulline, ornithine
  • acetic acid for example, citric acid
  • poly 3-hydroxybutyric acid, itaconic acid, citric acid, butyric acid, polyglutamic acid, 4-amino Butyric acid, 4-hydroxybutyric acid, 3-hydroxyisobutyric acid, 2-hydroxyisobutyric acid, 3-aminoisobutyric acid, etc.
  • circuit refers to a path that starts from an arbitrary substance on a path, is converted to another substance via the path, and is finally converted to the same substance as the start.
  • path refers to a series of reactions by an enzymatic reaction and / or a spontaneous chemical reaction in a fermenter.
  • the path may be a circuit or may not be a circuit. Therefore, the carbonic acid fixation path includes a carbonic acid fixation circuit.
  • carbon dioxide (CO 2) fixed in the present invention, refers to the conversion of CO 2 and / or CO 2 that is supplied from the outside occurs in the glucose metabolism to organic compounds. CO 2 may be HCO 3 — .
  • carbon dioxide (CO 2 ) fixation is sometimes referred to as “carbonic acid fixation”.
  • the “enzyme” in the present invention includes “factor” which does not exhibit enzyme activity by itself unless otherwise specified.
  • “Inactivation” of enzyme activity in the present invention refers to a state in which the enzyme activity measured by any existing measurement system is 1/10 or less when the enzyme activity in the microorganism before inactivation is defined as 100.
  • “reduction” of enzyme activity refers to a state in which when a gene encoding an enzyme is treated by genetic recombination technology, the enzyme activity is significantly lower than the state before the treatment. Point to.
  • the term “enhancement” of enzyme activity in the present invention broadly means that the enzyme activity in a microorganism before the enhancement increases after the enhancement.
  • the method of strengthening is not particularly limited as long as the activity of the enzyme possessed by the microorganism is increased, by strengthening by introducing the enzyme gene into the cell from outside the cell, or by enhancing the expression of the enzyme gene in the cell. Strengthening and combinations thereof may be mentioned.
  • the introduction of an enzyme gene from outside the cell into the cell can be carried out by using a gene recombination technique to encode a gene encoding an enzyme that is more active than the host's original enzyme.
  • the enhancement by enhancing the expression of the enzyme gene in the cell includes introducing a nucleotide sequence that enhances the expression of the enzyme gene into the cell from outside the host; the host possesses it in the genome Enhancing the expression of the enzyme gene by enhancing the promoter activity of the enzyme gene; Enhancing the expression of the enzyme gene by replacing the promoter of the enzyme gene held in the genome with another promoter; and these Can be mentioned.
  • “giving” enzyme activity broadly means that an enzyme gene is introduced into the cell from outside the cell to give the target enzyme activity to a microorganism that cannot find the target enzyme activity.
  • the method of providing is not particularly limited as long as the target enzyme activity is given to the microorganism, and can be performed by a gene recombination technique. Specific examples include transformation with a plasmid carrying the enzyme gene; introduction of the enzyme gene into the genome; and combinations thereof.
  • the introduced enzyme gene may be homologous or heterologous to the host cell.
  • “Granting” an enzyme activity related to a circuit or pathway of substance metabolism means that the circuit or pathway of substance metabolism is functionally constructed as a result of imparting the enzyme activity, and the method of granting depending on the host Can be selected.
  • does not perform its function even if a carbonic acid fixation circuit is imparted means that an enzyme gene is introduced from the outside into a microorganism that does not find the target enzyme activity, It indicates that the carbon fixation circuit is not functioning. That "no carbonate fixing circuit is functioning" is test using labeled CO 2, the label from CO 2 in material derived from metabolites thereof or metabolites in the circuit is not detected, or circuit in It can be indirectly grasped by, for example, no increase in the sugar yield of the substance derived from the metabolite.
  • the promoter used for “enhancement” or “giving” of enzyme activity is not particularly limited as long as it can express a gene, and a constitutive promoter or an inducible promoter can be used.
  • KEGG Knowles Genes and Genomes, http://www.genome.jp/kegg/
  • NCBI National Center for biotechnology information, ⁇ ⁇ ⁇ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/).
  • KEGG Knowles Genes and Genomes
  • NCBI National Center for biotechnology information
  • ⁇ ⁇ ⁇ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ only the genetic information of microorganisms registered in KEGG or NCBI is used.
  • the phrase “by gene recombination technology” means that the base sequence is changed by inserting another DNA into the native gene, replacing or deleting a part of the gene, or a combination thereof. All may be included, for example, the result of a mutation.
  • the microorganism in which the activity of the factor or enzyme is inactivated refers to a microorganism in which the intrinsic activity of the factor or enzyme is impaired by some method.
  • the microorganism can be produced by, for example, disrupting a gene encoding a factor or enzyme (gene disruption).
  • Examples of gene disruption in the present invention include insertion of another DNA into the gene so that the function of the gene is not exhibited, and mutation of the base sequence by substitution or deletion of a certain part of the gene. It is done.
  • the gene is not transcribed into mRNA and the protein is not translated, or the transcribed mRNA is incomplete and the amino acid sequence of the translated protein is mutated or deleted, resulting in the original function. Demonstrate becomes impossible.
  • the gene-disrupted strain can be produced by any method as long as a disrupted strain that does not express an enzyme or protein is obtained.
  • Various methods of gene disruption have been reported (natural breeding, addition of mutagen, ultraviolet irradiation, irradiation, introduction of random mutation, transposon insertion or transfer, site-specific gene disruption), but specific genes Gene disruption by homologous recombination is preferable in that it can only be disrupted.
  • Homologous recombination methods are: JournalJof Bacteriology, 1985; 161 (3): 1219-1221, Journal of Bacteriology, 1995; 177 (6): 1511-1519, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America , 2000; 97 (12): 6640-6645, which can be easily implemented by those skilled in the art by these methods and their applications.
  • “(native) does not have” means that the host microorganism does not inherently exist in nature.
  • the “host” in the present invention means a microorganism to which one or more genes are introduced from the outside.
  • the “host” is in a state where one or a plurality of genes can be exerted as a result of the introduction of one or more genes from the outside.
  • the “host” in the present invention may have a production path for useful metabolites.
  • the “useful metabolite” in the present invention means a general term for main metabolites in the metabolic pathway of microorganisms such as alcohol, amino acid, organic acid, terpenes and the like.
  • the “host” may be any microorganism that can have the ability to produce a useful metabolite by using any means regardless of whether or not it originally has the ability to produce a useful metabolite.
  • the classification of the enzyme referred to in the present specification is a classification based on the report of the International Union of Biochemistry (IUB) Enzyme Committee, and the “enzyme number” is the enzyme number based on the report of the IUB Enzyme Committee. It is.
  • metabolite having acetyl CoA as an intermediate and “(useful) metabolite derived from acetyl CoA” are produced via acetyl CoA on the metabolic pathway (useful) )
  • a generic name for metabolites examples of the alcohol include isopropyl alcohol, ethanol, and butanol.
  • amino acids include L-glutamic acid, L-glutamine, L-arginine, L-ornithine, L-citrulline, L-leucine, L-isoleucine, and L-proline.
  • organic acids examples include 3-hydroxybutyric acid, poly-3-hydroxybutyric acid, polyglutamic acid, 3-hydroxyisobutyric acid, 3-aminoisobutyric acid, 2-hydroxyisobutyric acid, methacrylic acid, citric acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid , Caproic acid and mevalonic acid.
  • terpenes examples include isoprene, squalene, steroids, and carotenoids. Another example is acetone.
  • metabolite having acetyl CoA as an intermediate and “(useful) metabolite derived from acetyl CoA” are produced via acetyl CoA on the metabolic pathway (useful) )
  • a generic name for metabolites for metabolites.
  • the organic acid include citric acid, itaconic acid, and (poly) -3-hydroxybutyric acid.
  • Other examples include 3-hydroxybutyric acid, polyglutamic acid, 3-hydroxyisobutyric acid, 3-aminoisobutyric acid, 2-hydroxyisobutyric acid, methacrylic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, caproic acid, and mevalonic acid.
  • production of acetyl CoA means that some substance is converted to acetyl CoA on the metabolic pathway.
  • Acetyl-CoA is a metabolic intermediate and is rapidly converted into various substances on the metabolic pathway, so the apparent amount of acetyl-CoA does not always increase, but a substance derived from acetyl-CoA is labeled with CO 2.
  • the effect can be indirectly grasped, for example, by detecting the yield of saccharides derived from acetyl-CoA or the like.
  • acetyl-CoA production is not necessarily proportional to the total amount of acetyl-CoA-derived substances Do not mean.
  • the production route from acetyl CoA to a specific substance is strengthened or the production route from acetyl CoA to a specific substance is originally strong (for example, in the case of a glutamic acid-producing microorganism described later)
  • conversion downstream from acetyl CoA Since efficiency is not easily influenced by external factors, the production efficiency of the specific substance can be regarded as an index of acetyl CoA production efficiency.
  • the acetyl-CoA producing microorganism according to the first invention is a microorganism that does not have any of the above (a), (b), (c), (d), and (e). , (C) and (d) are not applied, or even if one or more of the above (a), (b), (c) and (d) is applied, the function is not exerted.
  • a microorganism having a production circuit comprising pyruvate kinase, pyruvate carboxylase, phosphoenolpyruvate carboxylase, phosphoenolpyruvate carboxylate Kinase, malate dehydrogenase, malate thiokinase, malyl CoA lyase, glyoxylate carboligase, 2-hydroxy-3-oxopropionate reductase, hydroxypyruvate isomerase, hydroxypyruvate reductase, glycerate 2-kinase, glycerate 3- At least one enzyme activity selected from the group consisting of kinase
  • the microorganism according to the first invention is preferably provided with the enzyme activity of malate thiokinase, and preferably provided with the enzyme activity of malate thiokinase and malyl CoA lyase, from the viewpoint of production efficiency of acetyl CoA.
  • the enzyme activities of malate thiokinase, malyl CoA lyase, and glyoxylate carboligase are imparted, and malate thiokinase, malyl CoA lyase, glyoxylate carboligase, 2-hydroxy-3- More preferably, the enzyme activity of oxopropionate reductase and / or hydroxypyruvate reductase is imparted.
  • the microorganism according to the first invention has a simple and practical acetyl-CoA production circuit for fixing CO 2 and converting it to acetyl-CoA.
  • the circuit will be described in detail with reference to FIG.
  • the acetyl-CoA production circuit shown in FIG. 1 shows a preferred embodiment of the acetyl-CoA production circuit in the first invention (hereinafter sometimes referred to as “circuit of FIG. 1”).
  • the acetyl CoA production circuit includes the following (f) to (m).
  • F At least one selected from the group consisting of pyruvate kinase (Pyk) and pyruvate carboxylase (Pyc), phosphoenolpyruvate carboxylase (Ppc), and phosphoenolpyruvate carboxykinase (Pck).
  • G Malate dehydrogenase (Mdh).
  • H Malate thiokinase (Mtk).
  • I Malyl CoA lyase (Mcl).
  • J Glyoxylate carboligase (Gcl).
  • (K) At least one selected from the group consisting of 2-hydroxy-3-oxopropionate reductase (GlxR), hydroxypyruvate isomerase (Hyi), and hydroxypyruvate reductase (YcdW).
  • (L) At least one selected from the group consisting of glycerate 2-kinase (GarK), glycerate 3-kinase (GlxK), and phosphoglycerate mutase (Gpm).
  • the acetyl CoA production circuit essentially includes only the above (f) to (m), and the acetyl CoA production circuit possessed by the microorganism of the present invention includes only the above (f) to (m).
  • the acetyl-CoA production circuit is preferable.
  • CO 2 binds to phosphoenolpyruvate or pyruvate by the action of Ppc, Pck, or Pyc and is converted to oxaloacetate.
  • Oxaloacetic acid is converted to malic acid by the action of Mdh.
  • Malic acid is converted into malyl-CoA (malic acid CoA) by the action of Mtk.
  • Malyl CoA malic acid CoA
  • Glyoxylic acid is converted to 2-hydroxy-3-oxopropionic acid by the action of Gcl.
  • 2-hydroxy-3-oxopropionic acid is converted to glyceric acid by the action of GlxR, or converted to hydroxypyruvic acid by the action of Hyi and then converted to glyceric acid by the action of YcdW. .
  • Glyceric acid is converted to 2-phosphoglyceric acid by the action of GarK, or converted to 3-phosphoglyceric acid by the action of GlxK and then converted to 2-phosphoglyceric acid by the action of Gpm.
  • the 2-Phosphoglyceric acid is converted to phosphoenolpyruvate by the action of Eno. When Pyk and Pyc are included in the circuit, phosphoenolpyruvate is converted to pyruvate by the action of Pyk.
  • the microorganism according to the second aspect of the present invention is the microorganism (A2), (b2), (c2), (c2), (d2), and (e2). ) And (d2) are not imparted, or malate thiokinase and one of the above (a2), (b2), (c2) and (d2) are imparted without exerting their functions.
  • a microorganism of the genus Aspergillus or Capriavidas obtained by imparting at least one enzyme activity selected from the group consisting of malyl-CoA lyase.
  • (A2), (b2), (c2), (d2) and (e2) are respectively the same as (a), (b), (c), (d) and (e) in the first invention. It is synonymous.
  • a microorganism having a pathway via glycine (hereinafter sometimes referred to as “glycine pathway”) will be described.
  • the microorganism has at least one enzyme activity selected from the group consisting of a glycine transaminase and a glycine cleavage system.
  • the glycine pathway will be described with reference to FIG.
  • the glycine pathway comprises at least one enzyme reaction selected from the group consisting of: (a3) and (b3) below; and (c3), (d3), (e3), ( f3) and (g3), the following (h3) enzymatic reaction, the following (i3), (j3), (k3) and (n3) enzymatic reactions, and the following (i3), (j3), ( l3), at least one selected from the group consisting of (m3) and (n3) enzyme reactions.
  • A3 Enzymatic reaction from phosphoenolpyruvate to oxaloacetate.
  • B3 Enzymatic reaction from pyruvic acid to oxaloacetic acid.
  • C3 Enzymatic reaction from oxaloacetic acid to malic acid.
  • D3 Enzymatic reaction from malic acid to malyl CoA.
  • E3 Enzymatic reaction from malyl CoA to glyoxylic acid and acetyl CoA.
  • F3 Enzymatic reaction from glyoxylic acid to glycine.
  • G3 Enzymatic reaction from glycine to serine.
  • H3 Enzymatic reaction from serine to pyruvate.
  • I3) Enzymatic reaction from serine to 3-hydroxypyruvic acid.
  • J3 Enzymatic reaction from 3-hydroxypyruvic acid to glyceric acid.
  • K3 Enzymatic reaction from glyceric acid to 2-phosphoglyceric acid.
  • L3 Enzymatic reaction from glyceric acid to 3-phosphoglyceric acid.
  • M3 Enzymatic reaction from 3-phosphoglycerate to 2-phosphoglycerate.
  • N3 Enzymatic reaction from 2-phosphoglycerate to phosphoenolpyruvate.
  • Examples of (a3) include an enzyme reaction through any of a reaction with phosphoenolpyruvate carboxylase, a reaction with phosphoenolpyruvate carboxykinase, and a reaction with pyruvate kinase and pyruvate carboxylase.
  • Examples of (b3) include an enzyme reaction via pyruvate carboxylase.
  • Examples of (c3) include an enzymatic reaction via malate dehydrogenase.
  • Examples of (d3) include an enzyme reaction via malate thiokinase.
  • Examples of (e3) include an enzyme reaction via malyl CoA lyase.
  • Examples of (f3) include an enzyme reaction via glycine transaminase.
  • Examples of (g3) include an enzyme reaction via a glycine cleavage system and serine hydroxymethyltransferase.
  • Examples of (h3) include an enzyme reaction via serine dehydratase.
  • Examples of (i3) include an enzyme reaction via serine transaminase.
  • Examples of (j3) include an enzyme reaction via hydroxypyruvate reductase.
  • Examples of (k3) include an enzymatic reaction via glycerate 2-kinase.
  • Examples of (l3) include an enzyme reaction via glycerate 3-kinase.
  • Examples of (m3) include an enzyme reaction via phosphoglycerate mutase.
  • Examples of (n3) include an enzyme reaction via enolase.
  • the conversion from serine to pyruvate is an enzyme reaction that converts directly from serine (the reaction of (h3) above) or an enzyme reaction that converts via 3-hydroxypyruvic acid (above (i3)). And any reaction including downstream thereof).
  • the conversion from serine to pyruvic acid is an enzymatic reaction that converts via 3-hydroxypyruvic acid (the reaction including (i3) and its downstream)
  • the conversion from glyceric acid to 2-phosphoglyceric acid is Either an enzymatic reaction directly converting from glyceric acid (reaction (k3) above) or an enzymatic reaction converting via 3-phosphoglyceric acid (reaction containing (l3) and (m3) above) But you can.
  • One preferred embodiment of the microorganism according to the second invention is at least one enzyme selected from the group consisting of the following (a4) and (b4), and the following (c4), (d4), (e4), (f4) And the enzyme of (g4), the enzyme of the following (h4), the enzymes of the following (i4), (j4), (k4) and (n4), and the following (i4), (j4), (l4), (m4) And at least one selected from the group consisting of (n4) enzymes.
  • (A4) At least one selected from the group consisting of pyruvate kinase and pyruvate carboxylase, phosphoenolpyruvate carboxylase, and phosphoenolpyruvate carboxykinase.
  • (B4) Pyruvate carboxylase.
  • C4) Malate dehydrogenase.
  • D4) Malate thiokinase.
  • E4) Malyl CoA lyase.
  • F4 Glycine transaminase.
  • G4 Glycine cleavage system and serine hydroxymethyltransferase.
  • H4 Serine dehydratase.
  • I4) Serine transaminase.
  • K4) Glyceric acid 2-kinase.
  • M4) Phosphoglycerate mutase.
  • Pyruvate carboxylase (Pyc) and phosphoenolpyruvate carboxylase (Ppc) belong to a highly active class of carbonic acid-fixing enzymes.
  • the specific activity of RubisCO used in photosynthesis of plants and the like is about 3 to 20 U / mg (Journal of Biological Chemistry, 1999; 274 (8): 5078-5082, Salvucci M. E.
  • pyruvate carboxylase or phosphoenolpyruvate carboxylase has been reported to be 30 U / mg in Escherichia coli and 100-150 U / mg at the highest (Journal of Biological Chemistry, 1972; 247 (18) :) 5785-5792, Bioscience, 579Biotechnology, and Biochemistry, 1995; 59 (1): 140-142, Biochimica) et Biophysica Acta, 2000; 1475 (3): 191-206).
  • the circuit of FIG. 1 and the glycine pathway of FIG. 2 do not contain an enzyme that consumes acetyl CoA. Therefore, the circuit of FIG. 1 and the glycine pathway of FIG. 2 can be said to be ideal circuits for fixing CO 2 and converting it to acetyl CoA.
  • the enzyme that consumes acetyl CoA refers to an enzyme that converts acetyl CoA into another substance using acetyl CoA as a substrate, and examples thereof include acetyl CoA carboxylase and pyruvate synthase.
  • Not having an enzyme that consumes acetyl CoA in the circuit means that the enzyme that consumes acetyl CoA is not a closed circuit in which acetyl CoA returns to acetyl CoA again through the circuit. Point to.
  • the substance converted by the enzyme that consumes acetyl CoA is converted into another product without returning to acetyl CoA (for example, when converted to glutamic acid as the final product in the glutamic acid production pathway)
  • a closed circuit refers to a circuit that starts with any material on the circuit, is converted to another material through the circuit, and finally is converted to the same material as the first.
  • Acetyl CoA carboxylase is classified into enzyme number 6.4.1.2 and refers to a generic term for enzymes that convert acetyl CoA and CO 2 to malonyl CoA.
  • Pyruvate synthase is classified into enzyme number 1.2.7.1 and refers to a general term for enzymes that convert acetyl CoA to pyruvate.
  • malate dehydrogenase Mdh
  • 2-hydroxy-3-oxopropionate reductase GlxR
  • hydroxypyruvate reductase YcdW
  • Malate thiokinase Mtk
  • GarK glycerate 2-kinase
  • GlxK glycerate 3-kinase
  • Pyc pyruvate carboxylase
  • NADH or NADPH
  • glyoxylic acid When glyoxylic acid is converted to glycine, it has a reducing power equivalent to one NADH (or NADPH) directly by glycine dehydrogenase or indirectly by aminotransferase such as glyoxylate aminotransferase via other amino acids.
  • the glycine cleavage system consumes NAD + (or NADP + ) and converts it to NADH (or NADPH).
  • NAD + When serine is converted to 3-hydroxypyruvic acid, NAD + (or NADP + ) is consumed directly by serine dehydrogenase or indirectly by other amino acids by aminotransferases such as serine aminotransferase. , NADH (or NADPH).
  • Malate thiokinase (Mtk), glycerate 2-kinase (GarK), glycerate 3-kinase (GlxK) and pyruvate carboxylase (Pyc) consume ATP. When ammonia is taken into the metabolic system, ATP may be consumed. Pyruvate kinase (Pyk) produces ATP. Therefore, the balance of the pathway of FIG.
  • Table 1 shows a balance equation of a route for consuming oxygen during fermentation in the fermentation route using acetyl CoA as an intermediate.
  • a reduced coenzyme such as NADH is produced on the fermentation pathway and is returned to the oxidized coenzyme by the action of oxygen. Therefore, if the reduced coenzyme produced can be consumed by the circuit of FIG. 1 and the glycine pathway of FIG. 2 instead of oxygen, the reducing power produced during fermentation can be effectively utilized in the acetyl-CoA production circuit, and CO It is expected that 2 can be fixed and converted into a product.
  • the reduced coenzyme is a coenzyme involved in oxidation / reduction such as NADH, NADPH, FADH 2 , FMNH 2 , and reduced quinone coenzyme, and refers to a coenzyme in a reduced state.
  • the reduced coenzyme is preferably NADH or NADPH, more preferably NADH.
  • the oxidized coenzyme is an oxidized form of a reduced coenzyme, such as NAD + , NADP + , FAD, FMN, oxidized quinone coenzyme, etc., preferably NAD + or NADP + , more preferably NAD Point to + .
  • a reducing power may be applied by adding a substance capable of producing the reducing power or applying energy from the outside.
  • a substance with a high degree of reduction for example, hydrogen, sulfite, alcohols, paraffin
  • supplying reducing energy directly by electroculture for example, hydrogen, sulfite, alcohols, paraffin
  • supplying reducing energy directly by electroculture for example, supplying reducing power by photochemical reaction of living organisms, etc. Is mentioned.
  • the reducing power can be replenished from the outside, it is possible to drive the carbonic acid fixation pathway of the present invention even in the case of fermentation where reduced coenzyme is generated as shown in Table 1.
  • Pyruvate kinase is classified as an enzyme number 2.7.1.40 and refers to a generic name of enzymes that generate pyruvate and ATP from phosphoenolpyruvate and ADP. Examples thereof include those derived from Corynebacterium bacteria such as Corynebacterium glutamicum, Escherichia bacteria such as Escherichia coli, and Pantoea bacteria such as Pantoea ananatis.
  • DNA having a base sequence of a gene encoding pyruvate kinase obtained from the above-mentioned microorganism, or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence may be used.
  • Preferable examples include DNA having a base sequence of a gene derived from a Corynebacterium bacterium such as Corynebacterium glutamicum, an Escherichia bacterium such as Escherichia coli, or a Pantoea bacterium such as Pantoea ananatis. .
  • Pyruvate carboxylase is classified into enzyme number 6.4.1.1 and refers to a general term for enzymes that convert pyruvate and carbon dioxide into oxaloacetate. During the reaction, ATP is consumed and ADP and phosphoric acid are produced. Examples thereof include those derived from Corynebacterium bacteria such as Corynebacterium glutamicum, and Mycobacterium bacteria such as Mycobacterium smegmatis.
  • DNA having the base sequence of the gene encoding pyruvate carboxylase obtained from the above-mentioned microorganism, or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence may be used.
  • Preferable examples include DNA having a base sequence of a gene derived from a genus Corynebacterium such as Corynebacterium glutamicum, and a genus Mycobacterium such as Mycobacterium smegmatis. .
  • Phosphoenolpyruvate carboxylase is classified into enzyme number 4.1.1.13 and refers to a general term for enzymes that convert phosphoenolpyruvate and carbon dioxide into oxaloacetate and phosphate.
  • Corynebacterium bacteria such as Corynebacterium glutamicum, Escherichia bacteria such as Escherichia coli, Pantoea bacteria such as Pantoea ananatis, Hyphomicrobium methylovorum and Hyphomicrobium genus such as Hyphomicrobium methylovorum Derived from bacteria, Starkeya novella and other Starkella bacteria, Rhodopseudomonas sp.
  • Streptomyces coelicolor and other Streptomyces genus bacteria Things are examples of Streptomyces coelicolor and other Streptomyces genus bacteria Things.
  • the phosphoenolpyruvate carboxylase gene is a DNA having a base sequence of a gene encoding phosphoenolpyruvate carboxylase obtained from the above-mentioned microorganism, or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence May be used.
  • Preferred examples include corynebacterium bacteria such as Corynebacterium glutamicum, Escherichia bacteria such as Escherichia coli, Pantoea bacteria such as Pantoea ananatis, and hyphomicrobium methylovorum.
  • Examples thereof include DNA having a base sequence of a gene derived from bacteria.
  • Phosphoenolpyruvate carboxykinase is classified into enzyme number 4.1.1.32, enzyme number 4.1.1.38, enzyme number 4.1.1.49, and phosphoenolpyruvate and A generic term for enzymes that convert carbon dioxide into oxaloacetate.
  • enzyme number 4.1.1.32 is a reaction for converting GDP to GTP
  • enzyme number 4.1.1.38 is a reaction for converting phosphate to pyrophosphate
  • enzyme number 4.1.1.49. Is accompanied by a reaction to convert ADP to ATP.
  • a bacterium belonging to the genus Actinobacillus such as Actinobacillus succinogenes
  • a bacterium belonging to the genus Mycobacterium such as Mycobacterium ⁇ smegmatis
  • the genus Trypanosoma ⁇ brucei The thing of origin is mentioned.
  • DNA having a base sequence of a gene encoding phosphoenolpyruvate carboxykinase obtained from the above-mentioned microorganism, or a synthesis synthesized based on the known base sequence A DNA sequence may be used.
  • Suitable examples include Actinobacillus bacteria such as Actinobacillus succinogenes, Mycobacterium bacteria such as Mycobacterium smegmatis, Trypanosoma brucei, and Trypanosoma brucei. Examples are those derived from Trypanosoma bacteria.
  • Malate dehydrogenase is a general term for enzymes that are classified into enzyme number 1.1.1.37 and use NADH as a coenzyme to produce malate from oxaloacetate. Examples thereof include those derived from Corynebacterium bacteria such as Corynebacterium glutamicum, and Escherichia bacteria such as Escherichia coli.
  • malate dehydrogenase gene (mdh) DNA having the base sequence of the gene encoding malate dehydrogenase obtained from the above-mentioned micro tax, or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence is used. It's okay.
  • Preferable examples include DNA having a base sequence of a gene derived from a Corynebacterium bacterium such as Corynebacterium glutamicum, an Escherichia bacterium such as Escherichia coli, or a Pantoea bacterium such as Pantoea ananatis. .
  • Malate thiokinase is classified into enzyme number 6.2.1.9, and refers to a generic name of enzymes that combine malic acid and CoA to convert to malyl CoA. During the reaction, one molecule of ATP is consumed and one molecule of ADP and phosphoric acid are produced.
  • This enzyme is composed of a large subunit of about 400 amino acids and a 300 amino acid small subunit. On genes, they usually exist in the order of large subunit, small subunit. In this specification, for convenience, the large subunit is referred to as mtkB and the small subunit is referred to as mtkA.
  • mtkB the large subunit
  • mtkA As the specific activity of this enzyme, an example of 2.5 U / mg for a purified enzyme has been reported (Analytical Biochemistry, 1995; 227 (2): 363-367).
  • Malate thiokinase is mainly utilized in the utilization pathway of C1 carbon sources such as methane (Journal of Bacteriology, 1994; 176 (23): 7398-7404) and 3-hydroxypropionic acid pathway (Archives of Microbiology, 1989; 151: 252-256).
  • C1 carbon sources such as methane (Journal of Bacteriology, 1994; 176 (23): 7398-7404) and 3-hydroxypropionic acid pathway (Archives of Microbiology, 1989; 151: 252-256).
  • C1 carbon sources such as methane (Journal of Bacteriology, 1994; 176 (23): 7398-7404) and 3-hydroxypropionic acid pathway (Archives of Microbiology, 1989; 151: 252-256).
  • malyl-CoA lyase gene in the vicinity of the malate thiokinase gene, and the malate thiokinase gene present in such a manner is preferable.
  • Malate thiokinase is derived from a genus Methylobacterium such as Methylobacterium extorquens (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2), or a granule such as Granulibacter bethesdensis. Origin of Bacterium (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4), Hyphomicrobiumbmethylovorum (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6), Hyphomicrobium ⁇ denitrificans (SEQ ID NO: 7) Derived from the genus Hyphomicrobium such as SEQ ID NO: 8), Rhizobium sp. NGR234, etc.
  • a genus Methylobacterium such as Methylobacterium extorquens (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2), or a granule such as Granulibacter bethesdensis. Origin of Bacterium (SEQ ID NO: 3 and S
  • Genus origin SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: No. 12
  • those derived from the genus Methylococcus such as Methylococcus capsulatus
  • SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 those derived from the gamma proteobacteria
  • Hyphomicrobium From the genus Hyphomicrobium (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8), from Rhizobium (SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10), and from the genus Nitrosomonas (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12) ) Have 65% to 80% homology with each other.
  • Malate thiokinase SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14
  • derived from the genus Methylococcus has 70% to 80% homology with malate thiokinase (SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16) derived from gamma proteobacteria.
  • the protein having malate thiokinase activity can be suitably used for the production of useful substances derived from acetyl CoA and acetyl CoA.
  • malate thiokinase gene DNA having the base sequence of the gene encoding malate thiokinase obtained from the above-mentioned microorganism, or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence may be used.
  • Preferable examples include those derived from the genus Methylobacterium such as Methylobacterium Extorcus (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18), Hyphomicrobium methyloborum, Hyphomicrobium denitrificans, etc. Hyphomicrobium genus, Rhizobium sp.
  • Rhizobium genus Rhizobium genus
  • Granulibacter genus such as Bethesdensis
  • Nitrosomonas genus such as Nitrosomonas europia
  • Methylococcus examples thereof include DNA having a base sequence of a gene derived from the gamma proteobacteria world.
  • acetyl-CoA preferably, from the genus Hyphomicrobium (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22), from Rhizobium (eg, codon-optimized, SEQ ID NO: 23), derived from the genus Granuribacter (SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25), derived from the genus Nitrosomonas (SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27), derived from the genus Methylococcus (SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29), derived from the gamma proteobacterial kingdom Examples thereof include DNA having the base sequence of the gene (SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31).
  • Hyphomicrobium SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22
  • Rhizobium for example, codon-optimized, SEQ ID NO: 23
  • Nitrosomonas examples include DNAs having the base sequences of genes of SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27), Methylococcus genus (SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29), and gamma proteobacteria (SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31).
  • methane-utilizing bacteria such as Methylobacterum extorcens are microorganisms that inherently contain malate thiokinase and malyl CoA lyase.
  • the vector system suitable for methane-utilizing bacteria and the technology for modifying the genome gene of methane-utilizing bacteria have not been developed, compared to industrially used microorganisms such as Escherichia coli and Corynebacterium, Genetic manipulation is difficult.
  • methane-utilizing bacteria often grow slowly. Therefore, methane-utilizing bacteria are not suitable for producing useful metabolites.
  • Malyl CoA lyase is classified into enzyme number 4.1.3.24 and refers to an enzyme that produces glyoxylic acid and acetyl CoA from malyl CoA.
  • Methylobacterium such as Methylobacterium extorquens
  • Hyphomicrobium such as Hyphomicrobium methyloborum
  • Hyphomicrobium denitrichicans Chloroflexus aurantix And those derived from the genus Methylococcus such as Methylococcus capsulatas and the like.
  • specific activity of malyl-CoA lyase there is a report of 28.1 U / mg as a purified enzyme in Methylobacterium extroxen (Biochemical Journal, 1974; 139 (2): 399-405).
  • the malyl CoA lyase from the viewpoint of the production efficiency of acetyl CoA, particularly preferably, from the genus Methylobacterium (SEQ ID NO: 32) from the genus Hyphomicrobium (SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34), from the genus Nitrosomonas ( SEQ ID NO: 35) and enzymes having amino acid sequences derived from the genus Methylococcus (SEQ ID NO: 36) are exemplified.
  • DNA having the base sequence of the gene encoding malyl CoA lyase obtained from the above-mentioned microorganism, or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence may be used.
  • Preferable examples include those derived from the genus Methylobacterium such as Methylobacterium Extorcence, those derived from the genus Hyphomicrobium such as Hyphomicrobium methyloborum, Hyhomicrobium denitrichicans, and Chloroflexus.
  • the DNA which has the base sequence of the gene derived from chloroflexus genus, such as Aurantax, is illustrated. From the viewpoint of the production efficiency of acetyl CoA, particularly preferred is DNA having a base sequence of a gene derived from the genus Methylobacteria and from the genus Hyphomicrobium.
  • Examples of particularly preferred base sequences include, as an example derived from the genus Methylobacteria, the base sequence of a gene derived from Methylobacterium extremens (SEQ ID NO: 37), and as an example derived from the genus Hyphomicrobium, hyphomicrobium.
  • the base sequence of the gene derived from methyloboram (SEQ ID NO: 38), the base sequence of the gene derived from Hyphomicrobium denitrificans (SEQ ID NO: 39), the base sequence of the gene derived from Nitrosomonas europia as an example derived from the genus Nitrosomonas ( SEQ ID NO: 40), an example derived from the genus Methylococcus is the base sequence of a gene derived from Methylococcus capsuleatus (SEQ ID NO: 41).
  • Glyoxylate carboligase is classified under the enzyme number 4.1.1.47 and refers to a general term for enzymes that convert two molecules of glyoxylic acid into one molecule of 2-hydroxy-3-oxopropionic acid.
  • the reaction involves decarboxylation of one molecule of carbon dioxide. Examples thereof include those derived from Escherichia bacteria such as Escherichia coli and Rhodococcus bacteria such as Rhodococcus josti.
  • glyoxylate carboligase gene (gcl) DNA having the base sequence of the gene encoding glyoxylate carboligase obtained from the above-mentioned microorganism, or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence is used. It's okay.
  • Preferable examples include DNA having a base sequence of a gene derived from a genus Rhodococcus such as Rhodococcus josti or a bacterium belonging to the genus Escherichia such as Escherichia coli.
  • GlxR 2-Hydroxy-3-oxopropionic acid reductase
  • enzyme number 1.1.1.60 uses NADH as a coenzyme to convert 2-hydroxy-3-oxopropionic acid to glyceric acid It refers to the generic name of enzymes. Examples thereof include those derived from Rhodococcus bacteria such as Rhodococcus josti and Escherichia bacteria such as Escherichia coli.
  • the 2-hydroxy-3-oxopropionate reductase gene is a DNA having the base sequence of a gene encoding 2-hydroxy-3-oxopropionate reductase obtained from the above-mentioned microorganism, or a known base thereof A synthetic DNA sequence synthesized based on the sequence may be used.
  • Preferable examples include DNA having a base sequence of a gene derived from a genus Rhodococcus such as Rhodococcus josti or a bacterium belonging to the genus Escherichia such as Escherichia coli.
  • Hydroxypyruvate isomerase is a general term for enzymes that are classified into enzyme number 5.3.1.22 and isomerize 2-hydroxy-3-oxopropionic acid to hydroxypyruvic acid. Examples thereof include those derived from Corynebacterium bacteria such as Corynebacterium glutamicum, Escherichia bacteria such as Escherichia coli, and Pantoea bacteria such as Pantoea ananatis.
  • hydroxypyruvate isomerase gene (hyi) DNA having the base sequence of the gene encoding hydroxypyruvate isomerase obtained from the above-mentioned microorganism, or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence is used. It's okay.
  • Preferable examples include DNA having a base sequence of a gene derived from a Corynebacterium bacterium such as Corynebacterium glutamicum, an Escherichia bacterium such as Escherichia coli, or a Pantoea bacterium such as Pantoea ananatis. .
  • Hydroxypyruvate reductase is classified into the enzyme number 1.1.1.1.81, and refers to a general term for enzymes that convert hydroxypyruvic acid to glyceric acid using NADH or NADPH as a coenzyme. Examples thereof include those derived from Escherichia bacteria such as Escherichia coli and Pantoea bacteria such as Pantoea ananatis.
  • a gene (ycdW) of hydroxypyruvate reductase DNA having the base sequence of the gene encoding hydroxypyruvate reductase obtained from the above-mentioned microorganism, or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence is used. It's okay.
  • Preferable examples include DNA having a base sequence of a gene derived from a bacterium belonging to the genus Escherichia such as Escherichia coli and the genus Pantoea such as Pantoea ananatis.
  • Glyceric acid 2-kinase (GarK) is classified into enzyme number 2.7.1.165 and refers to a general term for enzymes that convert glyceric acid into 2-phosphoglyceric acid.
  • One molecule of ATP is consumed and one molecule of ADP and phosphoric acid are produced.
  • Examples thereof include those derived from Corynebacterium bacteria such as Corynebacterium glutamicum, Escherichia bacteria such as Escherichia coli, and Pantoea bacteria such as Pantoea ananatis.
  • the glycerate 2-kinase gene includes a DNA having a base sequence of a gene encoding glycerate 2-kinase obtained from the above-mentioned microorganism, or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence May be used.
  • Preferable examples include DNA having a base sequence of a gene derived from a Corynebacterium bacterium such as Corynebacterium glutamicum, an Escherichia bacterium such as Escherichia coli, or a Pantoea bacterium such as Pantoea ananatis. .
  • Glycerate 3-kinase is a generic term for enzymes that are classified into enzyme number 2.7.1.31 and convert glycerate to 3-phosphoglycerate.
  • One molecule of ATP is consumed and one molecule of ADP and phosphoric acid are produced.
  • Examples thereof include those derived from Corynebacterium bacteria such as Corynebacterium glutamicum, Escherichia bacteria such as Escherichia coli, and Pantoea bacteria such as Pantoea ananatis.
  • the glycerate 3-kinase gene includes a DNA having a base sequence of a gene encoding glycerate 3-kinase obtained from the above-mentioned microorganism, or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence May be used.
  • Preferable examples include DNA having a base sequence of a gene derived from a Corynebacterium bacterium such as Corynebacterium glutamicum, an Escherichia bacterium such as Escherichia coli, or a Pantoea bacterium such as Pantoea ananatis. .
  • Phosphoglycerate mutase is classified as enzyme number 5.4.2.1, and is a generic term for enzymes that convert 3-phosphoglycerate into 2-phosphoglycerate. Examples thereof include those derived from Corynebacterium bacteria such as Corynebacterium glutamicum, Escherichia bacteria such as Escherichia coli, and Pantoea bacteria such as Pantoea ananatis.
  • a DNA having a base sequence of a gene encoding phosphoglycerate mutase obtained from the above-mentioned microorganism, or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence is used. It's okay.
  • Preferable examples include DNA having a base sequence of a gene derived from a Corynebacterium bacterium such as Corynebacterium glutamicum, an Escherichia bacterium such as Escherichia coli, or a Pantoea bacterium such as Pantoea ananatis. .
  • Enolase is a generic term for enzymes that are classified into enzyme number 4.2.1.11 and convert 2-phosphoglycerate to phosphoenolpyruvate. Examples thereof include those derived from Corynebacterium bacteria such as Corynebacterium glutamicum, Escherichia bacteria such as Escherichia coli, and Pantoea bacteria such as Pantoea ananatis.
  • DNA having the base sequence of the gene encoding enolase obtained from the above-mentioned microorganism, or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence may be used.
  • Preferable examples include DNA having a base sequence of a gene derived from a Corynebacterium bacterium such as Corynebacterium glutamicum, an Escherichia bacterium such as Escherichia coli, or a Pantoea bacterium such as Pantoea ananatis. .
  • Glycine transaminase refers to an enzyme that transfers an amino group from a compound having an amino group (secondary amine or primary amine) to glyoxylic acid and converts it to glycine.
  • enzymes classified into the enzyme number 2.6.1 group enzymes using glyoxylic acid as a substrate can be mentioned.
  • 2.6.1. *; * 4, 35, 44, 45, 60, 63 and 73.
  • Glycine transaminase examples thereof include those derived from the genus Methylococcus such as Methylococcuscapsulatus, the genus Aspergillus such as Aspergillus niger, and the genus Capriavidas such as Capriavidas necatol.
  • Glycine transaminase may also have the activity of serine transaminase described below.
  • glycine dehydrogenase (Gdh) is also considered to be included in glycine transaminase.
  • glycine transaminase gene DNA having the base sequence of the gene encoding glycine transaminase obtained from the above-mentioned microorganism, or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence may be used.
  • Preferable examples include those derived from the genus Methylococcus such as Methylococcuscapsulatus, Aspergillus genus such as Aspergillus niger, and Capriavidas genus such as Capriavidas necatol.
  • the gene for glycine dehydrogenase is also considered to be included in the gene for glycine transaminase.
  • glycine dehydrogenase gene a DNA having a base sequence of a gene encoding glycine dehydrogenase obtained from the aforementioned microorganism, or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence may be used.
  • Glycine cleavage system refers glycine, tetrahydrofolate, and NAD +, 5,10-methylenetetrahydrofolate, a generic term for a series of enzymes that convert into NH 3, CO 2 and NADH. It is composed of proteins called H-protein, P-protein, L-protein, and T-protein (Molecular and Cellular Biochemistry, 1973; 1 (2): 169-187). P-protein, L-protein and T-protein are classified into enzyme numbers 1.4.4.2, 1.8.1.4 and 2.2.1.10.
  • Examples include those derived from Escherichia bacteria such as Escherichia coli, Pantoea bacteria such as Pantoea ananatis, Aspergillus bacteria such as Aspergillus niger, and Capriavidas bacteria such as Capriavidas necatol.
  • the glycine cleavage gene group includes a DNA having a base sequence of a gene encoding a glycine cleavage system enzyme group obtained from the above-mentioned microorganism, or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence May be used.
  • Preferred examples include a base sequence of a gene derived from an Escherichia bacterium such as Escherichia coli, a Pantoea bacterium such as Pantoea ananatis, an Aspergillus bacterium such as Aspergillus niger, or a Capriavidas bacterium such as Capriavidas necatol. DNA is exemplified.
  • the 5,10-methylenetetrahydrofolic acid produced in the glycine cleavage system reacts with new glycine by the action of serine hydroxymethyltransferase and is converted to serine. That is, two glycine molecules and NAD + are converted into serine, NH 3 , CO 2 and NADH by the action of the glycine cleavage system and serine hydroxymethyltransferase.
  • Serine hydroxymethyltransferase is classified into enzyme number 2.1.2.1, and is a general term for enzymes that produce serine and tetrahydrofolate from 5,10-methylenetetrahydrofolate and glycine. Examples thereof include those derived from Corynebacterium bacteria such as Corynebacterium glutamicum, Escherichia bacteria such as Escherichia coli, and Pantoea bacteria such as Pantoea ananatis.
  • DNA having the base sequence of the gene encoding serine hydroxymethyltransferase obtained from the above-mentioned microorganism, or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence is used. It's okay.
  • Preferable examples include DNA having a base sequence of a gene derived from a Corynebacterium bacterium such as Corynebacterium glutamicum, an Escherichia bacterium such as Escherichia coli, or a Pantoea bacterium such as Pantoea ananatis. .
  • Serine dehydratase is classified into enzyme number 4.3.1.17 and refers to a general term for enzymes that produce pyruvic acid and ammonia from serine. The same activity may be reported for the enzyme with enzyme number 4.3.1.19.
  • Corynebacterium bacteria such as Corynebacterium glutamicum, Escherichia bacteria such as Escherichia coli, Pantoea bacteria such as Pantoea ananatis, Aspergillus bacteria such as Aspergillus niger, Capriavidas bacteria such as Capriavidas necatol
  • Corynebacterium bacteria such as Corynebacterium glutamicum
  • Escherichia bacteria such as Escherichia coli
  • Pantoea bacteria such as Pantoea ananatis
  • Aspergillus bacteria such as Aspergillus niger
  • Capriavidas bacteria such as Capriavidas necatol The thing derived from is mentioned.
  • DNA having the base sequence of the gene encoding serine dehydratase obtained from the above-mentioned microorganism, or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence may be used.
  • Preferred examples include Corynebacterium bacteria such as Corynebacterium glutamicum, Escherichia bacteria such as Escherichia coli, Pantoea bacteria such as Pantoea ananatis, Aspergillus bacteria such as Aspergillus niger, Capriavidas necatol, etc.
  • Serine transaminase refers to an enzyme that transfers amino group from serine to a compound having carbonyl group (keto group or aldehyde group) to convert it into 3-hydroxypyruvic acid.
  • a compound having carbonyl group keto group or aldehyde group
  • Serine transaminase refers to an enzyme that transfers amino group from serine to a compound having carbonyl group (keto group or aldehyde group) to convert it into 3-hydroxypyruvic acid.
  • enzymes classified in the enzyme number 2.6.1 group enzymes using serine as a substrate can be mentioned. Examples include 2.6.1.51 and 2.6.1.45, but similar activities are reported in the enzyme groups 2.6.1.44 and 2.6.1.35. May have been. It may also have the above-mentioned glycine transaminase activity.
  • serine 2-dehydrogenase is also considered to be included in serine transaminase.
  • serine transaminase gene DNA having the base sequence of the gene encoding serine transaminase obtained from the above-mentioned microorganism, or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence may be used.
  • Preferable examples include those derived from the genus Methylococcus such as Methylococcuscapsulatus, Aspergillus genus such as Aspergillus niger, and Capriavidas genus such as Capriavidas necatol.
  • the serine 2-dehydrogenase gene is also considered to be included in the serine transaminase gene.
  • Serine 2-dehydrogenase (Sdh) is classified into enzyme number 1.4.1.7, and is a generic term for enzymes that produce 3-hydroxypyruvic acid and ammonia from serine. For example, the thing derived from plants, such as Petro serinum crispam (parsley), is mentioned.
  • serine 2-dehydrogenase gene DNA having the base sequence of the gene encoding serine 2-dehydrogenase obtained from the above-mentioned organism, or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence is used. It's okay.
  • Preferable examples include DNA having a base sequence of a gene derived from a plant such as Petrocerinum crispam (parsley).
  • an enzyme that is not retained may be imparted to a microorganism that does not form the circuit of FIG.
  • bacteria belonging to the genus Escherichia for example, Escherichia coli does not have malate thiokinase, malyl CoA lyase, and glycine transaminase, and therefore, at least malate thiokinase, malyl CoA lyase, and glycine transaminase may be added.
  • Pantoea bacteria such as Pantoea ananatis, do not have malate thiokinase, malyl CoA lyase, and glycine transaminase. Therefore, at least malate thiokinase, malyl CoA lyase, and glycine transaminase may be added.
  • Corynebacterium glutamicum does not possess malate thiokinase, malyl CoA lyase, glyoxylate carboligase, 2-hydroxy-3-oxopropionate reductase, and hydroxypyruvate reductase, At least malate thiokinase, malyl CoA lyase, glyoxylate carboligase, 2-hydroxy-3-oxopropionate reductase and / or hydroxypyruvate reductase may be added.
  • the acetyl-CoA producing microorganism according to the first invention includes pyruvate kinase, pyruvate carboxylase, phosphoenolpyruvate carboxylase, phosphoenolpyruvate carboxykinase, malate dehydrogenase, malate thiokinase, malyl CoA lyase, glyoxylate carboligase, At least one selected from the group consisting of 2-hydroxy-3-oxopropionate reductase, hydroxypyruvate isomerase, hydroxypyruvate reductase, glycerate 2-kinase, glycerate 3-kinase, phosphoglycerate mutase and enolase It is preferred that the enzyme activity is enhanced. Thereby, acetyl CoA can be produced more efficiently.
  • acetyl-CoA producing microorganism it is preferable that at least one enzyme activity selected from the group consisting of malate enzyme and fumarate reductase is inactivated or reduced. Thereby, acetyl CoA can be produced more efficiently.
  • Malate enzyme is classified into enzyme number 1.1.1.18, enzyme number 1.1.1.19, enzyme number 1.1.1.10 and converts malic acid into pyruvic acid and carbon dioxide.
  • a generic term for enzymes From the viewpoint of acetyl CoA production efficiency, it is preferable to inactivate or reduce the activity of malic enzyme.
  • Fumarate reductase is classified as enzyme number 1.3.99.1 and refers to a generic name for enzymes that convert fumarate into succinate.
  • succinate dehydrogenase belonging to enzyme number 1.3.99.1 may have fumarate reductase activity that converts fumaric acid to succinic acid. Therefore, in the present invention, succinate dehydrogenase having fumarate reductase activity is also included in fumarate reductase. From the viewpoint of acetyl CoA production efficiency, it is preferable to inactivate or reduce the fumarate reductase activity. Thereby, malic acid can be suppressed to fumaric acid and succinic acid and the amount of malic acid is reduced, leading to an improvement in the yield of acetyl CoA.
  • the malate enzyme gene (mostly, but not limited to, sfcA, maeA, maeB or malE) may have multiple isomers in the genome depending on the microorganism. .
  • Pantoea Ananatis has sfcA and maeB.
  • Corynebacterium glutamicum has malE.
  • the fumarate reductase gene (frd, sdh, yqiG, etc.) may have multiple isomers in the genome depending on the microorganism. Pantoea Ananatis owns yqiG. Corynebacterium glutamicum has sdh.
  • microorganism used as a host in the first invention is not particularly limited as long as it does not have any of the following (a), (b), (c), (d) and (e).
  • a carbonic acid fixation circuit having an enzymatic reaction from malonyl CoA to malonic acid semialdehyde or 3-hydroxypropionic acid (B) A carbonic acid fixation circuit having an enzymatic reaction from acetyl CoA and CO 2 to pyruvic acid. (C) A carbonic acid fixation circuit having an enzymatic reaction from crotonyl CoA and CO 2 to ethylmalonyl CoA or glutaconyl CoA. (D) A carbonic acid fixation circuit having an enzymatic reaction from CO 2 to formic acid. (E) At least one selected from the group consisting of malate thiokinase and malyl-CoA lyase.
  • FIG. 1 of International Publication No. 2011/099006. 1 is a circuit in which acetyl CoA is converted to acetyl CoA again via malonyl CoA, 3-hydroxypropionic acid, propionyl CoA, malic acid, and malyl CoA.
  • FIG. 4A A circuit shown in 4A, in which acetyl CoA is converted to acetyl CoA again via malonyl CoA, malonic acid semialdehyde, ⁇ -alanine, malic acid, malyl CoA.
  • FIG. 8 is a circuit in which acetyl CoA is converted to acetyl CoA again via malonyl CoA, malonic acid semialdehyde or hydroxypropionic acid, pyruvic acid, malic acid, malyl CoA.
  • FIG. Of International Publication No. 2011/099006. A circuit shown in 9A, 9B, or 9C, in which acetyl CoA is converted back to acetyl CoA via malonyl CoA, hydroxypropionic acid, 2-ketoglutaric acid, malic acid, and malyl CoA.
  • FIG. of International Publication No. 2011/099006. 17 is a circuit in which acetyl CoA is converted to acetyl CoA again via malonyl CoA, malonic acid semialdehyde or hydroxypropionic acid, methylmalonyl CoA, pyruvate, oxaloacetate, malic acid, malyl CoA.
  • the carbonic acid fixing circuit of (1) to (7) above has an enzyme reaction from malonyl CoA to malonic acid semialdehyde or 3-hydroxypropionic acid. These reactions are catalyzed by malonic acid semialdehyde dehydrogenase or malonyl-CoA reductase (WO 2011/099006). Such reduction reaction of carboxylic acid or its (thio) ester, such as reduction of succinyl CoA and malonyl CoA, is generally difficult as an enzyme reaction, and it is desirable to avoid it as much as possible as a fermentation route. (Nature, 2008; 451: 86-89, Nature Chemical Biolory, 2011; 7: 445-452).
  • FIG. Of International Publication No. 2011/099006. 1 is a circuit in which acetyl CoA is converted to acetyl CoA again via pyruvic acid, phosphoenolpyruvic acid, oxaloacetic acid, malic acid, and malyl CoA.
  • FIG. 7C, 7D, or 7E A circuit shown in 7C, 7D, or 7E in which acetyl CoA is converted to acetyl CoA again via pyruvic acid, malic acid, and malyl CoA.
  • FIG. Of International Publication No. 2011/099006. A circuit shown in 9M, in which acetyl CoA is converted to acetyl CoA again via pyruvic acid, 2-ketoglutaric acid, malic acid, and malyl CoA.
  • the carbonic acid fixing circuits of (8) to (10) have an enzyme reaction from acetyl CoA and CO 2 to pyruvic acid in common. It is pyruvate synthase that catalyzes this reaction (WO 2011/099006).
  • the synthesis reaction of pyruvic acid by pyruvate synthase requires a strong reducing power via ferredoxin, and the reaction is slow, and since it is weak against oxygen, the reaction does not proceed under extreme anaerobic conditions.
  • (c) a carbonic acid fixation circuit having an enzyme reaction from crotonyl CoA and CO 2 to ethylmalonyl CoA or glutaconyl CoA refers to FIG. 1 of WO2011 / 099006.
  • the circuit shown in 9H or 9J indicates that acetyl CoA is converted to acetyl CoA again through crotonyl CoA, ethylmalonyl CoA or glutaconyl CoA, oxaloacetate, malic acid, malyl CoA.
  • Crotonyl CoA carboxylase-reductase or methylcrotonyl CoA carboxylase catalyzes the conversion of crotonyl CoA and CO 2 to ethylmalonyl CoA or glutaconyl CoA.
  • Crotonyl CoA carboxylase-reductase has a high Km for carbonate (14 mM. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007; 104 (25): 10631-10636) and is expected to be active at low concentrations. Absent.
  • the substrate crotonyl-CoA is produced from 3-hydroxybutyryl-CoA by dehydration.
  • Malonate semialdehyde dehydrogenase is classified into enzyme number 1.2.1.18 and refers to a generic term for enzymes that convert malonyl CoA to malonate semialdehyde.
  • Malonyl CoA reductase is a generic term for enzymes that convert malonyl CoA into malonic acid semialdehyde or 3-hydroxypropionic acid.
  • Pyruvate synthase is classified into enzyme number 1.2.7.1 and refers to a general term for enzymes that convert acetyl CoA to pyruvate.
  • Crotonyl CoA carboxylase-reductase is classified under the enzyme number 1.3.1.85 and refers to the generic name of enzymes that convert crotonyl CoA to ethylmalonyl CoA.
  • Methylcrotonyl CoA carboxylase is classified into enzyme number 6.4.1.4, and refers to the generic name of enzymes that convert crotonyl CoA to glutaconyl CoA.
  • microorganisms not having any of (a), (b), (c), (d), and (e) include, for example, microorganisms belonging to the family Enterobacteriaceae, microorganisms belonging to coryneform bacteria, and filamentous fungi And actinomycetes.
  • microorganisms belonging to the family Enterobacteriaceae include bacteria belonging to the genus Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Pantoea, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, and the like. Among these, bacteria belonging to the genus Escherichia or Pantoea are preferable from the viewpoint that useful metabolites can be efficiently produced. Escherichia and Pantoea are very closely related (Journal of General and Applied Microbiology, 1997; 43 (6): 355-361, International Journal of Systematic Bacteriology, 1997; 47 (4): 1061-1067 ).
  • the Escherichia bacterium is not particularly limited, and examples thereof include Escherichia coli (E. coli). Specific examples of Escherichia coli include prototype wild-type B strain Escherichia coli B (ATCC 11303), prototype wild-type K12 strain-derived Escherichia coli W3110 (ATCC 27325), Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076) and the like. Can be mentioned.
  • Pantoea Ananatis AJ13355 (FERM BP-6614) (European Patent Application Publication No. 0952211)
  • Pantoea Ananatis AJ13356 (FERM BP-6615)
  • These strains are described as Enterobacter agglomerans in European Patent Application Publication No. 0952211, but as described above, these strains have been reclassified into Pantoea ananatis by 16S rRNA nucleotide sequence analysis as described above. Yes.
  • bacteria belonging to the genus Enterobacter have been reclassified as Pantoea agglomerans or Pantoea dispersa (International Journal of Systematic Bacteriology, 1989; 39 (3): 337-345).
  • Some bacteria belonging to the genus Ervinia have been reclassified as Pantoea Ananas and Pantoea Stuarti (International Journal of Systematic Bacteriology, 1993; 43 (1): 162-173).
  • Enterobacter bacteria examples include Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes, and the like. Specifically, the strains exemplified in European Patent Application Publication No. 952221 can be used. A representative strain of the genus Enterobacter is Enterobacter agglomerans ATCC 12287.
  • Coryneform bacteria refer to the genus Corynebacterium, Brevibacterium, or Microbacterium as defined in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th ed., P599 (1974). It refers to the microorganisms to which it belongs. In addition, microorganisms (Classic Bacteriology, 1991; 41 (2): 255-260) that have been classified as Brevibacterium but later reclassified as Corynebacterium, and related bacteria A microorganism belonging to a certain genus Brevibacterium is also mentioned. Examples of coryneform bacteria are listed below.
  • Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511, Corynebacterium carnae ATCC 15991, Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, 13032, 13060, Corynebacterium Lilium ATCC 15990, Corynebacterium merasecola ATCC 17965, Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539), Corynebacterium herculis ATCC 13868, Brevibacterium divalicatam ATCC 14020, Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067A, ATCC 14067A 8 (FERM BP-2205), Brevibacterium immophilophilum ATCC 14068, Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium
  • Aspergillus or Capriavidas that does not have any of the above (a), (b), (c), (d) and (e) is used as a host.
  • the genus Aspergillus include Aspergillus niger (including varieties such as Aspergillus awamori and Aspergillus kawachii), Aspergillus terreus, Aspergillus itaconicus and the like.
  • the genus Capriavidas include Capriavidus necator (also known as Alcaligenes eutropha, Ralstonia tro eutropha, and Wautersia eutropha).
  • citric acid When producing citric acid using the second invention, it is preferable to use Aspergillus spp. Such as Aspergillus niger. When producing itaconic acid, it is preferable to use Aspergillus genus bacteria such as Aspergillus terreus and Aspergillus itaconicus. When producing (poly) 3-hydroxybutyric acid, it is preferable to use Capriavidas bacteria such as Capriavidas and Necatol.
  • the acetyl-CoA-producing microorganism according to the present invention may have various pathways for producing metabolites using acetyl-CoA as an intermediate, or may have enhanced enzyme activity related to the pathway.
  • Examples of the route include a route for producing isopropyl alcohol, a route for producing acetone, and a route for producing glutamic acid.
  • microorganisms having these pathways and capable of producing useful metabolites derived from acetyl CoA will be described.
  • the acetyl-CoA producing microorganism according to the present invention which has an isopropyl alcohol production pathway, is obtained by, for example, constructing the acetyl-CoA producing microorganism of the present invention using a microorganism having an isopropyl alcohol production pathway as a host, or In the acetyl-CoA-producing microorganism of the present invention, the microorganism is obtained by adding or enhancing an enzyme gene related to the isopropyl alcohol production pathway.
  • microorganism having an isopropyl alcohol production pathway may be referred to as “isopropyl alcohol-producing microorganism”, and Escherichia coli having an isopropyl alcohol production pathway may be referred to as “isopropyl alcohol-producing Escherichia coli”.
  • Isopropyl alcohol-producing Escherichia coli is an Escherichia coli having an isopropyl alcohol production pathway, and means an Escherichia coli having isopropyl alcohol production ability introduced by a gene recombination technique.
  • Such an isopropyl alcohol production route is not particularly limited as long as the target Escherichia coli produces isopropyl alcohol.
  • the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli is preferably imparted or enhanced with four types of enzyme activities: thiolase activity, CoA transferase activity, acetoacetate decarboxylase activity, and isopropyl alcohol dehydrogenase activity.
  • a microorganism having thiolase activity, CoA transferase activity, and acetoacetate decarboxylase activity in the isopropyl alcohol production pathway can be used.
  • the microorganism does not have isopropyl alcohol dehydrogenase activity in the sopropyl alcohol production pathway.
  • the acetyl-CoA-producing microorganism of the present invention is a microorganism constructed using an Escherichia bacterium as a host
  • the following embodiments are preferred.
  • An example of a preferred embodiment is an acetyl-CoA producing microorganism in which a thiolase activity, a CoA transferase activity, an acetoacetate decarboxylase activity, and an isopropyl alcohol dehydrogenase activity are imparted or enhanced to a bacterium belonging to the genus Escherichia. Isopropyl alcohol is efficiently produced by the microorganism.
  • Another example of a preferred embodiment is an acetyl-CoA-producing microorganism in which Escherichia bacteria are imparted or enhanced with thiolase activity, CoA transferase activity, and acetoacetate decarboxylase activity. Acetone is efficiently produced by the microorganism.
  • Thiolase is classified as enzyme number 2.3.1.9 and refers to a generic name of enzymes that catalyze the reaction of producing acetoacetyl CoA from acetyl CoA.
  • Genus Candida Genus Candida, Caulobacter crescentus and other Streptomyces collinus, Streptomyces bacterium, Enterococcus faka Scan those derived from (Enterococcus faecalis) Enterococcus bacteria, and the like.
  • thiolase gene DNA having a base sequence of a gene encoding thiolase obtained from the above-mentioned microorganism, or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence may be used.
  • Preferable examples include Clostridium bacteria such as Clostridium acetobutylicum and Clostridium beigerinki, Escherichia bacteria such as Escherichia coli, Halobacteria species, Zogroa bacteria such as Zugroa lamigera, Rhizobium species, Brady Bradyrizobium bacteria such as Rhizobium japonica, Candida bacteria such as Candida tropicalis, Caulobacter bacteria such as Caulobacter crescentus, Streptomyces genus bacteria such as Streptomyces colinas, Enterococcus faecalis
  • DNA having a base sequence of a gene derived from Enterococcus bacterium DNA having a base sequence of a gene derived from Enterococcus bacterium.
  • More preferable examples include DNA having a base sequence of a gene derived from a prokaryotic organism such as a Clostridium bacterium and an Escherichia bacterium, and particularly preferably a base of a gene derived from Clostridium acetobutylicum or Escherichia coli.
  • a DNA having a sequence is exemplified.
  • CoA transferase is classified into enzyme number 2.8.3.8 and refers to a general term for enzymes that catalyze a reaction for producing acetoacetate from acetoacetyl CoA.
  • Clostridium acetobutylicum Clostridium acetobutylicum
  • Clostridium ⁇ ⁇ beijerinckii Clostridium bacteria
  • Roseburia intestinalis Roseburia intestinalis
  • Roseburia intestinalis such as Roseburia intestinalis (Faecali)
  • Examples include those derived from bacteria belonging to the genus Escherichia, such as bacteria belonging to the genus Calibacteria, bacteria belonging to the genus Coprococcus, trypanosoma such as Trypanosoma brucei, and Escherichia coli.
  • CoA transferase gene DNA having the base sequence of the gene encoding CoA transferase obtained from the above-mentioned microorganism, or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence may be used. Suitable examples include Clostridium bacteria such as Clostridium acetobutylicum, Roseburia bacteria such as Roseburia intestinalis, Facalibacteria bacteria such as Fakaribacterium plausents, Coprococcus bacteria, Trypanosoma brucei, etc. And DNA having a base sequence of a gene derived from a bacterium belonging to the genus Escherichia such as Trypanosoma and Escherichia coli.
  • Clostridium bacteria such as Clostridium acetobutylicum
  • Roseburia bacteria such as Roseburia intestinalis
  • Facalibacteria bacteria such as Fakaribacterium plausents
  • Coprococcus bacteria Trypanosoma brucei
  • More preferable examples include DNA having a nucleotide sequence of a gene derived from a bacterium belonging to the genus Clostridium or Escherichia, and particularly preferred is a DNA having a nucleotide sequence of a gene derived from Clostridium acetobutylicum or Escherichia coli. Illustrated.
  • Acetoacetate decarboxylase is classified into enzyme number 4.1.1.4 and refers to a general term for enzymes that catalyze the reaction of producing acetone from acetoacetate. Examples thereof include those derived from Clostridium bacteria such as Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii, and Bacillus bacteria such as Bacillus polymyxa.
  • DNA having a base sequence of a gene encoding acetoacetate decarboxylase obtained from the above-mentioned microorganism, or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence may be used.
  • Preferable examples include DNA having a base sequence of a gene derived from a Clostridium bacterium such as Clostridium acetobutylicum or a Bacillus bacterium such as Bacillus polymixa. Particularly preferred is DNA having a base sequence of a gene derived from Clostridium acetobutylicum.
  • Isopropyl alcohol dehydrogenase is classified into enzyme number 1.1.1.180 and refers to a general term for enzymes that catalyze the reaction of producing isopropyl alcohol from acetone. Examples thereof include those derived from Clostridium bacteria such as Clostridium beijerinckii.
  • a DNA having a base sequence of a gene encoding isopropyl alcohol dehydrogenase obtained from the above-mentioned microorganism, or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence may be used.
  • Preferable examples include DNA having a base sequence of a gene derived from a bacterium belonging to the genus Clostridium such as Clostridium beigerinki.
  • each of the four types of enzymes is preferably derived from at least one selected from the group consisting of Clostridium bacteria, Bacillus bacteria, and Escherichia bacteria, and the thiolase and CoA transferase are Escherichia bacteria. More preferably, the acetoacetate decarboxylase and isopropyl alcohol dehydrogenase are derived from a Clostridium bacterium.
  • each of the four types of enzymes is preferably derived from at least one selected from the group consisting of Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijurinki and Escherichia coli; More preferably from acetobutylicum or Escherichia coli, acetoacetate decarboxylase from Clostridium acetobutylicum, isopropyl alcohol dehydrogenase from Clostridium begerinki; thiolase and CoA transferase are from Escherichia coli, Acetate decarboxylase is derived from Clostridium acetobutylicum and isopropyl alcohol It is further preferred dehydrogenase is derived from Clostridium beijerinckii.
  • the CoA transferase gene (atoD and atoA) and the thiolase gene (atoB) derived from E. coli form an operon on the E. coli genome in the order of atoD, atoA, and atoB (Journal of Bacteriology, 1987; 169 (1): 42) -52). Therefore, it is possible to simultaneously control the expression of the CoA transferase gene and the thiolase gene by modifying the atoD promoter.
  • the promoter responsible for the expression of both enzyme genes is replaced with another promoter from the viewpoint of obtaining sufficient isopropyl alcohol production ability. It is preferable to enhance the expression of both enzyme genes by, for example.
  • the promoter used for enhancing the expression of CoA transferase activity and thiolase activity include glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) promoter derived from Escherichia coli.
  • GAPDH promoter derived from Escherichia coli is described in base numbers 397 to 440 in the base sequence information of GenBank accession number X02662.
  • Examples of the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli include pIPA / B strains and pIaaa / B strains described in International Publication No. 2009/008377, which can produce isopropyl alcohol from plant-derived materials.
  • a CoA transferase activity and a thiolase activity enhanced the expression of each gene on the E. coli genome
  • an acetoacetate decarboxylase activity and an isopropyl alcohol dehydrogenase activity enhanced the expression by introducing a plasmid (in this specification, pIa / B :: atoDAB strain).
  • examples of the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli include microorganisms described in International Publication No. 2009/094485, International Publication No. 2009/094485, International Publication No. 2009/046929, and International Publication No. 2009/046929. .
  • Isopropyl alcohol-producing Escherichia coli exhibits an enzyme activity pattern in which the activity of the transcriptional repressor GntR is inactivated, and the isopropyl alcohol production pathway and the enzyme activity pattern that maintains or enhances the ability to produce isopropyl alcohol with the inactivation of GntR activity.
  • An isopropyl alcohol-producing E. coli provided with an auxiliary enzyme group may be used. Thereby, isopropyl alcohol can be produced at a higher rate.
  • the “auxiliary enzyme group” refers to one or more enzymes that affect the ability to produce isopropyl alcohol.
  • the auxiliary enzyme group need not be composed of a plurality of enzymes, and may be composed of one enzyme.
  • Each enzyme activity of the auxiliary enzyme group is inactivated, activated or enhanced, and the “enzyme activity pattern of the auxiliary enzyme group” in the present invention means an improved isopropyl obtained only by inactivating the GntR activity.
  • Alcohol production refers to the enzyme activity pattern of each enzyme that can be maintained or increased, including one or a combination of two or more enzymes.
  • Preferred examples of the enzyme activity pattern of the auxiliary enzyme group include the following patterns (i) to (iii). Among these, the following (iii) is more preferable from the viewpoint of the ability to produce isopropyl alcohol.
  • Ii Inactivation of glucose-6-phosphate isomerase (Pgi) activity and enhancement of glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase (Zwf) activity.
  • auxiliary enzyme group and its enzyme activity pattern are not limited to the above, and include an inactivation of GntR activity, and an auxiliary enzyme group and its enzyme activity pattern that can increase the amount of isopropyl alcohol produced in isopropyl alcohol-producing Escherichia coli. Both are included in the present invention.
  • GntR refers to a transcription factor that negatively regulates the operon involved in gluconate metabolism via the Entner-Doudoroff pathway.
  • GntR refers to a generic term for GntR transcriptional repressors that suppress the action of two gene groups (GntI and GntII) responsible for gluconic acid uptake and metabolism.
  • Glucose-6-phosphate isomerase (Pgi) is classified into enzyme number 5.3.1.9 and catalyzes a reaction for producing D-fructose-6-phosphate from D-glucose-6-phosphate.
  • Glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase (Zwf) is classified into enzyme number 1.1.1.149, and D-glucose-6-phosphate to D-glucono-1,5-lactone-6-phosphorus
  • Dinococcus spp. Such as Dinococcus radiophilus, Aspergillus spp. Aspergillus niger, Aspergillus aculeatus, Acetiiacter hansen, etc.
  • Thermotoga maritima and other Thermotoga genus Cryptococcus neoformans Cryptococcus genus, Dictyostelium discoideum Dicchosterium genus Fungi, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, etc., Pseudomonas genus, Saccharomyces cerevisiae, etc.
  • Examples include those derived from Bacillus bacteria such as Mrs., Bacillus megaterium, and Escherichia bacteria such as Escherichia coli.
  • Zwf glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase
  • An array may be used.
  • Preferred examples include the genus Dinococcus such as Deinococcus radiophilus, the Aspergillus niger, the Aspergillus genus Aspergillus and the like, Acetobacter hanseni hansenii), Thermotoga maritima, Thermotoga, Cryptococus neoformans, Cryptococcus neoformans, Dictyostelium discoideum, etc.
  • Pseudomonas fluorescens Pseudomonas aeruginosa, etc.
  • Pseudomonas genus Saccharomyces cerevisiae Examples thereof include DNA having a base sequence of a gene derived from a genus Saccharomyces such as Bacillus megaterium, a Bacillus genus such as Bacillus megaterium, and an Escherichia bacterium such as Escherichia coli.
  • DNA having a base sequence of a gene derived from a prokaryotic organism such as Dinococcus, Aspergillus, Acetobacter, Thermotoga, Pseudomonas, Bacillus, Escherichia, etc. Illustrated. Particularly preferred is DNA having a base sequence of a gene derived from Escherichia coli.
  • Phosphogluconate dehydrogenase is classified into enzyme number 1.1.1.144 and is an enzyme that catalyzes a reaction of producing D-ribulose-5-phosphate and CO 2 from 6-phospho-D-gluconic acid.
  • the above-mentioned enzyme activity can be imparted or enhanced by gene introduction into the host, enhancement of the promoter activity of the enzyme gene possessed by the host on the genome, substitution of the promoter with a promoter, or a combination thereof.
  • the promoter in isopropyl alcohol-producing Escherichia coli means a site where RNA polymerase having a sigma factor binds and initiates transcription.
  • the promoter is not particularly limited as long as it can control the expression of the gene, but is preferably a strong promoter that constantly functions in microorganisms and is less susceptible to suppression of expression even in the presence of glucose. Specific examples include GAPDH promoter and serine hydroxymethyltransferase promoter.
  • lactate dehydrogenase (LdhA) gene (ldhA) may be disrupted. Thereby, since the production of lactic acid is suppressed even under culture conditions in which oxygen supply is restricted, isopropyl alcohol can be produced efficiently.
  • Culture conditions with limited oxygen supply are generally 0.02 vvm to 2.0 vvm (vvm; aeration capacity [mL] / liquid capacity [when liquid is used as the gas to be aerated by stirring the culture medium] mL] / hour [minute]), and a rotation speed of 200 rpm to 600 rpm.
  • Lactate dehydrogenase (LdhA) refers to an enzyme that produces D-lactic acid and NAD from pyruvate and NADH.
  • the acetyl-CoA producing microorganism according to the present invention may have various pathways for producing glutamic acid using acetyl-CoA as an intermediate, or may have enhanced enzyme activity associated with the pathway.
  • the acetyl-CoA-producing microorganism according to the present invention which has a glutamate production pathway, is obtained by, for example, constructing the acetyl-CoA-producing microorganism of the present invention using a microorganism having a glutamate production pathway as a host, or the present invention. It is obtained by imparting or enhancing the gene of an enzyme relating to the glutamate production pathway in the acetyl-CoA-producing microorganism.
  • a microorganism having a glutamic acid production pathway may be referred to as a “glutamic acid producing microorganism”.
  • glutamic acid-producing microorganisms include microorganisms capable of producing L-amino acids.
  • the glutamic acid-producing microorganism include enterobacteriaceae such as Escherichia bacteria and Pantoea bacteria, and coryneform bacteria such as Corynebacterium glutamicum, to which a glutamic acid production pathway is imparted or enhanced.
  • the method for imparting or enhancing glutamic acid-producing ability to a microorganism includes, for example, modifying so that expression of a gene encoding L-glutamic acid biosynthetic enzyme is increased and / or overexpressed.
  • L-glutamate biosynthetic enzymes include glutamate dehydrogenase, glutamine synthetase, glutamate synthase, isocitrate dehydrogenase, aconite hydratase, citrate synthase, phosphoenolpyruvate carboxylase, pyruvate carboxylase, pyruvate dehydrogenase, pyruvate kinase Phosphoenolpyruvate synthase, enolase, phosphoglyceromutase, phosphoglycerate kinase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, triose phosphate isomerase, fructose-2
  • glutamic acid-producing microorganisms include glutamic acid-producing microorganisms described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-278643.
  • the ability to accumulate L-glutamic acid in an amount exceeding the saturation concentration of L-glutamic acid in a liquid medium when cultured under acidic conditions (hereinafter referred to as “the ability to accumulate L-glutamic acid under acidic conditions”) can be used).
  • the ability to accumulate L-glutamic acid under acidic conditions can be used.
  • the ability to accumulate L-glutamic acid in an amount exceeding the saturation concentration is obtained. It can be given to microorganisms.
  • microorganisms having an ability to accumulate L-glutamic acid under acidic conditions include Pantoea Ananatis AJ13356 (FERM BP-6615) and AJ13601 (FERM BP-7207) (above, European Patent Application Publication No. 0952211) ).
  • Pantoea Ananatis AJ13356 was established in the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (currently, the National Institute for Product Evaluation and Technology (NITE-IPOD)). Deposited under the deposit number FERM P-16645, transferred to the international deposit under the Budapest Treaty on January 11, 1999, and given the deposit number FERM BP-6615.
  • the strain was identified as Enterobacter agglomerans at the time of its isolation, and deposited as Enterobacter agglomerans AJ13355. Recently, the strain was assigned to Pantoea ananatis by 16S rRNA nucleotide sequence analysis. Reclassified (see examples). Strains AJ13356 and AJ13601 derived from AJ13355 are also deposited with the depository organization as Enterobacter agglomerans, but are described herein as Pantoea Ananatis. On August 18, 1999, AJ13601 received the accession number FERM P- to the Biotechnology Institute of Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry (currently the National Institute for Product Evaluation and Technology (NITE-IPOD)). No. 17156, transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on July 6, 2000, and assigned the deposit number FERMBP-7207.
  • a method for imparting resistance to an organic acid analog or a respiratory inhibitor, or a method for imparting sensitivity to a cell wall synthesis inhibitor may be mentioned.
  • a method of imparting monofluoroacetic acid resistance Japanese Patent Laid-Open No. 50-113209
  • a method of imparting adenine resistance or thymine resistance Japanese Patent Laid-Open No. 57-065198
  • a method of weakening urease Japanese Patent Laid-Open No. 52-038088
  • a method for imparting malonic acid resistance Japanese Patent Laid-Open No.
  • Such resistant bacteria include the following strains. Brevibacterium flavum AJ3949 (FERMBP-2632; JP 50-113209 A) Corynebacterium glutamicum AJ11628 (FERM P-5736; Japanese Patent Laid-Open No. 57-065198) Brevibacterium flavum AJ11355 (FERM P-5007; JP 56-1889) Corynebacterium glutamicum AJ11368 (FERM P-5020; JP-A-56-1889) Brevibacterium flavum AJ11217 (FERM P-4318; Japanese Patent Laid-Open No.
  • microorganisms having L-glutamine-producing ability include bacteria having enhanced glutamate dehydrogenase activity, bacteria having enhanced glutamine synthetase (glnA) activity, and bacteria having a disrupted glutaminase gene (European Patent Application Publication Nos. 1229121 and 1424398). Issue description). Enhancement of glutamine synthetase activity can also be achieved by destruction of glutamine adenyl transferase (glnE) or PII regulatory protein (glnB).
  • glnE glutamine adenyl transferase
  • glnB PII regulatory protein
  • strains belonging to the genus Escherichia and having a mutant glutamine synthetase in which the tyrosine residue at position 397 of glutamine synthetase is substituted with another amino acid residue can also be exemplified as suitable L-glutamine producing bacteria (US patent application) (Publication No. 2003-0148474).
  • Brevibacterium flavum AJ11573 (FERM P-5492; JP 56-161495 A) Brevibacterium flavum AJ11576 (FERM BP-10381; Japanese Patent Laid-Open No. 56-161495) Brevibacterium flavum AJ12212 (FERM P-8123; JP-A 61-202694)
  • microorganisms producing proline, leucine, isoleucine, valine, arginine, citrulline, ornithine and / or polyglutamic acid are described in JP 2010-41920 A.
  • Microorganisms producing acetic acid, (poly) 3-hydroxybutyric acid, itaconic acid, citric acid, and / or butyric acid are described in “Fermentation Handbook” (Kyoritsu Shuppan).
  • Examples of microorganisms that produce 4-aminobutyric acid include microorganisms in which glutamate decarboxylase is introduced into glutamic acid-producing microorganisms (Japanese Patent Laid-Open No. 2011-167097).
  • microorganisms that produce 4-hydroxybutyric acid include microorganisms in which glutamate decarboxylase, aminotransferase, and aldehyde dehydrogenase are introduced into a glutamate-producing microorganism (Japanese Patent Laid-Open No. 2009-171960).
  • microorganisms that produce 3-hydroxyisobutyric acid include microorganisms introduced with the route described in International Publication No. 2009/135074 or International Publication No. 2008/145737.
  • microorganisms that produce 2-hydroxyisobutyric acid include microorganisms that have introduced the pathway described in International Publication No. 2009/135074 or International Publication No. 2009/156214.
  • microorganisms that produce 3-aminoisobutyric acid and / or methacrylic acid include microorganisms into which the pathway described in International Publication No. 2009/135074 has been introduced.
  • the method for producing acetyl-CoA according to the first invention and the method for producing a metabolite having acetyl-CoA as an intermediate are a culture process for culturing by bringing the acetyl-CoA-producing microorganism according to the first invention into contact with a carbon source material. And a recovery step of recovering a target product (acetyl CoA or a metabolite having acetyl CoA as an intermediate) obtained by the contact.
  • the metabolite having acetyl CoA as an intermediate include acetone, isopropyl alcohol, and glutamic acid.
  • acetyl CoA and metabolites having acetyl CoA as an intermediate are sometimes collectively referred to as “target product”.
  • the method for producing acetyl-CoA according to the second invention and the method for producing a metabolite having acetyl-CoA as an intermediate are a culture step of culturing by bringing the acetyl-CoA-producing microorganism according to the second invention into contact with the carbon source material. And a recovery step of recovering the target product (acetyl CoA or a metabolite having acetyl CoA as an intermediate) obtained by the contact.
  • the metabolite having acetyl CoA as an intermediate include citric acid, itaconic acid, and (poly) 3-hydroxybutyric acid.
  • acetyl-CoA and metabolites having acetyl-CoA as an intermediate are sometimes collectively referred to as “target product”.
  • each microorganism since each microorganism is brought into contact with the carbon source material and cultured, the carbon source material is assimilated by the acetyl-CoA producing microorganism, and the target product is efficiently obtained while fixing the carbon dioxide. Can be produced.
  • the carbon source material is not particularly limited as long as it contains a carbon source that can be assimilated by microorganisms, but is preferably a plant-derived material.
  • the plant-derived material refers to organs such as roots, stems, trunks, branches, leaves, flowers, seeds, plant bodies containing them, degradation products of these plant organs, and further plant bodies, plant organs, or degradation products thereof.
  • those that can be utilized as a carbon source in culture by microorganisms are also included in the plant-derived material.
  • Carbon sources included in plant-derived materials generally include sugars such as starch, sucrose, glucose, fructose, xylose, arabinose, and herbaceous degradation products, cellulose hydrolysates containing these components, and these Can be mentioned. Furthermore, glycerin or fatty acid derived from vegetable oil is also included in the carbon source in the present invention.
  • crops such as cereals are preferable, and specifically, corn, rice, wheat, soybean, sugar cane, beet, cotton, and combinations thereof can be preferably mentioned, and the usage form as the material is , Unprocessed products, juice, pulverized products, etc. are not particularly limited. Moreover, the form of only the above-mentioned carbon source may be sufficient.
  • Contact between the acetyl-CoA-producing microorganism and the plant-derived material in the culturing step is generally performed by culturing the acetyl-CoA-producing microorganism in a medium containing the plant-derived material.
  • the contact density between the plant-derived material and the acetyl-CoA-producing microorganism varies depending on the activity of the acetyl-CoA-producing microorganism, generally, the initial sugar concentration in terms of glucose is mixed as the concentration of the plant-derived material in the medium (acetyl-CoA-producing microorganism).
  • the initial sugar concentration is preferably 15% by mass or less from the viewpoint of the sugar resistance of the acetyl-CoA-producing microorganism.
  • Each of these other components may be added in an amount usually added to the microorganism medium, and is not particularly limited.
  • the acetyl-CoA production method of the present invention may further include a step of supplying carbonate ions, hydrogen carbonate ions, carbon dioxide gas (carbon dioxide gas) and / or a reducing agent to the medium used for culture (hereinafter referred to as supply step).
  • supply step a step of supplying carbonate ions, hydrogen carbonate ions, carbon dioxide gas (carbon dioxide gas) and / or a reducing agent to the medium used for culture.
  • supply step a step of supplying carbonate ions, hydrogen carbonate ions, carbon dioxide gas (carbon dioxide gas) and / or a reducing agent to the medium used for culture.
  • supply step a step of supplying carbonate ions, hydrogen carbonate ions, carbon dioxide gas (carbon dioxide gas) and / or a reducing agent to the medium used for culture.
  • supply step a step of supplying carbonate ions, hydrogen carbonate ions, carbon dioxide gas (carbon dioxide gas) and / or a reducing agent to the medium used for culture.
  • supply step
  • the carbonate ion or hydrogen carbonate ion may be derived from a component that can generate carbonate ion and / or hydrogen carbonate ion by supplying it to the medium.
  • the component capable of generating carbonate ion and / or hydrogen carbonate ion include sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, potassium carbonate, potassium hydrogen carbonate, ammonium carbonate, ammonium hydrogen carbonate, magnesium carbonate, calcium carbonate and the like.
  • the amount of carbonate ions and / or bicarbonate ions supplied to the medium is not particularly limited as long as the target product can be produced efficiently.
  • the total supply amount per 1 L of the medium is preferably 150 mmol or more. By supplying carbonate ions and / or bicarbonate ions of 150 mmol / L or more, the yield of the target product can be sufficiently improved.
  • the total supply amount of carbonate ions and / or bicarbonate ions per liter of the medium is more preferably 200 mmol or more. Moreover, it is preferable that the total supply amount of carbonate ions and / or bicarbonate ions per liter of the medium is 5 mol or less.
  • the total supply amount per 1 L of the medium is 5 mol or less, there is a low possibility that a large amount of carbonate ions or bicarbonate ions that are not used in the cells in the culturing step are generated.
  • the total supply amount of carbonate ions and / or bicarbonate ions per liter of medium is more preferably 3 mol or less, and even more preferably 2 mol or less.
  • a method for supplying carbonate ions and / or hydrogen carbonate ions to the medium may follow a known method.
  • the supply time may be at the start of culture or during culture, and is not particularly limited. Carbonate ions and / or hydrogencarbonate ions may be supplied all at once or may be supplied separately.
  • the carbon dioxide gas may be any gas containing carbon dioxide, and may be air, for example.
  • the carbon dioxide concentration of the carbon dioxide gas is preferably not less than the carbon dioxide concentration in the air, more preferably not less than 0.1 v / v%, and still more preferably not less than 1 v / v%.
  • the carbon dioxide concentration is preferably 75 v / v% or less, more preferably 50 v / v% or less, and still more preferably 25 v / v% or less.
  • Carbon dioxide gas can be dissolved in the medium by bubbling or the like.
  • the average bubble diameter of the carbon dioxide gas supplied into the medium is not particularly limited as long as the target product can be efficiently produced.
  • carbon dioxide gas having an average bubble diameter of 100 ⁇ m or more is preferable. If carbon dioxide gas has an average cell diameter of 100 ⁇ m or more, the foamability in the medium is extremely increased, and there is a low possibility that it is difficult to continue fermentation culture. More preferred is carbon dioxide gas having an average bubble diameter of 200 ⁇ m or more, and further preferred is carbon dioxide gas having an average bubble diameter of 500 ⁇ m or more.
  • Carbon dioxide gas can be supplied to the culture medium using a commonly used bubble generator.
  • the bubble generator include an air sparger.
  • a measuring method of the average bubble diameter for example, a method of measuring by a laser diffraction scattering method using a particle size distribution measuring device (for example, LS 13-320 manufactured by Beckman Coulter, Inc.) Examples include a method of measuring by a pore electrical resistance method using a Multisizer3), a method of binarizing a shadow image using a high-speed video camera, and the like.
  • the reducing agent is not particularly limited as long as the components in the medium and cells are reduced during culture and the reducing agent itself is oxidized.
  • sulfide, carbon compound, hydrogen and the like can be mentioned.
  • sulfides include sulfites (sodium sulfite, sodium hydrogen sulfite, potassium sulfite, ammonium sulfite, etc.), thiosulfates (sodium thiosulfate, potassium thiosulfate, etc.), and salts of sulfide ions (sodium sulfide, hydrogen sulfide).
  • the carbon compound include alcohols, fatty acids, paraffin, carbon monoxide and the like.
  • reducing agent sulfide is preferable, and among them, sodium sulfite, sodium hydrogen sulfite, sodium sulfide, and cysteine are preferable, and sodium sulfite is most preferable.
  • the concentration of the reducing agent supplied to the medium is not particularly limited as long as the target product can be efficiently produced, and can be appropriately set according to the components to be supplied.
  • the concentration of sodium sulfite is preferably 0.01 g / L or more, more preferably 0.1 g / L or more, and even more preferably 1 g / L or more, per 1 L of the medium.
  • the concentration of the reducing agent to be supplied is preferably 50 g / L or less, more preferably 20 g / L or less, and further preferably 10 g / L or less.
  • the acetyl-CoA production method of the present invention may further include a gas supply step of collecting a gas containing carbon dioxide generated by culturing and supplying the gas to a medium used for culturing. That is, the carbon dioxide gas released as exhaust without being consumed in the medium may be circulated and reused by supplying it again to the medium.
  • the method for supplying gas to the medium is not particularly limited as long as it is a commonly used method.
  • a method in which gas is pressurized and ejected from a ring-shaped or plate-shaped member having pores a method called aerator or aeration when the gas is air
  • a draft tube Air sparger gas disperser
  • a porous material with numerous holes is attached to generate fine bubbles such as air at the tip of plastic or stainless steel pipes.
  • the medium used for culturing acetyl-CoA-producing microorganisms usually contains carbon sources, nitrogen sources, inorganic ions, inorganic trace elements required by microorganisms to produce desired products, nucleic acids, vitamins, etc. There is no particular limitation as long as the medium is used.
  • the culture conditions in the culture step are not particularly limited.
  • the pH is 4 to 9 (preferably pH 6 to 8) and the temperature is 20 ° C. to 50 ° C. (preferably 25 ° C.) under aerobic conditions. Culturing while controlling the pH and temperature within the range of -40 ° C to 42 ° C.
  • the culture conditions in the culture process there are no particular restrictions on the culture conditions in the culture process.
  • the pH and temperature are controlled within a range of pH 1 to 10 (preferably pH 3 to 7) and temperature 20 ° C. to 50 ° C. (preferably 25 ° C. to 42 ° C.) under aerobic conditions. Incubate while cultivating.
  • the pH and temperature are controlled within a range of pH 4-9 (preferably pH 6-8) and temperature 20 ° C.-50 ° C. (preferably 25 ° C.-42 ° C.) under aerobic conditions. Incubate while cultivating.
  • the amount of gas aeration into the mixture containing the acetyl-CoA producing microorganism and the carbon source material is not particularly limited, but generally 0.02 vvm to 2.0 vvm (vvm; aeration) when only air is used as the gas.
  • Volume [mL] / liquid volume [mL] / hour [min]) 50 to 600 rpm, preferably from 0.1 vvm to 2.0 vvm from the viewpoint of suppressing physical damage to microorganisms, more preferably 0.1 vvm to 1.0 vvm.
  • the culture process can be continued from the start of culture until the carbon source material in the mixture is consumed or until the activity of the acetyl-CoA-producing microorganism is lost.
  • the duration of the culturing step varies depending on the number and activity of acetyl-CoA-producing microorganisms in the mixture and the amount of the carbon source material, but is generally 1 hour or longer, preferably 4 hours or longer.
  • the culture process can be continued continuously without limitation by re-introducing the carbon source material or the acetyl-CoA-producing microorganism. From the viewpoint of treatment efficiency, it is generally 5 days or less, preferably 72 hours or less. be able to. For other conditions, the conditions used for normal culture may be applied as they are.
  • the method for recovering the target product accumulated in the culture solution is a mixed solution in which the target product and other components are mixed, for example, after removing the cells from the culture solution by centrifugation, the condition depends on the type of the target product.
  • a method of separating the target product by a conventional separation method such as distillation or membrane separation can be employed.
  • the acetyl-CoA production method of the present invention may include a pre-culture step for bringing the acetyl-CoA-producing microorganism to be used into an appropriate number of bacteria and / or an appropriate active state before the culture step.
  • the pre-culture process may be a culture under normal culture conditions according to the type of acetyl-CoA-producing microorganism.
  • the isopropyl alcohol production method and the acetone production method of the present invention include producing isopropyl alcohol or acetone, which are target products, from a carbon source material using an acetyl CoA-producing microorganism. That is, the isopropyl alcohol production method and the acetone production method of the present invention include a culture step of culturing an acetyl CoA-producing microorganism and a carbon source material in contact with each other, and a target product (isopropyl alcohol or acetone) obtained by the contact. A recovery step of recovering.
  • acetyl CoA-producing microorganism used in the isopropyl alcohol production method those having the thiolase activity, CoA transferase activity, acetoacetate decarboxylase activity and isopropyl alcohol dehydrogenase activity described above as a preferred embodiment of the acetyl CoA-producing microorganism are isopropyl alcohol. From the viewpoint of production efficiency.
  • acetyl-CoA-producing microorganism used in the acetone production method those having the thiolase activity, the CoA-transferase activity and the acetoacetate decarboxylase activity described above as a preferred embodiment of the acetyl-CoA-producing microorganism are preferable from the viewpoint of the production efficiency of acetone. .
  • the isopropyl alcohol production method and the acetone production method are preferably a culture step (referred to as “aeration culture step”) of culturing an acetyl CoA-producing microorganism while supplying a gas to the mixture containing the acetyl-CoA producing microorganism and the carbon source material. And a target product recovery step of separating and recovering the target product (isopropyl alcohol or acetone) produced by the culturing step from the mixture.
  • the target product is released into the mixture and is evaporated from the mixture. As a result, the target product can be easily separated from the mixture.
  • the target product is continuously separated from the mixture, an increase in the concentration of the target product in the mixture can be suppressed. Therefore, it is not particularly necessary to consider the resistance of the acetyl CoA-producing microorganism to the target product.
  • the above-mentioned matters are applied as they are.
  • any method can be used as long as it can collect the target product in the form of gas or droplets evaporated from the mixture by culturing.
  • a collection member such as a generally used sealed container, and from the viewpoint of recovering only the target product with high purity, the capture liquid for capturing the target product and the purpose separated from the mixture Preferred is a method comprising contacting the product.
  • the target product can be recovered as a form dissolved in a capture liquid or a mixture.
  • a recovery method include a method described in International Publication No. 2009/008377.
  • the present invention may further include a dehydration step.
  • the target product can be dehydrated by a conventional method.
  • the recovered target product can be confirmed using a normal detection means such as HPLC.
  • the recovered target product may be further purified as necessary. Examples of the purification method include distillation.
  • FIG. 1 of International Publication No. 2009/008377 As an apparatus applied to a production method of a target product that can be recovered as a form dissolved in a capture liquid or a mixture, for example, a production apparatus shown in FIG. 1 of International Publication No. 2009/008377 can be cited.
  • an infusion tube for injecting gas from the outside of the apparatus is connected to a culture tank containing a culture medium containing microorganisms and plant-derived materials to be used, and aeration can be performed on the culture medium.
  • a trap tank containing a capture liquid (trap liquid) is connected to the culture tank via a connection tube.
  • the target product produced by aeration culture in the culture tank is evaporated by aeration and easily separated from the culture medium.
  • the gas or liquid moved to the trap tank comes into contact with the trap liquid, resulting in bubbling and trapped in the trap liquid.
  • the target product can be produced continuously and simply in a more purified form.
  • the glutamic acid production method of the present invention includes producing glutamic acid, which is a target product, from a carbon source material using an acetyl-CoA-producing microorganism. That is, the glutamic acid production method of the present invention includes a culture step in which an acetyl-CoA producing microorganism and a carbon source material are brought into contact with each other, and a recovery step in which the target product (glutamic acid) obtained by the contact is collected. .
  • the glutamic acid production method of the present invention since the acetyl-CoA producing microorganism and the carbon source material are brought into contact and cultured, the carbon source material is assimilated by the acetyl-CoA producing microorganism and the glutamic acid is efficiently fixed while fixing the carbon dioxide. Can be produced.
  • the medium used for the culture can be a normal medium containing a carbon source; a nitrogen source; inorganic salts; organic micronutrients such as amino acids and vitamins; Either a synthetic medium or a natural medium can be used. Any type of carbon source and nitrogen source may be used as long as the strain to be cultured is available.
  • nitrogen source ammonia, ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium chloride, ammonium phosphate, and ammonium acetate; nitrates; and the like can be used.
  • inorganic salts phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts and the like can be used.
  • organic micronutrients examples include amino acids, vitamins, fatty acids, nucleic acids, peptone containing these, casamino acids, yeast extracts, soybean protein degradation products, and the like.
  • auxotrophic mutant that requires an amino acid or the like for growth, it is preferable to supplement the required nutrients.
  • the culture is preferably carried out by aeration culture while controlling the temperature at 20 to 45 ° C. and the pH at 3 to 9.
  • an inorganic or organic acid, alkaline substance, ammonia gas, or the like can be used.
  • L-amino acids are accumulated in the culture solution or in the cells.
  • a microorganism can be cultured using a liquid medium adjusted to conditions where L-glutamic acid is precipitated while precipitating L-glutamic acid in the medium.
  • the conditions under which L-glutamic acid is precipitated include, for example, pH 4.0 to 5.0, preferably pH 4.0 to 4.5, more preferably pH 4.0 to 4.3, and particularly preferably pH 4.0. Conditions can be mentioned.
  • the pH is preferably 4.0 to 5.0, more preferably 4.0 to 4.5. More preferably, it is 4.0 to 4.3.
  • the culture at the above pH may be the whole culture period or a part thereof.
  • the method for collecting L-amino acid from the culture solution after completion of the culture may be performed according to a known recovery method. For example, there are a method of concentration crystallization after removing bacterial cells from the culture solution, and a method by ion exchange chromatography.
  • L-glutamic acid precipitated in the culture solution can be collected by centrifugation or filtration. In this case, L-glutamic acid dissolved in the culture solution may be crystallized and then collected together.
  • the citric acid production method, itaconic acid production method, and (poly) 3-hydroxybutyric acid production method of the present invention use acetyl-CoA-producing microorganisms from the carbon source material to each target product (citric acid, itaconic acid, or Producing (poly) 3-hydroxybutyric acid). That is, the citric acid production method, the itaconic acid production method, and the (poly) 3-hydroxybutyric acid production method of the present invention can be obtained by culturing the acetyl CoA-producing microorganism and the carbon source material in contact with each other and the contact. And a recovery step of recovering the desired product (citric acid, itaconic acid, or (poly) 3-hydroxybutyric acid).
  • the medium used for the culture can be a normal medium containing a carbon source; a nitrogen source; inorganic salts; organic micronutrients such as amino acids and vitamins; Either a synthetic medium or a natural medium can be used. Any type of carbon source and nitrogen source may be used as long as the strain to be cultured is available.
  • nitrogen source ammonia, ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium chloride, ammonium phosphate, and ammonium acetate; nitrates; and the like can be used.
  • inorganic salts phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts and the like can be used.
  • organic micronutrients examples include amino acids, vitamins, fatty acids, nucleic acids, peptone containing these, casamino acids, yeast extracts, soybean protein degradation products, and the like.
  • auxotrophic mutant that requires an amino acid or the like for growth, it is preferable to supplement the required nutrients.
  • the target product (citric acid, itaconic acid, or (poly) 3-hydroxybutyric acid) is dissolved in the culture solution. It can be recovered as a form deposited as a solid from the culture solution, or as a form accumulated in the microbial cells.
  • the present invention may further include a dehydration step.
  • the target product can be dehydrated by a conventional method.
  • the recovered target product can be confirmed using a normal detection means such as HPLC.
  • the recovered target product may be further purified as necessary. Examples of the purification method include crystallization, column purification using an ion exchange resin, and the like.
  • proline As a method of producing proline, leucine, isoleucine, valine, arginine, citrulline, ornithine, acetic acid, (poly) 3-hydroxybutyric acid, itaconic acid, citric acid, butyric acid, polyglutamic acid by applying the microorganism of the present invention,
  • “Fermentation Handbook” Korean University Press
  • p363-p364 p61-p63, p61-p63, p61-p63, p61-p63, p40-p42, p40-p42, p40-p42, p189-p192, p377-p378, p64-p65
  • Examples include the methods described in p124 to p125, p19 to p23, and p373, respectively.
  • Examples of a method for producing 4-aminobutyric acid by applying the microorganism of the present invention include a production method using a microorganism (Japanese Patent Laid-Open No. 2011-167097) in which glutamic acid decarboxylase is introduced into a glutamic acid-producing microorganism.
  • a method for producing 4-hydroxybutyric acid by applying the microorganism of the present invention for example, a microorganism in which glutamic acid decarboxylase, aminotransferase, and aldehyde dehydrogenase are introduced into a glutamic acid-producing microorganism (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2009-2009). -171960 publication).
  • Examples of a method for producing 2-hydroxyisobutyric acid by applying the microorganism of the present invention include a production method using a microorganism into which a route described in International Publication No. 2009/135074 or International Publication No. 2009/156214 is introduced. It is done.
  • Examples of a method for producing 3-aminoisobutyric acid and / or methacrylic acid by applying the microorganism of the present invention include a production method using a microorganism into which a route described in International Publication No. 2009/135074 is introduced.
  • GAPDH glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • Escherichia coli MG1655 is available from ATCC (American Type Culture Collection). Escherichia coli B (ATCC 11303) is available from ATCC. The genomic DNA of Methylococcus capsuleatus ATCC 33009 (ATCC 33009D-5) can be obtained from ATCC.
  • Corynebacterium DSM 1412 is available from DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures).
  • Rhodococcus josti NBRC16295 is available from NBRC (Biotechnology Division, Biotechnology Headquarters, National Institute of Product Evaluation Technology). Aspergillus niger ATCC 1015 is available from ATCC. Aspergillus terreus NBRC 6365 is available from NBRC.
  • Capriavidas Necatol JMP134 (DSM4058) is available from DSMZ.
  • Example 1 ⁇ Preparation of plasmid pMWKGC>
  • PCR was performed by using the genomic DNA of Escherichia coli MG1655 as a template, and the PCR fragment was amplified using CGAGCTACATATGCAATGTATTACACGATCTCCG (SEQ ID NO: 42) and CGCGCGCATGCCTATTGTTAGTAGGAATAAAAGG (SEQ ID NO: 43).
  • a DNA fragment corresponding to the GAPDH promoter of about 110 bp was obtained by digestion with NdeI and SphI.
  • This DNA fragment was mixed with a fragment obtained by digesting plasmid pBR322 (GenBank accession number J01749) with restriction enzymes NdeI and SphI, ligated with ligase, and then Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell (Toyo) Spinning Co., Ltd. DNA-903) was transformed to obtain transformants that grew on LB agar plates containing 50 ⁇ g / mL ampicillin. The obtained colonies were cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin, and the plasmid was recovered from the obtained cells to obtain plasmid pBRgapP.
  • the plasmid pBRgapP is used as a template, and CCGCTCGAGCATATGCTGTCGCAATGATTGACACG (SEQ ID NO: 44) and GCCTTCCATATGCAGGGTTATTGTTCCATGAGAC (SEQ ID NO: 45) are used as primers to oxidize the DNA fragment.
  • a DNA fragment containing the promoter was obtained.
  • Plasmid pMW119 (GenBank accession number AB005476) is treated with restriction enzymes AatII and NdeI, and the resulting DNA fragment is blunted with KOD plus DNA polymerase (Takara) to obtain a DNA fragment containing the replication origin of pMW119. It was.
  • a DNA fragment containing the GAPDH promoter and a DNA fragment containing the replication origin of pMW119 were mixed and ligated using ligase, then transformed into an Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell and applied to an LB agar plate containing 50 ⁇ g / mL ampicillin. A growing transformant was obtained. The obtained colony was cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin, and the plasmid was recovered from the obtained bacterial cells to obtain a plasmid pMWG.
  • the DNA obtained was amplified by PCR using pTH18cs1 (GenBank accession number AB019610) as a template, TCGGCACGTAAGAGGTTCC (SEQ ID NO: 46) and CGGGTCGAATTTGCTTTCG (SEQ ID NO: 47) as primers.
  • the fragment was phosphorylated with T4 Polynucleotide Kinase (Takara) to obtain a DNA fragment containing a chloramphenicol resistance gene.
  • CTAGATCTGACATAGATAGACGGGTAAGCC SEQ ID NO: 48
  • CTAGATCTCAGGGTTTATTGTTCCATGAGC SEQ ID NO: 49
  • CCTTTGGTTAAAGGCTTTAAGATCTTCCCAGTGGACAAACTATGCCC SEQ ID NO: 50
  • GGCATAGTTTGTCCCACTGAGAAGATTCTAAGCCCTTTAACCAAAGG SEQ ID NO: 51
  • pMWWGKC_mcl (Mc) _mtk (Mc) is a base sequence of the malyl CoA lyase gene (mcl) derived from Methylococcus capsuleatus (SEQ ID NO: 41), a base sequence of the subunit ⁇ gene (mtkA) of malate thiokinase (SEQ ID NO: 28) And the base sequence (SEQ ID NO: 29) of the subunit ⁇ gene (mtkB) of malate thiokinase.
  • the amino acid sequence of malyl CoA lyase (Mcl) derived from Methylococcus capsuleatus, the amino acid sequence of malate thiokinase subunit ⁇ (MtkA), and the amino acid sequence of malate thiokinase subunit ⁇ (MtkB) are SEQ ID NO: 36, As shown in SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14.
  • Example 3 ⁇ Preparation of plasmid pCASET> Using pHSG298 (Takara) as a template, CGCCTCGAGTGACTCATACCACGGCTG (SEQ ID NO: 54) and CGCCTCGAGGCAACACCACTTCTTCACGAG (SEQ ID NO: 55) as primers, the DNA fragment obtained was digested with the restriction enzyme XhoI and ligated. After that, it was transformed into Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell (Toyobo Co., Ltd. DNA-903) to obtain a transformant that grew on an LB agar plate containing 25 ⁇ g / mL kanamycin. The plasmid was recovered from the obtained cells, and the plasmid in which the XhoI recognition sequence was inserted into pHSG298 was named pHSG298-XhoI.
  • amplification was performed by PCR using pKK223-3 (Pharmacia) as a template, ATCATCCAGCTGTGCAGGCAGCCCATCGGAAG (SEQ ID NO: 56) and ATCCCCGGGAATTCTGTT (SEQ ID NO: 57) as primers, and the resulting DNA fragment was restricted to the restriction enzyme PvuII And digested with SmaI to obtain a DNA fragment encoding about 0.2 kbp tac promoter.
  • a DNA fragment encoding the tac promoter and an about 2.4 kbp DNA fragment obtained by digesting the plasmid pHSG298-XhoI with the restriction enzyme PvuII and treating with alkaline phosphatase were mixed and ligated using ligase, followed by Escherichia coli DH5 ⁇ strain
  • the cells were transformed into competent cells (Toyobo Co., Ltd., DNA-903) to obtain transformants that grew on LB agar plates containing 25 ⁇ g / mL kanamycin.
  • the plasmid was recovered from the obtained bacterial cells, and the pHSG298-XhoI lac promoter was replaced with the tac promoter to obtain a plasmid pHSGT1 in which the direction of the tac promoter was the same as the original lac promoter.
  • pHSG298 was digested with restriction enzymes EcoRI and ClaI to obtain a DNA fragment of about 1.0 kbp containing the multi-cloning site of pHSG298. .
  • the obtained DNA fragment was mixed with an approximately 1.7 kbp DNA fragment obtained by digesting plasmid pHSGT1 with restriction enzymes EcoRI and ClaI and further treated with alkaline phosphatase, and ligated with ligase, and then competed with Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent.
  • a cell (Toyobo Co., Ltd., DNA-903) was transformed to obtain a transformant that grew on an LB agar plate containing 25 ⁇ g / mL kanamycin.
  • the plasmid was recovered from the obtained bacterial cells to obtain a plasmid pHSGT2 in which a multi-cloning site of pHSG298 was linked downstream of the tac promoter.
  • the DNA fragment obtained by digesting the prepared DNA fragment with the restriction enzyme XhoI was mixed with the DNA fragment obtained by digesting the plasmid pHSGT2 with the restriction enzyme XhoI and further treated with alkaline phosphatase, and ligated with ligase.
  • a plasmid was recovered from the obtained bacterial cells, and a plasmid in which a DNA fragment containing the replication origin of pCASE1 and repA and repB was inserted into the XhoI recognition site of pHSGT2 was named pCSET.
  • pCSET a plasmid in which a DNA fragment containing the replication origin of pCASE1 and repA and repB was inserted into the XhoI recognition site of pHSGT2 was named pCSET.
  • the direction of pCASE1-derived repA was opposite to that of the tac promoter.
  • the plasmid was recovered from the obtained bacterial cells, and the plasmid in which the mcl-mtk fragment was inserted in a direction suitable for expression by the promoter of the plasmid was named pCSET_mcl (Mc) _mtk (Mc).
  • PCSET_mcl (Mc) _mtk (Mc) includes the base sequence of mcl derived from Methylococcus capsuleatus (SEQ ID NO: 41), the base sequence of mtkA (SEQ ID NO: 28), and the base sequence of mtkB (SEQ ID NO: 29).
  • Example 5 ⁇ Construction of mtk, mcl, gcl and glxR expression plasmids for Corynebacterium> Rhodococcus josti NBRC16295 was cultured in NBRC medium number 802, and genomic DNA was obtained using DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Inc.).
  • PCR was carried out using CGAGCTCAAGCTTACAAAAAGAGATAAAAACAATGAGCACCATTGCATTCCATCG (SEQ ID NO: 61) CGGGATCCCTAGTCCCAGCAGGCATGAGAG (SEQ ID NO: 62) to obtain a Rhodococcus glxR-gcl 63 fragment.
  • the plasmid was recovered from the obtained bacterial cells, and the plasmid in which the glxR-gcl fragment was inserted into pCSET_mcl (Mc) _mtk (Mc) was named pCSET_mcl (Mc) _mtk (Mc) _glxR (Rj) _gcl (Rj).
  • the plasmid pCSET_mcl (Mc) _mtk (Mc) _glxR (Rj) _gcl (Rj) comprises the base sequence of mcl derived from Methylococcus capsuleatus (SEQ ID NO: 41), the base sequence of mtkA (SEQ ID NO: 28), and the base sequence of mtkB ( In addition to SEQ ID NO: 29), the base sequence of 2-hydroxy-3-oxopropionate reductase (glxR) derived from Rhodococcus josti (SEQ ID NO: 64) and the base sequence of glyoxylate carboligase (gcl) (SEQ ID NO: 65) including.
  • the amino acid sequence of 2-hydroxy-3-oxopropionate reductase (GlxR) derived from Rhodococcus josti and the amino acid sequence of glyoxylate carboligase (Gcl) are as shown in SEQ ID NO: 66 and SEQ ID NO: 67, respectively.
  • Example 6 ⁇ Preparation of plasmid pMWCBL> Using the pMWGKC prepared in Example 1 as a template, ATCGATCTCGAGTTTACCCCGTCTTACTGTCAGATCTAG (SEQ ID NO: 68) and ATCGATCTCGAGGCCCTGTGATGATACCCGCTGCCTTA (SEQ ID NO: 69) as primers were used to digest the obtained DNA fragment I with the restriction enzyme X After binding, Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cells (Toyobo Co., Ltd. DNA-903) were transformed to obtain transformants that grew on LB agar plates containing 10 ⁇ g / mL chloramphenicol. The plasmid was recovered from the obtained bacterial cells, and the plasmid having the XhoI recognition sequence inserted into pMWGKC was named pMWKGC-XhoI.
  • Plasmid pBL1 (Journal of General Microbiology, 1984; 130: 2237-2246) was prepared from Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, and the obtained plasmid was used as a template for CCCCTCGAGGTCAACAAACAACCCATCA (SEQ ID NO: 70) and CCGCTCGAGCCATGCCATGCATGC (prime sequence number 71) By performing PCR in pairs, a DNA fragment (SEQ ID NO: 72) of about 1.8 kb containing the origin of replication and repA was amplified. The sequence is shown below.
  • the DNA fragment obtained by digesting the amplified DNA fragment with the restriction enzyme XhoI and the DNA fragment obtained by digesting the plasmid pMWKC-XhoI with the restriction enzyme XhoI and further treated with alkaline phosphatase were mixed and ligated using ligase.
  • Escherichia coli JM109 strain competent cell (Toyobo Co., Ltd., DNA-900) was transformed to obtain a transformant that grew on an LB agar plate containing 10 ⁇ g / mL chloramphenicol.
  • a plasmid was recovered from the obtained bacterial cells, and a plasmid in which a DNA fragment containing the replication origin of pBL1 and repA was inserted into the XhoI recognition site of pMWGKC-XhoI was named pMWCBL.
  • Example 7 ⁇ Construction of Corynebacterium glutamicum ATCC13032-derived pyc expression plasmid pMWCBL_pyc>
  • AAGCGAGCTCACAAAAAGGATAAAACAATGTCGAACTCACACATCTTACGA74 SEQ ID NO: 73
  • AATACATGCCATGACGTAGTAG primer Seed synthesized The primer of SEQ ID NO: 73 has a SacI recognition site on the 5 ′ end side, and the primer of SEQ ID NO: 74 has a SphI recognition site on the 5 ′ end side.
  • Genomic DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 was prepared, and the obtained genomic DNA was used as a template, and PCR was performed with a primer pair of SEQ ID NO: 73 and SEQ ID NO: 74 to amplify a DNA fragment of about 3.5 kb. This DNA fragment was digested with SacI and SphI, and separated and collected by agarose gel electrophoresis.
  • the recovered DNA fragment was mixed with pMWCBL digested with SacI and SphI and further treated with alkaline phosphatase, ligated with ligase, and transformed into Escherichia coli JM109 strain competent cell (manufactured by Toyobo Co., Ltd.)
  • a transformant was obtained that grew at 30 ° C. on an LB agar plate containing 10 ⁇ g / mL chloramphenicol.
  • a plasmid pMWCBL_pyc in which the pyruvate carboxylase gene was inserted into pMWCBL was recovered from the obtained transformant.
  • PMWCBL_pyc contains the base sequence (SEQ ID NO: 75) of the pyruvate carboxylase gene (pyc) derived from Corynebacterium glutamicum.
  • the amino acid sequence of pyruvate carboxylase (Pyc) derived from Corynebacterium glutamicum is as shown in SEQ ID NO: 76.
  • Example 8 ⁇ Construction of Corynebacterium glutamicum strain for evaluation> Using the Corynebacterium glutamicum DSM1412 (sometimes referred to as “CG strain”) as a host, the plasmid constructed in Examples 3, 5, and 7 was used for transformation by electroporation. Each strain was applied to an LB agar medium containing 15 ⁇ g / mL kanamycin and / or 10 ⁇ g / mL chloramphenicol, and the growing strain was used as an evaluation strain. These strains are summarized in Table 2.
  • the culture solution is periodically sampled, the cells are removed by centrifugation (MILLIPORE 12,000 rpm, 3 minutes), and the supernatant is filtered through a hydrophilic PTFE membrane filter (MILLIPORE, MSGVN2B50). It was.
  • HPLC Waters 2695
  • NN-814 column Showa Denko
  • UV / Vis detector Waters 2489
  • ULTRON PS-80H column Shinwa Kako
  • RI detector Waters 2414
  • Example 9 ⁇ Assessment of mtk, mcl, gcl and glxR gene addition and pyc gene-enhanced Corynebacterium strain> CG / mtk_mcl / gcl_glxR / vec2 and CG / mtk_mcl / gcl_glxR / pyc constructed in Example 8 were used as evaluation strains, except that 15 ⁇ g / mL kanamycin and 10 ⁇ g / mL chloramphenicol were used as antibiotics added to the medium. Is cultured and analyzed in the same manner as in Reference Example 1.
  • the pyc-enhanced strain (CG / mtk_mcl / gcl_glxR / pyc) shows higher sugar yield than the control strain (CG / mtk_mcl / gcl_glxR / vec2). That is, in the Corynebacterium strain provided with the CO 2 fixation pathway, enhancement of the pyc gene is considered to be effective in improving the sugar yield.
  • Example 10 ⁇ Evaluation of glutamic acid production under the condition of adding sodium sulfite> CG / mtk_mcl / gcl_glxR constructed in Example 8 was inoculated into an LB medium containing 25 ⁇ g / mL kanamycin as an evaluation strain and cultured at 30 ° C. for 2 days. Thereafter, 100 ⁇ L of the culture solution was applied to an LB plate having a diameter of 9 cm containing 25 ⁇ g / mL kanamycin, and cultured at 30 ° C. for 2 days.
  • the bacteria of 1/8 area of the plate are scraped off, and 5 mL of a minimal medium for coryneform strain containing 20 ⁇ g / L Biotine ⁇ 60 g / L glucose, 30 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 1 g / L KH 2 PO4, 0.4 g / L MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.01 g / L FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.01 g / L MnSO 4 ⁇ 5H 2 O, 200 ⁇ g / L Thiamine ⁇ HCl, 5.1 g / L Soytone ( Bacto), 25 ⁇ g / mL kanamycin, pH 8.0 ⁇ , and cultured with 0.25 g calcium carbonate in 125 mL Erlenmeyer flask with baffle at 31.5 ° C.
  • a minimal medium for coryneform strain containing 20 ⁇ g / L Biotine ⁇ 60 g / L glucose, 30 g
  • the yield to sugar was 44% in the sodium sulfite-free test group, whereas the yield to sugar was 50% in the sodium sulfite supply test group.
  • the yield was improved.
  • the OD 620 nm of the culture solution was measured, unexpectedly, since the OD that was 50 in the sodium sulfite-free test group was 29 in the sodium sulfite supply test group, the increase in the amount of cells was suppressed. It was also confirmed that there was an effect. If the increase in the amount of cells can be suppressed, the cost of waste cell processing can be suppressed.
  • Example 11 ⁇ Preparation of Escherichia coli B strain atoD genome-enhanced strain>
  • the entire base sequence of the genomic DNA of Escherichia coli MG1655 is known (GenBank accession number U00096), and the base sequence of the gene encoding the CoA transferase ⁇ subunit of Escherichia coli MG1655 (hereinafter sometimes referred to as “atoD”) is also included. It has been reported. That is, atoD is described in 232469-3232131 of the Escherichia coli MG1655 genomic sequence described in GenBank accession number U00096.
  • the restriction enzyme was amplified by PCR using the genomic DNA of Escherichia coli MG1655 as a template, using CGCTCAATTGCAAATTGACACGATTCCG (SEQ ID NO: 77) and ACAGAATTCGCTATTTTGTTAGGTGAATAAAAGGG (SEQ ID NO: 78) as a primer.
  • a DNA fragment encoding the GAPDH promoter of about 100 bp was obtained by digestion with MfeI and EcoRI.
  • the resulting DNA fragment was mixed with plasmid pUC19 (GenBank accession number X02514) digested with restriction enzyme EcoRI and further treated with alkaline phosphatase, and ligated with ligase, and then Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell ( Toyobo Co., Ltd. DNA-903) was transformed to obtain transformants that grew on LB agar plates containing 50 ⁇ g / mL ampicillin.
  • Escherichia coli MG1655 genomic DNA was used as a template, CGAATTCGCTGGTGGAACATATGAAAACAAAAATTGATGATACATTACAAGAC (SEQ ID NO: 79) and GCGGTACCTTTTTGCTCTCTCCTGTGAAACG (SEQ ID NO: 80) were used as primers and amplified using the PCR method. Digestion with EcoRI and KpnI yielded an approximately 690 bp atoD fragment.
  • This DNA fragment was mixed with pUCgapP digested with the restriction enzymes EcoRI and KpnI, ligated with ligase, transformed into Escherichia coli DH5 ⁇ competent cell (Toyobo Co., Ltd., DNA-903), and 50 ⁇ g / A transformant that grew on an LB agar plate containing mL ampicillin was obtained. A plasmid was recovered from the obtained bacterial cells, and it was confirmed that atoD was correctly inserted. This plasmid was named pGAPatoD.
  • Escherichia coli MG1655 using Escherichia coli MG1655 as a template of Escherichia coli MG1655, using primers of GCTCTAGATGCGGAAATCCCACTAGTCTGTGTC (SEQ ID NO: 81) and TACTGCAGCGTTCCAGCCACTTACAACC (SEQ ID NO: 82), which were prepared based on the genetic information of the 5 'vicinity region of atoD of Escherichia coli MG1655 An about 1.1 kbp DNA fragment was amplified by PCR.
  • GTCTAGAGCAATGATTGACACGATTCCCG (SEQ ID NO: 83) prepared based on the sequence information of the GAPDH promoter of Escherichia coli MG1655, and GCGGTACCTTTTGTCTCTCTGGAACG primer prepared using the sequence information of atoD of Escherichia coli MG1655 (SEQ ID NO: 83) Then, PCR was performed using the plasmid pGAPatoD as a template to obtain a DNA fragment of about 790 bp consisting of the GAPDH promoter and atoD.
  • the about 1.1 kbp DNA fragment was digested with restriction enzymes PstI and XbaI, the about 790 bp DNA fragment was digested with restriction enzymes XbaI and KpnI, and both fragments were digested with temperature sensitive plasmid pTH18cs1 (GenBank accession number AB019610) (Gene , 2000; 241: 185-191) were mixed with a fragment obtained by digesting with PstI and KpnI, ligated with ligase, transformed into DH5 ⁇ strain, and LB agar containing 10 ⁇ g / mL chloramphenicol. A transformant that grew on the plate at 30 ° C. was obtained.
  • the obtained colony was cultured overnight at 30 ° C. in an LB liquid medium containing 10 ⁇ g / mL chloramphenicol, and the plasmid was recovered from the obtained cells.
  • This plasmid was transformed into Escherichia coli B (ATCC 11303) and cultured on an LB agar plate containing 10 ⁇ g / mL chloramphenicol at 30 ° C. overnight to obtain a transformant.
  • the obtained transformant was inoculated into an LB liquid medium containing 10 ⁇ g / mL chloramphenicol and cultured at 30 ° C. overnight.
  • the obtained cultured cells were applied to an LB agar plate containing 10 ⁇ g / mL chloramphenicol and cultured at 42 ° C. to obtain colonies.
  • the obtained colonies were cultured in an LB liquid medium containing no antibiotics at 30 ° C. for 2 hours, and applied to an LB agar plate containing no antibiotics to obtain colonies that grew at 42 ° C.
  • Example 12 ⁇ Escherichia coli B strain atoD genome enhancement / pgi gene deletion strain> The entire base sequence of the genomic DNA of Escherichia coli MG1655 is known (GenBank accession number U00096), and the base sequence of the gene (pgi) encoding Escherichia coli phosphoglucose isomerase has also been reported (GenBank accession number X15196). .
  • the primer of SEQ ID NO: 85 has an EcoRI recognition site on the 5 ′ end side
  • the primers of SEQ ID NO: 86 and SEQ ID NO: 87 have an XbaI recognition site on the 5 ′ end side
  • the primer of SEQ ID NO: 88 has a PstI recognition site on the 5 ′ end side.
  • a genomic DNA of Escherichia coli MG1655 was prepared, and the obtained genomic DNA was used as a template, and PCR was performed with the primer pair of SEQ ID NO: 85 and SEQ ID NO: 86 to amplify a DNA fragment of about 1.0 kb. (Hereinafter sometimes referred to as “pgi-L fragment”). Further, by performing PCR with the primer pair of SEQ ID NO: 87 and SEQ ID NO: 88, a DNA fragment of about 1.0 kb was amplified (hereinafter sometimes referred to as “pgi-R fragment”).
  • DNA fragments were separated and collected by agarose gel electrophoresis, the pgi-L fragment was digested with EcoRI and XbaI, and the pgi-R fragment was digested with XbaI and PstI, respectively.
  • the two digested fragments were mixed with EcoRI and PstI digests of temperature sensitive plasmid pTH18cs1 (GenBank accession number AB019610), reacted with T4 DNA ligase, and then Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell (manufactured by Toyobo Co., Ltd.).
  • a transformant that grew on an LB agar plate containing 10 ⁇ g / mL chloramphenicol at 30 ° C. was obtained.
  • a plasmid was recovered from the obtained transformant, and it was confirmed that two fragments, a 5 'upstream vicinity fragment and a 3' downstream vicinity fragment of the gene encoding pgi were correctly inserted into pTH18cs1.
  • the obtained plasmid was digested with XbaI, and then blunt-ended with T4 DNA polymerase.
  • the plasmid was recovered from the obtained transformant, and it was confirmed that the kanamycin resistance gene was correctly inserted between the 5 ′ upstream neighboring fragment and the 3 ′ downstream neighboring fragment of the gene encoding pgi, and pTH18cs1-pgi and did.
  • the prepared pTH18cs1-pgi was transformed into the B :: atoDAB strain prepared in Example 11, and cultured overnight at 30 ° C. on an LB agar plate containing 10 ⁇ g / mL chloramphenicol and 50 ⁇ g / mL kanamycin. Got the body.
  • the obtained transformant was inoculated into an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin and cultured at 30 ° C. overnight. Next, a part of this culture solution was applied to an LB agar plate containing 50 ⁇ g / mL kanamycin to obtain colonies that grew at 42 ° C.
  • the obtained colonies were cultured in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin for 24 hours at 30 ° C., and further applied to an LB agar plate containing 50 ⁇ g / mL kanamycin to obtain colonies that grew at 42 ° C.
  • Example 13 ⁇ Escherichia coli B strain atoD genome enhancement / pgi gene deletion / gntR gene deletion strain>
  • the entire base sequence of the genomic DNA of Escherichia coli B strain is known (GenBank accession number CP000819), and the base sequence of the gene encoding the transcriptional repressor GntR is the genome sequence of the Escherichia coli B strain described in GenBank accession number CP000819. 3509184-351010.
  • the GGAATTCGGGTCAATTTTCACCCTCTATC (SEQ ID NO: 89), GTGGGCCGTCCTGGAGGTACAACCAAGGATAGATCTCGA (AG No. did.
  • the primers of SEQ ID NO: 89 and SEQ ID NO: 92 each have an EcoRI recognition site on the 5 'end side.
  • a genomic DNA of Escherichia coli B strain (GenBank accession number CP000819) was prepared, and the obtained genomic DNA was used as a template, and PCR was performed with a primer pair of SEQ ID NO: 89 and SEQ ID NO: 90 to obtain about 1.0 kb of DNA.
  • the fragment was amplified (hereinafter sometimes referred to as “gntR-L fragment”). Further, by performing PCR with the primer pair of SEQ ID NO: 91 and SEQ ID NO: 92, a DNA fragment of about 1.0 kb was amplified (hereinafter sometimes referred to as “gntR-R fragment”).
  • DNA fragments were separated and collected by agarose gel electrophoresis, and PCR was performed with a primer pair of SEQ ID NO: 89 and SEQ ID NO: 92 using the gntR-L fragment and the gntR-R fragment as a template, and a DNA fragment of about 2.0 kb was obtained.
  • the DNA fragment was amplified (hereinafter sometimes referred to as “gntR-LR fragment”).
  • This gntR-LR fragment was separated and collected by agarose gel electrophoresis, digested with EcoRI, mixed with the EcoRI digest of temperature sensitive plasmid pTH18cs1 (GenBank accession number AB019610), and reacted with T4 DNA ligase.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • a plasmid was recovered from the obtained transformant, and it was confirmed that the gntLR fragment was correctly inserted into pTH18cs1, and this plasmid was designated as pTH18cs1-gntR.
  • the obtained plasmid pTH18cs1-gntR was transformed into the B :: atoDAB ⁇ pgi strain prepared in Example 12, and cultured on an LB agar plate containing 10 ⁇ g / mL chloramphenicol at 30 ° C. overnight. Obtained.
  • the obtained transformant was inoculated into an LB liquid medium containing 10 ⁇ g / mL chloramphenicol and cultured at 30 ° C. overnight.
  • a part of this culture solution was applied to an LB agar plate containing 10 ⁇ g / mL chloramphenicol to obtain colonies that grew at 42 ° C.
  • the obtained colonies were cultured in an LB liquid medium at 30 ° C. for 24 hours, and further applied to an LB agar plate to obtain colonies that grew at 42 ° C.
  • Example 14 ⁇ Escherichia coli B strain atoD genome enhancement / pgi gene deletion / gntR gene deletion / gnd gene deletion strain>
  • CGCCATATGAATGGCGCGCGCGGGGCCGGTGG SEQ ID NO: 93
  • TGGGAGCTCTGTACATGATGCG SEQ ID NO: 94
  • TGGAGCTCTGGATCGG A seed was synthesized.
  • the primer of SEQ ID NO: 93 has an NdeI recognition site on the 5 ′ end side
  • the primers of SEQ ID NO: 94 and SEQ ID NO: 95 have a SacI recognition site on the 5 ′ end side
  • the primer of SEQ ID NO: 96 has a 5 ′ end side. Has a BamHI recognition site.
  • a genomic DNA (GenBank accession number CP000819) of Escherichia coli B strain was prepared and PCR was performed with the primer pair of SEQ ID NO: 93 and SEQ ID NO: 94 to amplify a DNA fragment of about 1.0 kb (hereinafter referred to as “gnd ⁇ ”). L fragment "). Further, by performing PCR with the primer pair of SEQ ID NO: 95 and SEQ ID NO: 96, a DNA fragment of about 1.0 kb was amplified (hereinafter sometimes referred to as “gnd-R fragment”).
  • a plasmid was recovered from the obtained transformant, and it was confirmed that two fragments of the 5 ′ upstream neighboring fragment and the 3 ′ downstream neighboring fragment of the gene encoding gnd were correctly inserted into pTH18cs1, and this plasmid was transformed into pTH18cs1. -Gnd.
  • the obtained plasmid pTH18cs1-gnd was transformed into the B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gntR strain prepared in Example 13, and cultured on an LB agar plate containing 10 ⁇ g / mL chloramphenicol at 30 ° C. overnight. Obtained.
  • the obtained transformant was inoculated into an LB liquid medium containing 10 ⁇ g / mL chloramphenicol and cultured at 30 ° C. overnight.
  • a part of this culture solution was applied to an LB agar plate containing 10 ⁇ g / mL chloramphenicol to obtain colonies that grew at 42 ° C.
  • the obtained colonies were cultured in an LB liquid medium at 30 ° C. for 24 hours, and further applied to an LB agar plate to obtain colonies that grew at 42 ° C.
  • AtoD genome enhancement / pgi gene deletion / gntR gene deletion / gnd gene deletion strain (hereinafter sometimes referred to as “B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gntR ⁇ gnd strain”).
  • Plasmid pBRgapP was prepared in the same manner as in the preparation of plasmid pBRgapP in Example 1.
  • the genomic DNA of Clostridium begerinki NRRL B-593 was used as a template, AATATGCATGCTGGGTGGAACATATGAAGGGTTTGCAATGCTAGGG (SEQ ID NO: 97) and ACGCGTCGAACTTAATAATAACTACTACTCTT
  • the obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes SphI and SalI to obtain an isopropyl alcohol dehydrogenase fragment of about 1.1 kbp.
  • the obtained DNA fragment and the fragment obtained by digesting plasmid pUC119 with restriction enzymes SphI and SalI were mixed, ligated with ligase, transformed into Escherichia coli DH5 ⁇ competent cell, and 50 ⁇ g A transformant that grew on an LB agar plate containing / mL ampicillin was obtained.
  • the obtained colonies were cultured overnight in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin at 37 ° C., and the plasmid was recovered from the obtained bacterial cells to confirm that IPAdh was correctly inserted. I was named.
  • a fragment containing IPAdh obtained by digesting plasmid pUC-I with restriction enzymes SphI and EcoRI and a fragment obtained by digesting plasmid pBRgapP with restriction enzymes SphI and EcoRI were mixed and ligated using ligase. Thereafter, the cells were transformed into Escherichia coli DH5 ⁇ competent cells to obtain transformants that grew on LB agar plates containing 50 ⁇ g / mL ampicillin. The obtained colonies were cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin, and the plasmid was recovered from the obtained bacterial cells to confirm that IPAdh was correctly inserted. I was named.
  • Clostridium acetobutylicum ATCC824 genomic DNA was used as a template, and ACGCGTCGACGCTGGTGGAACATATGTTAAAGGATGGAAGTATAAACAAATTAGC (SEQ ID NO: 99) and GCTCTTAGAGGTTACCTACTATAGACT PCR were obtained using the PCR method.
  • the fragment was digested with restriction enzymes SalI and XbaI to obtain an acetoacetate decarboxylase fragment of about 700 bp.
  • the obtained DNA fragment was mixed with the fragment obtained by digesting plasmid pGAP-I with restriction enzymes SalI and XbaI, ligated with ligase, and transformed into Escherichia coli DH5 ⁇ competent cell.
  • a transformant that grows on an LB agar plate containing 50 ⁇ g / mL ampicillin was obtained.
  • the obtained colony was cultured overnight in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin at 37 ° C., and the plasmid was recovered from the obtained bacterial cells to confirm that adc was correctly inserted. Named.
  • genomic DNA (GenBank accession numberBCP000819) of Escherichia coli B strain was used as a template, and GCTCGTAGTACGGCAAACACGCCGAGG (SEQ ID NO: 101) and CGGGATCGATCGATG sequence (101) was used as a primer for amplification by PCR, and the resulting DNA fragment was digested with restriction enzymes XbaI and BamHI to obtain a glucose 6-phosphate 1-dehydrogenase fragment of about 1500 bp.
  • the obtained DNA fragment and the fragment obtained by digesting the plasmid pIa with the restriction enzymes XbaI and BamHI were mixed, ligated with ligase, transformed into Escherichia coli DH5 ⁇ competent cell, 50 ⁇ g / A transformant that grew on an LB agar plate containing mL ampicillin was obtained.
  • the obtained colony was cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin, and the resulting plasmid was designated as pIaz.
  • Example 16 ⁇ Preparation of plasmids pMWGC2 and pMWKC2>
  • Escherichia coli MG1655 genomic DNA was used as a template, and CACTAGTCTGTCGCAATGATTGACACGATTCCCG (SEQ ID NO: 103) and GCTCGAATTCCCATATTTCCACCAGCTATTTTGTTAGGTGAATAAAAGG was used as a primer.
  • the DNA fragment containing the GAPDH promoter was obtained by digesting with EcoRI and phosphorylating the end with T4 Polynucleotide Kinase.
  • Plasmid pMW119 (GenBank accession number AB005476) was digested with the restriction enzyme NdeI, the ends were blunted, and then digested with EcoRI to dephosphorylate the ends.
  • This pMW119 DNA fragment and the above-mentioned GAPDH promoter-containing DNA fragment were mixed and ligated, and then transformed into an Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell and applied to an LB agar plate containing 50 ⁇ g / mL ampicillin. A growing transformant was obtained. The obtained colonies were cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin, and the plasmid was recovered from the obtained bacterial cells to obtain plasmid pMWG2.
  • the DNA obtained was amplified by PCR using pTH18cs1 (GenBank accession number AB019610) as a template, TCGGCACGTAAGAGGTTCC (SEQ ID NO: 46) and CGGGTCGAATTTGCTTTCG (SEQ ID NO: 47) as primers.
  • the fragment was phosphorylated with T4 Polynucleotide Kinase (Takara) to obtain a DNA fragment containing a chloramphenicol resistance gene.
  • CTAGATCTGACATAGTAAGACGGGTAGAGAG SEQ ID NO: 48
  • CTAGATCTCAGGGTTTATTGTCTCATGAGC SEQ ID NO: 49
  • plasmid pMWGC2 Using plasmid pMWGC2 as a template, CCTTTGGTTAAAGGCTTTAAGATCTTCCCAGTGGACAAACTATGCCC (SEQ ID NO: 50) and GGCATAGTTTGTCCCACTGGGAAGATTCTAAGCCCTTTAACCAAGG (SEQ ID NO: 51) were used as primers, amplified by the PCR method The transformant which grows on the LB agar plate containing was obtained. The obtained colonies were cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 25 ⁇ g / mL chloramphenicol, and the plasmid was recovered from the obtained bacterial cells to obtain plasmid pMWGKC2.
  • Example 17 ⁇ Construction of Mtk and mcl expression plasmids pMWGC2_mtk (Mc) _mcl and pMWGK2_mtk (Mc) _mcl derived from Methylococcus capsulatus ATCC 33009> PCR was performed using Methylococcus capratus genomic DNA (ATCC33009D-5) as a template and GGAATTCCATATGCTGTTAAAAATCGTCTAC (SEQ ID NO: 52) and GCTCTTAGATCAGAATCTGATCTCGTGTTC (SEQ ID NO: 53) to obtain a fragment of Methylococcus mc.
  • Methylococcus capratus genomic DNA ATCC33009D-5
  • GGAATTCCATATGCTGTTAAAAATCGTCTAC SEQ ID NO: 52
  • GCTCTTAGATCAGAATCTGATCTCGTGTTC SEQ ID NO: 53
  • the Escherichia coli DH5 ⁇ strain Transformants were obtained by transforming into competent cells and growing on LB agar plates containing 25 ⁇ g / mL chloramphenicol. The obtained colonies were cultured overnight at 30 ° C. in an LB liquid medium containing 25 ⁇ g / mL chloramphenicol, and cultured overnight at 30 ° C. on the ground.
  • the obtained plasmids were respectively pMWGC2_mtk (Mc) _mcl pMWGKC2_mtk (Mc) _mcl was named.
  • pMWGC2_mtk (Mc) _mcl and pMWGKC2_mtk (Mc) _mcl include a base sequence of mcl derived from Methylococcus capsuleatus (SEQ ID NO: 41), a base sequence of mtkA (SEQ ID NO: 28), and a base sequence of mtkB (SEQ ID NO: 29). .
  • the amino acid sequence of Mcl, MtkA, and MtkB derived from Methylococcus capsuleatus are as shown in SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 13, and SEQ ID NO: 14, respectively.
  • Example 18 ⁇ Construction of glxR and glxK expression plasmids>
  • the genomic DNA of the Escherichia coli B strain (GenBank accession number CP000819) was used as a template, and GCTCTAGACGGGAAAGTCTTTAGGAACTACTAGTGATGATGTATGATCG (SEQ ID NO: 106) was used as a primer for amplification by PCR, and the resulting DNA fragment was digested with restriction enzymes XbaI and PstI to obtain a glxR fragment of about 900 bp.
  • glyceric acid 3-kinase gene (glxK) derived from Escherichia coli
  • genomic DNA GenBank accession number CP000819
  • AACTGCAGCGGAGAAAGTCTTAGAAGATTGTTCTCTGTCTCTC SEQ ID NO: 107
  • the resulting DNA fragment was digested with restriction enzymes PstI and HindIII to obtain a glxK fragment of about 1100 bp.
  • the obtained glxR fragment and glxK fragment were mixed with plasmid pMWGC2_mtk (Mc) _mcl constructed in Example 17 cut with XbaI and HindIII, and glxR and glxK were mixed with malatethio of plasmid pMWGC2_mtk (Mc) _mcl. Ligated downstream of the kinase (mtk) sequence.
  • the obtained plasmid was designated as pMWGC2_mtk (Mc) _mcl_glxR_glxK.
  • Example 19 ⁇ Mtk and mcl-introduced isopropyl alcohol production atoD genome enhancement / pgi gene deletion / gntR gene deletion / gnd gene deletion strain> A competent cell of the strain prepared in Example 14 (B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gntR ⁇ gnd strain) was transformed with the plasmid pIaz prepared in Example 15 and any of the plasmids prepared in Examples 16-18, and 25 mg / L Of chloramphenicol and 100 mg / L ampicillin were applied to an LB agar medium and grown to obtain a strain. These strains are summarized in Table 3.
  • Example 20 ⁇ Production of isopropyl alcohol> Each test strain constructed in Example 19 was inoculated into a test tube containing 25 mL / L chloramphenicol and LB Broth, Miller culture solution (Difco244620) containing 100 mg / L ampicillin as a preculture. The culture was performed overnight at a culture temperature of 30 ° C. and 120 rpm. OD of preculture was measured, cells corresponding to OD3.0 were collected, suspended in 300 ⁇ l of 0.9% NaCl solution, 20 ⁇ l was suspended in 5% glucose, 25 mg / L chloramphenicol, 100 mg / L ampicillin.
  • the amount of isopropyl alcohol produced at 48 hours was 4.8 g in the control strain (vec / atoDAB ⁇ pgi ⁇ gntR ⁇ gnd), 7.2 g in the mtk + mcl-introduced strain (MtkAB / atoDAB ⁇ pgi ⁇ gntR ⁇ gnd, ⁇ ggRxg / ggRxgg). It was 7.9 g.
  • the amount of acetone produced at 48 hours was 0.1 g for the control strain (vec / atoDAB ⁇ pgi ⁇ gntR ⁇ gnd), 0.2 g for the mtk + mcl-introduced strain (MtkAB / atoDAB ⁇ pgi ⁇ gntR ⁇ gnd, ⁇ gg / gtk). It was 0.3 g. From this, it was found that the production of isopropyl alcohol and acetone was improved when glxR and glxK were introduced in addition to mtk and mcl.
  • the yields of isopropyl alcohol and acetone with respect to 48 hours were 14.8% for the control strain (vec / atoDAB ⁇ pgi ⁇ gntR ⁇ gnd), 17.3% for the mtk + mcl-introduced strain (MtkAB / atoDAB ⁇ pgi ⁇ gntR ⁇ gnd), glxR + glmTxk + x + g + k + x + g + k + x / AtoDAB ⁇ pgi ⁇ gntR ⁇ gnd) was 18.8%. From this, it was shown that introduction of glxR and glxK in addition to mtk and mcl improves the conversion efficiency of sugars to isopropyl alcohol and acetone.
  • Example 21 ⁇ Production of Aspergillus niger strain for evaluation> From the genome of Aspergillus niger ATCC 1015, the glucoamylase promoter region (GlaPr) and transcription termination region (GlaTt) genes were obtained by PCR by the method described in the literature (Plasmid, 2005; 53: 191-204).
  • GaPr glucoamylase promoter region
  • GaTt transcription termination region
  • Methyl CoA lyase gene (SEQ ID NO: 41) from Methylococcus capsulatus ATCC 33009, malate thiokinase subunit ⁇ gene (SEQ ID NO: 28), and malate thiokinase subunit ⁇ gene (SEQ ID NO: 29) with appropriate SD sequences Amplified by the PCR method together with (Shinendalgarno sequence). The obtained amplified fragments were designed so that the coding region of each protein was sandwiched between the promoter region (GlaPr) and the transcription termination region (GlaTt), and inserted into the HindIII site of the plasmid pPTRII (Takara). The obtained plasmid was designated as pPTRII_mcl (Mc) _mtk (Mc).
  • Rhodococcus josti NBRC16295 From the genome of Rhodococcus josti NBRC16295, the gene for 2-hydroxy-3-oxopropionate reductase (glxR) (SEQ ID NO: 64) and the gene for glyoxylate carboligase (gcl) (SEQ ID NO: 65) with appropriate SD sequences Amplified by the PCR method.
  • the obtained amplified fragment was designed so that the coding region of each protein was sandwiched between the promoter region (GlaPr) and the transcription termination region (GlaTt), and inserted into pPTRII_mcl (Mc) _mtk (Mc).
  • the obtained plasmid was designated as pPTRII_mcl (Mc) _mtk (Mc) _glxR (Rj) _gcl (Rj).
  • Example 22 ⁇ Citric acid production test by Aspergillus niger>
  • Aspergillus niger strains (AN / vec, AN / mtk_mcl, and AN / mtk_mcl_gcl_glxR) prepared in Example 21 were cultured at 30 ° C. using a medium containing a carbon source and Pyrithiamine hydrobromide, the control strain AN / vec and In comparison, AN / mtk_mcl and AN / mtk_mcl_gcl_glxR produce citric acid in higher yields.
  • Example 23 ⁇ Production of Aspergillus tereus strain for evaluation>
  • pPTRII, pPTRII_mcl (Mc) _mtk (Mc) and pPTRII_mcl (Mc) _mtk (Mc) _glxR (Rj) _gcl (Rj) were used according to the instruction manual of pPTRII (Takara).
  • Teleus NBRC6365 control strain of Aspergillus terreus (sometimes referred to as “AT / vec”), mtk + mcl introduced strain (sometimes referred to as “AT / mtk_mcl”), mtk + mcl + glxR + gcl introduced strain (“AT / mtk_mcl_gcl_gcl_gcl”) It was said that).
  • Example 24 ⁇ Itaconic acid production test by Aspergillus tereus>
  • Aspergillus terreus strains AT / vec, AT / mtk_mcl, and AT / mtk_mcl_gcl_glxR
  • AT / mtk_mcl_gcl_glxR is used as a strain for evaluation, and carbonate, carbon dioxide gas or a reducing agent is supplied as an additive to the medium, and culture and analysis are performed in the same manner.
  • the test plots for supplying carbonate, carbon dioxide gas or reducing agent to the additive show higher yields for sugars than the test plots for which no carbonate, carbon dioxide gas or reducing agent is supplied. That is, in a strain provided with a CO 2 fixation pathway, it is considered that the supply of carbonate, carbon dioxide gas or a reducing agent is effective in improving the sugar yield.
  • Example 25 ⁇ Preparation of Capriavidas Necatol strain for evaluation>
  • the malate thiokinase subunit ⁇ gene (SEQ ID NO: 28) derived from Methylococcus capsulatus ATCC 33009 and the malate thiokinase subunit ⁇ gene (SEQ ID NO: 29) were amplified together with appropriate SD sequences by PCR.
  • the obtained amplified fragment was ligated to a broad host range vector pBBR1-MCS2 (GenBank accession number U23751) so as to be under the control of the lac promoter.
  • the obtained plasmid was designated as pBBR-MCS2_mtk (Mc).
  • pBBR1-MCS2 and pBBR-MCS2_mtk were used to transform Capriavidas nekatol JMP134 (DSM4058), and a Capriavidas nekatol control strain (sometimes referred to as “CP / vec”) and an mtk-introduced strain (“CP / vec”) mtk ”).
  • Example 26 ⁇ Poly-3-hydroxybutyric acid production test by Capriavidas necatol>
  • the evaluation strains (CP / vec and CP / mtk) prepared in Example 25 were cultured at 30 ° C. using a medium containing a carbon source and kanamycin, the mtk-introduced strain was compared with the control strain CP / vec.
  • CP / mtk produces poly-3-hydroxybutyric acid in higher yields.
  • the fixed carbonic acid was acetyl-CoA and poly-3. -Confirmed to be introduced into hydroxybutyric acid.

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Abstract

　下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれも有していない微生物に、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性を付与することにより得られたアセチルＣｏＡ生産微生物：（ａ）マロニルＣｏＡからマロン酸セミアルデヒド又は３－ヒドロキシプロピオン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、（ｂ）アセチルＣｏＡとＣＯ２からピルビン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、（ｃ）クロトニルＣｏＡとＣＯ２からエチルマロニルＣｏＡ又はグルタコニルＣｏＡへの酵素反応を有する炭酸固定回路、（ｄ）ＣＯ２からギ酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、（ｅ）マレートチオキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼからなる群より選択された少なくとも１種。

Description

二酸化炭素固定回路を導入した微生物
　本発明は、二酸化炭素固定回路を導入した微生物、及びこれを用いた物質生産方法に関する。
　アセチルＣｏＡは、微生物の代謝経路における、きわめて重要な中間体のひとつである。様々な代謝産物がアセチルＣｏＡを経由して生産される。アセチルＣｏＡを経由して生成される物質の例として、例えば、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－プロリン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン等のアミノ酸類；酢酸、プロピオン酸、酪酸、カプロン酸、クエン酸、３－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシイソ酪酸、３－アミノイソ酪酸、２－ヒドロキシイソ酪酸、メタクリル酸、ポリ－３－ヒドロキシ酪酸等の有機酸類；イソプロピルアルコール、エタノール、ブタノール等のアルコール類；アセトン；ポリグルタミン酸；などが知られている。
　アセチルＣｏＡは、多くの微生物の場合、グルコース等の糖を炭素源として生産される。糖は、エムデン・マイヤーホフ経路、エントナー・ドウドロフ経路、ペントース・リン酸経路等の解糖系と呼ばれる代謝経路を経て、ピルビン酸へと変換され、ピルビン酸は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ピルビン酸－ギ酸リアーゼ等の作用により、アセチルＣｏＡへと変換される。この際、二酸化炭素（ＣＯ２）やギ酸が副生成物として生産されるので、糖に由来する炭素の全部がアセチルＣｏＡとして固定されるわけではない。そこで、ＣＯ２を再固定してアセチルＣｏＡの収量を増やすための幾つかの検討が行われている。
　微生物の体内において、ＣＯ２を固定して炭素源とする経路はいくつか知られている（Applied and Environmental Microbiology, 2011; 77(6): 1925-1936）。具体的には、カルビン・ベンソン回路、還元的ＴＣＡ回路、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路、３－ヒドロキシプロピオン酸回路、４－ヒドロキシ酪酸回路等が挙げられる。カルビン・ベンソン回路は、植物や光合成細菌に存在する、約１２種の酵素からなるＣＯ２固定回路であり、リブロース－１，５－ビスリン酸カルボキシラーゼ（ＲｕｂｉｓＣＯ）によりＣＯ２を固定し、最終的にグリセルアルデヒド３－リン酸が生産される。還元的ＴＣＡ回路は、緑色硫黄細菌をはじめとする嫌気性菌や微好気性菌にみられる回路で、１１種の酵素からなり、フェレドキシンを補酵素としたＣＯ２固定酵素（アセチルＣｏＡカルボキシラーゼと２－オキソグルタル酸シンターゼ）を有すること特徴とし、通常のＴＣＡ回路の逆方向の反応によりＣＯ２からピルビン酸を生産する。Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、酢酸産生菌等の嫌気性微生物にみられる経路で、９種の酵素からなり、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ＣＯデヒドロゲナーゼ等によりＣＯ２又は補酵素上のギ酸を還元し、最終的にアセチルＣｏＡへと変換する。３－ヒドロキシプロピオン酸回路は、クロロフレクサス属菌等にみられる回路で、１３種の酵素からなり、アセチルＣｏＡ（プロピオニルＣｏＡ）カルボキシラーゼの作用によりＣＯ２を固定し、マロニルＣｏＡ等を経由してアセチルＣｏＡを生産する。４－ヒドロキシ酪酸回路は、古細菌等に存在する経路で、ピルビン酸シンターゼ、アセチルＣｏＡ（プロピオニルＣｏＡ）カルボキシラーゼ、及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの反応によりＣＯ２を固定し、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡ等を経由してアセチルＣｏＡを生産する。
　ＣＯ２を固定する経路を、有用化合物を生産する微生物に導入し、有用物質を生産しようとする提案がされている。例えば国際公開第２００９／０９４４８５号及び国際公開第２０１０／０７１６９７号には、酢酸菌のＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路に類似した経路を導入した微生物を用いてＣＯ２からアセチルＣｏＡを生産する提案が開示されている。また、国際公開第２００９／０４６９２９号には、ヒドロゲナーゼとテトラヒドロ葉酸リアーゼを導入した微生物を用いてＣＯ２から乳酸を生産する提案が開示されている。国際公開第２０１１／０９９００６号には、アセチルＣｏＡ上への炭酸固定反応やマロニルＣｏＡの還元反応を経由し、ＣＯ２を固定する回路が提案されている。独国特許出願公開第１０２００７０５９２４８号明細書には、４－ヒドロキシ酪酸回路に類似した経路によるアセチルＣｏＡ生産が提案されている。
　しかしながら、公知の炭酸固定回路は、ＣＯ２を固定してアセチルＣｏＡ由来の有用化合物を生産するという観点から、必ずしも効率がよいとはいえない。例えば、カルビン・ベンソン回路は、自然界の炭酸固定回路としてよく知られているが、炭酸固定を担うＲｕｂｉｓＣＯは、反応速度が遅い上に、酸化的分解といった副反応もみられ、効率のいい酵素とはいえない（Journal of Bioscience and Bioengineering, 2002; 94(6): 497-505）。Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路、国際公開第２００９／０９４４８５号に開示されている経路、国際公開第２０１０／０７１６９７号に開示されている経路、及び国際公開第２００９／０４６９２９号に開示されている経路は、ＣＯ２をＣＯ又はギ酸へと還元する経路を含むが、このように強い還元反応を触媒する酵素は還元性の環境下でしか作用しない場合が多く、この還元反応は通常の条件下では困難な上に、当該酵素は絶対嫌気性の微生物以外に導入するのは容易ではない。還元的ＴＣＡ回路は、ピルビン酸シンターゼによる還元反応及び２－オキソグルタル酸シンターゼによる還元反応に、フェレドキシンを電子受容体とした強い還元力が必要で、反応の進行は容易でない。４－ヒドロキシ酪酸回路、３－ヒドロキシプロピオン酸回路、国際公開第２００９／０４６９２９号に記載されている経路、及び国際公開第２０１１／０９９００６号に記載されている経路は、スクシニルＣｏＡの還元又はマロニルＣｏＡの還元といった、カルボン酸又はその（チオ）エステルの還元反応を利用しているが、このような反応は酵素反応として一般的に困難で、発酵経路としてはできるだけ避けた方が望ましいとされている（Nature, 2008; 451: 86-89、Nature Chemical Biolory, 2011; 7: 445-452）。４－ヒドロキシ酪酸回路は、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡの脱水、又は３－ヒドロキシプロピオン酸の脱水といった、脱水反応を経由しているが、このような反応は水中だとしばしば逆反応（水和）と競合するという問題がある。４－ヒドロキシ酪酸回路、３－ヒドロキシプロピオン酸回路、及び還元的ＴＣＡ回路は、マロニルＣｏＡ合成酵素及びピルビン酸合成酵素の作用により、生産されたアセチルＣｏＡが回路内で別の物質へと変換されるため、アセチルＣｏＡの生産という観点では必ずしも効率的とはいえない。
　さらに、上記の回路を微生物に導入して、何らかの物質生産を試みる場合、回路を構成する酵素の数や、新たに付与すべき酵素活性の数を考慮する必要がある。回路を構成する酵素や付与する酵素の数が多いほど、回路の構築及び制御は難しくなり、その上、微生物への負担も増す。例えば、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を大腸菌に導入しようとすると、少なくとも９種の遺伝子導入が必要で、これほど多数の遺伝子を制御し得る態様で導入して物質生産経路を構築することは、現実的にきわめて困難な作業といえる。少ない数の酵素で構成される回路を、少ない数の遺伝子導入で構築したほうが、回路を構築する上でも、微生物が本来持っている物質生産経路と組み合わせる上でも、有利であることは明らかである。
　したがって、ＣＯ２を固定してアセチルＣｏＡへと変換するには、１）回路を構成する各酵素の活性が十分に高く、２）アセチルＣｏＡを消費する酵素を含む回路を有さず、３）新たに付与する酵素の数が少なく回路がシンプルである、ことが好ましい。しかしながら、今までに報告されたＣＯ２からアセチルＣｏＡを生産する回路において、１）～３）の条件をすべて満たす回路は存在せず、いずれも実現性に乏しかった。その証拠に、工業的に利用される微生物に実際に、上記各文献の提案のように酵素活性を付与して炭酸固定回路を構築し、ＣＯ２をアセチルＣｏＡへと変換し、さらにアセチルＣｏを有用化合物へと変換した例は、これまで皆無であった。
　本発明は、上記状況のもとになされた。
　第一の発明は、二酸化炭素を利用してアセチルＣｏＡを効率的に生成するために有用な微生物を提供することを課題とする。また、第一の発明は、前記微生物を用いて、アセチルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡに由来する有用な代謝産物を高収率に製造する方法を提供することを課題とする。
　第二の発明は、アセチルＣｏＡを経由して二酸化炭素を効率よく有用な代謝産物へと変換できる、アスペルギルス属菌又はカプリアビダス属菌の微生物を提供することを課題とする。また、第二の発明は、前記微生物を用いた有用な代謝産物の製造方法を提供することを課題とする。
　前記課題を解決する第一の発明は、以下のとおりである。
　［Ａ１］　下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれも有していない微生物に、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のいずれも付与せず、又は下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ以上を付与してもその機能を発揮させずに、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性を付与することにより得られたアセチルＣｏＡ生産回路を有する微生物であって、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ、ヒドロキシピルビン酸イソメラーゼ、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ、グリセリン酸２－キナーゼ、グリセリン酸３－キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ及びエノラーゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性が強化され、且つ／又は、リンゴ酸酵素及びフマル酸レダクターゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性が不活化又は低減されたアセチルＣｏＡ生産微生物：（ａ）マロニルＣｏＡからマロン酸セミアルデヒド又は３－ヒドロキシプロピオン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、（ｂ）アセチルＣｏＡとＣＯ２からピルビン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、（ｃ）クロトニルＣｏＡとＣＯ２からエチルマロニルＣｏＡ又はグルタコニルＣｏＡへの酵素反応を有する炭酸固定回路、（ｄ）ＣＯ２からギ酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、（ｅ）マレートチオキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼからなる群より選択された少なくとも１種。
　［Ａ２］　下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれも有していない微生物に、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のいずれも付与せず、又は下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ以上を付与してもその機能を発揮させずに、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性を付与することにより得られたアセチルＣｏＡ生産回路を有する微生物であって、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ、ヒドロキシピルビン酸イソメラーゼ、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ、グリセリン酸２－キナーゼ、グリセリン酸３－キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ及びエノラーゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性が強化されたアセチルＣｏＡ生産微生物：（ａ）マロニルＣｏＡからマロン酸セミアルデヒド又は３－ヒドロキシプロピオン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、（ｂ）アセチルＣｏＡとＣＯ２からピルビン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、（ｃ）クロトニルＣｏＡとＣＯ２からエチルマロニルＣｏＡ又はグルタコニルＣｏＡへの酵素反応を有する炭酸固定回路、（ｄ）ＣＯ２からギ酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、（ｅ）マレートチオキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼからなる群より選択された少なくとも１種。
　［Ａ３］　マレートチオキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼの酵素活性が付与された、［Ａ１］又は［Ａ２］に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。
　［Ａ４］　２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ及びグリセリン酸３－キナーゼの酵素活性が強化された、［Ａ１］～［Ａ３］のいずれか１つに記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。
　［Ａ５］　ホスホエノールピルビン酸又はピルビン酸がオキサロ酢酸に変換され、オキサロ酢酸が、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ及びグリオキシル酸カルボリガーゼにより２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸に変換され、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸が２－ホスホグリセリン酸に変換され、２－ホスホグリセリン酸がホスホエノールピルビン酸に変換される、アセチルＣｏＡ生産回路を有する、［Ａ１］～［Ａ４］のいずれか１つに記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。
　［Ａ６］　下記（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）及び（ｍ）を含むアセチルＣｏＡ生産回路を有する、［Ａ１］～［Ａ５］のいずれか１つに記載のアセチルＣｏＡ生産微生物：（ｆ）ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸カルボキシラーゼと、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼと、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼと、からなる群より選択された少なくとも１つ、（ｇ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、（ｈ）マレートチオキナーゼ、（ｉ）マリルＣｏＡリアーゼ、（ｊ）グリオキシル酸カルボリガーゼ、（ｋ）２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼと、ヒドロキシピルビン酸イソメラーゼ及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼと、からなる群より選択された少なくとも１つ、（ｌ）グリセリン酸２－キナーゼと、グリセリン酸３－キナーゼ及びホスホグリセリン酸ムターゼと、からなる群より選択された少なくとも１つ、（ｍ）エノラーゼ。
　［Ａ７］　前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれも有していない微生物が、腸内細菌科に属する微生物又はコリネ型細菌に属する微生物である、［Ａ１］～［Ａ６］のいずれか１つに記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。
　［Ａ８］　前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれも有していない微生物が、エシェリヒア属細菌若しくはパントエア属細菌である腸内細菌科に属する微生物、又はコリネバクテリウム属細菌であるコリネ型細菌に属する微生物である、［Ａ１］～［Ａ７］のいずれか１つに記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。
　［Ａ９］　［Ａ１］～［Ａ８］のいずれか１つに記載のアセチルＣｏＡ生産微生物と、炭素源材料とを接触させて培養を行う培養工程と、前記接触により得られた目的生産物を回収する回収工程と、を含む、アセチルＣｏＡ生産方法。
　［Ａ１０］　さらに、炭酸イオン、炭酸水素イオン、二酸化炭素ガス及び還元剤からなる群より選択された少なくとも１種を、培養に用いる培地に供給する供給工程を含む、［Ａ９］に記載のアセチルＣｏＡ生産方法。
　［Ａ１１］　さらに、培養によって発生した二酸化炭素を含む気体を回収して、培養に用いる培地に該気体を供給する気体供給工程を含む、［Ａ９］又は［Ａ１０］に記載のアセチルＣｏＡ生産方法。
　［Ａ１２］　［Ａ１］～［Ａ８］のいずれか１つに記載のアセチルＣｏＡ生産微生物と、炭素源材料とを接触させて培養を行う培養工程と、前記接触により得られた、アセチルＣｏＡを中間体とする代謝産物を回収する回収工程と、を含む、アセチルＣｏＡを中間体とする代謝産物の生産方法。
　［Ａ１３］　さらに、炭酸イオン、炭酸水素イオン、二酸化炭素ガス及び還元剤からなる群より選択された少なくとも１種を、培養に用いる培地に供給する供給工程を含む、［Ａ１２］に記載のアセチルＣｏＡを中間体とする代謝産物の生産方法。
　［Ａ１４］　さらに、培養によって発生した二酸化炭素を含む気体を回収して、培養に用いる培地に該気体を供給する気体供給工程を含む、［Ａ１２］又は［Ａ１３］に記載のアセチルＣｏＡを中間体とする代謝産物の生産方法。
　［Ａ１５］　前記アセチルＣｏＡを中間体とする代謝産物が、イソプロピルアルコール、アセトン、又はグルタミン酸である、［Ａ１２］～［Ａ１４］のいずれか１つに記載のアセチルＣｏＡを中間体とする代謝産物の生産方法。
　［Ａ１６］　下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれも有していない微生物に、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のいずれも付与せず、又は付与してもその機能を発揮させずに、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性を付与することにより得られたアセチルＣｏＡ生産回路を有するアセチルＣｏＡ生産微生物を培養する培養工程と、全供給量が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上の炭酸イオン又は炭酸水素イオン、平均気泡径が１００μｍ以上である二酸化炭素ガス、及び全供給量が０．０１ｇ／Ｌ以上５０ｇ／Ｌ以下の亜硫酸ナトリウムからなる群より選択された少なくとも１つを、培養に用いる培地に供給する供給工程と、を含むアセチルＣｏＡ生産方法：（ａ）マロニルＣｏＡからマロン酸セミアルデヒド又は３－ヒドロキシプロピオン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、（ｂ）アセチルＣｏＡとＣＯ２からピルビン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、（ｃ）クロトニルＣｏＡとＣＯ２からエチルマロニルＣｏＡ又はグルタコニルＣｏＡへの酵素反応を有する炭酸固定回路、（ｄ）ＣＯ２からギ酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、（ｅ）マレートチオキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼからなる群より選択された少なくとも１種。
　［Ａ１７］　さらに、培養によって発生した二酸化炭素を含む気体を回収して、培養に用いる培地に該気体を供給する気体供給工程を含む、［Ａ１６］に記載のアセチルＣｏＡ生産方法。
　［Ａ１８］　前記アセチルＣｏＡ生産微生物が、ホスホエノールピルビン酸又はピルビン酸がオキサロ酢酸に変換され、オキサロ酢酸が、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ及びグリオキシル酸カルボリガーゼにより２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸に変換され、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸が２－ホスホグリセリン酸に変換され、２－ホスホグリセリン酸がホスホエノールピルビン酸に変換される、アセチルＣｏＡ生産回路を有するアセチルＣｏＡ生産微生物である、［Ａ１６］又は［Ａ１７］に記載のアセチルＣｏＡ生産方法。
　［Ａ１９］　前記アセチルＣｏＡ生産微生物が、下記（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）及び（ｍ）を含むアセチルＣｏＡ生産回路を有するアセチルＣｏＡ生産微生物である、［Ａ１６］～［Ａ１８］のいずれか１つに記載のアセチルＣｏＡ生産方法：（ｆ）ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸カルボキシラーゼと、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼと、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼと、からなる群より選択された少なくとも１つ、（ｇ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、（ｈ）マレートチオキナーゼ、（ｉ）マリルＣｏＡリアーゼ、（ｊ）グリオキシル酸カルボリガーゼ、（ｋ）２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼと、ヒドロキシピルビン酸イソメラーゼ及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼと、からなる群より選択された少なくとも１つ、（ｌ）グリセリン酸２－キナーゼと、グリセリン酸３－キナーゼ及びホスホグリセリン酸ムターゼと、からなる群より選択された少なくとも１つ、（ｍ）エノラーゼ。
　［Ａ２０］　前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれも有していない微生物が、腸内細菌科に属する微生物又はコリネ型細菌に属する微生物である、［Ａ１６］～［Ａ１９］のいずれか１つに記載のアセチルＣｏＡ生産方法。
　［Ａ２１］　前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれも有していない微生物が、エシェリヒア属細菌若しくはパントエア属細菌である腸内細菌科に属する微生物、又はコリネバクテリウム属細菌であるコリネ型細菌に属する微生物である、［Ａ１６］～［Ａ２０］のいずれか１つに記載のアセチルＣｏＡ生産方法。
　［Ａ２２］　［Ａ１６］～［Ａ２１］のいずれか１項に記載のアセチルＣｏＡ生産方法により生産されたアセチルＣｏＡを中間体として、アセチルＣｏＡ生産微生物がイソプロピルアルコールを生産する、イソプロピルアルコール生産方法。
　［Ａ２３］　［Ａ１６］～［Ａ２１］のいずれか１項に記載のアセチルＣｏＡ生産方法により生産されたアセチルＣｏＡを中間体として、アセチルＣｏＡ生産微生物がアセトンを生産する、アセトン生産方法。
　［Ａ２４］　［Ａ１６］～［Ａ２１］のいずれか１項に記載のアセチルＣｏＡ生産方法により生産されたアセチルＣｏＡを中間体として、アセチルＣｏＡ生産微生物がグルタミン酸を生産する、グルタミン酸生産方法。
　［Ａ２５］　［Ａ１］～［Ａ８］のいずれか１つに記載のアセチルＣｏＡ生産微生物と、炭素源材料とを接触させて培養を行う培養工程と、前記接触により得られたイソプロピルアルコールを回収する回収工程と、を含むイソプロピルアルコール生産方法。
　［Ａ２６］　［Ａ１］～［Ａ８］のいずれか１つに記載のアセチルＣｏＡ生産微生物と、炭素源材料とを接触させて培養を行う培養工程と、前記接触により得られたアセトンを回収する回収工程と、を含むアセトン生産方法。
　［Ａ２７］　［Ａ１］～［Ａ８］のいずれか１つに記載のアセチルＣｏＡ生産微生物と、炭素源材料とを接触させて培養を行う培養工程と、前記接触により得られたグルタミン酸を回収する回収工程と、を含むグルタミン酸生産方法。
　前記課題を解決する第二の発明は、以下のとおりである。
　［Ｂ１］　下記（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）、（ｄ２）及び（ｅ２）のいずれも有していない微生物に、下記（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）及び（ｄ２）のいずれも付与せず、又は下記（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）及び（ｄ２）の１つ以上を付与してもその機能を発揮させずに、マレートチオキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性を付与することにより得られたアスペルギルス属菌又はカプリアビダス属菌である微生物：（ａ２）マロニルＣｏＡからマロン酸セミアルデヒド又は３－ヒドロキシプロピオン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、（ｂ２）アセチルＣｏＡとＣＯ２からピルビン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、（ｃ２）クロトニルＣｏＡとＣＯ２からエチルマロニルＣｏＡ又はグルタコニルＣｏＡへの酵素反応を有する炭酸固定回路、（ｄ２）ＣＯ２からギ酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、（ｅ２）マレートチオキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼからなる群より選択された少なくとも１種。
　［Ｂ２］　アセチルＣｏＡの生産能を有する、［Ｂ１］に記載の微生物。
　［Ｂ３］　さらに、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性を付与することにより得られた、［Ｂ１］又は［Ｂ２］に記載の微生物。
　［Ｂ４］　ホスホエノールピルビン酸又はピルビン酸が、オキサロ酢酸に変換され、オキサロ酢酸が、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ及びグリオキシル酸カルボリガーゼにより２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸に変換され、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸が２－ホスホグリセリン酸に変換され、２－ホスホグリセリン酸がホスホエノールピルビン酸に変換される、アセチルＣｏＡ生産回路を有する、［Ｂ１］～［Ｂ３］のいずれか１つに記載の微生物。
　［Ｂ５］　下記（ｆ２）、（ｇ２）、（ｈ２）、（ｉ２）、（ｊ２）、（ｋ２）、（ｌ２）及び（ｍ２）を含むアセチルＣｏＡ生産回路を有する、［Ｂ１］～［Ｂ４］のいずれか１つに記載の微生物：（ｆ２）ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸カルボキシラーゼと、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼと、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼと、からなる群より選択された少なくとも１つ、（ｇ２）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、（ｈ２）マレートチオキナーゼ、（ｉ２）マリルＣｏＡリアーゼ、（ｊ２）グリオキシル酸カルボリガーゼ、（ｋ２）２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼと、ヒドロキシピルビン酸イソメラーゼ及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼと、からなる群より選択された少なくとも１つ、（ｌ２）グリセリン酸２－キナーゼと、グリセリン酸３－キナーゼ及びホスホグリセリン酸ムターゼと、からなる群より選択された少なくとも１つ、（ｍ２）エノラーゼ。
　［Ｂ６］　下記（ａ３）及び（ｂ３）からなる群より選択された少なくとも１つの酵素反応と、下記（ｃ３）、（ｄ３）、（ｅ３）、（ｆ３）及び（ｇ３）の酵素反応と、下記（ｈ３）の酵素反応、下記（ｉ３）、（ｊ３）、（ｋ３）及び（ｎ３）の酵素反応、並びに下記（ｉ３）、（ｊ３）、（ｌ３）、（ｍ３）及び（ｎ３）の酵素反応、からなる群より選択された少なくとも１つと、を含む経路を有する、［Ｂ１］～［Ｂ５］のいずれか１つに記載の微生物：（ａ３）ホスホエノールピルビン酸からオキサロ酢酸への酵素反応、（ｂ３）ピルビン酸からオキサロ酢酸への酵素反応、（ｃ３）オキサロ酢酸からリンゴ酸への酵素反応、（ｄ３）リンゴ酸からマリルＣｏＡへの酵素反応、（ｅ３）マリルＣｏＡからグリオキシル酸及びアセチルＣｏＡへの酵素反応、（ｆ３）グリオキシル酸からグリシンへの酵素反応、（ｇ３）グリシンからセリンへの酵素反応、（ｈ３）セリンからピルビン酸への酵素反応、（ｉ３）セリンから３－ヒドロキシピルビン酸への酵素反応、（ｊ３）３－ヒドロキシピルビン酸からグリセリン酸への酵素反応、（ｋ３）グリセリン酸から２－ホスホグリセリン酸への酵素反応、（ｌ３）グリセリン酸から３－ホスホグリセリン酸への酵素反応、（ｍ３）３－ホスホグリセリン酸から２－ホスホグリセリン酸への酵素反応、（ｎ３）２－ホスホグリセリン酸からホスホエノールピルビン酸への酵素反応。
　［Ｂ７］　下記（ａ４）及び（ｂ４）からなる群より選択された少なくとも１つの酵素と、下記（ｃ４）、（ｄ４）、（ｅ４）、（ｆ４）及び（ｇ４）の酵素と、下記（ｈ４）の酵素、下記（ｉ４）、（ｊ４）、（ｋ４）及び（ｎ４）の酵素、並びに下記（ｉ４）、（ｊ４）、（ｌ４）、（ｍ４）及び（ｎ４）の酵素、からなる群より選択された少なくとも１つと、を有する、［Ｂ１］～［Ｂ６］のいずれか１つに記載の微生物：（ａ４）ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸カルボキシラーゼと、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼと、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼと、からなる群より選択された少なくとも１つ、（ｂ４）ピルビン酸カルボキシラーゼ、（ｃ４）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、（ｄ４）マレートチオキナーゼ、（ｅ４）マリルＣｏＡリアーゼ、（ｆ４）グリシントランスアミナーゼ、（ｇ４）グリシン開裂系及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、（ｈ４）セリンデヒドラターゼ、（ｉ４）セリントランスアミナーゼ、（ｊ４）ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ、（ｋ４）グリセリン酸２－キナーゼ、（ｌ４）グリセリン酸３－キナーゼ、（ｍ４）ホスホグリセリン酸ムターゼ、（ｎ４）エノラーゼ。
　［Ｂ８］　前記（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）、（ｄ２）及び（ｅ２）のいずれも有していない微生物が、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・テレウス又はカプリアビダス・ネカトールである、［Ｂ１］～［Ｂ７］のいずれか１つに記載の微生物。
　［Ｂ９］　［Ｂ１］～［Ｂ８］のいずれか１つに記載の微生物と、炭素源材料とを接触させて培養を行う培養工程と、前記接触により得られた目的生産物を回収する回収工程と、を含む、アセチルＣｏＡ生産方法。
　［Ｂ１０］　さらに、炭酸イオン、炭酸水素イオン、二酸化炭素ガス及び還元剤からなる群より選択された少なくとも１種を、培養に用いる培地に供給する供給工程を含む、［Ｂ９］に記載のアセチルＣｏＡ生産方法。
　［Ｂ１１］　さらに、培養によって発生した二酸化炭素を含む気体を回収して、培養に用いる培地に該気体を供給する気体供給工程を含む、［Ｂ９］又は［Ｂ１０］に記載のアセチルＣｏＡ生産方法。
　［Ｂ１２］　［Ｂ１］～［Ｂ８］のいずれか１つに記載の微生物を用いて、炭素源材料からクエン酸を生産することを含む、クエン酸生産方法。
　［Ｂ１３］　［Ｂ１］～［Ｂ８］のいずれか１つに記載の微生物を用いて、炭素源材料からイタコン酸を生産することを含む、イタコン酸生産方法。
　［Ｂ１４］　［Ｂ１］～［Ｂ８］のいずれか１つに記載の微生物を用いて、炭素源材料から（ポリ）３－ヒドロキシ酪酸を生産することを含む、（ポリ）３－ヒドロキシ酪酸生産方法。
　第一の発明によれば、二酸化炭素を利用してアセチルＣｏＡを効率的に生成するために有用な微生物が提供される。また、第一の発明によれば、前記微生物を用いて、アセチルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡに由来する有用な代謝産物を高収率に製造する方法が提供される。
　第二の発明によれば、アセチルＣｏＡを経由して二酸化炭素を効率よく有用な代謝産物へと変換できる、アスペルギルス属菌又はカプリアビダス属菌の微生物が提供される。また、第二の発明によれば、前記微生物を用いた有用な代謝産物の製造方法が提供される。
第一の発明に係る二酸化炭素固定回路（即ちアセチルＣｏＡ生産回路）の概要を説明する回路図である。 第二の発明に係るグリシン経路の概要を説明する経路図である。
　以下に、本発明の実施の形態について説明する。これらの説明及び実施例は、本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
　本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
　本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
　本発明において、組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
≪第一の発明≫
　第一の発明に係るアセチルＣｏＡ生産微生物は、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれも有していない微生物に、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のいずれも付与せず、又は下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ以上を付与してもその機能を発揮させずに、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性を付与することにより得られたアセチルＣｏＡ生産回路を有する微生物であって、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ、ヒドロキシピルビン酸イソメラーゼ、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ、グリセリン酸２－キナーゼ、グリセリン酸３－キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ及びエノラーゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性が強化され、且つ／又は、リンゴ酸酵素及びフマル酸レダクターゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性が不活化又は低減されたアセチルＣｏＡ生産微生物である。
（ａ）マロニルＣｏＡからマロン酸セミアルデヒド又は３－ヒドロキシプロピオン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路。
（ｂ）アセチルＣｏＡとＣＯ２からピルビン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路。
（ｃ）クロトニルＣｏＡとＣＯ２からエチルマロニルＣｏＡ又はグルタコニルＣｏＡへの酵素反応を有する炭酸固定回路。
（ｄ）ＣＯ２からギ酸への酵素反応を有する炭酸固定回路。
（ｅ）マレートチオキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼからなる群より選択された少なくとも１種。
　第一の発明に係る微生物は、所定の酵素活性が付与されたことにより、糖代謝において発生するＣＯ２及び外部から供給されたＣＯ２をアセチルＣｏＡへと変換しうる二酸化炭素固定回路を有し、さらに、所定の酵素活性が強化され、且つ／又は、所定の酵素活性が不活化又は低減されたことにより、ＣＯ２をアセチルＣｏＡへと効率的に変換しうる。
　第一の発明に係るアセチルＣｏＡ生産方法の一態様は、第一の発明に係る微生物を用いて、ＣＯ２をアセチルＣｏＡへと効率よく変換しうるアセチルＣｏＡ生産方法である。
　第一の発明に係るアセチルＣｏＡ生産方法の別の一態様は、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれも有していない微生物に、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のいずれも付与せず、又は前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ以上を付与してもその機能を発揮させずに、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性を付与することにより得られたアセチルＣｏＡ生産回路を有するアセチルＣｏＡ生産微生物を培養する培養工程と、全供給量が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上の炭酸イオン又は炭酸水素イオン、平均気泡径が１００μｍ以上である二酸化炭素ガス、及び全供給量が０．０１ｇ／Ｌ以上５０ｇ／Ｌ以下の亜硫酸ナトリウムからなる群より選択された少なくとも１つを、培養に用いる培地に供給する供給工程と、を含むアセチルＣｏＡ生産方法である。
　上記別の一態様によれば、二酸化炭素固定回路が構築された微生物を用いて、炭酸イオン、炭酸水素イオン、二酸化炭素ガス、及び亜硫酸ナトリウムからなる群より選択された少なくとも１種を培地に供給することで、効率的にアセチルＣｏＡを生産することができる。
　第一の発明に係る微生物又は生産方法を利用することにより、また当該微生物に対して所定の酵素活性をさらに付与することにより、アセチルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡに由来する有用な代謝産物（例えば、イソプロピルアルコール、エタノール、アセトン、クエン酸、イタコン酸、酢酸、酪酸、（ポリ）３－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシイソ酪酸、３－アミノイソ酪酸、２－ヒドロキシイソ酪酸、メタクリル酸、（ポリ）グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、オルニチン、シトルリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン等）を効率よく生産することができる。
≪第二の発明≫
　第二の発明に係る微生物は、下記（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）、（ｄ２）及び（ｅ２）のいずれも有していない微生物に、下記（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）及び（ｄ２）のいずれも付与せず、又は下記（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）及び（ｄ２）の１つ以上を付与してもその機能を発揮させずに、マレートチオキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性を付与することにより得られた、アスペルギルス属菌又はカプリアビダス属菌の微生物である。
（ａ２）マロニルＣｏＡからマロン酸セミアルデヒド又は３－ヒドロキシプロピオン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路。
（ｂ２）アセチルＣｏＡとＣＯ２からピルビン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路。
（ｃ２）クロトニルＣｏＡとＣＯ２からエチルマロニルＣｏＡ又はグルタコニルＣｏＡへの酵素反応を有する炭酸固定回路。
（ｄ２）ＣＯ２からギ酸への酵素反応を有する炭酸固定回路。
（ｅ２）マレートチオキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼからなる群より選択された少なくとも１種。
　第二の発明に係る微生物は、所定の酵素反応を含む経路を有するため、糖代謝において発生するＣＯ２及び外部から供給されたＣＯ２を効率的に固定化しうる。また、第二の発明に係る微生物は、ＣＯ２を効率よくアセチルＣｏＡへと変換しうる。
　第二の発明に係るアセチルＣｏＡ生産方法は、第二の発明に係る微生物を用いて、ＣＯ２をアセチルＣｏＡへと効率よく変換しうるアセチルＣｏＡ生産方法である。
　第二の発明に係る微生物又は生産方法を利用することにより、また当該微生物に対して所定の酵素活性をさらに付与することにより、アセチルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡに由来する有用な代謝産物（例えば、クエン酸、イタコン酸、（ポリ）３－ヒドロキシ酪酸、プロリン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、シトルリン、オルニチン、酢酸、（ポリ）３－ヒドロキシ酪酸、イタコン酸、クエン酸、酪酸、ポリグルタミン酸、４－アミノ酪酸、４－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシイソ酪酸、２－ヒドロキシイソ酪酸、３－アミノイソ酪酸等）を効率よく生産することができる。
　以下に、本明細書及び本発明において使用される用語の意味を説明する。
　本明細書において「回路」とは、経路上の任意の物質から開始して、経路を経由して別の物質へと変換され、最終的に開始と同じ物質へと変換される経路を指す。
　本明細書において「経路」とは、発酵槽内における、酵素反応及び／又は自発的な化学反応による、１連の反応を指す。経路は回路であってもよく、回路でなくてもよい。したがって、炭酸固定経路には炭酸固定回路が包含される。
　本発明における「二酸化炭素（ＣＯ２）固定」とは、糖代謝において発生するＣＯ２及び／又は外部から供給されたＣＯ２を有機化合物へ変換することを指す。ＣＯ２はＨＣＯ３ －であってもよい。本明細書では「二酸化炭素（ＣＯ２）固定」を「炭酸固定」と言うことがある。
　本発明における「酵素」には、特に断らない限り、単独では酵素活性を示さない「因子」も含まれる。
　本発明における酵素活性の「不活化」とは、既存のあらゆる測定系によって測定された酵素活性が、不活化前の微生物での酵素活性を１００としたときの１／１０以下である状態を指す。
　本発明における酵素活性の「低減」とは、酵素をコードする遺伝子に対して遺伝子組換え技術により処理を行った際、その処理を行う前の状態よりも有意に酵素活性が低下している状態を指す。
　本発明における酵素活性の「強化」とは、強化前の微生物での酵素活性が強化後に高まることを広く意味する。強化の方法としては、微生物が有している酵素の活性が高まれば特に制限はなく、酵素遺伝子を細胞外から細胞内に導入することによる強化、細胞内の酵素遺伝子の発現を増強することによる強化、及びこれらの組合せを挙げることができる。
　酵素遺伝子を細胞外から細胞内に導入することによる強化としては、具体的には、宿主が本来有する酵素よりも高活性の酵素をコードする遺伝子を、遺伝子組換え技術により、宿主の細胞外から細胞内に導入して、導入された酵素遺伝子による酵素活性を追加すること又は宿主が本来有する酵素活性と置換すること；宿主が本来有する酵素遺伝子の数、又は細胞外から細胞内に導入した酵素遺伝子の数を増加させること；及びこれらの組合せを挙げることができる。
　細胞内の酵素遺伝子の発現を増強することによる強化としては、具体的には、酵素遺伝子の発現を増強する塩基配列を宿主の細胞外から細胞内に導入すること；宿主がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化することによって酵素遺伝子の発現を強化させること；宿主がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーターを他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子の発現を強化させること；及びこれらの組合せを挙げることができる。
　本発明における酵素活性の「付与」とは、対象となる酵素活性を見出せない微生物に対して、酵素遺伝子を細胞外から細胞内に導入し、対象となる酵素活性を与えることを広く意味する。付与の方法は、微生物に対象となる酵素活性が与えられれば特に制限はなく、遺伝子組換え技術により行うことができる。具体的には、酵素遺伝子を保有するプラスミドによる形質転換；酵素遺伝子のゲノムへの導入；及びこれらの組合せを挙げることができる。導入される酵素遺伝子は、宿主細胞に対して同種又は異種のいずれであってもよい。
　物質代謝の回路又は経路に係る酵素活性の「付与」とは、酵素活性を付与した結果、物質代謝の回路又は経路が機能的に構築されることを意味し、宿主に応じて、付与の方法を選択することができる。
　本明細書において、炭酸固定回路を「付与してもその機能を発揮させずに（しない）」とは、対象となる酵素活性を見出せない微生物に対して、酵素遺伝子を外部から導入し、対象となる酵素活性を与えるが、炭酸固定回路が機能していないことを指す。「炭酸固定回路が機能してしない」ことは、ラベルされたＣＯ２を用いた試験で、回路中の代謝産物又はそれら代謝産物に由来する物質にＣＯ２由来のラベルが検出されない、又は回路中の代謝産物に由来する物質の対糖収率等の上昇が見られない等により間接的に把握することができる。
　酵素活性の「強化」又は「付与」で用いられるプロモーターとしては、遺伝子を発現できるものであれば特に制限はなく、構成型プロモーター又は誘導型プロモーターを使用することができる。
　対象となる酵素遺伝子を微生物が有しているか否かを判断する手段としては、例えば、ＫＥＧＧ（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, http://www.genome.jp/kegg/）、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）に登録されている微生物の遺伝子情報を参照することが挙げられる。本発明では、ＫＥＧＧ又はＮＣＢＩに登録されている微生物の遺伝子情報のみを用いることとする。
　細胞外から細胞内へ遺伝子を導入する際に必要なゲノムＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)などに記載されている。
　本発明における「遺伝子組換え技術により」等との文言は、生来の遺伝子に対する別のＤＮＡの挿入、遺伝子のある部分の置換若しくは欠失、又はこれらの組合せによって、塩基配列の変更を生じさせること全てを包含し、例えば、突然変異が生じた結果であってもよい。
　本発明において因子又は酵素の活性が不活化された微生物とは、何らかの方法によって、因子又は酵素の生来の活性が損なわれた微生物を指す。該微生物は、例えば因子又は酵素をコードする遺伝子を破壊すること（遺伝子破壊）により作出することができる。
　本発明における遺伝子破壊としては、遺伝子の機能が発揮されないようにするために、遺伝子に別のＤＮＡを挿入すること、遺伝子のある部分の置換若しくは欠失により塩基配列に変異を入れること、が挙げられる。遺伝子破壊の結果、例えば、遺伝子がｍＲＮＡへ転写されずタンパク質が翻訳されなくなったり、転写されたｍＲＮＡが不完全なために翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列に変異又は欠失が生じて本来の機能の発揮が不可能になる。
　遺伝子破壊株の作製は、酵素又はタンパク質が発現しない破壊株が得られればいかなる方法を用いてもよい。遺伝子破壊の方法は種々の方法（自然育種、変異剤添加、紫外線照射、放射線照射、ランダム突然変異の導入、トランスポゾンの挿入又は転移、部位特異的遺伝子破壊）が報告されているが、特定の遺伝子のみ破壊できるという点で、相同組換えによる遺伝子破壊が好ましい。相同組換えによる手法は、Journal of Bacteriology, 1985; 161(3): 1219-1221、Journal of Bacteriology, 1995; 177(6): 1511-1519、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000; 97(12): 6640-6645に記載されており、これらの方法及びその応用によって当業者であれば容易に実施可能である。
　本発明における「（生来）有していない」とは、宿主である微生物が自然界において本来的に有していないことを意味する。
　本発明における「宿主」とは、１個又は複数個の遺伝子が外部から導入される対象となる微生物を意味する。
　本発明において「宿主」は、１個又は複数個の遺伝子が外部から導入された結果、その遺伝子の機能を発揮しうる状態になる。
　本発明における「宿主」は、有用な代謝産物の生産経路を備えていてもよい。本発明における「有用な代謝産物」とは、アルコール、アミノ酸、有機酸、テルペン類等の、微生物の代謝経路における主な代謝産物の総称を意味する。「宿主」は、有用な代謝産物を生産する能力を本来有するか否かにかかわらず、何らかの手段を用いることにより有用な代謝産物を生産する能力を有し得る微生物であればよい。
　本明細書で言及する酵素の分類は、国際生化学連合（International Union of Biochemistry；ＩＵＢ）酵素委員会報告に準拠した分類であり、「酵素番号」は、ＩＵＢ酵素委員会報告に準拠した酵素番号である。
　第一の発明に関して「アセチルＣｏＡを中間体とする代謝産物」及び「アセチルＣｏＡに由来する（有用な）代謝産物」とは、代謝経路上でアセチルＣｏＡを経由して生産される、（有用な）代謝産物の総称を意味する。アルコールとして、例えば、イソプロピルアルコール、エタノール、ブタノールが挙げられる。アミノ酸として、例えば、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－オルニチン、Ｌ－シトルリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－プロリンが挙げられる。有機酸として、例えば、３－ヒドロキシ酪酸、ポリ－３－ヒドロキシ酪酸、ポリグルタミン酸、３－ヒドロキシイソ酪酸、３－アミノイソ酪酸、２－ヒドロキシイソ酪酸、メタクリル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、カプロン酸、メバロン酸が挙げられる。テルペン類として、例えば、イソプレン、スクアレン、ステロイド、カロテノイドが挙げられる。ほかに、アセトンが挙げられる。
　第二の発明に関して「アセチルＣｏＡを中間体とする代謝産物」及び「アセチルＣｏＡに由来する（有用な）代謝産物」とは、代謝経路上でアセチルＣｏＡを経由して生産される、（有用な）代謝産物の総称を意味する。有機酸として、例えば、クエン酸、イタコン酸、（ポリ）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。この他に、３－ヒドロキシ酪酸、ポリグルタミン酸、３－ヒドロキシイソ酪酸、３－アミノイソ酪酸、２－ヒドロキシイソ酪酸、メタクリル酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、カプロン酸、メバロン酸も挙げられる。
　本発明における「アセチルＣｏＡ（の）生産」とは、代謝経路上で、何らかの物質をアセチルＣｏＡへと変換することを意味する。アセチルＣｏＡは代謝中間体で、代謝経路上で様々な物質へと速やかに変換されるため、見かけのアセチルＣｏＡ量は必ずしも増加するとは限らないが、アセチルＣｏＡに由来する物質にＣＯ２由来のラベルが検出される、又はアセチルＣｏＡに由来する物質の対糖収率等が上昇する等により、間接的に効果を把握することができる。アセチルＣｏＡから他物質への変換に関与する要因は様々存在するため（補酵素量、基質量、フィードバック阻害等による代謝変化、など）、アセチルＣｏＡ生産量が全アセチルＣｏＡ由来物質量に必ずしも比例するわけではない。ただし、アセチルＣｏＡからある特定物質への生産経路を強化するか、アセチルＣｏＡからある特定物質への生産経路がもともと強い場合（例えば、後述するグルタミン酸生産微生物の場合）は、アセチルＣｏＡから下流の変換効率が外的要因に左右されにくいため、その特定物質の生産効率をアセチルＣｏＡ生産効率の指標とみなせる。
　以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
≪アセチルＣｏＡ生産微生物≫
　第一の発明に係るアセチルＣｏＡ生産微生物は、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれも有していない微生物に、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のいずれも付与せず、又は前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ以上を付与してもその機能を発揮させずに、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性を付与することにより得られたアセチルＣｏＡ生産回路を有する微生物であって、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ、ヒドロキシピルビン酸イソメラーゼ、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ、グリセリン酸２－キナーゼ、グリセリン酸３－キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ及びエノラーゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性が強化され、且つ／又は、リンゴ酸酵素及びフマル酸レダクターゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性が不活化又は低減されたアセチルＣｏＡ生産微生物である。
　第一の発明に係る微生物は、アセチルＣｏＡの生産効率の観点で、マレートチオキナーゼの酵素活性が付与されていることが好ましく、マレートチオキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼの酵素活性が付与されていることがより好ましく、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ及びグリオキシル酸カルボリガーゼの酵素活性が付与されていることがより好ましく、マレートチオキナーゼと、マリルＣｏＡリアーゼと、グリオキシル酸カルボリガーゼと、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ及び／又はヒドロキシピルビン酸レダクターゼと、の酵素活性が付与されていることが更に好ましい。
　第一の発明に係る微生物は、ＣＯ２を固定してアセチルＣｏＡへと変換する、簡潔で実用的なアセチルＣｏＡの生産回路を有する。当該回路を図１を用いて詳細に説明する。
　図１に示すアセチルＣｏＡ生産回路は、第一の発明におけるアセチルＣｏＡ生産回路の好ましい一態様を示す（以下「図１の回路」と称する場合がある。）。
　図１に記載されているように、アセチルＣｏＡ生産回路は、下記（ｆ）～（ｍ）を含む。
（ｆ）ピルビン酸キナーゼ（Ｐｙｋ）及びピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｙｃ）と、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｐｃ）と、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Ｐｃｋ）と、からなる群より選択された少なくとも１つ。
（ｇ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｍｄｈ）。
（ｈ）マレートチオキナーゼ（Ｍｔｋ）。
（ｉ）マリルＣｏＡリアーゼ（Ｍｃｌ）。
（ｊ）グリオキシル酸カルボリガーゼ（Ｇｃｌ）。
（ｋ）２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ（ＧｌｘＲ）と、ヒドロキシピルビン酸イソメラーゼ（Ｈｙｉ）及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ＹｃｄＷ）と、からなる群より選択された少なくとも１つ。
（ｌ）グリセリン酸２－キナーゼ（ＧａｒＫ）と、グリセリン酸３－キナーゼ（ＧｌｘＫ）及びホスホグリセリン酸ムターゼ（Ｇｐｍ）と、からなる群より選択された少なくとも１つ。
（ｍ）エノラーゼ（Ｅｎｏ）。
　本発明において、アセチルＣｏＡ生産回路は、本質的に前記（ｆ）～（ｍ）のみを含むことが好ましく、本発明の微生物が有するアセチルＣｏＡ生産回路は、前記（ｆ）～（ｍ）のみからなるアセチルＣｏＡ生産回路であることが好ましい。
　上記の酵素の中で、Ｐｙｃ、Ｐｐｃ、ＰｃｋがＣＯ２の固定を担う。ＣＯ２は、Ｐｐｃ、Ｐｃｋ、又はＰｙｃの作用で、ホスホエノールピルビン酸又はピルビン酸と結合し、オキサロ酢酸へと変換される。オキサロ酢酸は、Ｍｄｈの作用によりリンゴ酸へと変換される。リンゴ酸は、Ｍｔｋの作用でマリルＣｏＡ（リンゴ酸ＣｏＡ）へと変換される。マリルＣｏＡ（リンゴ酸ＣｏＡ）は、Ｍｃｌの作用でアセチルＣｏＡとグリオキシル酸に変換される。グリオキシル酸は、Ｇｃｌの作用で２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸へと変換される。２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸は、ＧｌｘＲの作用でグリセリン酸へと変換されるか、又は、Ｈｙｉの作用でヒドロキシピルビン酸へと変換されてからＹｃｄＷの作用でグリセリン酸へと変換される。グリセリン酸は、ＧａｒＫの作用で２－ホスホグリセリン酸へと変換されるか、又は、ＧｌｘＫの作用で３－ホスホグリセリン酸へと変換されてからＧｐｍの作用で２－ホスホグリセリン酸へと変換される。２－ホスホグリセリン酸は、Ｅｎｏの作用でホスホエノールピルビン酸へと変換される。回路にＰｙｋ及びＰｙｃが含まれる場合、Ｐｙｋの作用でホスホエノールピルビン酸はピルビン酸へと変換される。
　第二の発明に係る微生物は、前記（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）、（ｄ２）及び（ｅ２）のいずれも有していない微生物に、前記（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）及び（ｄ２）のいずれも付与せず、又は前記（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）及び（ｄ２）の１つ以上を付与してもその機能を発揮させずに、マレートチオキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性を付与することにより得られた、アスペルギルス属菌又はカプリアビダス属菌の微生物である。前記（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）、（ｄ２）及び（ｅ２）は、それぞれ、第一の発明における前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）と同義である。
　第二の発明に係る微生物の好ましい一態様として、グリシンを経由する経路（以下「グリシン経路」と称する場合がある。）を有する微生物を説明する。当該微生物は、グリシントランスアミナーゼ及びグリシン開裂系からなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性を有する。グリシン経路を図２を用いて説明する。
　図２に記載されているように、グリシン経路は、下記（ａ３）及び（ｂ３）からなる群より選択された少なくとも１つの酵素反応と、下記（ｃ３）、（ｄ３）、（ｅ３）、（ｆ３）及び（ｇ３）の酵素反応と、下記（ｈ３）の酵素反応、下記（ｉ３）、（ｊ３）、（ｋ３）及び（ｎ３）の酵素反応、並びに下記（ｉ３）、（ｊ３）、（ｌ３）、（ｍ３）及び（ｎ３）の酵素反応、からなる群より選択された少なくとも１つと、を有する。
（ａ３）ホスホエノールピルビン酸からオキサロ酢酸への酵素反応。
（ｂ３）ピルビン酸からオキサロ酢酸への酵素反応。
（ｃ３）オキサロ酢酸からリンゴ酸への酵素反応。
（ｄ３）リンゴ酸からマリルＣｏＡへの酵素反応。
（ｅ３）マリルＣｏＡからグリオキシル酸及びアセチルＣｏＡへの酵素反応。
（ｆ３）グリオキシル酸からグリシンへの酵素反応。
（ｇ３）グリシンからセリンへの酵素反応。
（ｈ３）セリンからピルビン酸への酵素反応。
（ｉ３）セリンから３－ヒドロキシピルビン酸への酵素反応。
（ｊ３）３－ヒドロキシピルビン酸からグリセリン酸への酵素反応。
（ｋ３）グリセリン酸から２－ホスホグリセリン酸への酵素反応。
（ｌ３）グリセリン酸から３－ホスホグリセリン酸への酵素反応。
（ｍ３）３－ホスホグリセリン酸から２－ホスホグリセリン酸への酵素反応。
（ｎ３）２－ホスホグリセリン酸からホスホエノールピルビン酸への酵素反応。
　前記（ａ３）としては、例えば、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼによる反応、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼによる反応、ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸カルボキシラーゼによる反応、のいずれかを介した酵素反応が挙げられる。
　前記（ｂ３）としては、例えば、ピルビン酸カルボキシラーゼを介した酵素反応が挙げられる。
　前記（ｃ３）としては、例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを介した酵素反応が挙げられる。
　前記（ｄ３）としては、例えば、マレートチオキナーゼを介した酵素反応が挙げられる。
　前記（ｅ３）としては、例えば、マリルＣｏＡリアーゼを介した酵素反応が挙げられる。
　前記（ｆ３）としては、例えば、グリシントランスアミナーゼを介した酵素反応が挙げられる。
　前記（ｇ３）としては、例えば、グリシン開裂系及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを介した酵素反応が挙げられる。
　前記（ｈ３）としては、例えば、セリンデヒドラターゼを介した酵素反応が挙げられる。
　前記（ｉ３）としては、例えば、セリントランスアミナーゼを介した酵素反応が挙げられる。
　前記（ｊ３）としては、例えば、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼを介した酵素反応が挙げられる。
　前記（ｋ３）としては、例えば、グリセリン酸２－キナーゼを介した酵素反応が挙げられる。
　前記（ｌ３）としては、例えば、グリセリン酸３－キナーゼを介した酵素反応が挙げられる。
　前記（ｍ３）としては、例えば、ホスホグリセリン酸ムターゼを介した酵素反応が挙げられる。
　前記（ｎ３）としては、例えば、エノラーゼを介した酵素反応が挙げられる。
　グリシン経路において、セリンからピルビン酸への変換は、セリンから直接的に変換する酵素反応（前記（ｈ３）の反応）でも、３－ヒドロキシピルビン酸を経由して変換する酵素反応（前記（ｉ３）及びその下流を含む反応）でも、いずれでもよい。
　セリンからピルビン酸への変換が、３－ヒドロキシピルビン酸を経由して変換する酵素反応（前記（ｉ３）及びその下流を含む反応）である場合、グリセリン酸から２－ホスホグリセリン酸への変換は、グリセリン酸から直接的に変換する酵素反応（前記（ｋ３）の反応）でも、３－ホスホグリセリン酸を経由して変換する酵素反応（前記（ｌ３）及び（ｍ３）を含む反応）でも、いずれでもよい。
　第二の発明に係る微生物の好ましい一態様は、下記（ａ４）及び（ｂ４）からなる群より選択された少なくとも１つの酵素と、下記（ｃ４）、（ｄ４）、（ｅ４）、（ｆ４）及び（ｇ４）の酵素と、下記（ｈ４）の酵素、下記（ｉ４）、（ｊ４）、（ｋ４）及び（ｎ４）の酵素、並びに下記（ｉ４）、（ｊ４）、（ｌ４）、（ｍ４）及び（ｎ４）の酵素、からなる群より選択された少なくとも１つと、を有する。
（ａ４）ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸カルボキシラーゼと、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼと、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼと、からなる群より選択された少なくとも１つ。
（ｂ４）ピルビン酸カルボキシラーゼ。
（ｃ４）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ。
（ｄ４）マレートチオキナーゼ。
（ｅ４）マリルＣｏＡリアーゼ。
（ｆ４）グリシントランスアミナーゼ。
（ｇ４）グリシン開裂系及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ。
（ｈ４）セリンデヒドラターゼ。
（ｉ４）セリントランスアミナーゼ。
（ｊ４）ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ。
（ｋ４）グリセリン酸２－キナーゼ。
（ｌ４）グリセリン酸３－キナーゼ。
（ｍ４）ホスホグリセリン酸ムターゼ。
（ｎ４）エノラーゼ。
　以下に、図１の回路及び図２のグリシン経路における物質変換を、詳しく説明する。
　ピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｙｃ）及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｐｃ）は、炭酸固定酵素の中で活性の高い部類に属する。例えば、植物等の光合成で利用されるＲｕｂｉｓＣＯの比活性が３～２０Ｕ／ｍｇ程度であるのに対し（Journal of Biological Chemistry, 1999; 274(8): 5078-5082、Salvucci M. E. at al., Analytical Biochemistry, 1986; 153(1): 97-101）、ピルビン酸カルボキシラーゼ又はホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、大腸菌で３０Ｕ／ｍｇ、高いものでは１００～１５０Ｕ／ｍｇが報告されている（Journal of Biological Chemistry, 1972; 247(18): 5785-5792、Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1995; 59(1): 140-142、Biochimica et Biophysica Acta, 2000; 1475(3): 191-206）。
　しかも、図１の回路及び図２のグリシン経路はアセチルＣｏＡを消費する酵素を含まない。したがって図１の回路及び図２のグリシン経路は、ＣＯ２を固定してアセチルＣｏＡへと変換するための、理想的な回路といえる。
　前記アセチルＣｏＡを消費する酵素とは、アセチルＣｏＡを基質として別の物質と変換する酵素を指し、例えばアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン酸シンターゼが挙げられる。前記アセチルＣｏＡを消費する酵素を回路中に有しないとは、アセチルＣｏＡを消費する酵素によりアセチルＣｏＡが、回路を経由して再びアセチルＣｏＡへと戻るような、閉じた回路になっていないことを指す。なお、アセチルＣｏＡを消費する酵素により変換された物質が、アセチルＣｏＡに戻ることなく別の生産物へと変換される場合（例えば、グルタミン酸生産経路で、最終産物としてグルタミン酸に変換される場合）、閉じた回路ではないため、「アセチルＣｏＡを消費する酵素を含む回路」には含まれない。閉じた回路とは、回路上の任意の物質から開始して、該回路を経由して別の物質へと変換され、最終的に最初と同じ物質へと変換される回路を指す。
　アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、酵素番号６．４．１．２に分類され、アセチルＣｏＡとＣＯ２からマロニルＣｏＡへと変換する酵素の総称を指す。
　ピルビン酸シンターゼは、酵素番号１．２．７．１に分類され、アセチルＣｏＡをピルビン酸へと変換する酵素の総称を指す。
　さらに、図１の回路及び図２のグリシン経路の利点として、これらは解糖系とは独立しているので、ほかの様々な解糖系経路との組合せが可能なことも挙げられる。例えば、ペントース・リン酸経路はＮＡＤＰＨの生産量が高いため、物質生産にしばしば用いられるところ（特表２００７－５１０４１１号公報）、図１の回路及び図２のグリシン経路とは独立しており、容易に組み合わせることができる。
　図１の回路において、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｍｄｈ）、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ（ＧｌｘＲ）及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ＹｃｄＷ）は、ＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）を還元力として消費する。マレートチオキナーゼ（Ｍｔｋ）、グリセリン酸２－キナーゼ（ＧａｒＫ）、グリセリン酸３－キナーゼ（ＧｌｘＫ）及びピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｙｃ）は、ＡＴＰを消費する。ピルビン酸キナーゼ（Ｐｙｋ）はピルビン酸を生産する。
　したがって、図１の回路の収支は、ホスホエノールピルビン酸を出発物質とする場合、「ホスホエノールピルビン酸＋２ＣｏＡ＋ＣＯ２＋３ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋３ＡＴＰ→２アセチルＣｏＡ＋３ＮＡＤ（Ｐ）＋＋３ＡＤＰ」である。ピルビン酸を出発物質とする場合、「ピルビン酸＋２ＣｏＡ＋ＣＯ２＋３ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋４ＡＴＰ→２アセチルＣｏＡ＋３ＮＡＤ（Ｐ）＋＋４ＡＤＰ」である。
　すなわち、図１の回路は、ＣＯ２を固定してアセチルＣｏＡへと変換する際、ホスホエノールピルビン酸（又はピルビン酸）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＡＴＰの供給を必要とする。
　図２のグリシン経路において、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｍｄｈ）及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ＹｃｄＷ）は、ＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）を還元力として消費する。グリオキシル酸がグリシンに変換される際、グリシンデヒドロゲナーゼにより直接的に、又はグリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ等のアミノトランスフェラーゼにより他のアミノ酸を介して間接的に、ＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）一個分に相当する還元力を消費する。グリシン開裂系は、ＮＡＤ＋（又はＮＡＤＰ＋）を消費してＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）へと変換する。セリンが３－ヒドロキシピルビン酸に変換される際、セリンデヒドロゲナーゼにより直接的に、又はセリンアミノトランスフェラーゼ等のアミノトランスフェラーゼにより他のアミノ酸を介して間接的に、ＮＡＤ＋（又はＮＡＤＰ＋）が消費されて、ＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）へと変換される。
　マレートチオキナーゼ（Ｍｔｋ）、グリセリン酸２－キナーゼ（ＧａｒＫ）、グリセリン酸３－キナーゼ（ＧｌｘＫ）及びピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｙｃ）は、ＡＴＰを消費する。アンモニアが代謝系に取り込まれる際、ＡＴＰが消費される場合もある。ピルビン酸キナーゼ（Ｐｙｋ）は、ＡＴＰを生産する。
　したがって、図２の経路の収支は、ホスホエノールピルビン酸を出発物質とする場合、「ホスホエノールピルビン酸＋２ＣｏＡ＋ＣＯ２＋３ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋３～５ＡＴＰ→２アセチルＣｏＡ＋３ＮＡＤ（Ｐ）＋＋３～５ＡＤＰ」である。ピルビン酸を出発物質とする場合、「ピルビン酸＋２ＣｏＡ＋ＣＯ２＋３ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋４～６ＡＴＰ→２アセチルＣｏＡ＋３ＮＡＤ（Ｐ）＋＋４～６ＡＤＰ」である。
　アセチルＣｏＡを中間体とする発酵経路の中で、発酵中に酸素を消費する経路の収支式を表１に記載した。これらの発酵においては、発酵経路上でＮＡＤＨなどの還元型補酵素が生成され、それが酸素の作用により酸化型補酵素へと戻される、という現象が起こっていると想定される。そこで、もし、生成される還元型補酵素を、酸素に代わって図１の回路及び図２のグリシン経路によって消費できれば、発酵中に生成される還元力をアセチルＣｏＡ生産回路で有効利用でき、ＣＯ２を固定して生産物へと変換できると期待される。
　上記の還元型補酵素とは、例えばＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤＨ２、ＦＭＮＨ２、還元型キノン補酵素等の酸化還元に関与する補酵素であり、且つそれが還元状態である補酵素を指す。上記の還元型補酵素として、好ましくはＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ、より好ましくはＮＡＤＨを指す。上記の酸化型補酵素とは、還元型補酵素の酸化型で、例えばＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ＦＡＤ、ＦＭＮ、酸化型キノン補酵素等であり、好ましくはＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋、より好ましくはＮＡＤ＋を指す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１のように、発酵式の左辺に酸素が存在する発酵では、しばしば酸素が大量に必要とされるが、そのためには大量の通気や強力な攪拌が要求されることがあり、設備費や電力費の増大につながる。図１の回路又は図２のグリシン経路を物質生産系に導入すれば、余剰の還元力を酸素に代わって消費するので、過剰な通気攪拌を緩和でき、発酵生産の費用を削減できると期待される。
　図１の回路又は図２のグリシン経路の還元力を補うために、還元力を生産できる物質を加えたり、外部からエネルギーを与えることで、還元力を与えてもよい。例えば、還元度の高い物質（例えば、水素、亜硫酸塩、アルコール類、パラフィン）を基質として利用する、電気培養で還元エネルギーを直接供給する、生物の光化学反応で還元力を供給する、などの手段が挙げられる。外部から還元力を補給できれば、表１のように還元型補酵素が発生する発酵でない場合でも、本発明の炭酸固定経路を駆動させることは可能である。
　以下に、図１の回路及び図２のグリシン経路に含まれる酵素を詳しく説明する。
　ピルビン酸キナーゼ（Ｐｙｋ）は、酵素番号２．７．１．４０に分類され、ホスホエノールピルビン酸とＡＤＰからピルビン酸とＡＴＰを生成する酵素の総称を指す。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌に由来のものが挙げられる。
　ピルビン酸キナーゼの遺伝子（ｐｙｋ）としては、上述した微生物から得られるピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
　ピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｙｃ）は、酵素番号６．４．１．１に分類され、ピルビン酸と二酸化炭素をオキサロ酢酸へと変換する酵素の総称を指す。反応の際、ＡＴＰを消費し、ＡＤＰとリン酸を生成する。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、マイコバクテリウム・スメグマティス（Mycobacterium smegmatis）等のマイコバクテリウム属細菌に由来のものが挙げられる。
　ピルビン酸カルボキシラーゼの遺伝子（ｐｙｃ）としては、上述した微生物から得られるピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、マイコバクテリウム・スメグマティス（Mycobacterium smegmatis）等のマイコバクテリウム属細菌に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
　ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｐｃ）は、酵素番号４．１．１．３１に分類され、ホスホエノールピルビン酸と二酸化炭素をオキサロ酢酸とリン酸へと変換する酵素の総称を指す。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌、ハイホマイクロビウム・メチロボラム（Hyphomicrobium methylovorum）等のハイホマイクロビウム属細菌、スタルケヤ・ノベラ（Starkeya novella）等のスタルケヤ属細菌、ロドシュードモナス・エスピー（Rhodopseudomonas sp.）等のロドシュードモナス属細菌、ストレプトマイセス・コエリカラ（Streptomyces coelicolor）等のストレプトマイセス属細菌に由来のものが挙げられる。
　ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの遺伝子（ｐｐｃ）としては、上述した微生物から得られるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌、ハイホマイクロビウム・メチロボラム（Hyphomicrobium methylovorum）等のハイホマイクロビウム属細菌、スタルケヤ・ノベラ（Starkeya novella）等のスタルケヤ属細菌、ロドシュードモナス・エスピー（Rhodopseudomonas sp.）等のロドシュードモナス属細菌、ストレプトマイセス・コエリカラ（Streptomyces coelicolor）等のストレプトマイセス属細菌に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
　ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Ｐｃｋ）は、酵素番号４．１．１．３２、酵素番号４．１．１．３８、酵素番号４．１．１．４９、に分類され、ホスホエノールピルビン酸と二酸化炭素をオキサロ酢酸へと変換する酵素の総称を指す。その際、酵素番号４．１．１．３２はＧＤＰをＧＴＰに変換する反応、酵素番号４．１．１．３８はリン酸をピロリン酸に変換する反応、酵素番号４．１．１．４９はＡＤＰをＡＴＰに変換する反応、をそれぞれ伴っている。例えば、アクチノバチルス・スクシノジェンス（Actinobacillus succinogenes）等のアクチノバチルス属細菌、マイコバクテリウム・スメグマティス（Mycobacterium smegmatis）等のマイコバクテリウム属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）等のトリパノソーマ属細菌に由来のものが挙げられる。
　ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼの遺伝子（ｐｃｋ）としては、上述した微生物から得られるホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、アクチノバチルス・スクシノジェンス（Actinobacillus succinogenes）等のアクチノバチルス属細菌、マイコバクテリウム・スメグマティス（Mycobacterium smegmatis）等のマイコバクテリウム属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）等のトリパノソーマ属細菌に由来のものが挙げられる。
　リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Ｍｄｈ）は、酵素番号１．１．１．３７に分類され、ＮＡＤＨを補酵素として用い、オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する酵素の総称を指す。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌に由来のものが挙げられる。
　リンゴ酸デヒドロゲナーゼの遺伝子（ｍｄｈ）としては、上述した微税物から得られるリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
　マレートチオキナーゼ（Ｍｔｋ）は、酵素番号６．２．１．９に分類され、リンゴ酸とＣｏＡを結合させマリルＣｏＡへと変換する酵素の総称を指す。反応の際、１分子のＡＴＰを消費し、１分子のＡＤＰとリン酸を生成する。本酵素は４００アミノ酸程度のｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔと３００アミノ酸ｓｍａｌｌ　ｓｕｂｕｎｉｔから構成される。遺伝子上には、通常、ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔ、ｓｍａｌｌ　ｓｕｂｕｎｉｔという順番で存在する。本明細書では、便宜上、ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔをｍｔｋＢ、ｓｍａｌｌ　ｓｕｂｕｎｉｔをｍｔｋＡと称する。本酵素の比活性としては、精製酵素で２．５Ｕ／ｍｇという例が報告されている（Analytical Biochemistry, 1995; 227(2): 363-367）。
　マレートチオキナーゼは、主に、メタン等のＣ１炭素源の資化経路（Journal of Bacteriology, 1994; 176(23): 7398-7404）及び３－ヒドロキシプロピオン酸経路（Archives of Microbiology, 1989; 151: 252－256）に見られる酵素である。ゲノム上、マレートチオキナーゼ遺伝子の近傍には、マリルＣｏＡリアーゼ遺伝子が存在し、そのように存在するマレートチオキナーゼ遺伝子が好適である。
　マレートチオキナーゼは、例えば、メチロバクテリウム・エクストルクエンス（Methylobacterium extorquens）等のメチロバクテリウム属由来（配列番号１及び配列番号２）、グラニュリバクター・ベセスデンシス（Granulibacter bethesdensis）等のグラニュリバクター属由来（配列番号３及び配列番号４）、ハイホマイクロビウム・メチロボラム（Hyphomicrobium methylovorum）（配列番号５及び配列番号６）、ハイホマイクロビウム・デニトリフィカンス（Hyphomicrobium denitrificans）（配列番号７及び配列番号８）等のハイホマイクロビウム属由来、リゾビウム・エスピー（Rhizobium sp.）ＮＧＲ２３４等のリゾビウム属由来（配列番号９及び配列番号１０）、ニトロソモナス・ユーロピア（Nitrosomonas europaea）等のニトロソモナス属由来（配列番号１１及び配列番号１２）、メチロコッカス・キャプスラタス（Methylococcus capsulatus）等のメチロコッカス属由来（配列番号１３及び配列番号１４）、ガンマプロテオバクテリア界由来（配列番号１５及び配列番号１６）、のものが挙げられる。
　マレートチオキナーゼとして、アセチルＣｏＡを経由する有用物質の生産効率の観点から、特に好ましくは、ハイホマイクロビウム属由来（配列番号５及び配列番号６、配列番号７及び配列番号８）、リゾビウム属由来（配列番号９及び配列番号１０）、ニトロソモナス属由来（配列番号１１及び配列番号１２）、メチロコッカス属由来（配列番号１３及び配列番号１４）、及びガンマプロテオバクテリア界由来（配列番号１５及び配列番号１６）が例示される。
　ハイホマイクロビウム属由来（配列番号５及び配列番号６、配列番号７及び配列番号８）、リゾビウム属由来（配列番号９及び配列番号１０）、及びニトロソモナス属由来（配列番号１１及び配列番号１２）の各マレートチオキナーゼは、互いに６５％～８０％の相同性を有する。メチロコッカス属由来のマレートチオキナーゼ（配列番号１３及び配列番号１４）は、ガンマプロテオバクテリア界由来のマレートチオキナーゼ（配列番号１５及び配列番号１６）と７０％～８０％の相同性を有する。
　本発明に開示されている、ハイホマイクロビウム属由来、リゾビウム属由来、ニトロソモナス属由来、メチロコッカス属由来、及びガンマプロテオバクテリア界由来の各マレートチオキナーゼのアミノ酸配列に７０％以上の相同性を有し、且つマレートチオキナーゼ活性を有するタンパク質は、アセチルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡに由来する有用物質の生産に好適に使用できる。
　マレートチオキナーゼの遺伝子（ｍｔｋ）としては、上述した微生物から得られるマレートチオキナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、メチロバクテリウム・エクストルクエンス等のメチロバクテリウム属由来（配列番号１７及び配列番号１８）、ハイホマイクロビウム・メチロボラム、ハイホマイクロビウム・デニトリフィカンス等のハイホマイクロビウム属由来、リゾビウム・エスピーＮＧＲ２３４等のリゾビウム属由来、グラニュリバクター・ベセスデンシス等のグラニュリバクター属由来、ニトロソモナス・ユーロピア等のニトロソモナス属由来、メチロコッカス・キャプスラタス等のメチロコッカス属由来、ガンマプロテオバクテリア界由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。アセチルＣｏＡの生産効率の観点から、好ましくは、ハイホマイクロビウム属由来（配列番号１９及び配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２）、リゾビウム属由来（例えば、コドンを最適化した、配列番号２３）、グラニュリバクター属由来（配列番号２４及び配列番号２５）、ニトロソモナス属由来（配列番号２６及び配列番号２７）、メチロコッカス属由来（配列番号２８及び配列番号２９）、ガンマプロテオバクテリア界由来（配列番号３０及び配列番号３１）の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、ハイホマイクロビウム属由来（配列番号１９及び配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２）、リゾビウム属由来（例えば、コドンを最適化した、配列番号２３）、ニトロソモナス属由来（配列番号２６及び配列番号２７）、メチロコッカス属由来（配列番号２８及び配列番号２９）、ガンマプロテオバクテリア界由来（配列番号３０及び配列番号３１）の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
　なお、メチロバクテリウム・エクストルクエンス等のメタン資化菌は、マレートチオキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼを生来有する微生物である。しかし、メタン資化菌に適したベクター系及びメタン資化菌のゲノム遺伝子の改変技術は発達しておらず、エシェリヒア・コリ及びコリネバクテリウム等の工業的に利用される微生物と比較して、遺伝子操作が困難である。また、メタン資化菌は増殖が遅い場合が多い。したがって、メタン資化菌は、有用な代謝産物の生産には適していない。
　マリルＣｏＡリアーゼ（Ｍｃｌ）は、酵素番号４．１．３．２４に分類され、マリルＣｏＡからグリオキシル酸とアセチルＣｏＡを生成する酵素を指す。例えば、メチロバクテリウム・エクストルクエンス等のメチロバクテリウム属由来、ハイホマイクロビウム・メチロボラム、ハイホマイクロビウム・デニトリフィカンス等のハイホマイクロビウム属由来、クロロフレクサス・アウランチアクス等のクロロフレクサス属由来、ニトロソモナス・ユーロピア等のニトロソモナス属由来、メチロコッカス・キャプスラタス等のメチロコッカス属由来のものが挙げられる。マリルＣｏＡリアーゼの比活性として、メチロバクテリウム・エクストロクエンスにおいて、精製酵素として２８．１Ｕ／ｍｇという報告がある（Biochemical Journal, 1974; 139(2): 399－405）。
　マリルＣｏＡリアーゼとして、アセチルＣｏＡの生産効率の観点から、特に好ましくは、メチロバクテリウム属由来（配列番号３２）ハイホマイクロビウム属由来（配列番号３３及び配列番号３４）、ニトロソモナス属由来（配列番号３５）、及びメチロコッカス属由来（配列番号３６）の各アミノ酸配列を有する酵素が例示される。
　マリルＣｏＡリアーゼの遺伝子（ｍｃｌ）としては、上述した微生物から得られるマリルＣｏＡリアーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、メチロバクテリウム・エクストルクエンス等のメチロバクテリウム属由来、ハイホマイクロビウム・メチロボラム、ハイホマイクロビウム・デニトリフィカンス等のハイホマイクロビウム属由来、クロロフレクサス・アウランチアクス等のクロロフレクサス属由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。アセチルＣｏＡの生産効率の観点から、特に好ましくは、メチロバクテリウム属由来、及びハイホマイクロビウム属由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
　特に好ましい塩基配列の例としては、メチロバクテリウム属由来の一例としてメチロバクテリウム・エクストルクエンス由来遺伝子の塩基配列（配列番号３７）、ハイホマイクロビウム属由来の一例としてハイホマイクロビウム・メチロボラム由来遺伝子の塩基配列（配列番号３８）、ハイホマイクロビウム・デニトリフィカンス由来遺伝子の塩基配列（配列番号３９）、ニトロソモナス属由来の一例としてニトロソモナス・ユーロピア由来遺伝子の塩基配列（配列番号４０）、メチロコッカス属由来の一例としてメチロコッカス・キャプスラタス由来遺伝子の塩基配列（配列番号４１）、が挙げられる。
　グリオキシル酸カルボリガーゼ（Ｇｃｌ）は、酵素番号４．１．１．４７に分類され、２分子のグリオキシル酸を１分子の２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸へと変換する酵素の総称を指す。反応の際、１分子の二酸化炭素の脱炭酸を伴う。例えば、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、ロドコッカス・ジョスティ等のロドコッカス属細菌に由来のものが挙げられる。
　グリオキシル酸カルボリガーゼの遺伝子（ｇｃｌ）としては、上述した微生物から得られるグリオキシル酸カルボリガーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、ロドコッカス・ジョスティ等のロドコッカス属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
　２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ（ＧｌｘＲ）は、酵素番号１．１．１．６０に分類され、ＮＡＤＨを補酵素として用い、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸をグリセリン酸へと変換する酵素の総称を指す。例えば、ロドコッカス・ジョスティ等のロドコッカス属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌に由来のものが挙げられる。
　２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼの遺伝子（ｇｌｘＲ）としては、上述した微生物から得られる２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、ロドコッカス・ジョスティ等のロドコッカス属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
　ヒドロキシピルビン酸イソメラーゼ（Ｈｙｉ）は、酵素番号５．３．１．２２に分類され、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸をヒドロキシピルビン酸へと異性化する酵素の総称を指す。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌に由来のものが挙げられる。
　ヒドロキシピルビン酸イソメラーゼの遺伝子（ｈｙｉ）としては、上述した微生物から得られるヒドロキシピルビン酸イソメラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
　ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ＹｃｄＷ）は、酵素番号１．１．１．８１に分類され、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを補酵素として用い、ヒドロキシピルビン酸をグリセリン酸へと変換する酵素の総称を指す。例えば、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、及びパントエア・アナナティス等のパントエア属細菌に由来のものが挙げられる。
　ヒドロキシピルビン酸レダクターゼの遺伝子（ｙｃｄＷ）としては、上述した微生物から得られるヒドロキシピルビン酸レダクターゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、及びパントエア・アナナティス等のパントエア属細菌に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
　グリセリン酸２－キナーゼ（ＧａｒＫ）は、酵素番号２．７．１．１６５に分類され、グリセリン酸を２－ホスホグリセリン酸へと変換する酵素の総称を指す。１分子のＡＴＰを消費し、１分子のＡＤＰとリン酸を生成する。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌に由来のものが挙げられる。
　グリセリン酸２－キナーゼの遺伝子（ｇａｒＫ）としては、上述した微生物から得られるグリセリン酸２－キナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
　グリセリン酸３－キナーゼ（ＧｌｘＫ）は、酵素番号２．７．１．３１に分類され、グリセリン酸を３－ホスホグリセリン酸へと変換する酵素の総称を指す。１分子のＡＴＰを消費し、１分子のＡＤＰとリン酸を生成する。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌に由来のものが挙げられる。
　グリセリン酸３－キナーゼの遺伝子（ｇｌｘＫ）としては、上述した微生物から得られるグリセリン酸３－キナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
　ホスホグリセリン酸ムターゼ（Ｇｐｍ）は、酵素番号５．４．２．１に分類され、３－ホスホグリセリン酸を２－ホスホグリセリン酸へと変換する酵素の総称を指す。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌に由来のものが挙げられる。
　ホスホグリセリン酸ムターゼの遺伝子（ｇｐｍ）としては、上述した微生物から得られるホスホグリセリン酸ムターゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
　エノラーゼ（Ｅｎｏ）は、酵素番号４．２．１．１１に分類され、２－ホスホグリセリン酸をホスホエノールピルビン酸へと変換する酵素の総称を指す。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌に由来のものが挙げられる。
　エノラーゼの遺伝子（ｅｎｏ）としては、上述した微生物から得られるエノラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
　グリシントランスアミナーゼ（Ｇｔａ）は、アミノ基を有する化合物（２級アミン又は１級アミン）から、グリオキシル酸にアミノ基を転移して、グリシンへと変換する酵素を指す。酵素番号２．６．１群に分類される酵素の中で、グリオキシル酸を基質とする酵素が挙げられる。例としては、２．６．１．＊；＊＝４，３５，４４，４５，６０，６３及び７３が挙げられる。また、２．６．１．＊；＊＝２，７，１２，１３，１４，１５，１８，１９，２７，３８，４０，４２，５７，６４，７２，及び７８の酵素群においても、同様の活性が報告されている場合がある。例えば、メチロコッカス・キャプスラタス等のメチロコッカス属菌、アスペルギルス・ニガー等のアスペルギルス属菌、カプリアビダス・ネカトール等のカプリアビダス属菌に由来のものが挙げられる。グリシントランスアミナーゼは、後述のセリントランスアミナーゼの活性も有している場合がある。本発明では、グリシンデヒドロゲナーゼ（Ｇｄｈ）もグリシントランスアミナーゼに含まれるとみなす。
　グリシントランスアミナーゼの遺伝子（ｇｔａ）としては、上述した微生物から得られるグリシントランスアミナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、メチロコッカス・キャプスラタス等のメチロコッカス属菌、アスペルギルス・ニガー等のアスペルギルス属菌、カプリアビダス・ネカトール等のカプリアビダス属菌に由来のものが挙げられる。本発明では、グリシンデヒドロゲナーゼの遺伝子もグリシントランスアミナーゼの遺伝子に含まれるとみなす。
　グリシンデヒドロゲナーゼの遺伝子（ｇｄｈ）としては、上述した微生物から得られるグリシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、マイコバクテリウム・ツベルクロシス、マイコバクテリウム・スメグマティス等のマイコバクテリウム属細菌、ハイホマイクロビウム・ヴァルガレ等のハイホマイクロビウム属細菌に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
　グリシン開裂系（Ｇｃｓ）は、グリシン、テトラヒドロ葉酸、及びＮＡＤ＋を、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸、ＮＨ３、ＣＯ２及びＮＡＤＨへと変換する一連の酵素群の総称を指す。Ｈ－タンパク質、Ｐ－タンパク質、Ｌ－タンパク質、及びＴ－タンパク質と呼ばれるタンパク質から構成されている（Molecular and Cellular Biochemistry, 1973; 1(2): 169-187）。Ｐ－タンパク質、Ｌ－タンパク質及びＴ－タンパク質は、酵素番号１．４．４．２、１．８．１．４、及び２．１．２．１０にそれぞれ分類される。例えば、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌、アスペルギルス・ニガー等のアスペルギルス属菌、カプリアビダス・ネカトール等のカプリアビダス属菌に由来のものが挙げられる。
　グリシン開裂系の遺伝子群（ｇｃｓ）としては、上述した微生物から得られるグリシン開裂系の酵素群をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌、アスペルギルス・ニガー等のアスペルギルス属菌、カプリアビダス・ネカトール等のカプリアビダス属菌に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
　グリシン開裂系で生産される５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸は、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼを作用させることで、新たなグリシンと反応して、セリンへと変換される。すなわち、グリシン開裂系及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの作用により、グリシン２分子及びＮＡＤ＋が、セリン、ＮＨ３、ＣＯ２及びＮＡＤＨへと変換される。
　セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（Ｓｈｍｔ）は、酵素番号２．１．２．１に分類され、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸及びグリシンから、セリン及びテトラヒドロ葉酸を生成する酵素の総称を指す。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌に由来のものが挙げられる。
　セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの遺伝子（ｓｈｍｔ）としては、上述した微生物から得られるセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
　セリンデヒドラターゼ（Ｓｄａ）は、酵素番号４．３．１．１７に分類され、セリンから、ピルビン酸とアンモニアを生成する酵素の総称を指す。酵素番号４．３．１．１９の酵素においても、同様の活性が報告されている場合がある。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌、アスペルギルス・ニガー等のアスペルギルス属菌、カプリアビダス・ネカトール等のカプリアビダス属菌に由来のものが挙げられる。
　セリンデヒドラターゼの遺伝子（ｓｄａ）としては、上述した微生物から得られるセリンデヒドラターゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌、アスペルギルス・ニガー等のアスペルギルス属菌、カプリアビダス・ネカトール等のカプリアビダス属菌に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
　セリントランスアミナーゼ（Ｓｇａ）は、セリンから、カルボニル基を有する化合物（ケト基又はアルデヒド基）にアミノ基を転移して、３－ヒドロキシピルビン酸へと変換する酵素を指す。酵素番号２．６．１群に分類される酵素の中で、セリンを基質とする酵素が挙げられる。例としては、２．６．１．５１及び２．６．１．４５が挙げられるが、２．６．１．４４及び２．６．１．３５の酵素群においても、同様の活性が報告されている場合がある。また、前述のグリシントランスアミナーゼの活性も有している場合がある。例えば、メチロコッカス・キャプスラタス等のメチロコッカス属菌、アスペルギルス・ニガー等のアスペルギルス属菌、カプリアビダス・ネカトール等のカプリアビダス属菌に由来のものが挙げられる。本発明では、セリン２－デヒドロゲナーゼもセリントランスアミナーゼに含まれるとみなす。
　セリントランスアミナーゼの遺伝子（ｓｇａ）としては、上述した微生物から得られるセリントランスアミナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、メチロコッカス・キャプスラタス等のメチロコッカス属菌、アスペルギルス・ニガー等のアスペルギルス属菌、カプリアビダス・ネカトール等のカプリアビダス属菌に由来のものが挙げられる。本発明では、セリン２－デヒドロゲナーゼの遺伝子もセリントランスアミナーゼの遺伝子に含まれるとみなす。
　セリン２－デヒドロゲナーゼ（Ｓｄｈ）は、酵素番号１．４．１．７に分類され、セリンから、３－ヒドロキシピルビン酸とアンモニアを生成する酵素の総称を指す。例えば、ペトロセリナム・クリスパム（パセリ）等の植物に由来のものが挙げられる。
　セリン２－デヒドロゲナーゼの遺伝子（ｓｄｈ）としては、上述した生物から得られるセリン２－デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、ペトロセリナム・クリスパム（パセリ）等の植物に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
　図１の回路上の酵素を一部保有していないために、図１の回路を形成していない微生物には、保有していない酵素を付与すればよい。
　エシェリヒア属細菌のうち、例えば大腸菌（Escherichia coli）は、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ及びグリシントランスアミナーゼを保有していないので、少なくとも、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ及びグリシントランスアミナーゼを付与すればよい。
　パントエア属細菌、例えばパントエア・アナナティスは、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ及びグリシントランスアミナーゼを保有していないので、少なくとも、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ及びグリシントランスアミナーゼを付与すればよい。
　コリネ型細菌のうち、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムは、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ、及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼを保有していないので、少なくとも、マレートチオキナーゼと、マリルＣｏＡリアーゼと、グリオキシル酸カルボリガーゼと、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ及び／又はヒドロキシピルビン酸レダクターゼを付与すればよい。
　図１の回路上及び図２のグリシン経路上の酵素を一部保有していないために、図１の回路及び図２の経路のいずれも形成していない微生物には、保有していない酵素を付与すればよい。糸状菌の１種であるアスペルギルス・ニガーは、マレートチオキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼを付与すれば、図２の経路を形成し得る。
　第一の発明に係るアセチルＣｏＡ生産微生物は、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ、ヒドロキシピルビン酸イソメラーゼ、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ、グリセリン酸２－キナーゼ、グリセリン酸３－キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ及びエノラーゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性が強化されていることが好ましい。これにより、より効率よくアセチルＣｏＡを生産することができる。
　強化の対象となりうるピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ、ヒドロキシピルビン酸イソメラーゼ、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ、グリセリン酸２－キナーゼ、グリセリン酸３－キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ又はエノラーゼは、図１の回路を構成する酵素群である。
　第一の発明に係るアセチルＣｏＡ生産微生物は、リンゴ酸酵素及びフマル酸レダクターゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性が不活化又は低減されていることが好ましい。これにより、より効率よくアセチルＣｏＡを生産することができる。
　リンゴ酸酵素は、酵素番号１．１．１．３８、酵素番号１．１．１．３９、酵素番号１．１．１．４０に分類され、リンゴ酸をピルビン酸と二酸化炭素へと変換する酵素の総称を指す。アセチルＣｏＡ生産効率の観点から、リンゴ酸酵素の活性を不活化又は低減させることが好ましい。
　フマル酸レダクターゼは、酵素番号１．３．９９．１に分類され、フマル酸をコハク酸へと変換する酵素の総称を指す。また、酵素番号１．３．９９．１に属するコハク酸デヒドロゲナーゼがフマル酸をコハク酸へと変換するフマル酸レダクターゼ活性を有することがある。したがって、本発明では、フマル酸レダクターゼ活性を有するコハク酸デヒドロゲナーゼもフマル酸レダクターゼに含む。アセチルＣｏＡ生産効率の観点から、フマル酸レダクターゼ活性を不活化又は低減させること好ましい。これにより、リンゴ酸がフマル酸、コハク酸へと変換されリンゴ酸の量が減ることを抑制でき、アセチルＣｏＡの収率向上につながる。
　リンゴ酸酵素の遺伝子（多くは、ｓｆｃＡ、ｍａｅＡ、ｍａｅＢ又はｍａｌＥの名称が付与されているが、この限りではない）は、微生物によって、複数個のアイソマーがゲノム中に存在している場合がある。パントエア・アナナティスはｓｆｃＡ及びｍａｅＢを保有している。コリネバクテリウム・グルタミカムはｍａｌＥを保有している。
　フマル酸レダクターゼの遺伝子（ｆｒｄ、ｓｄｈ、ｙｑｉＧ等）は、微生物によって、複数個のアイソマーがゲノム中に存在している場合がある。パントエア・アナナティスはｙｑｉＧを保有している。コリネバクテリウム・グルタミカムはｓｄｈを保有している。
　第一の発明で宿主として用いられる微生物は、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれも有していない微生物であれば特に制限されない。
（ａ）マロニルＣｏＡからマロン酸セミアルデヒド又は３－ヒドロキシプロピオン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路。
（ｂ）アセチルＣｏＡとＣＯ２からピルビン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路。
（ｃ）クロトニルＣｏＡとＣＯ２からエチルマロニルＣｏＡ又はグルタコニルＣｏＡへの酵素反応を有する炭酸固定回路。
（ｄ）ＣＯ２からギ酸への酵素反応を有する炭酸固定回路。
（ｅ）マレートチオキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼからなる群より選択された少なくとも１種。
　本明細書における「（ａ）マロニルＣｏＡからマロン酸セミアルデヒド又は３－ヒドロキシプロピオン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路」とは、下記（１）～（７）の回路を指す。
（１）国際公開第２０１１／０９９００６号のＦＩＧ．１に示された、アセチルＣｏＡがマロニルＣｏＡ、３－ヒドロキシプロピオン酸、プロピオニルＣｏＡ、リンゴ酸、マリルＣｏＡを経由し、再びアセチルＣｏＡに変換される回路。
（２）国際公開第２０１１／０９９００６号のＦＩＧ．４Ａに示された、アセチルＣｏＡがマロニルＣｏＡ、マロン酸セミアルデヒド、β－アラニン、リンゴ酸、マリルＣｏＡを経由し、再びアセチルＣｏＡに変換される回路。
（３）国際公開第２０１１／０９９００６号のＦＩＧ．４Ｂ、１６又は１８に示された、アセチルＣｏＡがマロニルＣｏＡ、ヒドロキシプロピオン酸、（Ｒ）－乳酸又は（Ｓ）－乳酸、リンゴ酸、マリルＣｏＡを経由し、再びアセチルＣｏＡに変換される回路。
（４）国際公開第２０１１／０９９００６号のＦＩＧ．８に示された、アセチルＣｏＡがマロニルＣｏＡ、マロン酸セミアルデヒド又はヒドロキシプロピオン酸、ピルビン酸、リンゴ酸、マリルＣｏＡを経由し、再びアセチルＣｏＡに変換される回路。
（５）国際公開第２０１１／０９９００６号のＦＩＧ．９Ａ、９Ｂ又は９Ｃに示された、アセチルＣｏＡがマロニルＣｏＡ、ヒドロキシプロピオン酸、２－ケトグルタル酸、リンゴ酸、マリルＣｏＡを経由し、再びアセチルＣｏＡに変換される回路。
（６）国際公開第２０１１／０９９００６号のＦＩＧ．９Ｄ又は９Ｆに示された、アセチルＣｏＡがマロニルＣｏＡ、ヒドロキシプロピオン酸、メチルマロニルＣｏＡ、リンゴ酸、マリルＣｏＡを経由し、再びアセチルＣｏＡに変換される回路。
（７）国際公開第２０１１／０９９００６号のＦＩＧ．１７に示された、アセチルＣｏＡがマロニルＣｏＡ、マロン酸セミアルデヒド又はヒドロキシプロピオン酸、メチルマロニルＣｏＡ、ピルビン酸、オキサロ酢酸、リンゴ酸、マリルＣｏＡを経由し、再びアセチルＣｏＡに変換される回路。
　上記（１）～（７）の炭酸固定回路は共通して、マロニルＣｏＡからマロン酸セミアルデヒド又は３－ヒドロキシプロピオン酸への酵素反応を有する。これらの反応はマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はマロニルＣｏＡレダクターゼが触媒する（国際公開第２０１１／０９９００６号）。このような、スクシニルＣｏＡの還元や、マロニルＣｏＡの還元といった、カルボン酸又はその（チオ）エステルの還元反応は、酵素反応として一般的に困難で、発酵経路としてはできるだけ避けた方が望ましいとされている（Nature, 2008; 451: 86-89、Nature Chemical Biolory, 2011; 7: 445-452）。
　本明細書における「（ｂ）アセチルＣｏＡとＣＯ２からピルビン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路」とは、下記（８）～（１０）の回路を指す。
（８）国際公開第２０１１／０９９００６号のＦＩＧ．１に示された、アセチルＣｏＡがピルビン酸、ホスホエノールピルビン酸、オキサロ酢酸、リンゴ酸、マリルＣｏＡを経由し、再びアセチルＣｏＡに変換される回路。
（９）国際公開第２０１１／０９９００６号のＦＩＧ．７Ｃ、７Ｄ又は７Ｅに示された、アセチルＣｏＡがピルビン酸、リンゴ酸、マリルＣｏＡを経由し、再びアセチルＣｏＡに変換される回路。
（１０）国際公開第２０１１／０９９００６号のＦＩＧ．９Ｍに示された、アセチルＣｏＡがピルビン酸、２－ケトグルタル酸、リンゴ酸、マリルＣｏＡを経由し、再びアセチルＣｏＡに変換される回路。
　上記（８）～（１０）の炭酸固定回路は共通して、アセチルＣｏＡとＣＯ２からピルビン酸への酵素反応を有する。この反応を触媒するのがピルビン酸シンターゼである（国際公開第２０１１／０９９００６号）。ピルビン酸シンターゼによるピルビン酸の合成反応はフェレドキシンを介した強い還元力が必要で、反応が遅い上に、酸素に弱いため極端な嫌気条件下でないと反応が進行しない。
　本明細書における「（ｃ）クロトニルＣｏＡとＣＯ２からエチルマロニルＣｏＡ又はグルタコニルＣｏＡへの酵素反応を有する炭酸固定回路」とは、国際公開第２０１１／０９９００６号のＦＩＧ．９Ｈ又は９Ｊに示された、アセチルＣｏＡがクロトニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ又はグルタコニルＣｏＡ、オキサロ酢酸、リンゴ酸、マリルＣｏＡを経由し、再びアセチルＣｏＡに変換される回路を指す。
　上記のクロトニルＣｏＡとＣＯ２からエチルマロニルＣｏＡ又はグルタコニルＣｏＡへの変換を触媒するのがクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ－レダクターゼ又はメチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼである。クロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ－レダクターゼは、炭酸塩に対するＫｍが高く（１４ｍＭ。Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007; 104(25): 10631-10636）、低濃度域での活性が見込めない。また、基質であるクロトニルＣｏＡは３－ヒドロキシブチリルＣｏＡから脱水反応により生産されるが、このような酵素は通常水中環境下だと逆反応の水和反応が優勢であるため、十分な速度が見込めない。また、メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼは、報告されている比活性がそれほど高くない（０．２～０．６Ｕ／ｍｇ。Archives of Biochemistry and Biophysics, 1994; 310(1): 64-75）上に、上記同様、基質であるクロトニルＣｏＡの生産に十分な速度が見込めないという問題もある。
　本明細書における「（ｄ）ＣＯ２からギ酸への酵素反応を有する炭酸固定回路」とは、国際公開第２００９／０４６９２９号のＦｉｇ．５、６、１３又は１４に示された回路、すなわち、ＣＯ２、ギ酸、５－ホルミルテトラヒドロ葉酸を経て、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸を生産する経路と、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸とグリシンとが反応してセリンを生成し、そのセリンが３－ヒドロキシピルビン酸、グリセリン酸、３－ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、オキサロ酢酸、リンゴ酸、マリルＣｏＡ、グリオキシル酸、を経て、最初のグリシンへと戻る回路と、リンゴ酸、マリルＣｏＡを経て生成したアセチルＣｏＡが、ＴＣＡ回路とイソクエン酸リアーゼの反応を経て、リンゴ酸に戻る回路と、が組み合わさった回路を指す。
　上記のＣＯ２からギ酸への酵素反応は強い還元力が必要で、反応が遅い上に、酸素に弱いため極端な嫌気条件下でないと反応が進行しない。
　マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、酵素番号１．２．１．１８に分類され、マロニルＣｏＡからマロン酸セミアルデヒドへと変換する酵素の総称を指す。
　マロニルＣｏＡレダクターゼは、マロニルＣｏＡをマロン酸セミアルデヒド若しくは３－ヒドロキシプロピオン酸へと変換する酵素の総称を指す。
　ピルビン酸シンターゼは、酵素番号１．２．７．１に分類され、アセチルＣｏＡをピルビン酸へと変換する酵素の総称を指す。
　クロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ－レダクターゼは、酵素番号１．３．１．８５に分類され、クロトニルＣｏＡをエチルマロニルＣｏＡへと変換する酵素の総称を指す。
　メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼは、酵素番号６．４．１．４に分類され、クロトニルＣｏＡをグルタコニルＣｏＡへと変換する酵素の総称を指す。
　前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれも有していない微生物としては、例えば、腸内細菌科に属する微生物、コリネ型細菌に属する微生物、糸状菌、放線菌等が挙げられる。
　腸内細菌科に属する微生物としては、エンテロバクター属、エルビニア属、エシェリヒア属、クレブシエラ属、パントエア属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、モルガネラ属等に属する細菌が挙げられる。中でも、有用な代謝産物を効率的に生産できるという観点から、エシェリヒア属又はパントエア属に属する細菌が好ましい。エシェリヒア属細菌とパントエア属細菌は、非常に近縁である（Journal of General and Applied Microbiology, 1997; 43(6): 355-361、International Journal of Systematic Bacteriology, 1997; 47(4): 1061-1067）。
　エシェリヒア属細菌としては、特に限定されないが、例えばエシェリヒア・コリ（大腸菌）が挙げられる。エシェリヒア・コリとしては具体的には、プロトタイプの野生株Ｂ株のエシェリヒア・コリＢ（ＡＴＣＣ１１３０３）、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ４７０７６）等が挙げられる。
　パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
・パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５（ＦＥＲＭ　ＢＰ－６６１４）（欧州特許出願公開０９５２２２１号明細書）
・パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６（ＦＥＲＭ　ＢＰ－６６１５）（欧州特許出願公開０９５２２２１号明細書）
　これらの菌株は、欧州特許出願公開０９５２２２１号明細書にはエンテロバクター・アグロメランスとして記載されているが、現在では、上記のとおり、１６Ｓ　ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
　近年、エンテロバクター属に属する菌には、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・ディスパーサ（Pantoea dispersa）等に再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology, 1989; 39(3): 337-345）。エルビニア属に属する菌には、パントエア・アナナス（Pantoea ananas）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology, 1993; 43(1): 162-173）。
　エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開９５２２２１号明細書に例示された菌株を使用することができる。エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスＡＴＣＣ１２２８７が挙げられる。
　コリネ型細菌とは、Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th ed., p599 (1974)に定義される、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、又はミクロバクテリウム（Microbacterium）属に属する微生物等をいう。また、これまでブレビバクテリウム属に分類されていたが、その後コリネバクテリウム属に再分類されている微生物（International Journal of Systematic Bacteriology, 1991; 41(2): 255-260）、及び類縁菌であるブレビバクテリウム属に属する微生物も挙げられる。以下にコリネ型細菌の例を列挙する。
　例えば、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム、コリネバクテリウム・アルカノリティカム、コリネバクテリウム・カルナエ、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・リリウム、コリネバクテリウム・メラセコーラ、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス、コリネバクテリウム・ハーキュリス、ブレビバクテリウム・ディバリカタム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、ブレビバクテリウム・ロゼウム、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、ブレビバクテリウム・アルバム、ブレビバクテリウム・セリヌム、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラムが挙げられる。
　コリネ型細菌に属する微生物として、以下の菌株を包含する。
　コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・アセトグルタミカムＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・アルカノリティカムＡＴＣＣ２１５１１、コリネバクテリウム・カルナエＡＴＣＣ１５９９１、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０２０、１３０３２、１３０６０、コリネバクテリウム・リリウムＡＴＣＣ１５９９０、コリネバクテリウム・メラセコーラＡＴＣＣ１７９６５、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１５３９）、コリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６８、ブレビバクテリウム・ディバリカタムＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリウム・フラバムＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０６７、ＡＪ１２４１８（ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２０５）、ブレビバクテリウム・インマリオフィラムＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼウムＡＴＣＣ１３８２５、ブレビバクテリウム・サッカロリティカムＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・チオゲニタリスＡＴＣＣ１９２４０、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７１、ＡＴＣＣ６８７２、ブレビバクテリウム・アルバムＡＴＣＣ１５１１１、ブレビバクテリウム・セリヌムＡＴＣＣ１５１１２及びミクロバクテリウム・アンモニアフィラムＡＴＣＣ１５３５４を包含する。
　第二の発明では、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれも有していない、アスペルギルス属菌又はカプリアビダス属菌が宿主として用いられる。アスペルギルス属菌としては、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger。Aspergillus awamori、Aspergillus kawachii等の変種を含む）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、アスペルギルス・イタコニカス（Aspergillus itaconicus）等が挙げられる。カプリアビダス属菌としては、カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator；別名Alcaligenes eutropha、Ralstonia eutropha、Wautersia eutropha）等が挙げられる。第二の発明を用いてクエン酸の生産を行う際には、アスペルギルス・ニガー等のアスペルギルス属菌等を用いることが好ましい。イタコン酸の生産を行う際には、アスペルギルス・テレウス、アスペルギルス・イタコニカス等のアスペルギルス属菌等を用いることが好ましい。（ポリ）３－ヒドロキシ酪酸の生産を行う際には、カプリアビダス・ネカトール等のカプリアビダス属菌等を用いることが好ましい。
　本発明に係るアセチルＣｏＡ生産微生物は、アセチルＣｏＡを中間体として代謝産物を生産する各種経路を有していてもよく、又は当該経路に関連する酵素活性を強化していてもよい。当該経路としては、イソプロピルアルコールを生産する経路、アセトンを生産する経路、グルタミン酸を生産する経路、などが挙げられる。以下、これらの経路を有し、アセチルＣｏＡに由来する有用な代謝産物を生産しうる微生物について説明する。
－イソプロピルアルコール生産に係る微生物、アセトン生産に係る微生物－
　本発明に係るアセチルＣｏＡ生産微生物であって、イソプロピルアルコール生産経路を有する微生物は、例えば、イソプロピルアルコール生産経路を有する微生物を宿主として、本発明のアセチルＣｏＡ生産微生物を構築して得られる、又は、本発明のアセチルＣｏＡ生産微生物においてイソプロピルアルコール生産経路に関する酵素の遺伝子を付与又は強化することによって得られる。以下、イソプロピルアルコール生産経路を有する微生物を「イソプロピルアルコール生産微生物」と称する場合があり、イソプロピルアルコール生産経路を有する大腸菌（Escherichia coli）を「イソプロピルアルコール生産大腸菌」と称する場合がある。
　イソプロピルアルコール生産大腸菌は、イソプロピルアルコール生産経路を備えた大腸菌であり、遺伝子組換え技術により導入されたイソプロピルアルコール生産能力を保有する大腸菌をいう。このようなイソプロピルアルコール生産経路は、対象となる大腸菌にイソプロピルアルコールを生産させるものであればよい。イソプロピルアルコール生産大腸菌は、チオラーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性の４種類の酵素活性が、付与又は強化されていることが好ましい。
　本発明のアセチルＣｏＡ生産微生物を用いてアセトンを生産する場合には、イソプロピルアルコール生産経路のうち、チオラーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する微生物を使用することができる。当該微生物は、ソプロピルアルコール生産経路のうち、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有していない。
　本発明のアセチルＣｏＡ生産微生物が、エシェリヒア属細菌を宿主に構築された微生物である場合、以下の態様が好ましい。
　好ましい態様の一例は、エシェリヒア属細菌に、チオラーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性が付与又は強化されたアセチルＣｏＡ生産微生物である。該微生物により、イソプロピルアルコールが効率よく生産される。
　好ましい態様の別の一例は、エシェリヒア属細菌に、チオラーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、及びアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性が付与又は強化されたアセチルＣｏＡ生産微生物である。該微生物により、アセトンが効率よく生産される。
　以下、イソプロピルアルコール生産経路及びこれを構成する酵素について、詳しく説明する。
　チオラーゼは、酵素番号２．３．１．９に分類され、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）等のクロストリジウム属細菌、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属細菌、ハロバクテリウム・エスピー（Halobacterium sp.）細菌、ズーグロア・ラミゲラ（Zoogloea　ramigera）等のズーグロア属細菌、リゾビウム・エスピー（Rhizobium sp.）細菌、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）等のブラディリゾビウム属細菌、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）等のカンジダ属細菌、カウロバクター・クレセンタス（Caulobacter crescentus）等のカウロバクター属細菌、ストレプトマイセス・コリナス（Streptomyces collinus）等のストレプトマイセス属細菌、エンテロコッカス・ファカリス（Enterococcus faecalis）等のエンテロコッカス属細菌に由来のものが挙げられる。
　チオラーゼの遺伝子としては、上述した微生物から得られるチオラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ等のクロストリジウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、ハロバクテリウム種の細菌、ズーグロア・ラミゲラ等のズーグロア属細菌、リゾビウム種の細菌、ブラディリゾビウム・ジャポニカム等のブラディリゾビウム属細菌、カンジダ・トロピカリス等のカンジダ属細菌、カウロバクター・クレセンタス等のカウロバクター属細菌、ストレプトマイセス・コリナス等のストレプトマイセス属細菌、エンテロコッカス・ファカリス等のエンテロコッカス属細菌に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。より好適なものとしては、クロストリジウム属細菌、及びエシェリヒア属細菌などの原核生物に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示され、特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリに由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
　ＣｏＡトランスフェラーゼは、酵素番号２．８．３．８に分類され、アセトアセチルＣｏＡからアセト酢酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）等のクロストリジウム属細菌、ローセブリア・インテスチナリス（Roseburia intestinalis）等のローセブリア属細菌、ファカリバクテリウム・プラウセンツ（Faecalibacterium prausnitzii）等ファカリバクテリウム属細菌、コプロコッカス（Coprococcus）属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）等のトリパノソーマ、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli、大腸菌）等エシェリヒア属細菌に由来のものが挙げられる。
　ＣｏＡトランスフェラーゼの遺伝子としては、上述した微生物から得られるＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、クロストリジウム・アセトブチリカム等のクロストリジウム属細菌、ローセブリア・インテスチナリス等のローセブリア属細菌、ファカリバクテリウム・プラウセンツ等のファカリバクテリウム属細菌、コプロコッカス属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ等のトリパノソーマ、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。より好適なものとしては、クロストリジウム属細菌及びエシェリヒア属細菌に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示され、特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム及びエシェリヒア・コリに由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
　アセト酢酸デカルボキシラーゼは、酵素番号４．１．１．４に分類され、アセト酢酸からアセトンを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）等のクロストリジウム属細菌、バチルス・ポリミクサ（Bacillus polymyxa）等のバチルス属細菌に由来のものが挙げられる。
　アセト酢酸デカルボキシラーゼの遺伝子としては、上述した微生物から得られるアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、クロストリジウム・アセトブチリカム等のクロストリジウム属細菌、バチルス・ポリミクサ等のバチルス属細菌に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
　イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼは、酵素番号１．１．１．８０に分類され、アセトンからイソプロピルアルコールを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）等のクロストリジウム属細菌に由来のものが挙げられる。
　イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子としては、上述した微生物から得られるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、クロストリジウム・ベイジェリンキ等のクロストリジウム属細菌に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
　酵素活性の観点から、上記４種類の酵素はそれぞれ、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも１種由来であることが好ましく、チオラーゼ及びＣｏＡトランスフェラーゼがエシェリヒア属細菌由来であり、アセト酢酸デカルボキシラーゼ及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼがクロストリジウム属細菌由来である場合がより好ましい。
　酵素活性の観点から、上記４種類の酵素はそれぞれ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジュリンキ及びエシェリヒア・コリからなる群より選択された少なくとも１種由来であることが好ましく；チオラーゼ及びＣｏＡトランスフェラーゼがそれぞれクロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来であり、アセト酢酸デカルボキシラーゼがクロストリジウム・アセトブチリカム由来であり、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼが、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来であることがより好ましく；チオラーゼ及びＣｏＡトランスフェラーゼがエシェリヒア・コリ由来であり、アセト酢酸デカルボキシラーゼがクロストリジウム・アセトブチリカム由来であり、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼがクロストリジウム・ベイジェリンキ由来であることが更に好ましい。
　大腸菌由来のＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ａｔｏＤ及びａｔｏＡ）とチオラーゼ遺伝子（ａｔｏＢ）は、ａｔｏＤ、ａｔｏＡ、ａｔｏＢの順番で大腸菌ゲノム上でオペロンを形成している（Journal of Bacteriology, 1987; 169(1): 42-52）。そのため、ａｔｏＤのプロモーターを改変することによって、ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子とチオラーゼ遺伝子の発現を同時に制御することが可能である。
　したがって、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が宿主大腸菌のゲノム遺伝子から得られたものである場合、充分なイソプロピルアルコール生産能力を獲得する観点から、両酵素遺伝子の発現を担うプロモーターを他のプロモーターと置換する等によって両酵素遺伝子の発現を増強することが好ましい。ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性の発現を増強するために用いられるプロモーターとしては、エシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター等を挙げることができる。エシェリヒア・コリ由来のＧＡＰＤＨプロモーターはGenBank accession number X02662の塩基配列情報において、塩基番号３９７～４４０に記されている。
　イソプロピルアルコール生産大腸菌としては、国際公開第２００９／００８３７７号に記載されている、植物由来材料からイソプロピルアルコールを生成しうるｐＩＰＡ／Ｂ株又はｐＩａａａ／Ｂ株が例として挙げられる。この大腸菌には、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性とチオラーゼ活性は大腸菌ゲノム上の各遺伝子の発現を強化し、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性とイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性はプラスミド導入で発現を強化した株（本明細書では、ｐＩａ／Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株ということがある）を含む。ほかに、イソプロピルアルコール生産大腸菌としては、国際公開第２００９／０９４４８５号、国際公開第２００９／０９４４８５号、国際公開第２００９／０４６９２９号、国際公開第２００９／０４６９２９号に記載の微生物が例として挙げられる。
　イソプロピルアルコール生産大腸菌は、転写抑制因子ＧｎｔＲの活性が不活化されていると共に、イソプロピルアルコール生産経路と、ＧｎｔＲ活性の不活化に伴って向上したイソプロピルアルコール生産能を維持又は強化する酵素活性パターンを示す補助酵素群と、を備えたイソプロピルアルコール生産大腸菌であってもよい。これにより、イソプロピルアルコールをよりいっそう高生産することができる。
　本発明における「補助酵素群」とは、イソプロピルアルコール生産能に影響する１つ又は２つ以上の酵素を指す。補助酵素群は、複数の酵素で構成されている必要はなく、１の酵素で構成されていてもよい。補助酵素群のそれぞれの酵素活性は、不活化、活性化又は強化されており、本発明における「補助酵素群の酵素活性パターン」とは、ＧｎｔＲ活性を不活化したことのみによって得られる向上したイソプロピルアルコール生産量が、維持又は増加し得る各酵素の酵素活性パターンを指し、１つ又は２つ以上の酵素の組み合わせを包含する。
　補助酵素群の酵素活性パターンとして、好ましくは、下記（ｉ）～（ｉｉｉ）のパターンを挙げることができる。なかでも、下記（ｉｉｉ）がイソプロピルアルコール生産能の観点からより好ましい。
（ｉ）グルコース－６－リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性、グルコース－６－リン酸－１－デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性及びホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ）活性の野生型の維持。
（ｉｉ）グルコース－６－リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性の不活化と、グルコース－６－リン酸－１－デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性の強化。
（ｉｉｉ）グルコース－６－リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）活性の不活化と、グルコース－６－リン酸－１－デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）活性の強化と、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ）活性の不活化。
　前記補助酵素群及びその酵素活性パターンは、上記に限定されず、ＧｎｔＲ活性の不活化を含み、イソプロピルアルコール生産大腸菌におけるイソプロピルアルコール生産量が増加し得る補助酵素群及びその酵素活性パターンであれば、いずれも本発明に包含される。
　ＧｎｔＲは、エントナー・ドウドロフ経路を経由したグルコン酸代謝に関与するオペロンを負に制御する転写因子を指す。ＧｎｔＲは、グルコン酸の取り込みと代謝を担う二つの遺伝子群（ＧｎｔＩとＧｎｔＩＩ）の働きを抑制するＧｎｔＲ転写抑制因子の総称を指す。
　グルコース－６－リン酸イソメラーゼ（Ｐｇｉ）は、酵素番号５．３．１．９に分類され、Ｄ－グルコース－６－リン酸からＤ－フルクトース－６－リン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
　グルコース－６－リン酸－１－デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）は、酵素番号１．１．１．４９に分類され、Ｄ－グルコース－６－リン酸からＤ－グルコノ－１，５－ラクトン－６－リン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。例えば、ディノコッカス・ラジオフィラス（Deinococcus radiophilus）等のディノコッカス属菌、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・アキュリタス（Aspergillus aculeatus）等のアスペルギルス属菌、アセトバクター・ハンセニー（Acetobacter hansenii）等のアセトバクター属菌、サーモトガ・マリチナ（Thermotoga maritima）等のサーモトガ属菌、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）等のクリプトコッカス属菌、ディクチョステリウム・ディスコイデウム（Dictyostelium discoideum）等のディクチョステリウム属菌、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）等のシュードモナス属、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロミセス属、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）等のバチルス属菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌に由来のものが挙げられる。
　グルコース－６－リン酸－１－デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｆ）の遺伝子としては、上述した微生物から得られるＺｗｆをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を用いてよい。好適なものとしては、ディノコッカス・ラジオフィラス（Deinococcus radiophilus）等のディノコッカス属菌、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・アキュリタス（Aspergillus aculeatus）等のアスペルギルス属菌、アセトバクター・ハンセニー（Acetobacter hansenii）等のアセトバクター属菌、サーモトガ・マリチナ（Thermotoga maritima）等のサーモトガ属菌、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）等のクリプトコッカス属菌、ディクチョステリウム・ディスコイデウム（Dictyostelium discoideum）等のディクチョステリウム属菌、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）等のシュードモナス属、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロミセス属、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）等のバチルス属菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。より好適なものとしては、ディノコッカス属菌、アスペルギルス属菌、アセトバクター属菌、サーモトガ属菌、シュードモナス属、バチルス属菌、エシェリヒア属細菌などの原核生物に由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。
　ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄ）は、酵素番号１．１．１．４４に分類され、６－ホスホ－Ｄ－グルコン酸からＤ－リブロース－５－リン酸とＣＯ２を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
　上記の酵素活性の付与又は強化は、宿主への遺伝子導入、宿主がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性の強化、前記プロモータの他プロモーターとの置換、及びこれらの組合せによって行うことができる。
　イソプロピルアルコール生産大腸菌におけるプロモーターとは、シグマ因子を有するＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写を開始する部位を意味する。プロモーターとしては、遺伝子の発現を制御可能なものであればよいが、恒常的に微生物内で機能する強力なプロモーターで且つグルコース存在下でも発現の抑制を受けにくいプロモーターがよい。具体的にはＧＡＰＤＨプロモーター、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのプロモーターが挙げられる。
　イソプロピルアルコール生産大腸菌においては、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬｄｈＡ）の遺伝子（ｌｄｈＡ）が破壊されていてもよい。これにより、酸素供給が制限された培養条件下においても乳酸の生産が抑制されるため、イソプロピルアルコールを効率よく生産することができる。酸素供給が制限された培養条件とは、培養液を攪拌することで通気させる気体として空気のみを用いる場合、一般的に０．０２ｖｖｍ～２．０ｖｖｍ（ｖｖｍ；通気容量〔ｍＬ〕／液容量〔ｍＬ〕／時間〔分〕）、回転数２００ｒｐｍ～６００ｒｐｍのことをいう。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬｄｈＡ）とは、ピルビン酸とＮＡＤＨからＤ－乳酸とＮＡＤを生成する酵素を指す。
－グルタミン酸生産に係る微生物－
　本発明に係るアセチルＣｏＡ生産微生物は、アセチルＣｏＡを中間体としてグルタミン酸を生産する各種経路を有していてもよく、又は当該経路に関連する酵素活性を強化していてもよい。
　本発明に係るアセチルＣｏＡ生産微生物であって、グルタミン酸生産経路を有する微生物は、例えば、グルタミン酸生産経路を有する微生物を宿主として、本発明のアセチルＣｏＡ生産微生物を構築して得られる、又は、本発明のアセチルＣｏＡ生産微生物においてグルタミン酸生産経路に関する酵素の遺伝子を付与又は強化することによって得られる。以下、グルタミン酸生産経路を有する微生物を「グルタミン酸生産微生物」と称する場合がある。
　グルタミン酸生産微生物としては、Ｌ－アミノ酸を生産する能力を有する微生物が挙げられる。グルタミン酸生産微生物の好ましい具体例としては、グルタミン酸生産経路が付与又は強化された、エシェリヒア属細菌、パントエア属細菌等の腸内細菌科属菌、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネ型細菌が挙げられる。
　微生物にグルタミン酸生産能を付与又は強化する方法は、例えば、Ｌ－グルタミン酸生合成酵素をコードする遺伝子の発現が増大及び／又は過剰発現するように改変することを含む。Ｌ－グルタミン酸生合成酵素の例としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミンシンセターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトース－２－リン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等が挙げられる。これらの酵素のうち、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼの１つ又は複数の活性が増大することが好ましく、これらの酵素の３つ全ての活性を増強させることがより好ましい。このようなグルタミン酸生産微生物としては、例えば特開２００５－２７８６４３号公報に記載されているグルタミン酸生産微生物を挙げることができる。
　Ｌ－グルタミン酸生産微生物としては、酸性条件下で培養したときに液体培地中にＬ－グルタミン酸の飽和濃度を越える量のＬ－グルタミン酸を蓄積する能力（以下「酸性条件下でのＬ－グルタミン酸蓄積能」ということがある）を有する微生物を用いることができる。例えば、欧州公開公報１０７８９８９号記載の方法により、低ｐＨ環境下でＬ－グルタミン酸に対する耐性が向上した菌株を取得することにより、飽和濃度を超える量のＬ－グルタミン酸を蓄積する能力を、本発明の微生物に付与することができる。
　本来的に酸性条件下でのＬ－グルタミン酸蓄積能を有する微生物として具体的には、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６（ＦＥＲＭ　ＢＰ－６６１５）及びＡＪ１３６０１（ＦＥＲＭ　ＢＰ－７２０７）（以上、欧州特許出願公開０９５２２２１号明細書）などが挙げられる。パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６は、１９９８年２月１９日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ－ＩＰＯＤ））に、受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－１６６４５として寄託され、１９９９年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－６６１５が付与されている。同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）と同定され、エンテロバクター・アグロメランスＡＪ１３３５５として寄託されたが、近年１６Ｓ　ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に再分類されている（実施例参照）。ＡＪ１３３５５から誘導された菌株ＡＪ１３３５６、及びＡＪ１３６０１も、同様にエンテロバクター・アグロメランスとして前記寄託機関に寄託されているが、本明細書ではパントエア・アナナティスと記述する。ＡＪ１３６０１は、１９９９年８月１８日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ－ＩＰＯＤ））に受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－１７１５６として寄託され、２０００年７月６日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭＢＰ－７２０７が付与されている。
　Ｌ－グルタミン酸生産能を付与又は強化する別の方法として、有機酸アナログや呼吸阻害剤などへの耐性を付与する方法や、細胞壁合成阻害剤に対する感受性を付与する方法も挙げられる。例えば、モノフルオロ酢酸耐性を付与する方法（特開昭５０－１１３２０９号公報）、アデニン耐性又はチミン耐性を付与する方法（特開昭５７－０６５１９８号公報）、ウレアーゼを弱化させる方法（特開昭５２－０３８０８８号公報）、マロン酸耐性を付与する方法（特開昭５２－０３８０８８号公報）、ベンゾピロン又はナフトキノン類への耐性を付与する方法（特開昭５６－１８８９号公報）、ＨＯＱＮＯ耐性を付与する方法（特開昭５６－１４０８９５号公報）、α－ケトマロン酸耐性を付与する方法（特開昭５７－２６８９号公報）、グアニジン耐性を付与する方法（特開昭５６－３５９８１号公報）、ペニシリンに対する感受性を付与する方法（特開平４－８８９９４号公報）などが挙げられる。
　このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
・ブレビバクテリウム・フラバムＡＪ３９４９（ＦＥＲＭＢＰ－２６３２；特開昭５０－１１３２０９号公報）
・コリネバクテリウム・グルタミカムＡＪ１１６２８（ＦＥＲＭ　Ｐ－５７３６；特開昭５７－０６５１９８号公報）
・ブレビバクテリウム・フラバムＡＪ１１３５５（ＦＥＲＭ　Ｐ－５００７；特開昭５６－１８８９号公報）
・コリネバクテリウム・グルタミカムＡＪ１１３６８（ＦＥＲＭ　Ｐ－５０２０；特開昭５６－１８８９号公報）
・ブレビバクテリウム・フラバムＡＪ１１２１７（ＦＥＲＭ　Ｐ－４３１８；特開昭５７－２６８９号公報）
・コリネバクテリウム・グルタミカムＡＪ１１２１８（ＦＥＲＭ　Ｐ－４３１９；特開昭５７－２６８９号公報）
・ブレビバクテリウム・フラバムＡＪ１１５６４（ＦＥＲＭ　Ｐ－５４７２；特開昭５６－１４０８９５号公報）
・ブレビバクテリウム・フラバムＡＪ１１４３９（ＦＥＲＭ　Ｐ－５１３６；特開昭５６－３５９８１号公報）
・コリネバクテリウム・グルタミカムＨ７６８４（ＦＥＲＭ　ＢＰ－３００４；特開平０４－８８９９４号公報）
・ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１１４２６（ＦＥＲＭ　Ｐ－５１２３；特開平５６－０４８８９０号公報）
・コリネバクテリウム・グルタミカムＡＪ１１４４０（ＦＥＲＭ　Ｐ－５１３７；特開平５６－０４８８９０号公報）
・ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１１７９６（ＦＥＲＭ　Ｐ－６４０２；特開平５８－１５８１９２号公報）
　Ｌ－グルタミン生産能を有する微生物として好ましい例は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を強化した菌、グルタミンシンセターゼ（ｇｌｎＡ）活性を強化した菌、グルタミナーゼ遺伝子を破壊した菌である（欧州特許出願公開１２２９１２１号、１４２４３９８号明細書）。グルタミンシンセターゼの活性増強は、グルタミンアデニルトランスフェラーゼ（ｇｌｎＥ）の破壊、ＰＩＩ制御タンパク質（ｇｌｎＢ）の破壊によっても達成できる。また、エシェリヒア属に属し、グルタミンシンセターゼの３９７位のチロシン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型グルタミンシンセターゼを有する菌株も好適なＬ－グルタミン生産菌として例示できる（米国特許出願公開第２００３－０１４８４７４号明細書）。
　Ｌ－グルタミン生産能を付与又は強化する別の方法として、６－ジアゾ－５－オキソ－ノルロイシン耐性を付与する方法（特開平３－２３２４９７号公報）、プリンアナログ耐性及びメチオニンスルホキシド耐性を付与する方法（特開昭６１－２０２６９４号公報）、α－ケトマレイン酸耐性を付与する方法（特開昭５６－１５１４９５号公報）などが挙げられる。Ｌ－グルタミン生産能を有するコリネ型細菌の具体例として、以下の微生物が挙げられる。
・ブレビバクテリウム・フラバムＡＪ１１５７３（ＦＥＲＭ　Ｐ－５４９２；特開昭５６－１６１４９５号公報）
・ブレビバクテリウム・フラバムＡＪ１１５７６（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０３８１；特開昭５６－１６１４９５号公報）
・ブレビバクテリウム・フラバム　ＡＪ１２２１２（ＦＥＲＭ　Ｐ－８１２３；特開昭６１－２０２６９４号公報）
　プロリン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、シトルリン、オルニチン、及び／又はポリグルタミン酸を生産する微生物として好ましい例は、特開２０１０－４１９２０号公報に記載されている。酢酸、（ポリ）３－ヒドロキシ酪酸、イタコン酸、クエン酸、及び／又は酪酸を生産する微生物は、「発酵ハンドブック」（共立出版）に記載されている。４－アミノ酪酸を生産する微生物としては、例えば、グルタミン酸生産微生物にグルタミン酸脱炭酸酵素を導入した微生物（特開２０１１－１６７０９７号公報）が挙げられる。４－ヒドロキシ酪酸を生産する微生物としては、例えば、グルタミン酸生産微生物に、グルタミン酸脱炭酸酵素、アミノ基転移酵素、及びアルデヒド脱水素酵素を導入した微生物（特開２００９－１７１９６０号公報）が挙げられる。
　３－ヒドロキシイソ酪酸を生産する微生物としては、例えば、国際公開第２００９／１３５０７４号又は国際公開第２００８／１４５７３７号記載の経路を導入した微生物が挙げられる。２－ヒドロキシイソ酪酸を生産する微生物としては、例えば、国際公開第２００９／１３５０７４号又は国際公開第２００９／１５６２１４号記載の経路を導入した微生物が挙げられる。３－アミノイソ酪酸、及び／又はメタクリル酸を生産する微生物としては、例えば、国際公開第２００９／１３５０７４号記載の経路を導入した微生物が挙げられる。
≪アセチルＣｏＡ生産方法、アセチルＣｏＡを中間体とする代謝産物の生産方法≫
　第一の発明に係るアセチルＣｏＡ生産方法、及びアセチルＣｏＡを中間体とする代謝産物の生産方法は、第一の発明に係るアセチルＣｏＡ生産微生物と炭素源材料とを接触させて培養を行う培養工程と、前記接触により得られた目的生産物（アセチルＣｏＡ、又はアセチルＣｏＡを中間体とする代謝産物）を回収する回収工程と、を含む。アセチルＣｏＡを中間体とする代謝産物としては、例えば、アセトン、イソプロピルアルコール、グルタミン酸が挙げられる。本発明において、アセチルＣｏＡ、及びアセチルＣｏＡを中間体とする代謝産物を「目的生産物」と総称することがある。
　第二の発明に係るアセチルＣｏＡ生産方法、及びアセチルＣｏＡを中間体とする代謝産物の生産方法は、第二の発明に係るアセチルＣｏＡ生産微生物と炭素源材料とを接触させて培養を行う培養工程と、前記接触により得られた目的生産物（アセチルＣｏＡ、又はアセチルＣｏＡを中間体とする代謝産物）を回収する回収工程と、を含む。アセチルＣｏＡを中間体とする代謝産物としては、例えば、クエン酸、イタコン酸、（ポリ）３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。本発明において、アセチルＣｏＡ、及びアセチルＣｏＡを中間体とする代謝産物を「目的生産物」と総称することがある。
　上記の各生産方法によれば、各微生物と炭素源材料とを接触させて培養するので、アセチルＣｏＡ生産微生物により炭素源材料が資化され、二酸化炭素を固定しながら、効率よく目的生産物を生産することができる。
　炭素源材料としては、微生物が資化可能な炭素源を含む材料であれば特に制限はないが、植物由来の材料であることが好ましい。植物由来材料としては、根、茎、幹、枝、葉、花、種子等の器官、それらを含む植物体、それら植物器官の分解産物を指し、さらに植物体、植物器官、又はそれらの分解産物から得られる炭素源のうち、微生物が培養において炭素源として利用し得るものも、植物由来材料に包含される。
　植物由来材料に包含される炭素源には、一般的なものとしてデンプン、スクロース、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース等の糖類、及びこれら成分を多く含む草木質分解産物、セルロース加水分解物、及びこれらの組み合わせを挙げることができる。さらには植物油由来のグリセリン又は脂肪酸も、本発明における炭素源に含む。
　植物由来材料としては、穀物等の農作物が好ましく、具体的には、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿、及びこれらの組み合わせを好ましく挙げることができ、その材料としての使用形態は、未加工品、絞り汁、粉砕物など、特に限定されない。また、上記の炭素源のみの形態であってもよい。
　培養工程におけるアセチルＣｏＡ生産微生物と植物由来材料との接触は、一般に、植物由来材料を含む培地でアセチルＣｏＡ生産微生物を培養することにより行われる。
　植物由来材料とアセチルＣｏＡ生産微生物との接触密度は、アセチルＣｏＡ生産微生物の活性によって異なるが、一般に、培地中の植物由来材料の濃度として、グルコース換算で初発の糖濃度を混合物（アセチルＣｏＡ生産微生物及び炭素源材料を含む混合物）の全質量に対して２０質量％以下としてよく、アセチルＣｏＡ生産微生物の耐糖性の観点から、初発の糖濃度を１５質量％以下とすることが好ましい。この他の各成分は、微生物の培地に通常添加される量で添加されればよく、特に制限されない。
　本発明のアセチルＣｏＡ生産方法は、培養に用いる培地に、炭酸イオン、炭酸水素イオン、二酸化炭素ガス（炭酸ガス）及び／又は還元剤を供給する工程（以下、供給工程）をさらに含んでいてもよい。培養に用いる培地中に、炭酸イオン、炭酸水素イオン及び／又は二酸化炭素ガスを供給することで、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ等の酵素活性が増強し、二酸化炭素の固定量が増大し、目的生産物を効率的に生産することができる。供給工程の温度、ｐＨ等の諸条件は、特に記載がない限り、培養工程の諸条件と同様の条件を適用してよい。
　炭酸イオン又は炭酸水素イオンは、培地に供給することにより炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンを生成することができる成分に由来するものであればよい。炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンを生成することができる成分としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム等が挙げられる。
　培地に供給する炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンの量としては、目的生産物を効率的に生産することができれば特に制限はない。培地１Ｌ当たりの全供給量としては、１５０ｍｍｏｌ以上であることが好ましい。１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上の炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンを供給することにより、目的生産物の収率を十分に向上することができる。培地１Ｌ当たりの炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンの全供給量は、より好ましくは２００ｍｍｏｌ以上である。
　また、培地１Ｌ当たりの炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンの全供給量は５ｍｏｌ以下であることが好ましい。培地１Ｌ当たりの全供給量が、５ｍｏｌ以下であれば培養工程において菌体に使用されない炭酸イオンや炭酸水素イオンが多量に生じるおそれが低い。培地１Ｌ当たりの炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンの全供給量は、より好ましくは３ｍｏｌ以下であり、更に好ましくは２ｍｏｌ以下である。
　炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンの培地への供給方法は、公知の方法に従えばよい。供給の時期は、培養開始時でもよく、培養中でもよく、特に限定されない。炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンは、一括して供給してもよいし、分割して供給してもよい。
　二酸化炭素ガスとしては、二酸化炭素を含む気体であればよく、例えば、空気であってよい。二酸化炭素ガスの二酸化炭素濃度は、好ましくは空気中の二酸化炭素濃度以上であり、より好ましくは０．１ｖ／ｖ％以上であり、更に好ましくは１ｖ／ｖ％以上である。
　また、二酸化炭素濃度は、好ましくは７５ｖ／ｖ％以下であり、より好ましくは５０ｖ／ｖ％以下であり、更に好ましくは２５ｖ／ｖ％以下である。
　二酸化炭素ガスは、バブリング等により培地中に溶存させることができる。培地中に供給する二酸化炭素ガスの平均気泡径は、目的生産物を効率的に生産することができれば特に制限はない。例えば、平均気泡径１００μｍ以上の二酸化炭素ガスであることが好ましい。平均気泡径が１００μｍ以上の二酸化炭素ガスであれば、培地中の発泡性が極端に増加し、発酵培養の継続が困難となるおそれが低い。より好ましくは、平均気泡径２００μｍ以上の二酸化炭素ガスであり、更に好ましくは、平均気泡径５００μｍ以上の二酸化炭素ガスである。また、平均気泡径１００ｃｍ以下の二酸化炭素ガスであることが好ましい。平均気泡径が１００ｃｍ以下であれば、培地中への二酸化炭素の溶存が十分可能であり好ましい。より好ましくは、平均気泡径５０ｃｍ以下の二酸化炭素ガスであり、更に好ましくは、平均気泡径２０ｃｍ以下の二酸化炭素ガスである。
　二酸化炭素ガスは、通常用いられている気泡発生器を用いて培地に供給することができる。気泡発生器としては、例えばエアスパージャー等が挙げられる。
　平均気泡径の測定方法としては、例えば、粒度分布測定装置（例えば、ベックマンコールター社製LS 13 320）を用いてレーザー回折散乱法により測定する方法、精密粒度分布測定装置（例えば、ベックマンコールター社製Multisizer3）を用いて細孔電気抵抗法により測定する方法、高速ビデオカメラを用いて陰影画像を２値化し処理する方法等が挙げられる。
　還元剤としては、培養中に培地や菌体中の成分が還元され、還元剤自らは酸化される成分であれば特に制限はない。例えば、硫化物、炭素化合物、水素等が挙げられる。硫化物としては、例えば、亜硫酸塩（亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸アンモニウム等）、チオ硫酸塩（チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カリウム等）、硫化物イオンの塩（硫化ナトリウム、硫化水素ナトリウム、硫化カリウム、硫化アンモニウム等）、システイン、二酸化硫黄、硫化水素等が挙げられる。炭素化合物としては、例えば、アルコール類、脂肪酸、パラフィン、一酸化炭素等が挙げられる。還元剤としては、硫化物が好ましく、中でも亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、硫化ナトリウム、システインが好ましく、亜硫酸ナトリウムが最も好ましい。
　培地に供給する還元剤の濃度は、目的生産物を効率的に生産することができれば特に制限はなく、供給する成分に応じて適宜設定することができる。例えば、亜硫酸ナトリウムの濃度としては、培地１Ｌ当たりの濃度が、好ましくは０．０１ｇ／Ｌ以上であり、より好ましくは０．１ｇ／Ｌ以上であり、更に好ましくは１ｇ／Ｌ以上である。また、供給する還元剤の濃度は、好ましくは５０ｇ／Ｌ以下であり、より好ましくは２０ｇ／Ｌ以下であり、更に好ましくは１０ｇ／Ｌ以下である。
　本発明のアセチルＣｏＡ生産方法は、培養によって発生した二酸化炭素を含む気体を回収して、培養に用いる培地に該気体を供給する気体供給工程をさらに含んでいてもよい。すなわち、培地中で消費されずに排気として放出された二酸化炭素ガスを、再度培地に供給することにより、循環させて再利用してもよい。
　気体を培地に供給する方法としては、通常用いられている方法であれば、特に制限はない。例えば、細孔を有する環状や板状の部材から気体を液体中に加圧して噴き出す方法（気体が空気の場合はエアレータ又はエアレーションと呼ばれる方法）、ドラフトチューブと呼ばれる側周面全面に空隙を有する中空パイプから供給する方法、プラスチックス製やステンレス製の管の先端部に空気などの細かい気泡を発生させるために無数の孔が開いた多孔性物質が取り付けられたエアスパージャー（ガス分散器）を用いる方法等が挙げられる。
　培地中のアセチルＣｏＡ生産微生物の含有量としては、微生物の種類及び活性によって異なるが一般に、培養開始時に投入する前培養の菌液（ＯＤ６６０ｎｍ＝４～８）の量を、培養液に対して０．１質量％から３０質量％、培養条件制御の観点から好ましくは１質量％～１０質量％とすることができる。
　アセチルＣｏＡ生産微生物の培養に用いられる培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、及び、目的生産物を生産するために微生物が要求する無機微量元素、核酸、ビタミン類等が含まれた通常用いられる培地であれば特に制限はない。
　第一の発明において、培養工程での培養条件に特別の制限はなく、例えば、好気条件下で、ｐＨ４～９が（好ましくはｐＨ６～８）、温度が２０℃～５０℃（好ましくは２５℃～４２℃）の範囲内でｐＨと温度を制御しながら培養する。
　第二の発明において、培養工程での培養条件に特別の制限はない。アスペルギルス属菌であれば、例えば、好気条件下で、ｐＨ１～１０（好ましくはｐＨ３～７）且つ温度２０℃～５０℃（好ましくは２５℃～４２℃）の範囲内でｐＨと温度を制御しながら培養する。カプリアビダス属菌であれば、例えば、好気条件下で、ｐＨ４～９（好ましくはｐＨ６～８）且つ温度２０℃～５０℃（好ましくは２５℃～４２℃）の範囲内でｐＨと温度を制御しながら培養する。
　アセチルＣｏＡ生産微生物及び炭素源材料を含む混合物中への気体の通気量は、特に制限はないが、気体として空気のみを用いる場合には、一般的に０．０２ｖｖｍ～２．０ｖｖｍ（ｖｖｍ；通気容量〔ｍＬ〕／液容量〔ｍＬ〕／時間〔分〕）、５０～６００ｒｐｍであり、微生物への物理的ダメージを抑制する観点から０．１ｖｖｍ～２．０ｖｖｍで行うことが好ましく、より好ましくは０．１ｖｖｍ～１．０ｖｖｍである。
　培養工程は、培養開始から混合物中の炭素源材料が消費されるまで、又はアセチルＣｏＡ生産微生物の活性がなくなるまで継続させることができる。培養工程の期間は、混合物中のアセチルＣｏＡ生産微生物の数及び活性、並びに炭素源材料の量により異なるが、一般に１時間以上、好ましくは４時間以上であればよい。培養工程は、炭素源材料又はアセチルＣｏＡ生産微生物の再投入を行うことによって、培養期間を無制限に連続することができるが、処理効率の観点から、一般に５日間以下、好ましくは７２時間以下とすることができる。その他の条件は、通常の培養に用いられる条件をそのまま適用すればよい。
　培養液中に蓄積した目的生産物を回収する方法としては、特に制限はない。培養工程により得られる培養液は、目的生産物及びその他の成分が混合した混合液であるため、例えば培養液から菌体を遠心分離などで除去した後、目的生産物の種類に応じた条件による蒸留や膜分離等通常の分離方法で目的生産物を分離する方法が採用できる。
　本発明のアセチルＣｏＡ生産方法は、培養工程の前に、使用するアセチルＣｏＡ生産微生物を適切な菌数及び／又は適度な活性状態とするための前培養工程を含んでいてもよい。前培養工程は、アセチルＣｏＡ生産微生物の種類に応じた通常用いられる培養条件による培養であればよい。
－イソプロピルアルコール生産方法、アセトン生産方法－
　本発明のイソプロピルアルコール生産方法及びアセトン生産方法は、アセチルＣｏＡ生産微生物を用いて、炭素源材料から、それぞれ目的生産物であるイソプロピルアルコール又はアセトンを生産することを含む。即ち、本発明のイソプロピルアルコール生産方法及びアセトン生産方法は、アセチルＣｏＡ生産微生物と炭素源材料とを接触させて培養する培養工程と、前記接触により得られた目的生産物（イソプロピルアルコール又はアセトン）を回収する回収工程と、を含む。
　イソプロピルアルコール生産方法において用いられるアセチルＣｏＡ生産微生物としては、アセチルＣｏＡ生産微生物の好ましい一態様として前述した、チオラーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するものが、イソプロピルアルコールの生産効率の観点から好ましい。
　アセトン生産方法において用いられるアセチルＣｏＡ生産微生物としては、アセチルＣｏＡ生産微生物の好ましい一態様として前述した、チオラーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有するものが、アセトンの生産効率の観点から好ましい。
　イソプロピルアルコール生産方法及びアセトン生産方法は、好ましくは、アセチルＣｏＡ生産微生物及び炭素源材料を含む混合物中に気体を供給しながら、アセチルＣｏＡ生産微生物を培養する培養工程（「通気培養工程」ということがある）と、前記培養工程により生成した目的生産物（イソプロピルアルコール又はアセトン）を混合物から分離し回収する目的生産物回収工程と、を含む。通気培養工程における通気培養により、目的生産物は混合物中に放出されると共に、混合物から蒸散し、その結果、目的生産物を混合物から容易に分離することができる。また、目的生産物が混合物から連続的に分離されるため、混合物中の目的生産物の濃度の上昇を抑制することができる。そのため、アセチルＣｏＡ生産微生物の目的生産物に対する耐性を特に考慮する必要がない。培養条件については、前述した事項がそのまま適用される。
　前記目的生産物回収工程における目的生産物の回収方法としては、培養により混合物から蒸散したガス状又は飛沫状の目的生産物を収集することができるものであればよい。例えば、一般に用いられる密閉容器等の収集部材へ収容することを挙げることができ、目的生産物のみを純度高く回収できる観点から、目的生産物を捕捉するための捕捉液と、混合物から分離した目的生産物とを接触させることを含む方法が好ましい。
　イソプロピルアルコール生産方法及びアセトン生産方法では、目的生産物は、捕捉液又は混合物に溶解した態様として回収することができる。そのような回収方法としては、例えば国際公開２００９／００８３７７号に記載された方法が挙げられる。回収された目的生産物が水溶液の状態である場合には、本発明はさらに脱水工程を含んでいてもよい。目的生産物の脱水は、常法により行なうことができる。回収された目的生産物は、ＨＰＬＣ等の通常の検出手段を用いて確認することができる。回収された目的生産物は、必要に応じてさらに精製してよい。精製方法としては、例えば蒸留が挙げられる。
　捕捉液又は混合物に溶解した態様として回収可能な目的生産物の生産方法に適用する装置としては、例えば、国際公開２００９／００８３７７号の図１に示される生産装置を挙げることができる。この生産装置では、使用される微生物と植物由来材料とを含む培地が収容された培養槽に、装置外部から気体を注入するための注入管が連結され、培地に対してエアレーションが可能となっている。培養槽には、連結管を介して、捕捉液（トラップ液）が収容されたトラップ槽が連結されている。培養槽で通気培養により生成した目的生産物はエアレーションによって蒸散して培地から容易に分離されると共に、トラップ槽へ移動した気体又は液体がトラップ液と接触してバブリングが生じトラップ液に捕捉される。この生産装置によれば、目的生産物を、より精製された形態で連続的に且つ簡便に生産することができる。
－グルタミン酸生産方法－
　本発明のグルタミン酸生産方法は、アセチルＣｏＡ生産微生物を用いて、炭素源材料から、目的生産物であるグルタミン酸を生産することを含む。即ち、本発明のグルタミン酸生産方法は、アセチルＣｏＡ生産微生物と炭素源材料とを接触させて培養する培養工程と、前記接触により得られた目的生産物（グルタミン酸）を回収する回収工程と、を含む。
　本発明のグルタミン酸生産方法によれば、アセチルＣｏＡ生産微生物と炭素源材料とを接触させて培養するので、アセチルＣｏＡ生産微生物により炭素源材料が資化され、二酸化炭素を固定しながら、効率よくグルタミン酸を生産することができる。
　培養に用いる培地は、炭素源；窒素源；無機塩類；アミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素；などを含有する通常の培地を用いることができる。合成培地又は天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源及び窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
　炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類；酢酸、クエン酸等の有機酸；エタノール等のアルコール類；を単独又は併用して用いることができる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩；硝酸塩；などを使用することができる。無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を使用できる。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク分解物等が使用できる。生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、要求される栄養素を補添することが好ましい。
　培養は、温度を２０℃～４５℃、ｐＨを３～９に制御し、通気培養を行うことが好ましい。ｐＨ調整には、無機若しくは有機の酸性、アルカリ性物質、アンモニアガス等を使用することができる。このような条件下で、好ましくは１０時間～１２０時間程度培養することにより、培養液中又は菌体内にＬ－アミノ酸が蓄積される。
　目的とするＬ－アミノ酸がＬ－グルタミン酸である場合、Ｌ－グルタミン酸が析出するような条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ－グルタミン酸を析出させながら微生物の培養を行ってもよい。Ｌ－グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、ｐＨ４．０～５．０、好ましくはｐＨ４．０～４．５、より好ましくはｐＨ４．０～４．３、特に好ましくはｐＨ４．０の、酸性条件を挙げることができる。酸性条件下での微生物の生育の向上、及び、効率的なＬ－グルタミン酸の析出を両立するためには、ｐＨは好ましくは４．０～５．０、より好ましくは４．０～４．５、更に好ましくは４．０～４．３である。上記ｐＨでの培養は、培養の全期間であってもよく、一部であってもよい。
　培養終了後の培養液からＬ－アミノ酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法、イオン交換クロマトグラフィーによる方法である。培養液中にＬ－グルタミン酸が析出するような条件下で培養した場合、培養液中に析出したＬ－グルタミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することができる。この場合、培養液中に溶解しているＬ－グルタミン酸を晶析させた後に、これを共に採取してもよい。
－クエン酸生産方法、イタコン酸生産方法、（ポリ）３－ヒドロキシ酪酸生産方法－
　本発明のクエン酸生産方法、イタコン酸生産方法、（ポリ）３－ヒドロキシ酪酸生産方法は、アセチルＣｏＡ生産微生物を用いて、炭素源材料から、それぞれの目的生産物（クエン酸、イタコン酸、又は（ポリ）３－ヒドロキシ酪酸）を生産することを含む。即ち、本発明のクエン酸生産方法、イタコン酸生産方法、（ポリ）３－ヒドロキシ酪酸生産方法は、アセチルＣｏＡ生産微生物と炭素源材料とを接触させて培養する培養工程と、前記接触により得られた目的生産物（クエン酸、イタコン酸、又は（ポリ）３－ヒドロキシ酪酸）を回収する回収工程と、を含む。
　上記の各生産方法によれば、アセチルＣｏＡ生産微生物と炭素源材料とを接触させて培養するので、アセチルＣｏＡ生産微生物により炭素源材料が資化され、二酸化炭素を固定しながら、効率よく目的生産物（クエン酸、イタコン酸、又は（ポリ）３－ヒドロキシ酪酸）を生産することができる。
　培養に用いる培地は、炭素源；窒素源；無機塩類；アミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素；などを含有する通常の培地を用いることができる。合成培地又は天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源及び窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
　炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類；酢酸、クエン酸等の有機酸；エタノール等のアルコール類；を単独又は併用して用いることができる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩；硝酸塩；などを使用することができる。無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を使用できる。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク分解物等が使用できる。生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、要求される栄養素を補添することが好ましい。
　本発明のクエン酸生産方法、イタコン酸生産方法、及び（ポリ）３－ヒドロキシ酪酸生産方法では、目的生産物（クエン酸、イタコン酸、又は（ポリ）３－ヒドロキシ酪酸）は、培養液に溶解した態様、培養液から固体として析出させた様態、又は菌体内に蓄積させた様態として回収することができる。回収された目的生産物が水溶液の状態である場合には、本発明はさらに脱水工程を含んでいてもよい。目的生産物の脱水は、常法により行なうことができる。回収された目的生産物は、ＨＰＬＣ等の通常の検出手段を用いて確認することができる。回収された目的生産物は、必要に応じてさらに精製してよい。精製方法としては、晶析、イオン交換樹脂等によるカラム精製などを挙げることができる。
　本発明の微生物を応用して、プロリン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、シトルリン、オルニチン、酢酸、（ポリ）３－ヒドロキシ酪酸、イタコン酸、クエン酸、酪酸、ポリグルタミン酸を生産する方法としては、例えば、「発酵ハンドブック」（共立出版）ｐ３６３～ｐ３６４、ｐ６１～ｐ６３、ｐ６１～ｐ６３、ｐ６１～ｐ６３、ｐ４０～ｐ４２、ｐ４０～ｐ４２、ｐ４０～ｐ４２、ｐ１８９～ｐ１９２、ｐ３７７～ｐ３７８、ｐ６４～ｐ６５、ｐ１２４～ｐ１２５、ｐ１９～ｐ２３、ｐ３７３にそれぞれ記載された方法が挙げられる。
　本発明の微生物を応用して、４－アミノ酪酸を生産する方法としては、例えば、グルタミン酸生産微生物にグルタミン酸脱炭酸酵素を導入した微生物（特開２０１１－１６７０９７号公報）による生産方法が挙げられる。
　本発明の微生物を応用して、４－ヒドロキシ酪酸を生産する方法としては、例えば、グルタミン酸生産微生物に、グルタミン酸脱炭酸酵素、アミノ基転移酵素、及びアルデヒド脱水素酵素を導入した微生物（特開２００９－１７１９６０号公報）による生産方法が挙げられる。
　本発明の微生物を応用して、３－ヒドロキシイソ酪酸を生産する方法としては、例えば、国際公開第２００９／１３５０７４号又は国際公開第２００８／１４５７３７号に記載の経路を導入した微生物による生産方法が挙げられる。
　本発明の微生物を応用して、２－ヒドロキシイソ酪酸を生産する方法としては、例えば、国際公開第２００９／１３５０７４号又は国際公開第２００９／１５６２１４号記載の経路を導入した微生物による生産方法が挙げられる。
　本発明の微生物を応用して、３－アミノイソ酪酸及び／又はメタクリル酸を生産する方法としては、例えば、国際公開第２００９／１３５０７４号記載の経路を導入した微生物による生産方法が挙げられる。
　以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。しかしながら、本発明は実施例に何ら限定されるものではない。
　細胞外から導入された遺伝子を発現させるために必要なプロモーターとして、エシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のプロモーターを使用することができる。エシェリヒア・コリ由来のＧＡＰＤＨプロモーターの塩基配列は、GenBank accession number X02662の塩基配列情報において、３９７～４４０に記されている。以下の実施例におけるＧＡＰＤＨプロモーターとは、上記のＧＡＰＤＨプロモーターを意味する。
　エシェリヒア・コリＭＧ１６５５は、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）から入手できる。
　エシェリヒア・コリＢ（ＡＴＣＣ１１３０３）は、ＡＴＣＣから入手できる。
　メチロコッカス・キャプスラタスＡＴＣＣ３３００９のゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ３３００９Ｄ－５）は、ＡＴＣＣから入手できる。
　コリネバクテリウムＤＳＭ１４１２は、ＤＳＭＺ（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures）から入手できる。
　ロドコッカス・ジョスティＮＢＲＣ１６２９５は、ＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門）から入手できる。
　アスペルギルス・ニガーＡＴＣＣ１０１５は、ＡＴＣＣから入手できる。
　アスペルギルス・テレウスＮＢＲＣ６３６５は、ＮＢＲＣから入手できる。
　カプリアビダス・ネカトールＪＭＰ１３４（ＤＳＭ４０５８）は、ＤＳＭＺから入手できる。
［実施例１］
＜プラスミドｐＭＷＧＫＣの作製＞
　ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するため、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＣＧＡＧＣＴＡＣＡＴＡＴＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＣＧ（配列番号４２）及びＣＧＣＧＣＧＣＡＴＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＧ（配列番号４３）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｄｅＩ及びＳｐｈＩで消化することで約１１０ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターにあたるＤＮＡフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントと、プラスミドｐＢＲ３２２（GenBank accession number J01749）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＳｐｈＩで消化することで得られるフラグメントとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社　ＤＮＡ－９０３）に形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、プラスミドｐＢＲｇａｐＰを得た。
　プラスミドｐＢＲｇａｐＰをテンプレートとし、ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＡＴＧＣＴＧＴＣＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧ（配列番号４４）及びＧＣＴＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣ（配列番号４５）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントをＴ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋｉｎａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）でリン酸化することで、ＧＡＰＤＨプロモーターを含むＤＮＡフラグメントを得た。
　プラスミドｐＭＷ１１９（GenBank accession number AB005476）を制限酵素ＡａｔＩＩ及びＮｄｅＩで処理し、得られたＤＮＡフラグメントをＫＯＤ　ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）で末端を平滑化することで、ｐＭＷ１１９の複製起点を含むＤＮＡフラグメントを得た。
　ＧＡＰＤＨプロモーターを含むＤＮＡフラグメントとｐＭＷ１１９の複製起点を含むＤＮＡフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ液体培地において３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、プラスミドｐＭＷＧを得た。
　クロラムフェニコール耐性遺伝子を取得するため、ｐＴＨ１８ｃｓ１（GenBank accession number AB019610）をテンプレートとし、ＴＣＧＧＣＡＣＧＴＡＡＧＡＧＧＴＴＣＣ（配列番号４６）及びＣＧＧＧＴＣＧＡＡＴＴＴＧＣＴＴＴＣＧ（配列番号４７）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントをＴ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋｉｎａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）でリン酸化することで、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを得た。その後、ｐＭＷＧをテンプレートとし、ＣＴＡＧＡＴＣＴＧＡＣＡＧＴＡＡＧＡＣＧＧＧＴＡＡＧＣＣ（配列番号４８）及びＣＴＡＧＡＴＣＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣ（配列番号４９）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅し、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むＤＮＡフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られたプラスミドをｐＭＷＧＣとした。
　プラスミドｐＭＷＧＣをテンプレートとし、ＣＣＴＴＴＧＧＴＴＡＡＡＧＧＣＴＴＴＡＡＧＡＴＣＴＴＣＣＡＧＴＧＧＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＣ（配列番号５０）及びＧＧＣＡＴＡＧＴＴＴＧＴＣＣＡＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＡＡＡＧＣＣＴＴＴＡＡＣＣＡＡＡＧＧ（配列番号５１）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅し、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、プラスミドｐＭＷＧＫＣを得た。
［実施例２］
＜メチロコッカス・キャプスラタスＡＴＣＣ３３００９由来ｍｔｋ及びｍｃｌ発現プラスミドｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）の構築＞
　メチロコッカス・キャプスラタスのゲノムＤＮＡを鋳型として、ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＣＴＧＴＴＡＡＡＡＡＴＣＧＴＣＴＡＣ（配列番号５２）及びＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＡＡＴＣＴＧＡＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣ（配列番号５３）をプライマーとしてＰＣＲを実施し、メチロコッカスのｍｃｌ－ｍｔｋフラグメントを得た。ｍｃｌ－ｍｔｋフラグメントをＮｄｅＩとＸｂａＩで切断し得られたフラグメントと、実施例１で作製したプラスミドｐＭＷＧＫＣをＮｄｅＩとＸｂａＩで切断して得られたフラグメントとを連結した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地にて３０℃で一晩培養し、得られたプラスミドをｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）と命名した。
　ｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）は、メチロコッカス・キャプスラタス由来のマリルＣｏＡリアーゼ遺伝子（ｍｃｌ）の塩基配列（配列番号４１）、マレートチオキナーゼのサブユニットα遺伝子（ｍｔｋＡ）の塩基配列（配列番号２８）、及びマレートチオキナーゼのサブユニットβ遺伝子（ｍｔｋＢ）の塩基配列（配列番号２９）を含む。メチロコッカス・キャプスラタス由来のマリルＣｏＡリアーゼ（Ｍｃｌ）のアミノ酸配列、マレートチオキナーゼのサブユニットα（ＭｔｋＡ）のアミノ酸配列、及びマレートチオキナーゼのサブユニットβ（ＭｔｋＢ）のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３６、配列番号１３、及び配列番号１４に示すとおりである。
［実施例３］
＜プラスミドｐＣＡＳＥＴの作製＞
　ｐＨＳＧ２９８（Ｔａｋａｒａ）をテンプレートとし、ＣＧＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＣＴＣＡＴＡＣＣＡＧＧＣＣＴＧ（配列番号５４）及びＣＧＣＣＴＣＧＡＧＧＣＡＡＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＡＣＧＡＧ（配列番号５５）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｈｏＩで消化し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社　ＤＮＡ－９０３）に形質転換し、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ｐＨＳＧ２９８にＸｈｏＩの認識配列が挿入されたプラスミドをｐＨＳＧ２９８－ＸｈｏＩと命名した。
　ｔａｃプロモーターを取得するため、ｐＫＫ２２３－３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をテンプレートとし、ＡＴＣＡＴＣＣＡＧＣＴＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＣＡＴＣＧＧＡＡＧ（配列番号５６）及びＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＧＴＴ（配列番号５７）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＰｖｕＩＩ及びＳｍａＩで消化することで約０．２ｋｂｐのｔａｃプロモーターをコードするＤＮＡフラグメントを得た。
　ｔａｃプロモーターをコードするＤＮＡフラグメントと、プラスミドｐＨＳＧ２９８－ＸｈｏＩを制限酵素ＰｖｕＩＩで消化しさらにアルカリフォスファターゼ処理した約２．４ｋｂｐのＤＮＡフラグメントとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社　ＤＮＡ－９０３）に形質転換し、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ｐＨＳＧ２９８－ＸｈｏＩのｌａｃプロモーターがｔａｃプロモーターに置換され、ｔａｃプロモーターの方向が元のｌａｃプロモーターと同じ向きになっているプラスミドｐＨＳＧＴ１を得た。
　得られたｐＨＳＧＴ１のｔａｃプロモーターの下流にｐＨＳＧ２９８のマルチクローニングサイトを連結するために、ｐＨＳＧ２９８を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＣｌａＩで消化することでｐＨＳＧ２９８のマルチクローニングサイトを含む約１．０ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと、プラスミドｐＨＳＧＴ１を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＣｌａＩで消化しさらにアルカリフォスファターゼ処理した約１．７ｋｂｐのＤＮＡフラグメントとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社　ＤＮＡ－９０３）に形質転換し、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ｔａｃプロモーターの下流にｐＨＳＧ２９８のマルチクローニングサイトが連結されたプラスミドｐＨＳＧＴ２を得た。
　コリネバクテリウム・カゼイＪＣＭ１２０７２から単離されたｐＣＡＳＥ１（Applied Microbiology and Biotechnology, 2009; 81: 1107-1115）の複製起点、ｒｅｐＡ及びｒｅｐＢを含むＤＮＡフラグメント（配列番号５８）をＤＮＡ合成により作製した。配列を以下に示す。
配列番号５８：ＣＧＣＣＴＣＧＡＧＣＡＣＴＧＧＡＡＧＧＧＴＴＣＴＴＣＡＧＧＧＧＡＡＣＣＣＣＣＧＧＡＡＡＣＣＧＧＧＧＡＡＡＣＡＴＣＴＧＡＣＴＴＧＧＴＴＡＡＡＴＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴＧＡＡＣＡＣＧＣＣＧＡＧＧＡＡＴＧＡＡＡＡＣＣＧＡＣＣＧＴＧＣＡＣＧＣＴＣＧＴＧＴＧＡＧＡＡＡＧＴＣＡＧＣＴＡＣＡＴＧＡＧＡＣＣＡＡＣＴＡＣＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＧＧＡＣＧＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＴＧＧＣＣＡＴＴＧＧＣＡＡＧＣＧＡＴＧＡＣＣＴＣＣＧＴＧＡＧＧＧＣＡＴＴＴＡＣＣＧＣＡＣＣＴＣＡＣＧＧＡＡＧＡＡＣＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＡＧＣＧＣＴＡＣＧＴＣＧＡＡＧＣＣＡＡＴＣＣＣＧＡＣＧＣＧＣＴＣＴＣＴＡＡＣＣＴＣＣＴＧＧＴＣＧＴＴＧＡＣＡＴＣＧＡＣＣＡＧＧＡＧＧＡＣＧＣＧＣＴＴＴＴＧＣＧＣＴＣＴＴＴＧＴＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣＣＴＡＡＣＧＣＧＧＴＧＧＴＴＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＴＡＡＡＣＧＧＧＣＡＣＧＣＡＣＡＣＧＣＴＧＴＣＴＧＧＧＣＧＣＴＣＧＣＧＧＡＧＣＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＣＡＣＣＧＡＡＴＡＣＧＣＣＡＡＡＣＧＣＡＡＧＣＣＴＴＴＧＧＣＣＴＡＴＧＣＣＧＣＧＧＣＴＧＴＣＡＣＣＧＡＡＧＧＣＣＴＡＣＧＧＣＧＣＴＣＴＧＴＣＧＡＴＧＧＣＧＡＴＡＧＣＧＧＡＴＡＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＡＴＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＣＣＣＧＡＧＣＡＣＡＣＴＧＣＡＴＧＧＧＡＴＡＧＴＣＡＣＴＧＧＡＴＣＡＣＣＧＡＴＡＡＧＣＴＧＴＡＴＡＣＧＣＴＣＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＴＴＴＴＧＧＣＴＣＧＡＡＧＡＡＡＣＣＧＧＣＴＴＴＡＴＧＣＣＧＣＣＴＧＣＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＣＧＣＧＧＣＧＧＴＴＣＴＣＧＣＣＡＧＴＴＧＧＴＣＴＡＧＧＴＣＧＴＡＡＴＴＧＣＧＣＡＣＴＣＴＴＴＧＡＡＡＧＣＧＣＡＣＧＴＡＣＧＴＧＧＧＣＡＴＡＴＣＧＧＧＡＧＧＴＣＡＧＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＧＧＡＧＡＣＧＣＴＧＡＣＧＧＣＣＴＡＧＧＣＣＧＣＧＣＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＧＣＡＡＧＣＡＣＴＴＡＡＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＴＴＴＧＡＴＧＡＡＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＴＧＧＣＣＧＡＡＧＴＴＧＡＣＴＧＴＡＴＴＧＣＣＡＧＧＴＣＡＡＴＣＣＡＴＡＡＡＴＧＧＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＴＣＡＣＧＣＡＴＧＴＧＧＡＣＡＧＡＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＴＧＣＡＡＴＣＣＧＣＡＣＧＣＧＧＧＡＡＧＡＡＡＧＧＣＴＧＧＣＡＡＣＧＡＡＧＣＧＣＴＧＡＧＧＴＧＣＧＴＣＧＴＧＡＧＧＣＴＧＧＡＣＡＴＡＣＴＣＴＴＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡＴＴＧＧＣＴＡＡＧＧＴＴＴＡＴＧＣＡＣＧＴＴＡＴＣＣＡＣＧＣＡＡＣＧＧＡＡＡＡＡＣＡＧＣＣＣＧＣＧＡＧＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＧＴＧＣＣＧＧＴＡＴＧＴＣＧＧＴＧＡＧＡＡＣＡＧＣＴＣＡＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＴＣＣＧＡＡＣＣＧＣＧＴＧＡＡＧＴＧＴＴＣＡＴＴＡＡＡＣＧＴＧＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＴＧＣＴＣＧＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＧＣＧＣＣＡＡＡＧＧＴＣＴＧＴＣＣＡＴＧＣＧＣＧＣＴＡＴＣＧＣＧＧＣＡＧＡＧＡＴＴＧＧＴＴＧＣＴＣＧＧＴＧＧＧＣＡＣＧＧＴＴＣＡＣＣＧＣＴＡＣＧＴＣＡＡＡＧＡＡＧＴＴＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＧＣＧＴＡＡＡＴＣＣＡＧＣＧＧＴＴＴＡＧＴＣＡＣＣＣＴＣＧＧＣＧＴＧＴＴＣＡＡＡＧＴＣＣＡＴＣＧＴＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＧＣＴＣＧＡＧＧＣＧ
　作製したＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｈｏＩで消化することで得られたＤＮＡフラグメントと、プラスミドｐＨＳＧＴ２を制限酵素ＸｈｏＩで消化しさらにアルカリフォスファターゼ処理したＤＮＡフラグメントとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社　ＤＮＡ－９０３）に形質転換し、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ｐＨＳＧＴ２のＸｈｏＩ認識部位にｐＣＡＳＥ１の複製起点、ｒｅｐＡ及びｒｅｐＢを含むＤＮＡフラグメントが挿入されたプラスミドをｐＣＡＳＥＴと命名した。回収したｐＣＡＳＥＴでは、ｐＣＡＳＥ１由来ｒｅｐＡの方向がｔａｃプロモーターと逆向きになっていた。
［実施例４］
＜メチロコッカス・キャプスラタス由来ｍｔｋ及びｍｃｌ発現プラスミドｐＣＡＳＥＴ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）の構築＞
　ｐＭＷＧＫＣ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）（メチロコッカス・キャプスラタス由来ｍｃｌ及びｍｔｋを含む遺伝子）を鋳型として、ＧＧＡＡＴＴＣＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＡＡＡＡＣＡＡＴＧＧＣＴＧＴＣＡＡＧＡＡＣＣＧＴＣＴＡＣ（配列番号５９）及びＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＡＡＴＣＴＧＡＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧ（配列番号６０）のプライマーペアでＰＣＲを実施し、メチロコッカスのｍｃｌ－ｍｔｋを含むＤＮＡ断片を得た。配列番号５９及び配列番号６０のプライマーは５’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位を有している。
　メチロコッカスのｍｃｌ－ｍｔｋを含むＤＮＡ断片と、実施例３で作製したプラスミドｐＣＡＳＥＴをＥｃｏＲＩで切断し脱リン酸化したものとを、リガーゼで結合した後、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡績株式会社　ＤＮＡ－９００）に形質転換し、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ｍｃｌ－ｍｔｋフラグメントがプラスミドのプロモーターによる発現に適した方向に挿入されているプラスミドをｐＣＡＳＥＴ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）と命名した。
　ｐＣＡＳＥＴ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）は、メチロコッカス・キャプスラタス由来のｍｃｌの塩基配列（配列番号４１）、ｍｔｋＡの塩基配列（配列番号２８）、及びｍｔｋＢの塩基配列（配列番号２９）を含む。
［実施例５］
＜コリネバクテリウム用ｍｔｋ、ｍｃｌ、ｇｃｌ及びｇｌｘＲ発現プラスミドの構築＞
　ロドコッカス・ジョスティＮＢＲＣ１６２９５をＮＢＲＣの培地番号８０２で培養し、ＤＮｅａｓｙ　Ｂｌｏｏｄ　＆　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔ（株式会社キアゲン）を用いてゲノムＤＮＡを得た。このゲノムＤＮＡを鋳型として、ＣＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＡＡＡＡＣＡＡＴＧＡＧＣＡＣＣＡＴＴＧＣＡＴＴＣＡＴＣＧＧ（配列番号６１）ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＴＧＡＧＡＧ（配列番号６２）をプライマーとしてＰＣＲを実施し、ロドコッカスのｇｌｘＲ－ｇｃｌフラグメントを得た（配列番号６３）。
　ロドコッカスのｇｌｘＲ－ｇｃｌフラグメントをＳａｃＩとＢａｍＨＩで切断し得られたフラグメントと、実施例４で構築したｐＣＡＳＥＴ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）をＳａｃＩとＢａｍＨＩで切断して得られたフラグメントとを連結後、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡績株式会社　ＤＮＡ－９００）に形質転換し、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ｐＣＡＳＥＴ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）にｇｌｘＲ－ｇｃｌフラグメントが挿入されたプラスミドをｐＣＡＳＥＴ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）＿ｇｌｘＲ（Ｒｊ）＿ｇｃｌ（Ｒｊ）と命名した。
　プラスミドｐＣＡＳＥＴ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）＿ｇｌｘＲ（Ｒｊ）＿ｇｃｌ（Ｒｊ）は、メチロコッカス・キャプスラタス由来のｍｃｌの塩基配列（配列番号４１）、ｍｔｋＡの塩基配列（配列番号２８）、及びｍｔｋＢの塩基配列（配列番号２９）のほかに、ロドコッカス・ジョスティ由来の２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ（ｇｌｘＲ）の塩基配列（配列番号６４）及びグリオキシル酸カルボリガーゼ（ｇｃｌ）の塩基配列（配列番号６５）を含む。ロドコッカス・ジョスティ由来の２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ（ＧｌｘＲ）のアミノ酸配列及びグリオキシル酸カルボリガーゼ（Ｇｃｌ）のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６６及び配列番号６７に示すとおりである。
［実施例６］
＜プラスミドｐＭＷＣＢＬの作製＞
　実施例１で作製したｐＭＷＧＫＣをテンプレートとし、ＡＴＣＧＡＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＣＣＧＴＣＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＡＧ（配列番号６８）及びＡＴＣＧＡＴＣＴＣＧＡＧＧＣＣＴＧＴＴＧＡＴＧＡＴＡＣＣＧＣＴＧＣＣＴＴＡ（配列番号６９）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｈｏＩで消化し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社　ＤＮＡ－９０３）に形質転換し、１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ｐＭＷＧＫＣにＸｈｏＩの認識配列が挿入されたプラスミドをｐＭＷＧＫＣ－ＸｈｏＩと命名した。
　コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９からプラスミドｐＢＬ１（Journal of General Microbiology, 1984; 130: 2237-2246）を調製し、得られたプラスミドを鋳型とし、ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＴＣＡ（配列番号７０）とＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＴＣＡＴＧＴ（配列番号７１）のプライマーペアでＰＣＲを行うことにより、複製起点及びｒｅｐＡを含む約１．８ｋｂのＤＮＡフラグメント（配列番号７２）を増幅した。配列を以下に示す。
配列番号７２：ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＴＣＡＴＡＧＴＴＴＧＣＣＣＣＣＧＣＧＡＣＡＴＴＧＡＣＣＡＴＡＡＡＴＴＣＡＴＣＧＣＡＣＡＡＡＡＴＡＴＣＧＡＡＣＧＧＧＧＴＴＴＡＴＧＣＣＧＣＴＴＴＴＡＧＴＧＧＧＴＧＣＧＡＡＧＡＡＴＡＧＴＣＴＧＣＴＣＡＴＴＡＣＣＣＧＣＧＡＡＣＡＣＣＧＣＣＧＣＡＴＴＣＡＧＡＴＣＡＣＧＣＴＴＡＧＴＡＧＣＧＴＣＣＣＣＡＴＧＡＧＴＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＧＣＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＡＣＡＴＣＡＴＣＣＡＴＡＡＣＧＡＴＣＡＴＧＣＡＣＧＧＧＧＴＧＧＡＡＴＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＡＣＴＴＧＣＣＡＧＣＡＣＣＴＣＡＴＴＡＧＣＧＡＣＡＣＧＴＴＧＣＧＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＧＴＣＣＴＴＡＧＣＣＴＴＡＴＣＣＡＣＧＣＡＡＴＣＴＡＧＡＡＣＧＴＡＣＴＧＣＣＴＡＡＣＣＧＣＧＡＡＡＴＣＡＧＡＣＴＧＡＡＴＣＡＧＴＴＴＣＣＡＡＴＣＡＴＣＧＧＧＣＴＴＣＡＣＣＡＡＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＧＣＧＧＧＴＴＧＡＴＴＣＧＡＣＣＣＧＴＴＣＣＧＧＴＧＣＴＴＣＣＡＧＡＣＣＧＧＣＧＡＧＣＴＴＧＴＡＣＡＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＡＣＧＡＣＧＴＡＣＡＴＣＡＧＣＧＴＣＴＡＴＧＴＡＡＴＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＡＧＣＡＣＧＣＴＴＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＧＡＣＣＡＧＧＡＣＧＡＡＣＧＣＡＧＧＴＴＴＴＴＡＧＡＡＣＣＡＡＣＣＴＣＡＴＡＣＴＣＡＣＧＣＣＡＣＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＡＡＡＣＡＧＣＧＴＣＣＡＴＡＴＣＣＴＣＧＣＣＧＧＣＧＴＣＧＣＴＴＴＧＡＴＣＧＧＣＣＡＡＣＡＴＡＴＣＣＡＡＣＡＴＣＴＧＡＡＡＣＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＡＣＣＣＣＴＴＡＧＡＣＧＣＧＧＴＴＴＴＡＧＴＡＧＣＧＧＡＧＣＣＡＧＴＣＡＧＴＴＣＣＴＧＡＧＡＣＡＴＧＣＣＣＴＴＡＧＣＧＡＧＧＴＡＧＧＴＴＧＣＣＡＴＴＴＴＣＧＣＡＧＣＧＴＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＧＧＴＡＧＡＣＡＣＣＴＧＡＴＣＡＡＧＴＴＴＧＡＣＣＣＣＧＴＧＣＴＣＡＣＧＣＡＧＴＧＧＣＧＣＧＴＣＣＡＴＡＣＣＧＧＣＣＴＴＡＡＣＣＡＣＡＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＣＧＧＧＡＡＡＡＣＡＴＧＧＡＡＴＣＣＴＣＡＡＡＣＧＣＣＴＴＧＡＧＴＴＣＡＴＣＧＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＡＣＧＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＧＴＴＧＣＧＧＴＧＣＡＡＧＴＧＣＣＡＡＣＣＧＴＴＣＧＣＣＣＡＡＧＡＧＴＣＴＧＴＧＡＣＣＴＣＡＴＡＧＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＧＴＧＣＴＣＣＡＣＣＣＣＧＴＡＣＣＧＴＧＣＡＣＧＴＴＣＴＴＴＣＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＡＴＧＴＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＧＡＡＧＡＧＴＡＣＧＣＡＧＴＣＴＴＡＡＴＡＣＣＣＧＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＣＧＣＡＡＡＴＧＡＣＴＧＴＧＡＧＣＧＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＡＣＡＧＴＧＣＣＣＡＣＡＡＡＣＡＴＣＡＴＧＡＧＣＧＣＧＣＣＡＣＣＣＧＣＣＧＣＣＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＴＡＧＴＡＧＣＡＡＴＡＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＴＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＣＣＣＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＡＴＴＣＡＧＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＴＧＡＧＡＧＴＴＴＴＧＣＡＧＡＣＣＣＴＣＡＡＡＣＴＧＣＧＡＡＧＣＡＣＣＧＴＴＡＧＡＣＧＡＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＡＡＣＡＧＣＴＴＣＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＡＣＣＴＡＴＧＧＣＡＣＣＣＣＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＴＡＣＴＡＴＴＧＧＴＧＡＴＣＴＴＧＴＡＣＡＴＧＡＣＧＴＴＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣＧＣＣＣＴＡＧＣＧＣＧＡＧＴＧＡＣＣＴＴＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＴＴＧＡＣＣＴＧＣＧＧＴＴＣＣＴＴＡＧＡＧＧＴＧＴＴＣＡＣＴＴＣＴＡＴＴＴＣＡＧＴＧＴＴＡＣＣＴＡＧＡＣＣＣＧＡＴＧＴＴＧＴＧＣＧＧＧＧＴＴＧＣＧＣＡＧＴＧＣＧＡＧＴＴＴＧＴＧＣＧＧＧＴＧＴＴＧＴＧＣＣＣＧＴＴＧＴＣＴＴＡＧＣＴＡＧＴＧＣＴＡＴＧＧＴＴＧＴＣＡＡＴＴＧＡＡＡＣＣＣＣＴＴＣＧＧＧＴＴＡＴＧＴＧＧＣＣＣＣＣＧＴＧＣＡＴＡＴＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＧＣＡＣＧＧＧＧＧＴＴＴＧＴＣＴＴＧＴＣＴＡＧＧＧＡＣＴＡＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＧＴＧＧＴＧＴＴＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧＣＴＴＧＧＣＴＡＴＧＣＧＴＧＣＣＡＧＣＴＴＡＣＣＣＧＴＡＣＴＣＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＡＴＴＴＧＣＡＴＣＧＡＣＡＴＧＧＧＡＧＧＧＴＴＡＣＧＴＧＴＣＣＧＡＴＡＣＣＴＡＧＧＧＧＧＧＧＴＡＴＣＣＧＣＧＡＣＴＡＧＧＴＧＣＣＣＣＧＧＴＧＣＴＣＡＣＴＧＴＣＴＧＴＡＣＣＧＧＣＧＧＧＧＣＡＡＧＣＣＣＣＡＣＡＣＣＣＣＧＣＡＴＧＧＡＣＡＧＧＧＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＣＣＣＣＡＧＣＡＡＴＣＴＧＣＡＴＧＴＡＣＡＴＧＴＴＴＴＡＣＡＣＡＴＴＡＧＣＡＣＧＡＣＡＴＧＡＣＴＧＣＡＴＧＴＧＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧ
　増幅したＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｈｏＩで消化することで得られたＤＮＡフラグメントと、プラスミドｐＭＷＧＫＣ－ＸｈｏＩを制限酵素ＸｈｏＩで消化しさらにアルカリフォスファターゼ処理したＤＮＡフラグメントとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡績株式会社　ＤＮＡ－９００）に形質転換し、１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ｐＭＷＧＫＣ－ＸｈｏＩのＸｈｏＩ認識部位にｐＢＬ１の複製起点及びｒｅｐＡを含むＤＮＡフラグメントが挿入されたプラスミドをｐＭＷＣＢＬと命名した。
［実施例７］
＜コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来ｐｙｃ発現プラスミドｐＭＷＣＢＬ＿ｐｙｃの構築＞
　既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の塩基配列（GenBank accession number BA000036 GI:21323455）を参考にして、ＡＡＧＣＧＡＧＣＴＣＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＡＡＡＡＣＡＡＴＧＴＣＧＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＣＴＴＣＡ（配列番号７３）及びＡＴＡＣＡＴＧＣＡＴＧＣＴＴＡＧＧＡＡＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＡＡ（配列番号７４）のプライマーを２種合成した。配列番号７３のプライマーは５’末端側にＳａｃＩ認識部位を、配列番号７４のプライマーは５’末端側にＳｐｈＩ認識部位をそれぞれ有している。
　コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７３と配列番号７４のプライマーペアでＰＣＲを行うことにより、約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片をＳａｃＩ及びＳｐｈＩで消化し、アガロースゲル電気泳動にて分離、回収した。回収したＤＮＡ断片と、ＳａｃＩ及びＳｐｈＩで消化しさらにアルカリフォスファターゼ処理したｐＭＷＣＢＬとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体から、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子がｐＭＷＣＢＬに挿入されたプラスミドｐＭＷＣＢＬ＿ｐｙｃを回収した。
　ｐＭＷＣＢＬ＿ｐｙｃは、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｃ）の塩基配列（配列番号７５）を含む。コリネバクテリウム・グルタミカム由来のピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｙｃ）のアミノ酸配列は、配列番号７６に示すとおりである。
［実施例８］
＜評価用のコリネバクテリウム・グルタミカム株の構築＞
　コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳＭ１４１２（「ＣＧ株」ということがある。）を宿主として、実施例３、５、及び７で構築したプラスミドを用いて、エレクトロポレーション法で形質転換した。それぞれの株は１５μｇ／ｍＬカナマイシン及び／又は１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗布し、生育する株を評価用株とした。それらの株を表２にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［参考例１］
＜ｍｔｋ、ｍｃｌ、ｇｃｌ及びｇｌｘＲ遺伝子を付与したコリネバクテリウム株の評価＞
　実施例８で構築したＣＧ／ｖｅｃ１及びＣＧ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ／ｇｃｌ＿ｇｌｘＲを、それぞれ１５μｇ／ｍＬカナマイシンを含む２ｍＬのＬＢ液体培地により、３０℃且つ２８０ｒｐｍの条件で、十分な生育がみられるまで培養した。その後、１００ｍＬの羽根つき三角フラスコに、２０ｇ／Ｌグルコース及び１５μｇ／ｍＬカナマイシンを含む１０ｍｌのコリネバクテリウム用最小培地｛３０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、３ｇ／Ｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４、６ｇ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／Ｌ　ＮａＣｌ、８４ｍｇ／Ｌ　ＣａＣｌ２、３．９ｍｇ／Ｌ　ＦｅＣｌ３、０．９ｍｇ／Ｌ　ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．３ｍｇ／Ｌ　ＣｕＣｌ２・Ｈ２Ｏ、５．５６ｍｇ／Ｌ　ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１ｍｇ／Ｌ　（ＮＨ４）６ＭＯ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、０．３ｍｇ／Ｌ　Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、０．４ｇ／Ｌ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４０ｍｇ／Ｌ　ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５００μｇ／Ｌ　Ｖｉｔａｍｉｎｅ　Ｂ１・ＨＣｌ、０．１ｇ／Ｌ　ＥＤＴＡ、１０μｇ／Ｌ　Ｂｉｏｔｉｎ｝を調製し、前述のＬＢ液体培地による培養液を１ｍＬ添加して、十分な増殖がみられるまで１日～４日間培養し、前培養液とした。前培養液から、遠心分離（５０００ｒｐｍ、５分間）により菌体を回収した。
　１００ｍＭの炭酸水素ナトリウム（１３Ｃでラベル化されている）、２０ｇ／Ｌのグルコース、１．５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ６０（シグマ・アルドリッチ社製）、及び１５μｇ／ｍＬカナマイシンを含む２ｍＬのコリネバクテリウム用最小培地（ただしＢｉｏｔｉｎ最終濃度は２μｇ／Ｌに変更）を準備し、前培養菌体をＯＤが１～５の範囲内になるよう調整して添加した。密栓した後、３０℃、１５０ｒｐｍで１日～２日間培養した。培養液は定期的にサンプリングして、遠心分離（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社　１２，０００ｒｐｍ、３分間）して菌体を除去し、上清を親水性ＰＴＦＥメンブレンフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、ＭＳＧＶＮ２Ｂ５０）で濾過し、培養サンプルとした。
　培養サンプル中のグルタミン酸の定量には、ＮＮ－８１４カラム（昭和電工社）を装着したＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社　２６９５）とＵＶ／Ｖｉｓ検出器（Ｗａｔｅｒｓ社　２４８９）を用いた。培養サンプル中のグルコースの定量には、ＵＬＴＲＯＮ　ＰＳ－８０Ｈカラム（信和化工社）を装着したＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社　２６９５）とＲＩ検出器（Ｗａｔｅｒｓ社　２４１４）を用いた。
　その結果、ｍｔｋ、ｍｃｌ、ｇｃｌ及びｇｌｘＲ遺伝子を付与した株（ＣＧ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ／ｇｃｌ＿ｇｌｘＲ）は、対照株（ＣＧ／ｖｅｃ１）よりも高い対糖収率を示した。すなわち、コリネバクテリウムにｍｔｋ、ｍｃｌ、ｇｃｌ及びｇｌｘＲ遺伝子を付与することで新たにＣＯ２固定経路が付与され、この経路により固定化されたＣＯ２がアセチルＣｏＡを経由して、グルタミン酸に導入され、対糖収率が向上したと考えられる。対糖収率は、以下の通り算出した。
（対糖収率）＝（生成グルタミン酸量（ｇ））÷（消費グルコース量（ｇ））
［実施例９］
＜ｍｔｋ、ｍｃｌ、ｇｃｌ及びｇｌｘＲ遺伝子付与ならびにｐｙｃ遺伝子増強コリネバクテリウム株の評価＞
　実施例８で構築したＣＧ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ／ｇｃｌ＿ｇｌｘＲ／ｖｅｃ２及びＣＧ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ／ｇｃｌ＿ｇｌｘＲ／ｐｙｃを評価用株として用い、培地に添加する抗生物質に１５μｇ／ｍＬカナマイシン及び１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを用いる以外は参考例１と同様の方法で培養及び分析を行う。分析の結果、ｐｙｃ増強株（ＣＧ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ／ｇｃｌ＿ｇｌｘＲ／ｐｙｃ）は、対照株（ＣＧ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ／ｇｃｌ＿ｇｌｘＲ／ｖｅｃ２）よりも高い対糖収率を示す。すなわち、ＣＯ２固定経路が付与されたコリネバクテリウム株では、ｐｙｃ遺伝子の増強が対糖収率の向上において効果的であると考えられる。
［実施例１０］
＜亜硫酸ナトリウムを添加した条件でのグルタミン酸生産評価＞
　実施例８で構築したＣＧ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ／ｇｃｌ＿ｇｌｘＲを評価用株として、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ培地に植菌して、３０℃で２日間培養した。その後、１００μＬの培養液を、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含む直径９ｃｍのＬＢプレートに塗布し、３０℃で２日間培養した。プレートの１／８の面積の菌をかきとり、２０μｇ／Ｌ　Ｂｉｏｔｉｎｅを含む５ｍＬのコリネ株用の最小培地｛６０ｇ／Ｌ　グルコース、３０ｇ／Ｌ　（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４、０．４ｇ／Ｌ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ　ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ　ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、２００μｇ／Ｌ　Ｔｈｉａｍｉｎｅ・ＨＣｌ、５．１ｇ／Ｌ　Ｓｏｙｔｏｎｅ（Ｂａｃｔｏ）、２５μｇ／ｍＬカナマイシン、ｐＨ８．０｝に植菌し、０．２５ｇの炭酸カルシウムとともに、１２５ｍＬのバッフル付き三角フラスコ中で、３１．５℃、２７０ｒｐｍで１日培養して、前培養液とした。
　前培養液０．２５ｍＬを、５ｍＬのコリネ株用の最小培地に植菌し、さらに終濃度５ｇ／Ｌとなるよう亜硫酸ナトリウム（還元剤）を供給して、０．２５ｇの炭酸カルシウムとともに、１２５ｍＬのバッフル付き三角フラスコ中で、３１．５℃、２７０ｒｐｍで２日間培養して、本培養液とした。
　上記の亜硫酸ナトリウムを供給した試験区を「亜硫酸ナトリウム供給試験区」とした。また、対照試験として、亜硫酸ナトリウムを無添加とした以外は上記と同じ手順で、「亜硫酸ナトリウム無添加試験区」も準備した。
　分析の結果、亜硫酸ナトリウム無添加試験区では、対糖収率が４４％であったのに対し、亜硫酸ナトリウム供給試験区では、対糖収率が５０％であったことから、亜硫酸ナトリウムの添加による収率の向上が確認された。
　また、培養液のＯＤ６２０ｎｍを測定したところ、予想外なことに、亜硫酸ナトリウム無添加試験区で５０だったＯＤが、亜硫酸ナトリウム供給試験区では２９であったことから、菌体量の増加を抑える効果があることも確認された。菌体量の増加を抑えることができれば、廃菌体処理のコストを抑えることができる。
［実施例１１］
＜エシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤゲノム強化株の作製＞
　エシェリヒア・コリＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（GenBank accession number U00096）、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５のＣｏＡトランスフェラーゼαサブユニットをコードする遺伝子（以下「ａｔｏＤ」ということがある）の塩基配列も報告されている。すなわちａｔｏＤはGenBank accession number U00096に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５ゲノム配列の２３２１４６９～２３２２１３１に記載されている。
　ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するため、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＣＧＣＴＣＡＡＴＴＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＣＧ（配列番号７７）及びＡＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＧ（配列番号７８）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＭｆｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで約１００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡフラグメントを得た。
　得られたＤＮＡフラグメントと、プラスミドｐＵＣ１９（GenBank accession number X02514）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化しさらにアルカリフォスファターゼ処理したものとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社　ＤＮＡ－９０３）に形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニー１０個をそれぞれ５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、プラスミドを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化した際、ＧＡＰＤＨプロモーターが切り出されないものを選抜し、さらに、ＤＮＡ配列を確認しＧＡＰＤＨプロモーターが正しく挿入されたものをｐＵＣｇａｐＰとした。得られたｐＵＣｇａｐＰを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化した。
　ａｔｏＤを取得するために、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＣＧＡＡＴＴＣＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＧＡＴＧＡＣＡＴＴＡＣＡＡＧＡＣ（配列番号７９）及びＧＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＡＡＡＣＧ（配列番号８０）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化することで約６９０ｂｐのａｔｏＤフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントを、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化したｐＵＣｇａｐＰと混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社　ＤＮＡ－９０３）に形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ａｔｏＤが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰａｔｏＤと命名した。
　エシェリヒア・コリＭＧ１６５５のａｔｏＤの５’近傍領域の遺伝子情報に基づいて作製された、ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＧＣＴＧＡＡＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＣＴＴＧＴＣ（配列番号８１）及びＴＡＣＴＧＣＡＧＣＧＴＴＣＣＡＧＣＡＣＣＴＴＡＴＣＡＡＣＣ（配列番号８２）のプライマーを用いて、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
　エシェリヒア・コリＭＧ１６５５のＧＡＰＤＨプロモーターの配列情報に基づいて作製されたＧＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＣＧ（配列番号８３）、及びエシェリヒア・コリＭＧ１６５５のａｔｏＤの配列情報に基づいて作製されたＧＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＡＡＡＣＧ（配列番号８４）をプライマーに用いて、プラスミドｐＧＡＰａｔｏＤを鋳型としてＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨプロモーターとａｔｏＤからなる約７９０ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。
　前記約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩで消化し、前記約７９０ｂｐのＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｂａＩとＫｐｎＩで消化し、両フラグメントを、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（GenBank accession number AB019610）（Gene, 2000; 241: 185-191）をＰｓｔＩとＫｐｎＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５α株に形質転換し、１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをエシェリヒア・コリＢ（ＡＴＣＣ１１３０３）に形質転換し、１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体を１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。得られた培養菌体を１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で培養しコロニーを得た。得られたコロニーを抗生物質を含まないＬＢ液体培地で３０℃で２時間培養し、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。
　出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれを、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレートと１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらに、これらのクローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりＧＡＰＤＨプロモーターとａｔｏＤを含む約７９０ｂｐ断片を増幅させ、ａｔｏＤプロモーター領域がＧＡＰＤＨプロモーターに置換されている株を選抜し、以上を満足するクローンをエシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤゲノム強化株（以下「Ｂ：：ａｔｏＤＡＢ株」ということがある）と命名した。
［実施例１２］
＜エシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤゲノム強化／ｐｇｉ遺伝子欠失株の作製＞
　エシェリヒア・コリＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（GenBank accession number U00096）、エシェリヒア・コリのホスホグルコースイソメラーゼをコードする遺伝子（ｐｇｉ）の塩基配列も報告されている（GenBank accession number X15196）。
　ｐｇｉをコードする遺伝子（１，６５０ｂｐ）の近傍領域をクローニングするため、ＣＡＧＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＡＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＧ（配列番号８５）、ＣＡＧＴＣＴＡＧＡＧＣＡＡＴＡＣＴＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＴＧＡＧ（配列番号８６）、ＣＡＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＣＧＴＣＧＡＴＡＴＧＴＡＧＧＣＣ（配列番号８７）及びＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＣＡＴＣＣＧＴＣＡＧＣＴＧＴＡＣＧＣ（配列番号８８）のプライマー４種を合成した。配列番号８５のプライマーは５’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位を、配列番号８６及び配列番号８７のプライマーは５’末端側にＸｂａＩ認識部位を、配列番号８８のプライマーは５’末端側にＰｓｔＩ認識部位をそれぞれ有している。
　エシェリヒア・コリＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ７００９２６）のゲノムＤＮＡを調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号８５と配列番号８６のプライマーペアでＰＣＲを行うことにより、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下「ｐｇｉ－Ｌ断片」ということがある）。また、配列番号８７と配列番号８８のプライマーペアでＰＣＲを行うことにより、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下「ｐｇｉ－Ｒ断片」ということがある）。これらのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分離、回収し、ｐｇｉ－Ｌ断片をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで、ｐｇｉ－Ｒ断片をＸｂａＩ及びＰｓｔＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（GenBank accession number AB019610）のＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩの消化物とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｐｇｉをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の２つの断片がｐＴＨ１８ｃｓ１に正しく挿入されていることを確認した。得られたプラスミドをＸｂａＩで消化した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化処理を行った。本ＤＮＡ断片と、ｐＵＣ４Ｋプラスミド（GenBank accession number X06404）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＥｃｏＲＩで消化することで得られるカナマイシン耐性遺伝子をさらにＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化処理を行ったＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。その後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールと５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｐｇｉをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の間にカナマイシン耐性遺伝子が正しく挿入されていることを確認し、ｐＴＨ１８ｃｓ１－ｐｇｉとした。
　作製したｐＴＨ１８ｃｓ１－ｐｇｉを実施例１１で作製したＢ：：ａｔｏＤＡＢ株に形質転換し、１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールと５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーを５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、さらに５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。
　出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれを５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートと、１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、カナマイシンを含むＬＢ寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらに、クローンの染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施し、ｐｇｉ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子に置換されていることで約３．３ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をエシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤゲノム強化／ｐｇｉ遺伝子欠失株（以下「Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉ株」ということがある）と命名した。
［実施例１３］
＜エシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤゲノム強化／ｐｇｉ遺伝子欠失／ｇｎｔＲ遺伝子欠失株の作製＞
　エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（GenBank accession number CP000819）、転写抑制因子ＧｎｔＲをコードする遺伝子の塩基配列はGenBank accession number CP000819に記載のエシェリヒア・コリＢ株ゲノム配列の３５０９１８４～３５１０１７９に記載されている。
　ＧｎｔＲをコードする遺伝子（ｇｎｔＲ）の近傍領域をクローニングするため、ＧＧＡＡＴＴＣＧＧＧＴＣＡＡＴＴＴＴＣＡＣＣＣＴＣＴＡＴＣ（配列番号８９）、ＧＴＧＧＧＣＣＧＴＣＣＴＧＡＡＧＧＴＡＣＡＡＡＡＧＡＧＡＴＡＧＡＴＴＣＴＣ（配列番号９０）、ＣＴＣＴＴＴＴＧＴＡＣＣＴＴＣＡＧＧＡＣＧＧＣＣＣＡＣＡＡＡＴＴＴＧＡＡＧ（配列番号９１）、及びＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＧＣＡＡＧＧＣＣＧＡＴＧＧＣ（配列番号９２）のプライマー４種を合成した。配列番号８９及び配列番号９２のプライマーは５’末端側にＥｃｏＲＩ認識部位をそれぞれ有している。
　エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（GenBank accession number CP000819）を調製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号８９と配列番号９０のプライマーペアでＰＣＲを行うことにより、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下「ｇｎｔＲ－Ｌ断片」ということがある）。また、配列番号９１と配列番号９２のプライマーペアでＰＣＲを行うことにより、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下「ｇｎｔＲ－Ｒ断片」ということがある）。これらのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分離、回収し、ｇｎｔＲ－Ｌ断片とｇｎｔＲ－Ｒ断片を鋳型に配列番号８９と配配列番号９２のプライマーペアでＰＣＲを行うことにより、約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下「ｇｎｔＲ－ＬＲ断片」ということがある）。このｇｎｔＲ－ＬＲ断片をアガロースゲル電気泳動にて分離、回収し、ＥｃｏＲＩで消化し、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（GenBank accession number AB019610）のＥｃｏＲＩ消化物を脱リン酸化したものと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｇｎｔＬＲ断片がｐＴＨ１８ｃｓ１に正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＴＨ１８ｃｓ１－ｇｎｔＲとした。
　得られたプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１－ｇｎｔＲを、実施例１２で作製したＢ：：ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉ株に形質転換し、１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体を１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部を１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、さらにＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。
　出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをＬＢ寒天プレートと、１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらに、クローンの染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを実施し、ｇｎｔＲ遺伝子が欠失していることで約２．０ｋｂｐ断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をエシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤゲノム強化／ｐｇｉ遺伝子欠失／ｇｎｔＲ遺伝子欠失株（以下「Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｔＲ株」ということがある）と命名した。
［実施例１４］
＜エシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤゲノム強化／ｐｇｉ遺伝子欠失／ｇｎｔＲ遺伝子欠失／ｇｎｄ遺伝子欠失株の作製＞
　ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｇｎｄ）の近傍領域をクローニングするため、ＣＧＣＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＧＴＧＧ（配列番号９３）、ＴＧＧＡＧＣＴＣＴＧＴＴＴＡＣＴＣＣＴＧＴＣＡＧＧＧＧＧ（配列番号９４）、ＴＧＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＡＴＴＴＡＡＴＣＡＡＣＡＡＴＡＡＡＡＴＴＧ（配列番号９５）、及びＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＴＡＡＣＣＡＡＡＣＧＡＣＧＧ（配列番号９６）のプライマー４種を合成した。配列番号９３のプライマーは５’末端側にＮｄｅＩ認識部位を有し、配列番号９４及び配列番号９５のプライマーは５’末端側にＳａｃＩ認識部位を有し、配列番号９６のプライマーは５’末端側にＢａｍＨＩ認識部位を有している。
　エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（GenBank accession number CP000819）を調製し、配列番号９３と配列番号９４のプライマーペアでＰＣＲを行うことにより、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下「ｇｎｄ－Ｌ断片」ということがある）。また、配列番号９５と配列番号９６のプライマーペアでＰＣＲを行うことにより、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（以下「ｇｎｄ－Ｒ断片」ということがある）。これらのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分離、回収し、ｇｎｄ－Ｌ断片をＮｄｅＩ及びＳａｃＩで、ｇｎｄ－Ｒ断片をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩでそれぞれ消化した。この消化断片２種と、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（GenBank accession number AB019610）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩの消化物を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績社製）に形質転換し、１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、ｇｎｄをコードする遺伝子の５’上流近傍断片と３’下流近傍断片の２つの断片がｐＴＨ１８ｃｓ１に正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＴＨ１８ｃｓ１－ｇｎｄとした。
　得られたプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１－ｇｎｄを、実施例１３で作製したＢ：：ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｔＲ株に形質転換し、１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体を１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部を１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをＬＢ液体培地で、３０℃で２４時間培養し、さらにＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。
　出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップして、それぞれをＬＢ寒天プレートと、１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらに、クローンの染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを実施し、ｇｎｄ遺伝子が欠失していることで約２．０ｋｂｐ断片の増幅が得られる株を選抜し、得られた株をエシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤゲノム強化／ｐｇｉ遺伝子欠失／ｇｎｔＲ遺伝子欠失／ｇｎｄ遺伝子欠失株（以下「Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｔＲΔｇｎｄ株」ということがある）と命名した。
［実施例１５］
＜プラスミドｐＩａｚの作製＞
　クロストリジウム属細菌の、アセト酢酸デカルボキシラーゼはGenBank accession number M55392に、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼはGenBank accession number AF157307に記載されている。
　実施例１におけるプラスミドｐＢＲｇａｐＰの作製と同じ方法でプラスミドｐＢＲｇａｐＰを作製した。
　イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、クロストリジウム・ベイジェリンキＮＲＲＬ Ｂ－５９３のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＡＡＴＡＴＧＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡＡＴＧＣＴＡＧＧ（配列番号９７）及びＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＡＡＴＡＴＡＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＴＡＡＴＴＡＡＧＴＣ（配列番号９８）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳｐｈＩ及びＳａｌＩで消化することで約１．１ｋｂｐのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと、プラスミドｐＵＣ１１９を制限酵素ＳｐｈＩ及びＳａｌＩで消化することで得られるフラグメントとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収しＩＰＡｄｈが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＵＣ－Ｉと命名した。
　プラスミドｐＵＣ－Ｉを制限酵素ＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで得られるＩＰＡｄｈを含むフラグメントと、プラスミドｐＢＲｇａｐＰを制限酵素ＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで得られるフラグメントとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収しＩＰＡｄｈが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰ－Ｉと命名した。
　アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を取得するために、クロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＣＡＴＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＡＴＧＡＡＧＴＡＡＴＴＡＡＡＣＡＡＡＴＴＡＧＣ（配列番号９９）及びＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＴＡＣＣＴＴＡＣＴＴＡＡＧＡＴＡＡＴＣＡＴＡＴＡＴＡＡＣＴＴＣＡＧＣ（配列番号１００）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩで消化することで約７００ｂｐのアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと、プラスミドｐＧＡＰ－Ｉを制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩで消化することで得られるフラグメントとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、ａｄｃが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＩａと命名した。
　グルコース６リン酸－１－デヒドロゲナーゼの遺伝子（ｚｗｆ）を取得するために、エシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（GenBank accession number CP000819）をテンプレートとし、ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＧＣＧＧＴＡＡＣＧＣＡＡＡＣＡＧＣＣＣＡＧＧ（配列番号１０１）及びＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＡＧＣＡＡＡＣＡＧＴＴＴＡＴＡＴＣＧＣＣ（配列番号１０２）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化することで約１５００ｂｐのグルコース６リン酸１－デヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと、プラスミドｐＩａを制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ消化することで得られるフラグメントとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られたプラスミドをｐＩａｚとした。
［実施例１６］
＜プラスミドｐＭＷＧＣ２及びｐＭＷＧＫＣ２の作製＞
　ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するため、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＣＴＡＣＴＡＧＴＣＴＧＴＣＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＣＧ（配列番号１０３）及びＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＣＣＡＴＡＴＧＴＴＣＣＡＣＣＡＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＡＧＧ（配列番号１０４）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、Ｔ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋｉｎａｓｅで末端をリン酸化することで、ＧＡＰＤＨプロモーターを含むＤＮＡフラグメントを得た。
　プラスミドｐＭＷ１１９（GenBank accession number AB005476）を制限酵素ＮｄｅＩで消化して、末端を平滑してから、ＥｃｏＲＩで消化して、末端を脱リン酸化した。このｐＭＷ１１９のＤＮＡフラグメントと、上記ＧＡＰＤＨプロモーターを含むＤＮＡフラグメントとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセルを形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、プラスミドｐＭＷＧ２を得た。
　クロラムフェニコール耐性遺伝子を取得するため、ｐＴＨ１８ｃｓ１（GenBank accession number AB019610）をテンプレートとし、ＴＣＧＧＣＡＣＧＴＡＡＧＡＧＧＴＴＣＣ（配列番号４６）及びＣＧＧＧＴＣＧＡＡＴＴＴＧＣＴＴＴＣＧ（配列番号４７）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントをＴ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋｉｎａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）でリン酸化することで、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを得た。その後、ｐＭＷＧ２をテンプレートとし、ＣＴＡＧＡＴＣＴＧＡＣＡＧＴＡＡＧＡＣＧＧＧＴＡＡＧＣＣ（配列番号４８）及びＣＴＡＧＡＴＣＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣ（配列番号４９）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅し、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むＤＮＡフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られたプラスミドをｐＭＷＧＣ２とした。
　プラスミドｐＭＷＧＣ２をテンプレートとし、ＣＣＴＴＴＧＧＴＴＡＡＡＧＧＣＴＴＴＡＡＧＡＴＣＴＴＣＣＡＧＴＧＧＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＣ（配列番号５０）及びＧＧＣＡＴＡＧＴＴＴＧＴＣＣＡＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＡＡＡＧＣＣＴＴＴＡＡＣＣＡＡＡＧＧ（配列番号５１）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅し、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地にて３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、プラスミドｐＭＷＧＫＣ２を得た。
［実施例１７］
＜メチロコッカス・キャプスラタスＡＴＣＣ３３００９由来ｍｔｋ及びｍｃｌ発現プラスミドｐＭＷＧＣ２＿ｍｔｋ（Ｍｃ）＿ｍｃｌ及びｐＭＷＧＫＣ２＿ｍｔｋ（Ｍｃ）＿ｍｃｌの構築＞
　メチロコッカス・キャプスラタスのゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ３３００９Ｄ－５）を鋳型として、ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＣＴＧＴＴＡＡＡＡＡＴＣＧＴＣＴＡＣ（配列番号５２）及びＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＡＡＴＣＴＧＡＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣ（配列番号５３）をプライマーとしてＰＣＲを実施し、メチロコッカスのｍｃｌ－ｍｔｋフラグメントを得た。ｍｃｌ－ｍｔｋフラグメントをＮｄｅＩとＸｂａＩで切断し得られたフラグメントと、実施例１６で作製したプラスミドｐＭＷＧＣ２又はｐＭＷＧＫＣ２をＮｄｅＩとＸｂａＩで切断して得られたフラグメントとを連結した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセルに形質転換し、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーを２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地にて３０℃で一晩培養し、地にて３０℃で一晩培養し、得られたプラスミドをそれぞれｐＭＷＧＣ２＿ｍｔｋ（Ｍｃ）＿ｍｃｌ、ｐＭＷＧＫＣ２＿ｍｔｋ（Ｍｃ）＿ｍｃｌと命名した。
　ｐＭＷＧＣ２＿ｍｔｋ（Ｍｃ）＿ｍｃｌ及びｐＭＷＧＫＣ２＿ｍｔｋ（Ｍｃ）＿ｍｃｌは、メチロコッカス・キャプスラタス由来のｍｃｌの塩基配列（配列番号４１）、ｍｔｋＡの塩基配列（配列番号２８）、及びｍｔｋＢの塩基配列（配列番号２９）を含む。メチロコッカス・キャプスラタス由来のＭｃｌのアミノ酸配列、ＭｔｋＡのアミノ酸配列、及びＭｔｋＢのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３６、配列番号１３、及び配列番号１４に示すとおりである。
［実施例１８］
＜ｇｌｘＲ及びｇｌｘＫ発現プラスミドの構築＞
　エシェリヒア・コリ由来の２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ遺伝子（ｇｌｘＲ）を所得するためにエシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（GenBank accession number CP000819）をテンプレートとし、ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＡＡＣＴＧＧＧＡＴＴＴＡＴＴＧＧＣ（配列番号１０５）及びＡＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＧＧＣＣＡＧＴＴＴＡＴＧＧＴＴＡＧ（配列番号１０６）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｂａＩ及びＰｓｔＩで消化することで約９００ｂｐのｇｌｘＲフラグメントを得た。エシェリヒア・コリ由来のグリセリン酸３－キナーゼ遺伝子（ｇｌｘＫ）を所得するためにエシェリヒア・コリＢ株のゲノムＤＮＡ（GenBank accession number CP000819）をテンプレートとし、ＡＡＣＴＧＣＡＧＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＡＧＡＴＴＧＴＣＡＴＴＧＣＧＣＣＡ（配列番号１０７）及びＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴＣＣＣＴＧＡＣＣ（配列番号１０８）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約１１００ｂｐのｇｌｘＫフラグメントを得た。得られたｇｌｘＲのフラグメント及びｇｌｘＫのフラグメントと、実施例１７で構築したプラスミドｐＭＷＧＣ２＿ｍｔｋ（Ｍｃ）＿ｍｃｌをＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したものとを混合し、ｇｌｘＲ及びｇｌｘＫをプラスミドｐＭＷＧＣ２＿ｍｔｋ（Ｍｃ）＿ｍｃｌのマレートチオキナーゼ（ｍｔｋ）配列の下流に連結した。得られたプラスミドをｐＭＷＧＣ２＿ｍｔｋ（Ｍｃ）＿ｍｃｌ＿ｇｌｘＲ＿ｇｌｘＫと命名した。
［実施例１９］
＜ｍｔｋ及びｍｃｌ導入イソプロピルアルコール生産ａｔｏＤゲノム強化／ｐｇｉ遺伝子欠失／ｇｎｔＲ遺伝子欠失／ｇｎｄ遺伝子欠失株の作製＞
　実施例１４で作製した株（Ｂ：：ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｔＲΔｇｎｄ株）のコンピテントセルに、実施例１５で作製したプラスミドｐＩａｚと、実施例１６～１８で作製したプラスミドのいずれかを形質転換し、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し生育させ株を得た。それらの株を表３にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［実施例２０］
＜イソプロピルアルコールの生産＞
　前培養として２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ　Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）２ｍＬを入れた試験管に、実施例１９で構築した各評価用株を植菌し、一晩、培養温度３０℃、１２０ｒｐｍで培養を行った。前培養のＯＤを測定し、ＯＤ３．０相当の細胞を回収し、０．９％　ＮａＣｌ溶液３００μｌに懸濁し、２０μｌを、５％グルコース、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ　Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ培養液２０ｍＬを入れた１００ｍＬ容のバッフル付フラスコに植菌し、培養温度３０℃、１２０ｒｐｍで４８時間、培養を行った。菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中のイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、アセトン及び主な副産物（コハク酸等の有機酸）の蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。結果を表４及び表５に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　４８時間におけるイソプロピルアルコール生産量は、対照株（ｖｅｃ／ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｔＲΔｇｎｄ）では４．８ｇであり、ｍｔｋ＋ｍｃｌ導入株（ＭｔｋＡＢ／ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｔＲΔｇｎｄ）では７．２ｇであり、ｇｌｘＲ＋ｇｌｘＫ＋ｍｔｋ＋ｍｃｌ導入株（ＭｔｋＡＢ，ｇｌｘＲ，ｇｌｘＫ／ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｔＲΔｇｎｄ）では７．９ｇであった。
　４８時間におけるアセトンの生産量は、対照株（ｖｅｃ／ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｔＲΔｇｎｄ）では０．１ｇであり、ｍｔｋ＋ｍｃｌ導入株（ＭｔｋＡＢ／ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｔＲΔｇｎｄ）では０．２ｇであり、ｇｌｘＲ＋ｇｌｘＫ＋ｍｔｋ＋ｍｃｌ導入株（ＭｔｋＡＢ，ｇｌｘＲ，ｇｌｘＫ／ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｔＲΔｇｎｄ）では０．３ｇであった。
　このことから、ｍｔｋ及びｍｃｌに加えてｇｌｘＲ及びｇｌｘＫを導入した方がイソプロピルアルコール及びアセトンの生産量が向上することがわかった。
　４８時間におけるイソプロピルアルコールとアセトンの対糖収率は、対照株（ｖｅｃ／ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｔＲΔｇｎｄ）では１４．８％、ｍｔｋ＋ｍｃｌ導入株（ＭｔｋＡＢ／ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｔＲΔｇｎｄ）では１７．３％、ｇｌｘＲ＋ｇｌｘＫ＋ｍｔｋ＋ｍｃｌ導入株（ＭｔｋＡＢ，ｇｌｘＲ，ｇｌｘＫ／ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｔＲΔｇｎｄ）では１８．８％を示した。このことから、ｍｔｋ及びｍｃｌに加えてｇｌｘＲ及びｇｌｘＫを導入することにより、糖のイソプロピルアルコール及びアセトンへの変換効率が向上することが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　４８時間における対照株（ｖｅｃ／ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｔＲΔｇｎｄ）とｍｔｋ＋ｍｃｌ導入株（ＭｔｋＡＢ／ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｔＲΔｇｎｄ）とを比較すると乳酸の量が減少しており、ｍｔｋ及びｍｃｌに加えてｇｌｘＲ及びｇｌｘＫを導入した株（ＭｔｋＡＢ，ｇｌｘＲ，ｇｌｘＫ／ａｔｏＤＡＢΔｐｇｉΔｇｎｔＲΔｇｎｄ）ではさらに予想外に乳酸の量が減少していることがわかった。
［実施例２１］
＜評価用のアスペルギルス・ニガー株の作製＞
　アスペルギルス・ニガーＡＴＣＣ１０１５のゲノムから、文献（Plasmid, 2005; 53: 191-204）に記載の方法で、グルコアミラーゼのプロモーター領域（ＧｌａＰｒ）と転写終結領域（ＧｌａＴｔ）の遺伝子をＰＣＲで取得した。
　メチロコッカス・キャプスラタスＡＴＣＣ３３００９由来のマリルＣｏＡリアーゼ遺伝子（配列番号４１）、マレートチオキナーゼのサブユニットα遺伝子（配列番号２８）、及びマレートチオキナーゼのサブユニットβ遺伝子（配列番号２９）を、適切なＳＤ配列（Ｓｈｉｎｅ ｄａｌｇａｒｎｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とともに、ＰＣＲ法にて増幅した。得られた増幅断片を、それぞれのタンパク質のコード領域を、プロモーター領域（ＧｌａＰｒ）と転写終結領域（ＧｌａＴｔ）で挟むように設計し、プラスミドｐＰＴＲＩＩ（Ｔａｋａｒａ）のＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入した。得られたプラスミドをｐＰＴＲＩＩ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）と命名した。
　ロドコッカス・ジョスティＮＢＲＣ１６２９５のゲノムから、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼの遺伝子（ｇｌｘＲ）（配列番号６４）及びグリオキシル酸カルボリガーゼの遺伝子（ｇｃｌ）（配列番号６５）を、適切なＳＤ配列とともに、ＰＣＲ法にて増幅した。得られた増幅断片を、それぞれのタンパクのコード領域を、プロモーター領域（ＧｌａＰｒ）と転写終結領域（ＧｌａＴｔ）で挟むように設計し、ｐＰＴＲＩＩ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）に挿入した。得られたプラスミドをｐＰＴＲＩＩ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）＿ｇｌｘＲ（Ｒｊ）＿ｇｃｌ（Ｒｊ）と命名した。
　ｐＰＴＲＩＩ、ｐＰＴＲＩＩ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）及びｐＰＴＲＩＩ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）＿ｇｌｘＲ（Ｒｊ）＿ｇｃｌ（Ｒｊ）を用い、アスペルギルス・ニガーＡＴＣＣ１０１５を形質転換し、アスペルギルス・ニガーの対照株（「ＡＮ／ｖｅｃ」ということがある）、ｍｔｋ＋ｍｃｌ導入株（「ＡＮ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ」ということがある）、ｍｔｋ＋ｍｃｌ＋ｇｌｘＲ＋ｇｃｌ導入株（「ＡＮ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ＿ｇｃｌ＿ｇｌｘＲ」ということがある）を作製した。
［実施例２２］
＜アスペルギルス・ニガーによるクエン酸生産試験＞
　実施例２１で作製したアスペルギルス・ニガー株（ＡＮ／ｖｅｃ、ＡＮ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ、及びＡＮ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ＿ｇｃｌ＿ｇｌｘＲ）を、炭素源及びPyrithiamine hydrobromideを含む培地を用い３０℃で培養させると、対照株のＡＮ／ｖｅｃと比較して、ＡＮ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ及びＡＮ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ＿ｇｃｌ＿ｇｌｘＲでは、より高い収率でクエン酸が生産される。１３Ｃラベル化された炭酸水素ナトリウムを用いて培養し、中間体であるアセチルＣｏＡ及び最終産物であるクエン酸における１３Ｃ含量を調べることで、固定された炭酸がアセチルＣｏＡ及びクエン酸に導入されていることが確認される。
［実施例２３］
＜評価用のアスペルギルス・テレウス株の作製＞
　実施例２１と同様の方法で、ｐＰＴＲＩＩ、ｐＰＴＲＩＩ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）及びｐＰＴＲＩＩ＿ｍｃｌ（Ｍｃ）＿ｍｔｋ（Ｍｃ）＿ｇｌｘＲ（Ｒｊ）＿ｇｃｌ（Ｒｊ）を用い、ｐＰＴＲＩＩ（Ｔａｋａｒａ）の取扱説明書に従い、アスペルギルス・テレウスＮＢＲＣ６３６５を形質転換し、アスペルギルス・テレウスの対照株（「ＡＴ／ｖｅｃ」ということがある）、ｍｔｋ＋ｍｃｌ導入株（「ＡＴ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ」ということがある）、ｍｔｋ＋ｍｃｌ＋ｇｌｘＲ＋ｇｃｌ導入株（「ＡＴ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ＿ｇｃｌ＿ｇｌｘＲ」ということがある）を作製した。
［実施例２４］
＜アスペルギルス・テレウスによるイタコン酸生産試験＞
　実施例２３で作製したアスペルギルス・テレウス株（ＡＴ／ｖｅｃ、ＡＴ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ、及びＡＴ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ＿ｇｃｌ＿ｇｌｘＲ）を、炭素源及びPyrithiamine hydrobromideを含む培地を用い３０℃で培養させると、対照株のＡＴ／ｖｅｃに比較して、ＡＴ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ及びＡＴ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ＿ｇｃｌ＿ｇｌｘＲでは、より高い収率でイタコン酸が生産される。１３Ｃラベル化された炭酸水素ナトリウムを用いて培養し、中間体であるアセチルＣｏＡ及び最終産物であるイタコン酸における１３Ｃ含量を調べることで、固定された炭酸がアセチルＣｏＡ及びイタコン酸に導入されていることが確認される。
　ＡＴ／ｍｔｋ＿ｍｃｌ＿ｇｃｌ＿ｇｌｘＲを評価用株として用い、培地に炭酸塩、二酸化炭素ガス又は還元剤を添加剤として供給して、同様の方法で培養及び分析を行う。分析の結果、添加剤に炭酸塩、二酸化炭素ガス又は還元剤を供給する試験区は、炭酸塩、二酸化炭素ガス又は還元剤を供給しない試験区に比べて、それぞれ高い対糖収率を示す。すなわち、ＣＯ２固定経路が付与された株では、炭酸塩、二酸化炭素ガス又は還元剤の供給が対糖収率の向上において効果的であると考えられる。
［実施例２５］
＜評価用のカプリアビダス・ネカトール株の作製＞
　メチロコッカス・キャプスラタスＡＴＣＣ３３００９由来のマレートチオキナーゼのサブユニットα遺伝子（配列番号２８）、及びマレートチオキナーゼのサブユニットβ遺伝子（配列番号２９）を、適切なＳＤ配列とともにＰＣＲ法にて増幅した。得られた増幅断片を、広宿主域ベクターｐＢＢＲ１－ＭＣＳ２（GenBank accession number U23751）に、ｌａｃプロモーターの支配下になるように連結した。得られたプラスミドをｐＢＢＲ－ＭＣＳ２＿ｍｔｋ（Ｍｃ）と命名した。
　ｐＢＢＲ１－ＭＣＳ２及びｐＢＢＲ－ＭＣＳ２＿ｍｔｋ（Ｍｃ）を用い、カプリアビダス・ネカトールＪＭＰ１３４（ＤＳＭ４０５８）を形質転換し、カプリアビダス・ネカトールの対照株（「ＣＰ／ｖｅｃ」ということがある）及びｍｔｋ導入株（「ＣＰ／ｍｔｋ」ということがある）を作製した。
［実施例２６］
＜カプリアビダス・ネカトールによるポリ３－ヒドロキシ酪酸生産試験＞
　実施例２５で作製した評価用株（ＣＰ／ｖｅｃ及びＣＰ／ｍｔｋ）を、炭素源及びカナマイシンを含む培地を用い３０℃で培養させると、対照株のＣＰ／ｖｅｃと比較して、ｍｔｋ導入株のＣＰ／ｍｔｋでは、より高い収率でポリ３－ヒドロキシ酪酸が生産される。１３Ｃラベル化された炭酸水素ナトリウムを用いて培養し、中間体であるアセチルＣｏＡ及び最終産物であるポリ３－ヒドロキシ酪酸における１３Ｃ含量を調べることで、固定された炭酸がアセチルＣｏＡ及びポリ３－ヒドロキシ酪酸に導入されていることが確認される。
　２０１３年１月２４日に出願の日本国出願番号第２０１３－０１１５３６号、及び２０１３年１月２４日に出願の日本国出願番号第２０１３－０１１５３８号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
　本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (32)

  1. 　下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれも有していない微生物に、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のいずれも付与せず、又は下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ以上を付与してもその機能を発揮させずに、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性を付与することにより得られたアセチルＣｏＡ生産回路を有する微生物であって、
    　ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ、ヒドロキシピルビン酸イソメラーゼ、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ、グリセリン酸２－キナーゼ、グリセリン酸３－キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ及びエノラーゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性が強化され、且つ／又は、リンゴ酸酵素及びフマル酸レダクターゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性が不活化又は低減されたアセチルＣｏＡ生産微生物：
    （ａ）マロニルＣｏＡからマロン酸セミアルデヒド又は３－ヒドロキシプロピオン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、
    （ｂ）アセチルＣｏＡとＣＯ２からピルビン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、
    （ｃ）クロトニルＣｏＡとＣＯ２からエチルマロニルＣｏＡ又はグルタコニルＣｏＡへの酵素反応を有する炭酸固定回路、
    （ｄ）ＣＯ２からギ酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、
    （ｅ）マレートチオキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼからなる群より選択された少なくとも１種。
  2. 　ホスホエノールピルビン酸又はピルビン酸がオキサロ酢酸に変換され、
    　オキサロ酢酸が、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ及びグリオキシル酸カルボリガーゼにより２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸に変換され、
    　２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸が２－ホスホグリセリン酸に変換され、
    　２－ホスホグリセリン酸がホスホエノールピルビン酸に変換される、アセチルＣｏＡ生産回路を有する、請求項１に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。
  3. 　下記（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）及び（ｍ）を含むアセチルＣｏＡ生産回路を有する、請求項１又は請求項２に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物：
    （ｆ）ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸カルボキシラーゼと、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼと、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼと、からなる群より選択された少なくとも１つ、
    （ｇ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、
    （ｈ）マレートチオキナーゼ、
    （ｉ）マリルＣｏＡリアーゼ、
    （ｊ）グリオキシル酸カルボリガーゼ、
    （ｋ）２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼと、ヒドロキシピルビン酸イソメラーゼ及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼと、からなる群より選択された少なくとも１つ、
    （ｌ）グリセリン酸２－キナーゼと、グリセリン酸３－キナーゼ及びホスホグリセリン酸ムターゼと、からなる群より選択された少なくとも１つ、
    （ｍ）エノラーゼ。
  4. 　前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれも有していない微生物が、腸内細菌科に属する微生物又はコリネ型細菌に属する微生物である、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。
  5. 　前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれも有していない微生物が、エシェリヒア属細菌若しくはパントエア属細菌である腸内細菌科に属する微生物、又はコリネバクテリウム属細菌であるコリネ型細菌に属する微生物である、請求項１～請求項４のいずれか１項に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物。
  6. 　請求項１～請求項５のいずれか１項に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物と、炭素源材料とを接触させて培養を行う培養工程と、
    　前記接触により得られた目的生産物を回収する回収工程と、
    を含む、アセチルＣｏＡ生産方法。
  7. 　さらに、炭酸イオン、炭酸水素イオン、二酸化炭素ガス及び還元剤からなる群より選択された少なくとも１種を、培養に用いる培地に供給する供給工程を含む、請求項６に記載のアセチルＣｏＡ生産方法。
  8. 　さらに、培養によって発生した二酸化炭素を含む気体を回収して、培養に用いる培地に該気体を供給する気体供給工程を含む、請求項６又は請求項７に記載のアセチルＣｏＡ生産方法。
  9. 　下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれも有していない微生物に、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のいずれも付与せず、又は下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ以上を付与してもその機能を発揮させずに、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性を付与することにより得られたアセチルＣｏＡ生産回路を有するアセチルＣｏＡ生産微生物を培養する培養工程と、
    　全供給量が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上の炭酸イオン又は炭酸水素イオン、平均気泡径が１００μｍ以上である二酸化炭素ガス、及び全供給量が０．０１ｇ／Ｌ以上５０ｇ／Ｌ以下の亜硫酸ナトリウムからなる群より選択された少なくとも１つを、培養に用いる培地に供給する供給工程と、
    を含むアセチルＣｏＡ生産方法：
    （ａ）マロニルＣｏＡからマロン酸セミアルデヒド又は３－ヒドロキシプロピオン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、
    （ｂ）アセチルＣｏＡとＣＯ２からピルビン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、
    （ｃ）クロトニルＣｏＡとＣＯ２からエチルマロニルＣｏＡ又はグルタコニルＣｏＡへの酵素反応を有する炭酸固定回路、
    （ｄ）ＣＯ２からギ酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、
    （ｅ）マレートチオキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼからなる群より選択された少なくとも１種。
  10. 　さらに、培養によって発生した二酸化炭素を含む気体を回収して、培養に用いる培地に該気体を供給する気体供給工程を含む、請求項９に記載のアセチルＣｏＡ生産方法。
  11. 　前記アセチルＣｏＡ生産微生物が、
    　ホスホエノールピルビン酸又はピルビン酸がオキサロ酢酸に変換され、オキサロ酢酸が、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ及びグリオキシル酸カルボリガーゼにより２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸に変換され、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸が２－ホスホグリセリン酸に変換され、２－ホスホグリセリン酸がホスホエノールピルビン酸に変換される、アセチルＣｏＡ生産回路を有するアセチルＣｏＡ生産微生物である、請求項９又は請求項１０に記載のアセチルＣｏＡ生産方法。
  12. 　前記アセチルＣｏＡ生産微生物が、下記（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）及び（ｍ）を含むアセチルＣｏＡ生産回路を有するアセチルＣｏＡ生産微生物である、請求項９～請求項１１のいずれか１項に記載のアセチルＣｏＡ生産方法：
    （ｆ）ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸カルボキシラーゼと、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼと、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼと、からなる群より選択された少なくとも１つ、
    （ｇ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、
    （ｈ）マレートチオキナーゼ、
    （ｉ）マリルＣｏＡリアーゼ、
    （ｊ）グリオキシル酸カルボリガーゼ、
    （ｋ）２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼと、ヒドロキシピルビン酸イソメラーゼ及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼと、からなる群より選択された少なくとも１つ、
    （ｌ）グリセリン酸２－キナーゼと、グリセリン酸３－キナーゼ及びホスホグリセリン酸ムターゼと、からなる群より選択された少なくとも１つ、
    （ｍ）エノラーゼ。
  13. 　前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれも有していない微生物が、腸内細菌科に属する微生物又はコリネ型細菌に属する微生物である、請求項９～請求項１２のいずれか１項に記載のアセチルＣｏＡ生産方法。
  14. 　前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のいずれも有していない微生物が、エシェリヒア属細菌若しくはパントエア属細菌である腸内細菌科に属する微生物、又はコリネバクテリウム属細菌であるコリネ型細菌に属する微生物である、請求項９～請求項１３のいずれか１項に記載のアセチルＣｏＡ生産方法。
  15. 　請求項９～請求項１４のいずれか１項に記載のアセチルＣｏＡ生産方法により生産されたアセチルＣｏＡを中間体として、アセチルＣｏＡ生産微生物がイソプロピルアルコールを生産する、イソプロピルアルコール生産方法。
  16. 　請求項９～請求項１４のいずれか１項に記載のアセチルＣｏＡ生産方法により生産されたアセチルＣｏＡを中間体として、アセチルＣｏＡ生産微生物がアセトンを生産する、アセトン生産方法。
  17. 　請求項９～請求項１４のいずれか１項に記載のアセチルＣｏＡ生産方法により生産されたアセチルＣｏＡを中間体として、アセチルＣｏＡ生産微生物がグルタミン酸を生産する、グルタミン酸生産方法。
  18. 　請求項１～請求項５のいずれか１項に記載のアセチルＣｏＡ生産微生物と、炭素源材料とを接触させて培養を行う培養工程と、
    　前記接触により得られたグルタミン酸を回収する回収工程と、
    を含むグルタミン酸生産方法。
  19. 　下記（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）、（ｄ２）及び（ｅ２）のいずれも有していない微生物に、下記（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）及び（ｄ２）のいずれも付与せず、又は下記（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）及び（ｄ２）の１つ以上を付与してもその機能を発揮させずに、マレートチオキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性を付与することにより得られたアスペルギルス属菌又はカプリアビダス属菌である微生物：
    （ａ２）マロニルＣｏＡからマロン酸セミアルデヒド又は３－ヒドロキシプロピオン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、
    （ｂ２）アセチルＣｏＡとＣＯ２からピルビン酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、
    （ｃ２）クロトニルＣｏＡとＣＯ２からエチルマロニルＣｏＡ又はグルタコニルＣｏＡへの酵素反応を有する炭酸固定回路、
    （ｄ２）ＣＯ２からギ酸への酵素反応を有する炭酸固定回路、
    （ｅ２）マレートチオキナーゼ及びマリルＣｏＡリアーゼからなる群より選択された少なくとも１種。
  20. 　アセチルＣｏＡの生産能を有する、請求項１９に記載の微生物。
  21. 　さらに、グリオキシル酸カルボリガーゼ、２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼ及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼからなる群より選択された少なくとも１種の酵素活性を付与することにより得られた、請求項１９又は請求項２０に記載の微生物。
  22. 　ホスホエノールピルビン酸又はピルビン酸が、オキサロ酢酸に変換され、
    　オキサロ酢酸が、マレートチオキナーゼ、マリルＣｏＡリアーゼ及びグリオキシル酸カルボリガーゼにより２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸に変換され、
    　２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸が２－ホスホグリセリン酸に変換され、
    　２－ホスホグリセリン酸がホスホエノールピルビン酸に変換される、アセチルＣｏＡ生産回路を有する、請求項１９～請求項２１のいずれか１項に記載の微生物。
  23. 　下記（ｆ２）、（ｇ２）、（ｈ２）、（ｉ２）、（ｊ２）、（ｋ２）、（ｌ２）及び（ｍ２）を含むアセチルＣｏＡ生産回路を有する、請求項１９～請求項２２のいずれか１項に記載の微生物：
    （ｆ２）ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸カルボキシラーゼと、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼと、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼと、からなる群より選択された少なくとも１つ、
    （ｇ２）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、
    （ｈ２）マレートチオキナーゼ、
    （ｉ２）マリルＣｏＡリアーゼ、
    （ｊ２）グリオキシル酸カルボリガーゼ、
    （ｋ２）２－ヒドロキシ－３－オキソプロピオン酸レダクターゼと、ヒドロキシピルビン酸イソメラーゼ及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼと、からなる群より選択された少なくとも１つ、
    （ｌ２）グリセリン酸２－キナーゼと、グリセリン酸３－キナーゼ及びホスホグリセリン酸ムターゼと、からなる群より選択された少なくとも１つ、
    （ｍ２）エノラーゼ。
  24. 　下記（ａ３）及び（ｂ３）からなる群より選択された少なくとも１つの酵素反応と、
    　下記（ｃ３）、（ｄ３）、（ｅ３）、（ｆ３）及び（ｇ３）の酵素反応と、
    　下記（ｈ３）の酵素反応、下記（ｉ３）、（ｊ３）、（ｋ３）及び（ｎ３）の酵素反応、並びに下記（ｉ３）、（ｊ３）、（ｌ３）、（ｍ３）及び（ｎ３）の酵素反応、からなる群より選択された少なくとも１つと、
    を含む経路を有する、請求項１９～請求項２３のいずれか１項に記載の微生物：
    （ａ３）ホスホエノールピルビン酸からオキサロ酢酸への酵素反応、
    （ｂ３）ピルビン酸からオキサロ酢酸への酵素反応、
    （ｃ３）オキサロ酢酸からリンゴ酸への酵素反応、
    （ｄ３）リンゴ酸からマリルＣｏＡへの酵素反応、
    （ｅ３）マリルＣｏＡからグリオキシル酸及びアセチルＣｏＡへの酵素反応、
    （ｆ３）グリオキシル酸からグリシンへの酵素反応、
    （ｇ３）グリシンからセリンへの酵素反応、
    （ｈ３）セリンからピルビン酸への酵素反応、
    （ｉ３）セリンから３－ヒドロキシピルビン酸への酵素反応、
    （ｊ３）３－ヒドロキシピルビン酸からグリセリン酸への酵素反応、
    （ｋ３）グリセリン酸から２－ホスホグリセリン酸への酵素反応、
    （ｌ３）グリセリン酸から３－ホスホグリセリン酸への酵素反応、
    （ｍ３）３－ホスホグリセリン酸から２－ホスホグリセリン酸への酵素反応、
    （ｎ３）２－ホスホグリセリン酸からホスホエノールピルビン酸への酵素反応。
  25. 　下記（ａ４）及び（ｂ４）からなる群より選択された少なくとも１つの酵素と、
    　下記（ｃ４）、（ｄ４）、（ｅ４）、（ｆ４）及び（ｇ４）の酵素と、
    　下記（ｈ４）の酵素、下記（ｉ４）、（ｊ４）、（ｋ４）及び（ｎ４）の酵素、並びに下記（ｉ４）、（ｊ４）、（ｌ４）、（ｍ４）及び（ｎ４）の酵素、からなる群より選択された少なくとも１つと、
    を有する、請求項１９～請求項２４のいずれか１項に記載の微生物：
    （ａ４）ピルビン酸キナーゼ及びピルビン酸カルボキシラーゼと、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼと、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼと、からなる群より選択された少なくとも１つ、
    （ｂ４）ピルビン酸カルボキシラーゼ、
    （ｃ４）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、
    （ｄ４）マレートチオキナーゼ、
    （ｅ４）マリルＣｏＡリアーゼ、
    （ｆ４）グリシントランスアミナーゼ、
    （ｇ４）グリシン開裂系及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、
    （ｈ４）セリンデヒドラターゼ、
    （ｉ４）セリントランスアミナーゼ、
    （ｊ４）ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ、
    （ｋ４）グリセリン酸２－キナーゼ、
    （ｌ４）グリセリン酸３－キナーゼ、
    （ｍ４）ホスホグリセリン酸ムターゼ、
    （ｎ４）エノラーゼ。
  26. 　前記（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）、（ｄ２）及び（ｅ２）のいずれも有していない微生物が、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・テレウス又はカプリアビダス・ネカトールである、請求項１９～請求項２５のいずれか１項に記載の微生物。
  27. 　請求項１９～請求項２６のいずれか１項に記載の微生物と、炭素源材料とを接触させて培養を行う培養工程と、
    　前記接触により得られた目的生産物を回収する回収工程と、
    を含む、アセチルＣｏＡ生産方法。
  28. 　さらに、炭酸イオン、炭酸水素イオン、二酸化炭素ガス及び還元剤からなる群より選択された少なくとも１種を、培養に用いる培地に供給する供給工程を含む、請求項２７に記載のアセチルＣｏＡ生産方法。
  29. 　さらに、培養によって発生した二酸化炭素を含む気体を回収して、培養に用いる培地に該気体を供給する気体供給工程を含む、請求項２７又は請求項２８に記載のアセチルＣｏＡ生産方法。
  30. 　請求項１９～請求項２６のいずれか１項に記載の微生物を用いて、炭素源材料からクエン酸を生産することを含む、クエン酸生産方法。
  31. 　請求項１９～請求項２６のいずれか１項に記載の微生物を用いて、炭素源材料からイタコン酸を生産することを含む、イタコン酸生産方法。
  32. 　請求項１９～請求項２６のいずれか１項に記載の微生物を用いて、炭素源材料から（ポリ）３－ヒドロキシ酪酸を生産することを含む、（ポリ）３－ヒドロキシ酪酸生産方法。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8647642B2 (en) 2008-09-18 2014-02-11 Aviex Technologies, Llc Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment
US10301653B2 (en) * 2015-07-06 2019-05-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Microorganisms that co-consume glucose with non-glucose carbohydrates and methods of use
EP3430150A4 (en) * 2016-03-19 2019-12-25 Kiverdi, Inc. MICROORGANISMS AND ARTIFICIAL ECOSYSTEMS FOR THE PRODUCTION OF PROTEIN, FOODSTUFFS AND USEFUL BY-PRODUCTS FROM C1 SUBSTRATES
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
KR102000755B1 (ko) * 2016-12-27 2019-07-17 한국과학기술원 외부 유전자가 도입된 재조합 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 개미산과 이산화탄소로부터 유용물질을 제조하는 방법
WO2019152757A1 (en) * 2018-02-01 2019-08-08 Invista North America S.A.R.L. Methods and materials for the biosynthesis of compounds involved in the tricarboxylic acid cycle and derivatives and compounds related thereto

Citations (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS50113209A (ja) 1974-02-13 1975-09-05
JPS5238088A (en) 1975-09-19 1977-03-24 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-glutamic acid
JPS561889A (en) 1979-06-20 1981-01-10 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-glutamic acid by fermentation
JPS5635981A (en) 1979-08-31 1981-04-08 Ajinomoto Co Inc Novel variant
JPS5648890A (en) 1979-08-10 1981-05-02 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-glutamic acid by fermentation
JPS56140895A (en) 1980-04-02 1981-11-04 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-glutamic acid by fermentation
JPS56151495A (en) 1980-04-25 1981-11-24 Ajinomoto Co Inc Production of l-glutamine through fermentation
JPS56161495A (en) 1980-04-23 1981-12-11 Source Technology Inc Liquid fuel for automatic propulsion
JPS572689A (en) 1981-03-23 1982-01-08 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-glutamic acid
JPS5765198A (en) 1980-10-09 1982-04-20 Ajinomoto Co Inc Fermentative production of l-glutamic acid
JPS58158192A (ja) 1982-03-15 1983-09-20 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造方法
JPS61202694A (ja) 1985-03-07 1986-09-08 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−グルタミンの製造法
JPH03232497A (ja) 1990-02-08 1991-10-16 Asahi Chem Ind Co Ltd 発酵法によるｌ―グルタミンの製造方法
JPH0488994A (ja) 1990-07-30 1992-03-23 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 発酵法によるｌ―グルタミン酸の製造法
EP0952221A2 (en) 1998-03-18 1999-10-27 Ajinomoto Co., Ltd. L-Glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid
EP1078989A2 (en) 1999-08-20 2001-02-28 Ajinomoto Co., Ltd. Method for producing L-glutamic acid by fermentation accompanied by precipitation
EP1229121A2 (en) 2001-02-05 2002-08-07 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-glutamine by fermentation and L-glutamine producing bacterium
US20030148474A1 (en) 2001-11-30 2003-08-07 Ajinomoto Co., Inc. New mutant glutamine synthetase and method for producing amino acids
JP2005278643A (ja) 2004-03-04 2005-10-13 Ajinomoto Co Inc Ｌ−グルタミン酸生産微生物及びｌ−グルタミン酸の製造法
JP2007510411A (ja) 2003-11-06 2007-04-26 メタボリック エクスプローラ Ｎａｄｐｈ消費生合成経路のために最適化された微生物菌株
WO2008145737A1 (de) 2007-06-01 2008-12-04 Evonik Degussa Gmbh Ein verfahren zur herstellung von methacrylsäure oder methacrylsäureestern
WO2009008377A1 (ja) 2007-07-11 2009-01-15 Mitsui Chemicals, Inc. イソプロピルアルコール生産細菌及びこれを用いたイソプロピルアルコール生産方法
WO2009046929A2 (de) 2007-10-02 2009-04-16 Insilico Biotechnology Ag Biotechnologische fixierung von kohlenstoffdioxid
DE102007059248A1 (de) 2007-12-07 2009-06-10 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Zelle, welche in der Lage ist, CO2 zu fixieren
WO2009094485A1 (en) 2008-01-22 2009-07-30 Genomatica, Inc. Methods and organisms for utilizing synthesis gas or other gaseous carbon sources and methanol
JP2009171960A (ja) 1997-09-19 2009-08-06 Metabolix Inc ４−ヒドロキシ酸を含むポリヒドロキシアルカノエートポリマー製造のための生物学的システム
WO2009135074A2 (en) 2008-05-01 2009-11-05 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of methacrylic acid
WO2009156214A1 (de) 2008-06-27 2009-12-30 Evonik Röhm Gmbh 2-hydroxyisobuttersäure produzierende rekombinante zelle
JP2010041920A (ja) 2006-12-19 2010-02-25 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2010071697A1 (en) 2008-12-16 2010-06-24 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for conversion of syngas and other carbon sources to useful products
WO2011099006A2 (en) 2010-02-11 2011-08-18 Yeda Research And Development Co. Ltd. Enzymatic systems for carbon fixation and methods of generating same
JP2011167097A (ja) 2010-02-17 2011-09-01 Kobe Univ γ−アミノ酪酸の製造方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2004124226A (ru) * 2004-08-10 2006-01-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Использование фосфокетолазы для продукции полезных метаболитов
JP5180060B2 (ja) * 2006-02-24 2013-04-10 三菱化学株式会社 有機酸生産菌及び有機酸の製造法
PL2738247T3 (pl) 2011-07-29 2017-05-31 Mitsui Chemicals, Inc. Mikroorganizm z wprowadzonym cyklem asymilacyjnym dwutlenku węgla

Patent Citations (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS50113209A (ja) 1974-02-13 1975-09-05
JPS5238088A (en) 1975-09-19 1977-03-24 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-glutamic acid
JPS561889A (en) 1979-06-20 1981-01-10 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-glutamic acid by fermentation
JPS5648890A (en) 1979-08-10 1981-05-02 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-glutamic acid by fermentation
JPS5635981A (en) 1979-08-31 1981-04-08 Ajinomoto Co Inc Novel variant
JPS56140895A (en) 1980-04-02 1981-11-04 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-glutamic acid by fermentation
JPS56161495A (en) 1980-04-23 1981-12-11 Source Technology Inc Liquid fuel for automatic propulsion
JPS56151495A (en) 1980-04-25 1981-11-24 Ajinomoto Co Inc Production of l-glutamine through fermentation
JPS5765198A (en) 1980-10-09 1982-04-20 Ajinomoto Co Inc Fermentative production of l-glutamic acid
JPS572689A (en) 1981-03-23 1982-01-08 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-glutamic acid
JPS58158192A (ja) 1982-03-15 1983-09-20 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造方法
JPS61202694A (ja) 1985-03-07 1986-09-08 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−グルタミンの製造法
JPH03232497A (ja) 1990-02-08 1991-10-16 Asahi Chem Ind Co Ltd 発酵法によるｌ―グルタミンの製造方法
JPH0488994A (ja) 1990-07-30 1992-03-23 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 発酵法によるｌ―グルタミン酸の製造法
JP2009171960A (ja) 1997-09-19 2009-08-06 Metabolix Inc ４−ヒドロキシ酸を含むポリヒドロキシアルカノエートポリマー製造のための生物学的システム
EP0952221A2 (en) 1998-03-18 1999-10-27 Ajinomoto Co., Ltd. L-Glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid
EP1078989A2 (en) 1999-08-20 2001-02-28 Ajinomoto Co., Ltd. Method for producing L-glutamic acid by fermentation accompanied by precipitation
EP1229121A2 (en) 2001-02-05 2002-08-07 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-glutamine by fermentation and L-glutamine producing bacterium
EP1424398A2 (en) 2001-02-05 2004-06-02 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-glutamine by fermentation and L-glutamine producing bacterium
US20030148474A1 (en) 2001-11-30 2003-08-07 Ajinomoto Co., Inc. New mutant glutamine synthetase and method for producing amino acids
JP2007510411A (ja) 2003-11-06 2007-04-26 メタボリック エクスプローラ Ｎａｄｐｈ消費生合成経路のために最適化された微生物菌株
JP2005278643A (ja) 2004-03-04 2005-10-13 Ajinomoto Co Inc Ｌ−グルタミン酸生産微生物及びｌ−グルタミン酸の製造法
JP2010041920A (ja) 2006-12-19 2010-02-25 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2008145737A1 (de) 2007-06-01 2008-12-04 Evonik Degussa Gmbh Ein verfahren zur herstellung von methacrylsäure oder methacrylsäureestern
WO2009008377A1 (ja) 2007-07-11 2009-01-15 Mitsui Chemicals, Inc. イソプロピルアルコール生産細菌及びこれを用いたイソプロピルアルコール生産方法
WO2009046929A2 (de) 2007-10-02 2009-04-16 Insilico Biotechnology Ag Biotechnologische fixierung von kohlenstoffdioxid
DE102007059248A1 (de) 2007-12-07 2009-06-10 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Zelle, welche in der Lage ist, CO2 zu fixieren
WO2009094485A1 (en) 2008-01-22 2009-07-30 Genomatica, Inc. Methods and organisms for utilizing synthesis gas or other gaseous carbon sources and methanol
WO2009135074A2 (en) 2008-05-01 2009-11-05 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of methacrylic acid
WO2009156214A1 (de) 2008-06-27 2009-12-30 Evonik Röhm Gmbh 2-hydroxyisobuttersäure produzierende rekombinante zelle
WO2010071697A1 (en) 2008-12-16 2010-06-24 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for conversion of syngas and other carbon sources to useful products
WO2011099006A2 (en) 2010-02-11 2011-08-18 Yeda Research And Development Co. Ltd. Enzymatic systems for carbon fixation and methods of generating same
JP2011167097A (ja) 2010-02-17 2011-09-01 Kobe Univ γ−アミノ酪酸の製造方法

Non-Patent Citations (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", vol. 8, 1974, pages: 599
"Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 227, no. 2, 1995, pages 363 - 367
APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 77, no. 6, 2011, pages 1925 - 1936
APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 81, 2009, pages 1107 - 1115
ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS, vol. 310, no. 1, 1994, pages 64 - 75
ARCHIVES OF MICROBIOLOGY, vol. 151, 1989, pages 252 - 256
BIOCHEMICAL JOURNAL, vol. 139, no. 2, 1974, pages 399 - 405
BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 1475, no. 3, 2000, pages 191 - 206
BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND BIOCHEMISTRY, vol. 59, no. 1, 1995, pages 140 - 142
GENE, vol. 241, 2000, pages 185 - 191
INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, vol. 39, no. 3, 1989, pages 337 - 345
INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, vol. 41, no. 2, 1991, pages 255 - 260
INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, vol. 43, no. 1, 1993, pages 162 - 173
INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, vol. 47, no. 4, 1997, pages 1061 - 1067
JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 161, no. 3, 1985, pages 1219 - 1221
JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 169, no. 1, 1987, pages 42 - 52
JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 176, no. 23, 1994, pages 7398 - 7404
JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 177, no. 6, 1995, pages 1511 - 1519
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 247, no. 18, 1972, pages 5785 - 5792
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 274, no. 8, 1999, pages 5078 - 5082
JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, vol. 94, no. 6, 2002, pages 497 - 505
JOURNAL OF GENERAL AND APPLIED MICROBIOLOGY, vol. 43, no. 6, 1997, pages 355 - 361
JOURNAL OF GENERAL MICROBIOLOGY, vol. 130, 1984, pages 2237 - 2246
MOLECULAR AND CELLULAR BIOCHEMISTRY, vol. 1, no. 2, 1973, pages 169 - 187
NATURE CHEMICAL BIOLOGY, vol. 7, 2011, pages 445 - 452
NATURE, vol. 451, 2008, pages 86 - 89
PLASMID, vol. 53, 2005, pages 191 - 204
PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 104, no. 25, 2007, pages 10631 - 10636
PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 97, no. 12, 2000, pages 6640 - 6645
SALVUCCI M. E., ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 153, no. 1, 1986, pages 97 - 101
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