TWI573869B - 導入有二氧化碳固定循環之微生物 - Google Patents

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Description

導入有二氧化碳固定循環之微生物
本發明係關於生產乙醯輔酶A之微生物及使用該微生物之物質生產方法。
乙醯輔酶A係在微生物之代謝路徑中極重要的一種中間體。有各式各樣的代謝產物係經由乙醯輔酶A而生產。如此之經由乙醯輔酶A而生成的物質，例如已知有：L-麩胺酸、L-麩醯胺酸、L-脯胺酸、L-精胺酸、L-白胺酸、L-異白胺酸等胺基酸類；乙酸、丙酸、丁酸、己酸、檸檬酸、3-羥基丁酸、3-羥基異丁酸、3-胺基異丁酸、2-羥基異丁酸、甲基丙烯酸及聚-3-羥基丁酸等有機酸類；異丙醇、乙醇、丁醇等醇類；此外，尚有丙酮、聚麩胺酸等。
乙醯輔酶A在許多微生物係以葡萄糖等糖作為碳源而生產。糖首先經由Embden-Meyerhof路徑、Entner-Doudoroff路徑、五碳糖磷酸路徑等稱為解糖系的代謝路徑變換為丙酮酸。之後，由於丙酮酸去羧酶(pyruvic acid decarboxylase)或丙酮酸-甲酸裂解酶(pyruvic acid-formic acid lyase)等的作用變換為乙醯輔酶A。此時，會產出二氧化碳或甲酸作為副產物，來自於糖的碳會有部分損失。所以，已有一些研究係探討將二氧化碳予以再固定而用以增加乙醯輔酶A之產量。
於微生物體內，已知有幾種固定二氧化碳成為碳源的路徑(Appl.Environ.Microbiol.77(6),1925-1936(2011))。具體而言，可列舉：卡爾文文生循環(Calvin-Benson cycle)、還原的TCA循環、Wood-Ljungdahl路徑、3-羥基丙酸循環、4-羥基丁酸循環等。Calvin-Benson循環存在於植物或光合成細菌，係由約 12種的酵素組成的CO2固定路徑，由核酮糖-1,5-雙磷酸羧化酶(RubisCO)固定CO2，且最終生產甘油醛3-磷酸。還原的TCA循環，係在綠色硫細菌等嫌氣性菌或微好氣性菌觀察到的循環，係由11種酵素組成，特徵為以鐵氧化還原蛋白(ferredoxin)作為輔酶之CO2固定酵素(乙醯輔酶A羧化酶、2-側氧基戊二酸合酶)，利用與通常之TCA循環為反方向的反應，從CO2產生丙酮酸。Wood-Ljungdahl路徑係在乙酸產生菌等嫌氣性微生物觀察到的路徑，由9種酵素組成，利用甲酸去氫酶或CO去氫酶等還原CO2或輔酶上的甲酸，最終變換為乙醯輔酶A。3-羥基丙酸循環係在綠曲撓菌(Chloroflexus)屬菌等觀察到的循環，由13種酵素組成，利用乙醯輔酶A(丙醯基輔酶A)羧化酶的作用固定CO2，並經由丙二醯基輔酶A(malonyl CoA)等而產生乙醯輔酶A。4-羥基丁酸循環，係存在於古細菌等之路徑，利用丙酮酸合酶(pyruvic acid synthase)、乙醯輔酶A(丙醯基輔酶A)羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvic acid carboxylase)的反應固定CO2，並經由4-羥基丁醯基輔酶A等而生產乙醯輔酶A。
另一方面，也有人報告一些點子，嘗試將固定二氧化碳之路徑導入有用化合物生產微生物而欲生產有用物質。例國際公開第2009/094485號小冊或國際公開第2010/071697號小冊，揭示以下提議：使用導入有類似於乙酸菌之Wood-Ljungdahl路徑的路徑的微生物從二氧化碳生產乙醯輔酶A。又，就固定CO2並使有用化合物生產之例，國際公開第2009/046929號小冊已揭示：使用導入有氫化酶(hydrogenase)與四氫葉酸裂解酶的微生物嘗試從二氧化碳生產乳酸。又，國際公開第2011/099006號小冊中，提出：經由對於乙醯輔酶A上之碳酸固定反應或丙二醯基輔酶A之還原反應並固定CO2之循環。德國專利申請案公開第102007059248號說明書提出：利用類似於4-羥基丁酸循環之路徑生產乙醯輔酶A。
但是公知之碳酸固定循環，從固定CO2並生產來自於乙醯輔酶A之有用化學品之觀點，未能稱得上效率一定是良好。比如，卡爾文文生循環在自然界之碳酸固定循環最有名，但是擔任碳酸固定的RubisCO反應速度慢，而且會觀察到氧化性分解此類的副反應，未能稱得上是效率好的酵素(Journal of Bioscience and Bioengineering 94(6)497-505,2002)。又，Wood-Ljungdahl路徑、國際公開第2009/094485號小冊、國際公開第2010/071697號小冊、國際公開第2009/046929號小冊等記載之路徑，包括將CO2還原為CO或甲酸的路徑，但是如此的還原反應在通常條件下難以進行，此外催化如此強還原反應之酵素常只能在還原性環境下作用，不易導入到絶對嫌氣性之微生物以外。於還原的TCA循環，在中途的利用丙酮酸合酶或2-側氧基戊二酸合酶的還原反應，必需有使鐵氧化還原蛋白成為電子受體的強還原力，就反應而言有困難。又，4-羥基丁酸循環、3-羥基丙酸循環、國際公開第2011/099006號小冊、國際公開第2009/046929號小冊等記載之路徑等，係利用琥珀醯基輔酶A之還原、或丙二醯基輔酶A之還原此類羧酸或其(硫)酯之還原反應，但是如此的反應一般就酵素反應而言係為困難，希望在發酵路徑中儘可能避免較理想(Atsumi et al.,Nature,451,(3),86-89,2008；Yim et al.,Nat.Chem.Biol.,7,445-452,2011)。4-羥基丁酸循環，係經由4-羥基丁醯基輔酶A之脫水、或3-羥基丙酸之脫水此類脫水反應，但是如此的反應若在水中時常會有與逆反應(水合)競爭的問題。又，4-羥基丁酸循環、3-羥基丙酸循環、還原的TCA循環，由於係利用丙二醯基輔酶A合成酵素或丙酮酸合成酵素的作用，將生產的乙醯輔酶A在循環內變換為其他物質，所以若從乙醯輔酶A之生產之觀點，未必能稱得上是有效率。
再者，當將如此的循環對微生物導入並嘗試生產某物質時， 必需要考慮構成循環之酵素之數目、或是應新賦予的酵素活性的數目。亦即，若建構循環之酵素或賦予酵素之數目愈多，控制會愈難，此外，對於微生物的負擔也會增加。例如，若欲將Wood-Ljungdahl路徑對於大腸桿菌導入，必需導入至少9種基因，在建構物質生產之路徑方面，再又導入這種程度的基因並控制，在現實上可說是極困難的作業。顯然地，以少數的酵素賦予建構以少數酵素構成之循環，在建構循環方面、在與物質生產路徑組合方面，都較有利。
因此，當固定CO2並變換為乙醯輔酶A時，以下可說是理想：A.構成路徑之各酵素之活性充分高、B.在循環中不含消耗乙醯輔酶A之酵素、C.新賦予的酵素數目少，循環簡單。但是迄今所報告之從CO2產生乙醯輔酶A之循環，並不存在滿足A~C之所有條件的循環，均欠缺實現性。基於此，在現有的碳酸固定循環的提議中，尚無實際上將酵素活性對於工業上利用的微生物賦予，並將CO2變換為乙醯輔酶A及乙醯輔酶A來源的物質而用在發酵的例子。
本發明提供對於利用二氧化碳以良好效率生成乙醯輔酶A為有用的微生物，及使用該微生物製造乙醯輔酶A及從乙醯輔酶A而來之有用的代謝產物的製造方法。
本發明如下。
[1]一種生產乙醯輔酶A之微生物，具有乙醯輔酶A生產循環，其係對於下列(a)、(b)、(c)、(d)及(e)中之任一者均不具有的微生物，(a)、(b)、(c)及(d)中之任一者均不賦予或即使賦予其機能也不發揮地，藉由賦予選自於由蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶、及羥基丙酮酸還原酶構成之群組中之至少1種之酵素活性而得；(a)具有從丙二醯基輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵 素反應的碳酸固定循環、(b)具有從乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應之碳酸固定循環、(c)具有從巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯基輔酶A或戊烯二醯基(glutoconyl)輔酶A之酵素反應之碳酸固定循環、(d)具有從CO2至甲酸之酵素反應之碳酸固定循環、以及(e)選自於由蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶構成之群組中之至少1種。
[2]如[1]之生產乙醯輔酶A之微生物，其係具有乙醯輔酶A生產循環，該乙醯輔酶A生產循環係磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸經由草醯乙酸，再者，藉由蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶獲得之2-羥基-3-側氧基丙酸進一步經由2-磷酸甘油酸而再度變換為磷酸烯醇丙酮酸。
[3]如[1]或[2]之生產乙醯輔酶A之微生物，其係具有由以下構成之乙醯輔酶A生產循環：(f)選自於由丙酮酸激酶及丙酮酸羧化酶、或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、或磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶構成之群組中之至少一種；(g)蘋果酸去氫酶；(h)蘋果酸硫激酶；(i)蘋果醯輔酶A裂解酶；(j)乙醛酸醛連接酶；(k)選自於由2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶、或羥基丙酮酸異構酶及羥基丙酮酸還原酶構成之群組中之至少一種；(l)選自於由甘油酸2-激酶、或磷酸甘油酸變位酶及甘油酸3-激酶構成之群組中之至少一種；及(m)烯醇酶。
[4]如[1]~[3]中任一項之生產乙醯輔酶A之微生物，其中，該微生物係屬於腸內細菌科之微生物或屬於棒型細菌之微生物。
[5]如[1]~[4]中任一項之生產乙醯輔酶A之微生物，其中，該微生物係埃希氏菌屬細菌或泛菌屬細菌的屬於腸內細菌科之微 生物、或係棒桿菌屬細菌的屬於棒型細菌之微生物。
[6]如[1]~[5]中任一項之生產乙醯輔酶A之微生物，其中，該微生物為埃希氏菌屬細菌且埃希氏菌屬細菌具有之乳酸去氫酶之活性係失活或減活。
[7]如[1]~[6]中任一項之生產乙醯輔酶A之微生物，其中，該微生物為埃希氏菌屬細菌，且埃希氏菌屬細菌具有之選自於由異檸檬酸裂解酶及蘋果酸合酶構成之群組中之至少1種酵素之活性係失活或減活。
[8]如[1]~[7]中任一項之生產乙醯輔酶A之微生物，其中，該微生物係埃希氏菌屬細菌且已對於埃希氏菌屬細菌賦予或強化硫解酶活性、輔酶A轉移酶活性及乙醯乙酸去羧酶活性。
[9]如[1]~[8]中任一項之生產乙醯輔酶A之微生物，其中，該微生物係埃希氏菌屬細菌且已對於埃希氏菌屬細菌賦予或強化硫解酶活性、輔酶A轉移酶活性、乙醯乙酸去羧酶活性及異丙醇去氫酶活性。
[10]如[1]~[5]中任一項之生產乙醯輔酶A之微生物，其中，該微生物為泛菌屬細菌，且泛菌屬細菌具有之富馬酸水合酶A及富馬酸水合酶C之活性係失活或減活。
[11]如[1]~[5]及[10]中任一項之生產乙醯輔酶A之微生物，其中，微生物為泛菌屬細菌，且泛菌屬細菌具有之蘋果酸合酶之活性係失活或減活。
[12]如[1]~[11]中任一項之生產乙醯輔酶A之微生物，其中，該蘋果酸硫激酶，係使用相當於Methylobacterium extorquens來源之mtkB之144號胺基酸的胺基酸為異白胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、麩醯胺酸或脯胺酸，及/或244號胺基酸係使用麩胺酸、丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、天冬醯胺酸、酪胺酸、離胺酸或精胺酸的蘋果酸硫激酶。
[13]一種乙醯輔酶A生產方法，係包含使用[1]~[12]中任一項之生產乙醯輔酶A之微生物從碳源材料生產乙醯輔酶A。
[14]一種丙酮生產方法，係包含使用[9]或[12]記載之生產乙 醯輔酶A之微生物從碳源材料生產丙酮。
[15]一種異丙醇生產方法，係包含使用[9]或[12]記載之生產乙醯輔酶A之微生物從碳源材料生產異丙醇。
[16]一種麩胺酸生產方法，係包含使用[5]、[10]、[11]或[12]記載之生產乙醯輔酶A之微生物從碳源材料生產麩胺酸。
依照本發明，提供用於以良好效率將二氧化碳變換為乙醯輔酶A之有用微生物，並提供使用該微生物製造乙醯輔酶A及有用代謝產物之製造方法。
[實施發明之形態]
本發明之生產乙醯輔酶A之微生物，係對於下列(a)、(b)、(c)、(d)及(e)中任一者均不具有之微生物，(a)、(b)、(c)及(d)中之任一者均不賦予或即使賦予其機能也不發揮，而具有藉由賦予選自於由蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶、及羥基丙酮酸還原酶構成之群組中至少1種酵素活性而得到之乙醯輔酶A生產循環。
(a)具有從丙二醯基輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應之碳酸固定循環。
(b)具有從乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應之碳酸固定循環。
(c)具有從巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯基輔酶A或戊烯二醯基輔酶A之酵素反應之碳酸固定循環。
(d)具有從CO2至甲酸之酵素反應之碳酸固定循環。
(e)選自於由蘋果酸硫激酶與蘋果醯輔酶A裂解酶構成之群組中之至少1種。
依照本發明，藉由賦予既定酵素活性，構建能將糖代謝產生之CO2或從外部供給的CO2固定化的二氧化碳固定循環，能提供一種具有能以良好效率將CO2變換為乙醯輔酶A之乙醯輔酶A生產循環的生產乙醯輔酶A之微生物。
亦即本發明為了將CO2變換為乙醯輔酶A而進行各種探討，結果發現：如上述，藉由對於下列(a)、(b)、(c)、(d)及(e)中任一者均無之微生物，(a)、(b)、(c)及(d)中任一者均未賦予或即使賦予也未發揮其機能地賦予選自於由蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶、及羥基丙酮酸還原酶構成之群組中之至少1種酵素活性，能將CO2變換為乙醯輔酶A。
(a)具有從丙二醯基輔酶A生成丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應之碳酸固定循環、(b)具有從乙醯輔酶A與CO2生成丙酮酸之酵素反應之碳酸固定循環、(c)具有從巴豆醯輔酶A與CO2生成乙基丙二醯基輔酶A或戊烯二醯基輔酶A之酵素反應之碳酸固定循環、(d)具有從CO2生成甲酸之酵素反應之碳酸固定循環、(e)選自於由蘋果酸硫激酶與蘋果醯輔酶A裂解酶構成之群組中之至少1種。
又，藉由利用該將CO2變換為乙醯輔酶A之生產乙醯輔酶A之微生物，並對於該微生物更進一步賦予既定酵素活性，能以良好效率生產乙醯輔酶A、以及來自於乙醯輔酶A之有用代謝產物，例如：異丙醇、乙醇、丙酮、檸檬酸、伊康酸、乙酸、丁酸、(聚-)3-羥基丁酸、3-羥基異丁酸、3-胺基異丁酸、2-羥基異丁酸、甲基丙烯酸、(聚)麩胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、鳥胺酸、瓜胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸等物質。
本發明提出：固定CO2並變換為乙醯輔酶A之最簡單且實用的乙醯輔酶A生產循環(圖1)。
圖1記載之乙醯輔酶A生產循環，顯示本發明中之乙醯輔酶A生產循環的一理想態樣(以下有時稱為「圖1之循環」)。
係由以下8~10種酵素構成且(磷酸烯醇)丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase)負責碳酸固定：從磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶、丙酮酸羧化酶及丙酮酸激酶構成的群組中選出至少一種；從蘋果酸去氫酶、蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、羥基丙酮酸異構酶、羥基丙酮酸還原酶及2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶構成之群組中選出至少一種；從甘油酸2-激酶、磷酸甘油酸變位酶及甘油酸3-激酶構成之群組中選出至少一種；以及烯醇酶。該(磷酸烯醇)丙酮酸羧化酶屬於碳酸固定酵素當中之高活性類。例如植物等光合成利用的RubisCO之比活性，已知為約3U~20U/mg(J.Biol.Chem.274(8)5078-82(1999),Anal.Biochem.153(1)97-101(1986))，相對於此，(磷酸烯醇)丙酮酸羧化酶在大腸桿菌為30U/mg，高者也有人報告有達100~150U/mg者(J.Biol.Chem.247,5785-5792(1972)；Biosci.Biotechnol.Biochem.59,140-142(1995)；Biochim Biophys Acta.1475(3)：191-206(2000))。又，合成蘋果醯輔酶A之蘋果酸硫激酶(mtk)，在本研究中，發現：比起迄今已知的酵素(J.Biol.Chem.248(21)7295-303(1973))活性更高的蘋果酸硫激酶。再者，構成圖1之循環的酵素數為8~10種，相較於公知之乙醯輔酶A生產循環為最簡單而且要對微生物賦予的酵素數可為少。而且，圖1之循環中不包括會消耗乙醯輔酶A的酵素。所以，圖1之循環可說是用以固定CO2並變換為乙醯輔酶A的理想的循環。
再者，就圖1之循環的優點而言，可列舉：由於循環與解糖系係獨立，因此能自由地與各種路徑的解糖系組合。例如五碳糖 ‧磷酸路徑由於NADPH之生產量高，時常用在物質生產(日本特表2007-510411號公報)，由於與本循環獨立，可輕易組合。
圖1之循環中，蘋果酸去氫酶(mdh)、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶(glxR)或羥基丙酮酸還原酶(ycdW)各將NADH(或NADPH)消耗作為還原力。又，蘋果酸硫激酶(mtk)、甘油酸3-激酶(glxK)、甘油酸2-激酶(garK)、丙酮酸羧化酶(pyc)消耗ATP。丙酮酸激酶(pyk)生產丙酮酸。
就圖1之循環之收支而言，當以磷酸烯醇丙酮酸作為起始物質之情形，為「磷酸烯醇丙酮酸+2輔酶A+CO2+3NAD(P)H+3ATP→2乙醯輔酶A+3NAD(P)++3ADP」。
又，當以丙酮酸作為起始物質之情形，成為「丙酮酸+2輔酶A+CO2+3NAD(P)H+4ATP→2乙醯輔酶A+3NAD(P)++4ADP」。
亦即，圖1之循環當固定CO2並轉換為乙醯輔酶A時，必需供給磷酸烯醇丙酮酸(或丙酮酸)、NAD(P)H、ATP。
在以乙醯輔酶A當作中間產物的發酵路徑中，在發酵中消耗氧的路徑的收支式記載於表1。該等發酵中，會於發酵路徑上生成NADH等還原型輔酶，其推測會由於氧的作用而發生回到氧化型的現象。而若生成之還原型輔酶不會由氧消耗而是由圖1之循環消耗，則發酵中生成之還原力能有效利用在乙醯輔酶A生產循環，可期待能固定CO2並變換為生產物。
又，在此之還原型輔酶，係指NADH、NADPH、FADH2、FMNH2、還原型醌輔酶此類涉及氧化還原的輔酶，且指還原狀態輔酶，較佳為NADH或NADPH，更佳為NADH。另一方面，氧化型輔酶，係還原型輔酶之氧化型，係指例如NAD+、NADP+、FAD、FMN、氧化型醌輔酶，較佳為NAD+或NADP+，更佳為NAD+。
[表1]
又，如表1，在發酵式的左邊存在氧的發酵中，常需要大量的氧，因此有時需要大量通氣或強力攪拌，會導致設備費或電費增加。而，若導入圖1之循環，藉由消耗多餘的還原力，能緩和過度的通氣攪拌，可期待減少發酵生產的費用。
為了補強本發明之循環之還原力，可添加能生產還原力的物質，或從外部提供能量以賦予還原力。例如可考慮以下等方式：利用高還原度之物質(例如氫、亞硫酸鹽、醇類、石蠟等)作為基質、以電培養直接供給還原能量、以生物之光化學反應提供還原力等。又，若能從外部補給還原力，則即使不是如表1會產生還 原型輔酶的發酵，也能驅動提案的碳酸固定路徑。
以下針對本發明說明。
本發明中，「二氧化碳(CO2)固定」係指將糖代謝產生之CO2或從外部供給的CO2變換為有機化合物。CO2也可為HCO3 -。又，本說明書中，「二氧化碳(CO2)固定」有時稱為「碳酸固定」。
本說明書中，用語「步驟」不僅指獨立的步驟，即使無法與其他步驟明確區別，只要能達成該步驟所期待的目的即包括在本用語。又，本說明書中，「~」代表的數值範圍，在「~」前後記載之數值各代表包括最小值及最大值之範圍。
本發明中，提及組成物中之各成分之量時，當於組成物中各成分所該當的物質有多數存在時，若無特別指明，則意指組成物中存在之該多數物質之合計量。
本發明中，「失活」係指利用既存的各種測定系測定之酵素(若未特別指明，在本說明書中，「酵素」也包括單獨未顯示酵素活性的「因子」)之活性，當令失活前於微生物之活性為100，為其1/10以下之狀態。
本發明中，酵素活性之「減低」，係指利用編碼為該酵素之基因之基因重組技術，使該酵素之活性比起進行此等處理前之狀態顯著下降的狀態。
本發明中，「活性」之「強化」係廣泛指強化前在微生物之各種酵素活性於強化後提高。
強化之方法，只要能提高微生物具有的各種酵素之活性即可，無特別限制，可列舉：利用從細胞外導入的酵素基因所為強化、利用細胞內之酵素基因之表現增強所為之強化及該等之組合。
利用從細胞外導入的酵素基因所為之強化，具體而言，可列舉：將編碼為比起寄主來源的酵素有更高活性之酵素的基因利用基因重組技術從寄主微生物之細胞外導入到細胞內，利用導入的酵素基因而追加酵素活性或以該酵素活性取代寄主原本具有的酵素活性，及更進一步將寄主來源的酵素基因或來自於細胞外的酵素基因的數目增加為2以上，及該等之組合。
利用微生物內之酵素基因之表現增強所為之強化，具體而言可列舉：將增強酵素基因之表現的鹼基序列從寄主微生物之微生物外導入到微生物內、將寄主微生物在基因體上保有的酵素基因的啟動子取代成其他啟動子以強化酵素基因之表現，及該等之組合。
本發明中，「活性」之「賦予」，廣泛指對於未找到對象酵素基因的微生物，將酵素基因從外部導入並提供成為對象之酵素之活性。賦予的方法，只要能夠對於微生物提供成為對象之酵素之活性即可，無特別限制，可列舉：利用保有酵素基因之質體進行轉形、將酵素基因導入基因體、及該等之組合。
「活性」之「強化」或「賦予」可使用之啟動子，只要能夠表現基因即可，無特別限制，可使用構成型啟動子或誘導型啟動子。
當判斷該微生物是否有成為對象之酵素基因之情形，可參考例如KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes；http：//www.genome.jp/kegg/)或NCBI(National Center for Biotechnology Information；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)登載的各菌株之基因資訊。又，本發明僅使用KEGG或NCBI登載的各菌株之基因資訊。
本發明中，酵素活性之賦予，可藉由例如將編碼為酵素之基因利用基因重組技術從寄主細菌之細胞外導入到細胞內以進行。 此時導入的酵素基因，可以對寄主細胞為同種或異種均可。
從細胞外將基因導入細胞內時必需之基因體DNA之製備、DNA之切斷及連結、轉形、PCR(Polymerase Chain Reaction)、設計作為引子之寡核苷酸、合成等方法，可利用該技術領域之人士熟知的通常的方法進行。該等方法記載於Sambrook,J.,etal.,”Molecular Cloning A Laboratory Manual,Second Edition”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989)等。
本發明中，「利用基因重組技術」等的用語，只要是藉由對於天生之基因之鹼基序列插入其他DNA、或將基因的某部分取代、缺失或該等之組合而造成鹼基序列上的改變即全部包括，例如也可為獲得產生突變之結果者。
本發明中，因子或酵素之活性失活的微生物，係指利用從細胞外到細胞內的某方法，而造成天生之活性受損的微生物。該等微生物可利用破壞例如編碼為該蛋白質或酵素之基因(基因破壞)而製作。
本發明中，就基因破壞而言，係為了使得某基因之機能無法發揮，可列舉：在該基因之鹼基序列置入變異、插入其他DNA、及使基因之某部分缺失。基因破壞之結果，例如該基因無法轉錄為mRNA、結構基因無法被轉譯。或由於被轉錄的mRNA不完整，使得轉譯出來的結構蛋白質的胺基酸序列發生變異或缺失，不能發揮原本的機能。
基因破壞株之製作，只要能獲得不表現該酵素或蛋白質之破壞株的各方法都可採用。基因破壞的方法據報告有各種方法(自然育種、變異劑添加、紫外線照射、放射線照射、隨機突變、轉位子、部位專一性基因破壞)，但從能僅破壞某特定基因的觀點，宜 以利用相同重組之基因破壞為較佳。利用相同重組之方法，記載J.Bacteriol.,161,1219-1221(1985)或J.Bacteriol.,177,1511-1519(1995)或Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,97,6640-6645(2000)，該技術領域中之技術人士可利用該等方法及其應用輕易實施。
本發明中「寄主」，係指將1個以上之基因從微生物外導入的結果，成為能發揮本發明之效果之狀態的該微生物。
又，本發明中，「寄主」，係指不論原本是否具有從碳源材料生產乙醯輔酶A的能力，藉由某種方法使得具有從碳源材料生產乙醯輔酶A之能力的微生物。
本發明中，「寄主」也可具備有用代謝產物之生產路徑。本發明中，「有用代謝產物」，係指醇、胺基酸、有機酸、萜烯類等在微生物之代謝路徑中的主要代謝產物的總稱。不論原本是否有生產有用代謝產物的能力，藉由某方法而可具有生產有用代謝產物之能力之微生物即可。
本發明中，「來自於乙醯輔酶A之有用代謝產物」，係指在代謝路徑上經由乙醯輔酶A而生產的有用代謝產物的總稱。醇例如：異丙醇、乙醇、丁醇等。胺基酸例如：L-麩胺酸、L-麩胺酸、L-精胺酸、L-鳥胺酸、L-瓜胺酸、L-白胺酸、L-異白胺酸、L-脯胺酸等。有機酸例如：3-羥基丁酸、聚-3-羥基丁酸、聚麩胺酸、3-羥基異丁酸、3-胺基異丁酸、2-羥基異丁酸、甲基丙烯酸、檸檬酸、乙酸、丙酸、丁酸、己酸、甲羥戊酸(mevalonic acid)等。萜烯類例如：異戊二烯、鯊烯、類固醇、類胡蘿蔔素等。此外，可列舉例如丙酮等。不論原本是否有生產來自於乙醯輔酶A之有用代謝產物之能力，只要利用某方法而具有能生產來自於乙醯輔酶A之有用代謝產物之能力之微生物即可。
本發明之「乙醯輔酶A之生產」，係指於代謝路徑上將某物質變換為乙醯輔酶A。乙醯輔酶A為代謝中間產物，在代謝路徑上會迅速地變換成各式各樣的物質，所以，巨觀上乙醯輔酶A量不一定會增加，但可檢測來自於乙醯輔酶A之物質之CO2來源的水平、或來自於乙醯輔酶A之物質之對糖產率等上升等而間接的掌握效果。關於變換的要因有各式各樣(輔酶量、基質量、回饋抑制等所致之代謝變化等)，所以，乙醯輔酶A之生產量不一定會與所有乙醯輔酶A來源的物質的量成比例，但若強化從乙醯輔酶A生產特定物質之生產路徑、或原本就強的情形(例如下列生產異丙醇之微生物或生產麩胺酸之微生物的情形)，由於乙醯輔酶A以後的變換效率不易受外在要因影響，所以該物質之生產效率可視為乙醯輔酶A生產效率的指標。
本發明之生產乙醯輔酶A之微生物，具有乙醯輔酶A生產循環，其係對於下列(a)、(b)、(c)、(d)及(e)中任一者均不具有的微生物，(a)、(b)、(c)及(d)中之任一者均不賦予或即使賦予也不發揮其機能，藉由賦予選自於由蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶、及羥基丙酮酸還原酶構成之群組中之至少1種酵素活性而得之生產乙醯輔酶A之微生物。
(a)具有從丙二醯基輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應的碳酸固定循環、(b)具有從乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應之碳酸固定循環、(c)具有從巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯基輔酶A或戊烯二醯基輔酶A之酵素反應之碳酸固定循環、(d)具有從CO2至甲酸之酵素反應之碳酸固定循環、(e)選自於由蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶構成之群組中之至少1種。
從乙醯輔酶A生產效率之觀點，生產乙醯輔酶A之微生物宜賦予有蘋果酸硫激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶之酵素活性較佳，賦予有蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶及乙醛酸醛連接酶之酵素活性更佳，賦予有蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶及/或羥基丙酮酸還原酶之酵素活性又更佳。
在此，本發明中，「非(天生)具有」，係指寄主微生物於天然界原本不具有之意。
本說明書中，「具有從丙二醯基輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應之碳酸固定循環」，係指下列(1)~(7)之循環。
(1)國際公開第2011/099006號小冊之圖1所示之乙醯輔酶A經由丙二醯基輔酶A、3-羥基丙酸、丙醯基輔酶A、蘋果酸、蘋果醯輔酶A，再變換為乙醯輔酶A之循環
(2)國際公開第2011/099006號小冊之圖4A所示之乙醯輔酶A經由丙二醯基輔酶A、丙二酸半醛、β-丙胺酸、蘋果酸、蘋果醯輔酶A，再變換為乙醯輔酶A之循環
(3)國際公開第2011/099006號小冊之圖4B、16或18所示之乙醯輔酶A經由丙二醯基輔酶A、羥基丙酸、(R)-乳酸或(S)-乳酸、蘋果酸、蘋果醯輔酶A，再變換為乙醯輔酶A之循環
(4)國際公開第2011/099006號小冊之圖8所示之乙醯輔酶A經由丙二醯基輔酶A、丙二酸半醛或羥基丙酸、丙酮酸、蘋果酸、蘋果醯輔酶A，再變換為乙醯輔酶A之循環
(5)國際公開第2011/099006號小冊之圖9A、9B或9C所示之乙醯輔酶A經由丙二醯基輔酶A、羥基丙酸、2-酮基戊二酸、蘋果酸、蘋果醯輔酶A，再變換為乙醯輔酶A之循環
(6)國際公開第2011/099006號小冊之圖9D或9F所示之乙醯輔酶A經由丙二醯基輔酶A、羥基丙酸、甲基丙二醯基輔酶A、蘋果酸、蘋果醯輔酶A，再變換為乙醯輔酶A之循環
(7)國際公開第2011/099006號小冊之圖17所示之乙醯輔酶A 經由丙二醯基輔酶A、丙二酸半醛或羥基丙酸、甲基丙二醯基輔酶A、丙酮酸、草醯乙酸、蘋果酸、蘋果醯輔酶A，再變換為乙醯輔酶A之循環。
上述(1)~(7)之碳酸固定循環共通具有從丙二醯基輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應。該等反應由丙二酸半醛去氫酶或丙二醯基輔酶A還原酶催化(國際公開第2011/099006號小冊)。如此的琥珀醯基輔酶A之還原、或丙二醯基輔酶A之還原此類之羧酸或其(硫)酯之還原反應，一般而言就酵素反應為困難，在發酵路徑儘可能希望避免(Atsumi et al.,Nature,451,(3),86-89,2008；Yim et al.,Nat.Chem.Biol.,7,445-452,2011)。
本說明書中「具有從乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應之碳酸固定循環」，係指下列(8)~(10)之循環。
(8)國際公開第2011/099006號小冊之圖1所示之乙醯輔酶A經由丙酮酸、磷酸烯醇丙酮酸、草醯乙酸、蘋果酸、蘋果醯輔酶A，再變換為乙醯輔酶A之循環
(9)國際公開第2011/099006號小冊之圖7C、7D或7E所示之乙醯輔酶A經由丙酮酸、蘋果酸、蘋果醯輔酶A，再變換為乙醯輔酶A之循環
(10)國際公開第2011/099006號小冊之圖9M所示之乙醯輔酶A經由丙酮酸、2-酮基戊二酸、蘋果酸、蘋果醯輔酶A，再變換為乙醯輔酶A之循環
上述(8)~(10)之碳酸固定循環共通具有從乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應。催化該反應的是丙酮酸合酶(國際公開第2011/099006號小冊)。利用丙酮酸合酶(synthase)合成丙酮酸的反應，需要借重鐵氧化還原蛋白(ferredoxin)的強還原力，故反應慢且不耐氧，故若非在極端嫌氣條件下反應不會進行。
本說明書中「具有從巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯基輔酶 A或戊烯二醯基輔酶A之酵素反應之碳酸固定循環」，係指國際公開第2011/099006號小冊之圖9H或9J所示之乙醯輔酶A經由巴豆醯輔酶A、乙基丙二醯基輔酶A或戊烯二醯基輔酶A、草醯乙酸、蘋果酸、蘋果醯輔酶A，再變換為乙醯輔酶A之循環。
催化上述從巴豆醯輔酶A與CO2變換為乙基丙二醯基輔酶A或戊烯二醯基輔酶A的是巴豆醯輔酶A羧基酶-還原酶或甲基巴豆醯輔酶A羧化酶。巴豆醯輔酶A羧基酶-還原酶，對碳酸鹽的Km高(14mM；PNAS 104(25)10631-10636、(2007))、於低濃度域未能期待活性。又，基質巴豆醯輔酶A可利用從3-羥基丁醯基輔酶A以脫水反應生產，但如此的酵素通常若在水中環境下，逆反應的水合反應會處於優勢，故不能期待有足夠速度。又，甲基巴豆醯輔酶A羧化酶，據報告比活性並非頗高(0.2-0.6U/mg；Arch Biochem Biophys.310(1)64-75(1994))，故與上述相同，會有無法預期基質巴豆醯輔酶A之生產有足夠速度的問題。
本說明書中「具有從CO2至為甲酸之酵素反應之碳酸固定循環」，係指國際公開第2009/046929號小冊之圖5、6、13或14所示之循環，亦即具有從CO2經由甲酸、絲胺酸之路徑，且草醯乙酸經由蘋果酸、蘋果醯輔酶A、甘油酸再變換為草醯乙酸之循環。
上述從CO2至為甲酸之酵素反應需有強還原力，所以反應慢，而且對氧不耐，若不是在極端嫌氣條件下反應不進行。
本說明書中，碳酸固定循環「即使賦予也不(不會)發揮其機能」，係指對於未找到對象酵素基因的微生物，將帶有活性的酵素基因從外部導入且提供成為對象之酵素之活性，但是作為碳酸固定循環不具作用。「作為碳酸固定循環不具作用」，可藉由在使用經標記的CO2的試驗中，未檢測到循環中之代謝產物或來自於該等代謝產物之物質有CO2來源的標記、或未觀察到循環中之來自代謝產物之物質之對糖產率等上升等而間接地掌握。
前述生產乙醯輔酶A之微生物中構建的乙醯輔酶A生產循環，係包括蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、羥基丙酮酸還原酶、乙醛酸醛連接酶或2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶的路徑。如此的乙醯輔酶A生產循環的一例如圖1。又，前述乙醯輔酶A生產循環，不具有消耗乙醯輔酶A的酵素例如乙醯輔酶A羧化酶或丙酮酸合酶。
圖1所示之乙醯輔酶A生產循環中，二氧化碳，首先由磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸羧化酶(pyc)、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(pck)等作用而與磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸結合並變換為草醯乙酸。草醯乙酸，由於蘋果酸去氫酶(mdh)之作用變換為蘋果酸。蘋果酸由於蘋果酸硫激酶(mtk)之作用而變換為蘋果醯輔酶A(蘋果酸輔酶A)。蘋果醯輔酶A(蘋果酸輔酶A)由於蘋果醯輔酶A裂解酶(Mcl)之作用而變換為乙醯輔酶A及乙醛酸。乙醛酸由於乙醛酸醛連接酶(gcl)之作用而變換為2-羥基-3-側氧基丙酸。3-羥基-2-側氧基丙酸由於2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶(glxR)之作用而變換為甘油酸或由於羥基丙酮酸異構酶(hyi)之作用而變換為羥基丙酮酸之後再由羥基丙酮酸還原酶(ycdW)之作用變換為甘油酸。甘油酸由於甘油酸3-激酶(glxK)之作用而變換為3-磷酸甘油酸或由甘油酸2-激酶(garK)之作用而變換為2-磷酸甘油酸。3-磷酸甘油酸由磷酸甘油酸變位酶(gpm)之作用變換為2-磷酸甘油酸。2-磷酸甘油酸由烯醇酶(eno)之作用而變換為磷酸烯醇丙酮酸。循環包括丙酮酸羧化酶的情形，由丙酮酸激酶(pyk)之作用將磷酸烯醇丙酮酸變換為丙酮酸。
對於前述生產乙醯輔酶A之微生物賦予之酵素活性，只要是賦予的結果能機能性構建前述乙醯輔酶A生產循環者即可，可因應寄主微生物在本說明書記載之範圍內適當選擇。
於因為不具一部分圖1之循環上之酵素而在圖1中任一路徑無法形成封閉循環的微生物，需要對其賦予不足的酵素。埃希氏 菌屬細菌之中，例如大腸桿菌不具蘋果酸硫激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶，故至少賦予此兩酵素即可。
又，泛菌屬細菌例如Pantoea ananatis，不具有蘋果酸硫激酶、及蘋果醯輔酶A裂解酶、及乙醛酸醛連接酶，故至少賦予蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶即可。
又，棒型細菌之中，例如Corynebacterium glutamicum不具蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶、及羥基丙酮酸還原酶，故至少賦予蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶及/或羥基丙酮酸還原酶即可。
前述消耗乙醯輔酶A之酵素，係指以乙醯輔酶A作為基質變換為其他物質的酵素。例如依國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號6.4.1.2，將乙醯輔酶A變換為丙二醯基輔酶A之乙醯輔酶A羧化酶、或分類為酵素號1.2.7.1，將乙醯輔酶A變換為丙酮酸之丙酮酸合酶。
包括前述消耗乙醯輔酶A之酵素之循環，係指藉由消耗乙醯輔酶A的酵素，使乙醯輔酶A經由循環再度回到乙醯輔酶A之此種封閉的循環。又，藉由消耗乙醯輔酶A的酵素而被變換的物質，非回到乙醯輔酶A而是變換為其他生產物的情形(例如異丙醇生產路徑中，變換為異丙醇作為最終產物的情形)，並非封閉的循環，所以不包括在「包括消耗乙醯輔酶A之酵素之循環」。
前述封閉的循環，係指從循環上的任意物質開始，經由循環而變換為其他物質，最終變換為為起初為相同物質的路徑。
前述蘋果酸硫激酶，係依國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號6.2.1.9，使蘋果酸與輔酶A結合並變換為蘋果醯輔酶A之酵素的總稱。反應時，會消耗1分子ATP，並生成1 分子ADP及磷酸。本酵素由約400個胺基酸的大次單元(large subunit)及300個胺基酸的小次單元(small subunit)構成。在基因上，通常以large subunit、small subunit的順序存在。本專利申請案為求簡便，將大次單元(large subunit)稱為mtkB、小次單元(small subunit)稱為mtkA。本酵素之比活性據報告有例如精製酵素為2.5U/mg之例(Anal Biochem.227(2),363-367(1995))。
本酵素係在甲烷等Cl碳源之同化代謝路徑(J.Bacteriol.176(23),7398-7404(1994))或3-羥基丙酸路徑(Arch.Microbiol.,151、252-256(1989))中主要觀察到的酵素，可見到在基因體上的附近有蘋果醯輔酶A裂解酶存在的特徵，若為如此的酵素即可理想地使用。以精製酵素評價活性之例，已知有Methylobacterium extorquens來源的蘋果酸硫激酶，但比對實際序列與活性者少，同時評價活性與序列的例只有Methylobacterium extorquensAM1株來源酵素(Genbank Accession Number AAA62654及AAA62655)(J.Bacteriol.176(23),7398-7404(1994))。該文獻中，係選殖基因並將其導入相同Methylobacterium extorquens並評價活性。然即使實際合成該序列並評價例少，也未能認為有活性。而，若比較AAA62655的序列、及本發明重新取得的Methylobacterium extorquens來源的蘋果酸硫激酶序列(序列號70)，發現AAA62655的羧酸末端有大幅(36個胺基酸)缺失，與其他蘋果酸硫激酶的序列(例如圖3)比較，異常的短，據認為是錯誤的記載了非活性型的序列。
因此實際上選殖蘋果酸硫激酶並使異種微生物表現，比對活性與序列之報告例，事實上本發明為首次。
蘋果酸硫激酶例如：Methylobacterium extorquens(Methylobacterium extorquens)等甲基桿菌屬來源(序列號70及71)、Hyphomicrobium methylovorum(Hyphomicrobium methylovorum)、Hyphomicrobium denitrificans(Hyphomicrobium denitrificans)等生絲微菌(Hyphomicrobium)屬來源、Rhizobium sp(Rhizobium sp)NGR234等根瘤菌屬來源、Granulibacter bethesdensis(Granulibacter bethesdensis)等Granulibacter屬來源(序列號107及108)、Nitrosomonas europaea(Nitrosomonas europaea)等亞硝化單胞菌屬來源、Methylococcus capsulatus(Methylococcus capsulatus)等甲基球菌(Methylococcus)屬來源、gammaproteobacteria界來源者。
從經由乙醯輔酶A之有用物質之生產效率之觀點，尤佳例如為生絲微菌屬來源的胺基酸序列(序列號73及74、110及111)、根瘤菌屬來源的胺基酸序列(序列號75及76)、亞硝化單胞菌屬來源的胺基酸序列(序列號113及114)、甲基球菌屬來源的胺基酸序列(序列號116、117)、及gammaproteobacteria界來源的胺基酸序列(例如序列號118、119)。
生絲微菌屬來源的蘋果酸硫激酶(序列號73、74及110及111)、根瘤菌屬來源的蘋果酸硫激酶(序列號75及76)及亞硝化單胞菌(Nitrosomonas)屬來源的蘋果酸硫激酶(序列號113及114)，有65%~80%的相同性。又，甲基球菌屬來源的蘋果酸硫激酶(序列號116、117)，與gammaproteobacteria界來源的蘋果酸硫激酶(例如序列號118、119)有70%~80%的相同性。
對於本發明中揭示的生絲微菌屬來源的蘋果酸硫激酶、根瘤菌屬來源的蘋果酸硫激酶、亞硝化單胞菌屬來源的蘋果酸硫激酶、甲基球菌屬來源的蘋果酸硫激酶、gammaproteobacteria界來源的蘋果酸硫激酶，各胺基酸序列帶有70%以上的同源性且具有蘋果酸硫激酶活性的蘋果酸硫激酶，可理想地用於生產本發明之乙醯輔酶A及來自於乙醯輔酶A之有用產物。
實施例所示之蘋果酸硫激酶之比對(alignment)結果，如圖2A及圖2B(MtkB：mtk之large subunit)(以下將圖2A及圖2B合稱 為「圖2」。)及圖3A及圖3B(MtkA：mtk之small subunit)(以下將圖3A及圖3B合稱為「圖3」。)所示。如圖2及圖3所示可知：蘋果酸硫激酶全體保持著相同胺基酸或保守為類似胺基酸之高相同性的共通序列。
Methylobacterium extorquens(圖2及圖3中記載為Me)、高酵素活性之Rhizobium sp(圖2及圖3中記載為Rh)、Hyphomicrobium methylovorum(圖2及圖3中記載為Hme)、Hyphomicrobium denitrificans(圖2及圖3中記載為Hd)、Nitrosomonas europaea(圖2及圖3中記載為Ne)、Methylococcus capsulatus(圖2及圖3中記載為Mc)及gammaproteobacteria界來源的蘋果酸硫激酶(圖2及圖3中記載為gam)，分類為以下所示之第一群組至第四群組的4個群組，且圖2及圖3將各群組以「.+#＊」的4種記號代表。
第一群組，係將Methylobacterium extorquens、與酵素活性高的Rhizobium sp、Hyphomicrobium methylovorum、Hyphomicrobium denitrificans、Nitrosomonas europaea、Methylococcus capsulatus及gammaproteobacteria進行比較時具有不同序列的部位，圖2及圖3以「.」的記號表示。序列之位置係依Methylobacteriumextorquens之胺基酸之序列號記載。
MtkB(圖2)，可列舉：18號之組胺酸、脯胺酸或離胺酸、21號之精胺酸、麩胺酸、天冬胺酸或丙胺酸、26號之酪胺酸或組胺酸、29號之麩胺酸、丙胺酸或精胺酸、34號之精胺酸或纈胺酸、36號之精胺酸、絲胺酸或麩胺酸、42號之精胺酸、蘇胺酸、纈胺酸或甘胺酸、44號之纈胺酸、66號之天冬胺酸、麩胺酸、組胺酸、異白胺酸或白胺酸、67號之組胺酸、離胺酸或麩胺酸、74號之天冬胺酸或麩胺酸、75號之絲胺酸、苯基丙胺酸、丙胺酸或麩胺酸、80號之蘇胺酸、離胺酸或組胺酸、84號之組胺酸或脯胺酸、89 號之麩醯胺酸、丙胺酸、甘胺酸或離胺酸、92號之白胺酸或纈胺酸、100號之麩胺酸、丙胺酸或麩醯胺酸、102號之甲硫胺酸、蘇胺酸、絲胺酸或纈胺酸、103號之天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、組胺酸或絲胺酸、104號之異白胺酸或脯胺酸、105號之丙胺酸、天冬胺酸、離胺酸或麩醯胺酸、112號之苯基丙胺酸或白胺酸、121號之異白胺酸、122號之甲硫胺酸、纈胺酸或蘇胺酸、127號之絲胺酸或丙胺酸、128號之絲胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸或麩胺酸、139號之丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、麩胺酸或精胺酸、144號之異白胺酸、146號之精胺酸或離胺酸、166號之甘胺酸或丙胺酸、170號之天冬胺酸、麩胺酸、離胺酸或精胺酸、171號之天冬醯胺酸、脯胺酸、天冬胺酸或甘胺酸、173號之異白胺酸或白胺酸、175號之甘胺酸、天冬醯胺酸、脯胺酸或丙胺酸、176號之精胺酸、離胺酸、組胺酸或麩醯胺酸、183號之甘胺酸、丙胺酸或精胺酸、184號之半胱胺酸或異白胺酸、191號之酪胺酸、白胺酸或離胺酸、193號之丙胺酸、206號之精胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸或絲胺酸、207號之甘胺酸、離胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或脯胺酸、208號之天冬胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、絲胺酸或離胺酸、231號之麩胺酸、233號之精胺酸、235號之離胺酸、天冬醯胺酸或白胺酸、238號之麩胺酸或異白胺酸、243號之蘇胺酸、異白胺酸或纈胺酸、244號之酪胺酸、丙胺酸或麩胺酸、249號之甘胺酸、256號之天冬胺酸、258號之天冬醯胺酸或天冬胺酸、278號之異白胺酸、白胺酸或苯基丙胺酸、300號之離胺酸或天冬醯胺酸、307號之蘇胺酸、精胺酸、丙胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸、336號之白胺酸、纈胺酸、半胱胺酸或酪胺酸、340號之甘胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸或精胺酸、358號之精胺酸或白胺酸、375號之丙胺酸或天冬胺酸、379號之天冬胺酸、離胺酸、麩胺酸或丙胺酸、385號之色胺酸、丙胺酸、精胺酸或纈胺酸。
MtkA(圖3)，可列舉：16號之苯基丙胺酸、19號之離胺酸、精胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸、20號之異白胺酸或組胺酸、30號之精胺酸或天冬胺酸、46號之麩醯胺酸、蘇胺酸或絲胺酸、47號之 丙胺酸、絲胺酸、離胺酸或精胺酸、49號之白胺酸或脯胺酸、51號之甲硫胺酸、精胺酸或白胺酸、67號之天冬胺酸或麩胺酸、68號之丙胺酸或纈胺酸、71號之纈胺酸或異白胺酸、74號之脯胺酸、90號之異白胺酸、93號之半胱胺酸、丙胺酸或異白胺酸、94號之纈胺酸、119號之天冬胺酸、丙胺酸或絲胺酸、121號之甲硫胺酸、絲胺酸或半胱胺酸、124號之異白胺酸、蘇胺酸或白胺酸、137號之丙胺酸或半胱胺酸、151號之精胺酸、纈胺酸或天冬醯胺酸、155號之纈胺酸、171號之丙胺酸、精胺酸或離胺酸、193號之離胺酸、精胺酸或纈胺酸、195號之甲硫胺酸、纈胺酸或異白胺酸、197號之麩胺酸、麩醯胺酸、精胺酸或離胺酸、223號之丙胺酸或甘胺酸、224號之白胺酸或精胺酸、226號之丙胺酸、230號之甲硫胺酸、259號之苯基丙胺酸、丙胺酸或麩胺酸、267號之纈胺酸或甲硫胺酸、271號之麩胺酸或離胺酸、273號之丙胺酸、半胱胺酸或白胺酸、280號之蘇胺酸或天冬醯胺酸、282號之絲胺酸或丙胺酸、294號之丙胺酸、離胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸或麩胺酸、295號之甲硫胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、白胺酸或組胺酸。
具有1個以上的該等胺基酸序列的蘋果酸硫激酶，從酵素活性之觀點為更理想。
第二群組，係Rhizobium sp、Hyphomicrobiummethylovorum、Hyphomicrobium denitrificans、Nitrosomonas europaea、Methylococcus capsulatus及gammaproteobacteria全部特徵的共通序列，圖2及圖3以「+」的記號表示。特徵的共通序列的位置，係依Hyphomicrobium methylovorum的胺基酸的序列號記載。
可列舉：MtkB(圖2)之43號之纈胺酸、120號之異白胺酸、143號之異白胺酸、192號之丙胺酸、230號之麩胺酸、232號之精胺酸、248號之甘胺酸及255號之天冬胺酸。
MtkA(圖3)，可列舉16號之苯基丙胺酸、74號之脯胺酸、90號之異白胺酸、94號之纈胺酸、155號之纈胺酸、226號之丙胺酸 及230號之甲硫胺酸。
該等特徵的共通序列、及全體保守的共通序列以外的無相同性之部分，也可有變異。具有該等胺基酸序列之蘋果酸硫激酶，從酵素活性之觀點更為理想。
第三群組，係Rhizobium sp、Hyphomicrobium methylovorum、Hyphomicrobium denitrificans及Nitrosomonas europaea的特徵的共通序列，圖2及圖3以「#」的記號表示。特徵的共通序列的位置係依Hyphomicrobium methylovorum的胺基酸的序列號記載。
可列舉：MtkB(圖2)之29號之麩胺酸、34號之精胺酸、68號之異白胺酸、83號之組胺酸、91號之白胺酸、95號之白胺酸、103號之異白胺酸、111號之苯基丙胺酸、141號之天冬胺酸、182號之甘胺酸、183號之半胱胺酸、252號之纈胺酸、299號之離胺酸、345號之纈胺酸、354號之麩胺酸、357號之精胺酸及374號之丙胺酸。
MtkA(圖3)，可列舉：20號之異白胺酸、68號之丙胺酸、93號之半胱胺酸、121號之甲硫胺酸、123號之白胺酸、137號之丙胺酸、224號之白胺酸、236號之丙胺酸、237號之酪胺酸、238號之異白胺酸、261號之麩胺酸、267號之纈胺酸、270號之白胺酸、271號之離胺酸、275號之纈胺酸、277號之異白胺酸、280號之蘇胺酸及282號之絲胺酸。
該等特徵的共通序列、及全體保守的共通序列以外的無相同性之部分，也可有變異。具有該等胺基酸序列之蘋果酸硫激酶，從酵素活性之觀點更為理想。
第四群組，係Methylococcus capsulatus及gammaproteobacteria特徵的共通序列，圖2及圖3以「＊」的記號表示。特徵的共通序列的位置，係依Methylococcus capsulatus的胺基酸的序列號記載。
可列舉：MtkB(圖2)之2號之天冬醯胺酸、15號之酪胺酸、18號之脯胺酸、26號之酪胺酸、28號之天冬胺酸、34號之纈胺酸、36號之麩胺酸、38號之異白胺酸、53號之甘胺酸、60號之纈胺酸、63號之丙胺酸、65號之絲胺酸、67號之麩胺酸、74號之天冬胺酸、76號之甲硫胺酸、114號之異白胺酸、119號之麩醯胺酸、122號之蘇胺酸、128號之麩胺酸、132號之麩胺酸、136號之纈胺酸、143號之離胺酸、145號之纈胺酸、147號之麩胺酸、153號之異白胺酸、160號之半胱胺酸、162號之離胺酸、163號之纈胺酸、166號之丙胺酸、167號之異白胺酸、173號之白胺酸、174號之甲硫胺酸、176號之麩醯胺酸、179號之精胺酸、180號之白胺酸、181號之甲硫胺酸、184號之異白胺酸、194號之白胺酸、195號之麩醯胺酸、203號之異白胺酸、204號之纈胺酸、205號之甘胺酸、211號之白胺酸、218號之苯基丙胺酸、219號之天冬醯胺酸、237號之白胺酸、239號之麩胺酸、240號之麩胺酸、245號之纈胺酸、246號之麩胺酸、249號之甘胺酸、253號之天冬醯胺酸、256號之丙胺酸、277號之丙胺酸、281號之組胺酸、298號之麩胺酸、299號之離胺酸、302號之天冬醯胺酸、304號之半胱胺酸、306號之異白胺酸、330號之異白胺酸、334號之白胺酸、336號之麩醯胺酸、340號之絲胺酸、341號之白胺酸、370號之苯基丙胺酸、375號之天冬醯胺酸、377號之天冬胺酸、378號之天冬胺酸、381號之丙胺酸及386號之異白胺酸。
MtkA(圖3)，可列舉：4號之苯基丙胺酸、5號之纈胺酸、6號之天冬醯胺酸、8號之組胺酸、9號之絲胺酸、11號之纈胺酸、12號之異白胺酸、20號之組胺酸、28號之丙胺酸、30號之精胺酸、33號之蘇胺酸、56號之白胺酸、60號之天冬胺酸、72號之天冬胺酸、73號之纈胺酸、91號之異白胺酸、96號之精胺酸、97號之纈胺酸、102號之丙胺酸、107號之纈胺酸、111號之異白胺酸、114號之麩醯胺酸、117號之精胺酸、119號之甘胺酸、121號之天冬胺酸、129號之蘇胺酸、130號之脯胺酸、134號之蘇胺酸、137號之麩胺酸、138號之半胱胺酸、139號之離胺酸、140 號之纈胺酸、163號之天冬醯胺酸、168號之麩胺酸、175號之白胺酸、191號之蘇胺酸、192號之天冬胺酸、194號之纈胺酸、195號之蘇胺酸、196號之纈胺酸、199號之丙胺酸、210號之纈胺酸、221號之纈胺酸、222號之丙胺酸、224號之丙胺酸、225號之精胺酸、227號之丙胺酸、260號之麩胺酸、263號之蘇胺酸、266號之丙胺酸、268號之甲硫胺酸、269號之天冬胺酸、270號之丙胺酸、272號之麩胺酸、274號之白胺酸、277號之酪胺酸、280號之精胺酸、281號之天冬醯胺酸、283號之丙胺酸、285號之異白胺酸、290號之白胺酸、291號之精胺酸、292號之丙胺酸、295號之麩胺酸。
該等特徵的共通序列、及全體保守的共通序列以外的無相同性之部分，也可有變異。
具有該等胺基酸序列之蘋果酸硫激酶，從酵素活性之觀點最為理想。
前述蘋果酸硫激酶之基因(mtk)，可利用從上述各來源生物獲得之具有編碼為蘋果酸硫激酶的基因的鹼基序列的DNA或依據其公知之鹼基序列合成的合成DNA序列。
理想者，例如具有Methylobacterium extorquens等甲基桿菌屬來源(序列號67及68)、Hyphomicrobium methylovorum、Hyphomicrobium denitrificans等生絲微菌屬來源、Rhizobium sp NGR234等根瘤菌屬來源、Granulibacter bethesdensis等Granulibacter屬來源、Nitrosomonas europaea等亞硝化單胞菌屬來源、Methylococcus capsulatus等甲基球菌屬來源、gammaproteobacteria界來源之基因之鹼基序列的DNA。
從乙醯輔酶A之生產效率之觀點，較佳為例如具有生絲微菌屬來源(序列號61及62、序列號86及87)、根瘤菌屬來源(例如：序列號63)、Granulibacter屬來源(序列號81及82)、亞硝化單胞菌屬來源(序列號91及92)、甲基球菌屬來源(序列號96及97)、gammaproteobacteria界來源之基因之鹼基序列(序列號102及 103)之DNA。
尤佳為生絲微菌屬來源基因之鹼基序列(序列號61及62、序列號86及87)、及密碼子(codon)經過最適化的根瘤菌屬來源之基因之鹼基序列(例如：序列號63)、亞硝化單胞菌屬來源之基因之鹼基序列(序列號91及92)、甲基球菌屬來源之基因之鹼基序列(序列號96及97)、gammaproteobacteria界來源之基因之鹼基序列(序列號102及103)。
前述蘋果醯輔酶A裂解酶，係依國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號4.1.3.24，從蘋果醯輔酶A生成乙醛酸與乙醯輔酶A的酵素。例如：Methylobacterium extorquens等甲基桿菌屬來源、Hyphomicrobium methylovorum、Hyphomicrobium denitrificans等生絲微菌屬來源、Chloroflexus aurantiacus等綠曲撓菌屬來源、Nitrosomonas europaea等亞硝化單胞菌屬來源、Methylococcus capsulatus等甲基球菌屬來源者。
從乙醯輔酶A之生產效率之觀點，尤佳為例如甲基桿菌屬來源的胺基酸序列(序列號69)生絲微菌屬來源的胺基酸序列(序列號72及109)、亞硝化單胞菌屬來源的胺基酸序列(序列號112)、甲基球菌屬來源的胺基酸序列(序列號115)。
蘋果醯輔酶A裂解酶之比活性，例如有於Methylobacterium extorquens製成精製酵素為28.1U/mg的報告(Biochem.J.139,399-405,(1974))。
前述蘋果醯輔酶A裂解酶之基因(mcl)，可利用從上述各來源生物獲得之具有編碼為蘋果醯輔酶A裂解酶之基因之鹼基序列的DNA或依其公知之鹼基序列合成的合成DNA序列。
理想者例如具有Methylobacterium extorquens等甲基桿菌屬來源、Hyphomicrobium methylovorum、Hyphomicrobium denitrificans等生絲微菌屬來源、Chloroflexus aurantiacus 等綠曲撓菌來源之基因之鹼基序列之DNA。從乙醯輔酶A之生產效率之觀點，尤佳為具有甲基桿菌屬來源之基因、及生絲微菌屬來源之基因之鹼基序列之DNA。
尤佳之甲基桿菌屬來源之基因之鹼基序列之一例，可列舉：Methylobacterium extorquens來源基因之鹼基序列(序列號66)、生絲微菌屬來源之基因之鹼基序列之一例，可列舉：Hyphomicrobium methylovorum來源基因之鹼基序列(序列號60)、Hyphomicrobium denitrificans來源基因之鹼基序列(序列號85)、亞硝化單胞菌屬來源之基因之鹼基序列之一例可列舉：Nitrosomonas europaea來源基因之鹼基序列(序列號90)、甲基球菌屬來源之基因之鹼基序列之一例可列舉：Methylococcus capsulatus來源基因之鹼基序列(序列號95)。
前述乙醯輔酶A羧化酶，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號6.4.1.2，將乙醯輔酶A與CO2變換為丙二醯基輔酶A之酵素的總稱。
前述丙二酸半醛去氫酶，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號1.2.1.18，將丙二醯基輔酶A變換為丙二酸半醛之酵素的總稱。
前述丙二醯基輔酶A還原酶，係指將丙二醯基輔酶A變換為丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素的總稱。
前述巴豆醯輔酶A羧基酶-還原酶，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號1.3.1.85，將巴豆醯輔酶A變換為乙基丙二醯基輔酶A之酵素的總稱。
前述甲基巴豆醯輔酶A羧化酶，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號6.4.1.4，將巴豆醯輔酶A變換為戊烯二醯基輔酶A之酵素的總稱。
前述丙酮酸合酶，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號1.2.7.1，將乙醯輔酶A變換為丙酮酸之酵素的總稱。
前述生產乙醯輔酶A之微生物，宜更將選自於由乳酸去氫酶、蘋果酸合酶、及富馬酸水合酶構成之群組中之至少1種酵素之活性失活或減活較佳。藉此，能以更良好的效率生產乙醯輔酶A。
能成為活性之失活或減活之對象的乳酸去氫酶、蘋果酸合酶、及富馬酸水合酶的各酵素當中，蘋果酸合酶係將乙醯輔酶A與乙醛酸變換為蘋果酸之反應，為蘋果酸硫激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶所為之反應之逆反應，因為乙醯輔酶A與乙醛酸回到蘋果酸之反應受阻止或減低，與乙醯輔酶A之產率提高有關，故為較佳。
又，能成為活性之失活或減活之對象的乳酸去氫酶、蘋果酸合酶、及富馬酸水合酶的各酵素當中，使富馬酸水合酶失活時，從乙醯輔酶A之生產效率之觀點為較佳。藉此，可以防止蘋果酸變換為富馬酸等其他物質的量減少，能提高乙醯輔酶A之產率。
前述乳酸去氫酶(ldhA)，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號1.1.1.28，將丙酮酸變換為乳酸、或將乳酸變換為丙酮酸的酵素的總稱。
前述異檸檬酸裂解酶(aceA)，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號4.1.3.1,將異檸檬酸變換為琥珀酸與乙醛酸之酵素的總稱。
前述蘋果酸合酶(aceB及glcB)，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號2.3.3.9，將乙醯輔酶A與乙醛酸變換為蘋果酸與輔酶A之酵素的總稱。蘋果酸合酶，視微生物之不同，有時在基因體中會有多個同分異構物(isomer)。由於許多的大腸桿菌保有aceB及glcB 2種名稱之基因，所以本 申請案將兩者都記載。又，Pantoea ananatis及Corynebacterium glutamicum，存在1種相當於aceB或glcB的基因，所以本申請案為了求簡潔，統一記載為aceB。
前述富馬酸水合酶(fum)，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號4.2.1.2，將蘋果酸變換為富馬酸之酵素的總稱。富馬酸水合酶，取決於微生物，有時在基因體中會有多個同分異構物。例如大腸桿菌保有fumA、fumB、fumC之三種富馬酸水合酶。Pantoea ananatis保有fumA、fumC。Corynebacterium glutamicum保有fumC。
前述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號4.1.1.31，將磷酸烯醇丙酮酸與二氧化碳變換為草醯乙酸與磷酸之酵素的總稱。例如：Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌、Hyphomicrobium methylovorum(Hyphomicrobium methylovorum)等生絲微菌屬細菌、Starkeya novella(Starkeya novella)等Starkeya屬細菌、Rhodopseudomonas sp.(Rhodopseudomonas sp.)等紅假單胞菌(Rhodopseudomonas)屬細菌、Streptomyces coelicolor(Streptomyces coelicolor)等鏈絲菌(Streptomyces)屬細菌來源者。
前述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之基因(ppc)，可使用從上述各來源生物獲得之具有編碼為磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者，例如具有Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌、Hyphomicrobium methylovorum(Hyphomicrobium methylovorum)等生絲微菌屬細菌、Starkeya novella(Starkeya novella)等 Starkeya屬細菌、Rhodopseudomonas sp.(Rhodopseudomonas sp.)等紅假單胞菌屬細菌、Streptomyces coelicolor(Streptomyces coelicolor)等鏈絲菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
前述磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號4.1.1.32、酵素號4.1.1.38、酵素號4.1.1.49，將磷酸烯醇丙酮酸與二氧化碳變換為草醯乙酸之酵素的總稱。此時，酵素號4.1.1.32係執行將GDP變換為GTP之反應、酵素號4.1.1.38執行將磷酸變換為焦磷酸之反應、酵素號4.1.1.49執行將ADP變換為ATP之反應。例如：Actinobacillus succinogenes(Actinobacillus succinogenes)等放線菌(Actinobacillus)屬細菌、Mycobacterium smegmatis(Mycobacterium smegmatis)等分支桿菌(Mycobacterium)屬細菌、Trypanosoma brucei(Trypanosoma brucei)等錐體蟲(Trypanosoma)屬細菌來源者。
前述磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶之基因(pck)，可利用從上述各來源生物獲得之具有編碼為磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者可列舉Actinobacillus succinogenes(Actinobacillus succinogenes)等、放線菌屬、Mycobacterium smegmatis(Mycobacterium smegmatis)等分支桿菌屬細菌、Trypanosoma brucei(Trypanosoma brucei)等錐體蟲屬細菌來源者。
前述丙酮酸羧化酶，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號6.4.1.1，將丙酮酸與二氧化碳變換為草醯乙酸之酵素的總稱。反應時，消耗ATP，生成ADP與磷酸。例如：Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、Mycobacterium smegmatis(Mycobacterium smegmatis)等分支桿菌屬細菌來源者。
前述丙酮酸羧化酶之基因(pyc)，可利用從上述各來源生物獲得之具有編碼為磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者例如具有Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、Mycobacterium smegmatis(Mycobacterium smegmatis)等分支桿菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
前述蘋果酸去氫酶，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號1.1.1.37，以NADH作為輔酶，從草醯乙酸生成蘋果酸之酵素的總稱。例如：Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌來源者。
前述蘋果酸去氫酶之基因(mdh)，可利用從上述各來源生物獲得之具有編碼為蘋果酸去氫酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者例如具有Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
前述乙醛酸醛連接酶，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號4.1.1.47，將2分子的乙醛酸變換為1分子的2-羥基-3-側氧基丙酸的酵素的總稱。反應時，伴隨1分子的二氧化碳之脫碳酸。例如：大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Rhodococcus jostii等紅球菌屬細菌來源者。
前述乙醛酸醛連接酶之基因(gcl)，可利用從上述各來源生物獲得之具有編碼為乙醛酸醛連接酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者例如具有Rhodococcus jostii等紅球菌(Rhodococcus)屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
前述2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶，係指依據國際生化學聯盟 (I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號1.1.1.60，以NADH作為輔酶，將2-羥基-3-側氧基丙酸變換為甘油酸之酵素的總稱。例如：大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌來源者。
前述2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶之基因(glxR)，可利用從上述各來源生物獲得之具有編碼為2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者例如具有大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
前述羥基丙酮酸異構酶，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號5.3.1.22，將2-羥基-3-側氧基丙酸異構化為羥基丙酮酸之酵素的總稱。例如：Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源者。
前述羥基丙酮酸異構酶之基因(hyi)，可利用從上述各來源生物獲得之具有編碼為羥基丙酮酸異構酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者例如具有Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
前述羥基丙酮酸還原酶，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號1.1.1.81，以NADH或NADPH當作輔酶，將羥基丙酮酸變換為甘油酸之酵素的總稱。例如：大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、及Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源者。
前述羥基丙酮酸還原酶之基因(ycdW)，可利用從上述各來源生物獲得之具有編碼為羥基丙酮酸還原酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者例如具有大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、及Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
前述甘油酸3-激酶，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號2.7.1.31，將甘油酸變換為3-磷酸甘油酸之酵素的總稱。消耗1分子的ATP，生成1分子的ADP及磷酸。例如：Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌來源者。
本發明中，甘油酸3-激酶之基因(glxK)，可利用從上述各來源生物獲得之具有編碼為甘油酸3-激酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者例如具有Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
前述甘油酸2-激酶，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號2.7.1.165，將甘油酸變換為2-磷酸甘油酸之酵素的總稱。消耗1分子的ATP，生成1分子的ADP與磷酸。例如：Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌來源者。
本發明中，甘油酸2-激酶之基因(garK)，可利用從上述各來源生物獲得之具有編碼為甘油酸2-激酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者例如具有Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
前述磷酸甘油酸變位酶，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號5.4.2.1，將3-磷酸甘油酸變換為2-磷酸甘油酸之酵素的總稱。例如：Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源者。
前述磷酸甘油酸變位酶之基因(gpm)，可利用從上述各來源生物獲得之具有編碼為磷酸甘油酸變位酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者例如具有Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
前述烯醇酶，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號4.2.1.11，將2-磷酸甘油酸變換為磷酸烯醇丙酮酸之酵素的總稱。例如：Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源者。
前述烯醇酶之基因(eno)，可利用從上述各來源生物獲得之具有編碼為烯醇酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者例如具有Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
前述丙酮酸激酶，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號2.7.1.40，從磷酸烯醇丙酮酸與ADP生成丙酮酸與ATP之酵素的總稱。例如：Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌來源、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源者。
前述丙酮酸激酶之基因(pyk)，可利用從上述各來源生物獲得之具有編碼為丙酮酸激酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者例如具有Corynebacterium glutamicum等棒桿菌屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Pantoea ananatis等泛菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
前述生產乙醯輔酶A之微生物，除了具有將乙醯輔酶A變換為有用的代謝產物的路徑以外，也可具有生產以乙醯輔酶A作為原料的其他代謝產物之路徑，或也可強化與該生產其他代謝產物之路徑相關酵素之活性。藉此，可以從碳源材料及二氧化碳生成來自於乙醯輔酶A之有用代謝產物，且同時可提高來自於乙醯輔酶A之代謝產物之生產性。
本發明可使用之微生物，只要是下列(a)、(b)、(c)、(d)及(e)中之任一者均不具有的微生物即可，不特別限制。
(a)具有從丙二醯基輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應之碳酸固定循環、(b)具有從乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應之碳酸固定循環、(c)具有從巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯基輔酶A或戊烯二醯基輔酶A之酵素反應之碳酸固定循環、(d)具有從CO2至甲酸之酵素反應之碳酸固定循環、(e)選自於由蘋果酸硫激酶與蘋果醯輔酶A裂解酶構成之群組中之至少1種。
例如：屬於腸內細菌科之微生物或屬於棒型細菌之微生物。具體而言，可列舉埃希氏菌屬細菌或泛菌屬細菌等屬於腸內細菌科之微生物、棒桿菌屬細菌或短桿菌(Brevibacterium)屬細菌等屬於棒型細菌之微生物、絲狀菌、放線菌等。
屬於腸內細菌科之微生物，可列舉：腸桿菌(Enterobacter)屬、歐文氏菌(Erwinia)屬、埃希氏菌屬、克雷伯氏菌(Klebsiella)屬、泛菌屬、普羅威登斯菌(Providencia)屬、沙門氏菌(Salmonella)屬、沙雷氏菌(Serratia)屬、志賀菌(Shigella)屬、摩根氏菌(Morganella)屬、Erwinia屬等之菌。其中，從有效地生產有用代謝產物之觀點，屬於埃希氏菌屬或泛菌屬之微生物為較佳。
棒桿菌屬細菌，例如Corynebacterium glutamicum等。
埃希氏菌屬細菌不特別限定，例如大腸桿菌。大腸桿菌具體而言，可列舉原型的野生株K12株來源的大腸桿菌W3110(ATCC 27325)、大腸桿菌MG1655(ATCC 47076)、原型的野生株B株來源的大腸桿菌B(ATCC 11303)等。
埃希氏菌屬細菌及泛菌屬細菌，均屬於腸內細菌科，親緣關係非常近(J.Gen.Appl.Microbiol.43(6)355-361(1997)、International Journal of Systematic Bacteriology，p1061-1067(1997))。
近年來，屬腸桿菌屬之菌，有時會再分類為Pantoea agglomerans(Pantoea agglomerans)或Pantoea dispersa(Pantoea dispersa)等(International Journal of Systematic Bacteriology,July 39(3)337-345(1989))。
又，屬於歐文氏菌屬之菌有時會再分類為Pantoea ananas(Pantoea ananas)、Pantoea stewartii(International Journal of Systematic Bacteriology,43(1),162-173(1993))。
腸桿菌屬細菌，例如Enterobacter agglomerans(Enterobacter agglomerans)、Enterobacter aerogenes(Enterobacter aerogenes)等。具體而言，可使用歐洲專利申請案公開952221號說明書例示之菌株。腸桿菌屬之代表株可列舉Enterobacter agglomeransATCC12287株。
泛菌屬細菌之代表菌株，可列舉Pantoea ananatis(Pantoea ananatis)、Pantoea stewartii(Pantoea stewartii)Pantoea agglomerans、Pantoea citrea(Pantoea citrea)。具體而言，可列舉下列之菌株。
‧Pantoea ananatisAJ13355株(FERM BP-6614)(歐洲專利申請案公開0952221號說明書)
.Pantoea ananatisAJ13356株(FERM BP-6615)(歐洲專利申請案公開0952221號說明書)
又，該等菌株在歐洲專利申請案公開0952221號說明書記載為Enterobacter agglomerans，但現在如上述利用16S rRNA之鹼基序列解析等，再分類為Pantoea ananatis。
本發明之棒型細菌，係指於Bergeys Manual of Determinative Bacteriology,8,599(1974)所定義之屬於棒桿菌(Corynebacterium)屬、短桿菌屬(Brevibacterium)、或微桿菌(Microbacterium)屬之微生物等。
又，可列舉至今為止係分類為短桿菌屬，但之後再分類為棒桿菌屬之微生物(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1991))、及屬於類緣菌短桿菌屬之微生物。以下列舉棒型細菌之例。
例如：Corynebacteriumacetoacidophilum、Corynebacterium acetoglutamicum、Corynebacterium alkanolyticum、Corynebacterium callunae、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium lilium、Corynebacterium melassecola、Corynebacterium thermoaminogenes、Corynebacterium herculis、Brevibacterium divaricatum、Brevibacterium flavum、Brevibacterium immariophilum、Brevibacterium lactofermentum、Brevibacterium roseum、Brevibacterium saccharolitycum、Brevibacterium thiogenitalis、Corynebacterium ammoniagenes、Brevibacterium album、Brevibacterium selinum、Microbacterium ammoniaphilum。
尤其，包含以下菌株。
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806、Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511、Corynebacterium callunae ATCC15991、Corynebacterium glutamicum ATCC13020、13032、13060、 Corynebacterium lilium ATCC15990、Corynebacterium melassecola ATCC17965、Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340(FERM BP-1539)、Corynebacterium herculis ATCC13868、Brevibacterium divaricatum ATCC14020、Brevibacterium flavum ATCC13826、ATCC14067、AJ12418(FERM BP-2205)、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium lactofermentum(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869、Brevibacterium roseum ATCC13825、Brevibacterium saccharolitycum ATCC14066、Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240、Brevibacterium ammoniagenes ATCC6871、ATCC6872、Brevibacterium album ATCC15111、Brevibacterium selinum ATCC15112及Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354。
微生物為埃希氏菌屬細菌之情形，對於埃希氏菌屬細菌賦予或強化硫解酶活性、輔酶A轉移酶活性及乙醯乙酸去羧酶活性而得之生產乙醯輔酶A之微生物，可列舉為本發明中之生產乙醯輔酶A之微生物之一理想態樣。
又，微生物為埃希氏菌屬細菌之情形，對於埃希氏菌屬細菌賦予或強化硫解酶活性、輔酶A轉移酶活性、乙醯乙酸去羧酶活性及異丙醇去氫酶活性而得之生產乙醯輔酶A之微生物，亦可列舉在本發明中之生產乙醯輔酶A之微生物之一理想態樣。
前述硫解酶，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號2.3.1.9，催化從乙醯輔酶A生成乙醯乙醯輔酶A之反應之酵素的總稱。
如此者例如：Clostridium acetobutylicum(Clostridium acetobutylicum)、Clostridium beijerinckii(Clostridium beijerinckii)等梭狀芽胞桿菌(Clostridium)屬細菌、大腸桿菌(Escherichia coli)等埃希氏菌屬細菌、Halobacterium種(Ha1obacterium sp.)細菌、Zoogloea ramigera(Zoogloea ramigera)等動膠菌(Zoogloea)屬細菌、Rhizobium種(Rhizobium sp.)細菌、Bradyrhizobium japonicum(Bradyrhizobium japonicum)等慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)屬細菌、Candida tropicalis(Candida tropicalis)等念珠菌(Candida)屬細菌、Caulobacter crescentus(Caulobacter crescentus)等莖菌(Caulobacter)屬細菌、Streptomyces collinus(Streptomyces collinus)等鏈絲菌屬細菌、Enterococcus faecalis(Enterococcus faecalis)等腸球菌(Enterococcus)屬細菌來源者。
作為前述硫解酶之基因，可利用從上述各來源生物獲得之具有編碼為硫解酶之基因之鹼基序列的DNA或基於其公知之鹼基序列而合成的合成DNA序列。理想者可列舉具有Clostridium acetobutylicum、Clostridium beijerinckii等梭狀芽胞桿菌屬屬細菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌、Halobacterium種之細菌、Zoogloea ramigera等Zoogloea屬細菌、Rhizobium種之細菌、Bradyrhizobium japonicum等慢生根瘤菌屬細菌、Candida tropicalis等念珠菌屬細菌、Caulobacter crescentus等莖菌屬細菌、Streptomyces collinus等鏈絲菌屬細菌、Enterococcus faecalis等腸球菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。更理想者可列舉梭狀芽胞桿菌屬屬細菌、及埃希氏菌屬細菌等原核生物來源者，尤佳為具有Clostridium acetobutylicum或大腸桿菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
前述乙醯乙酸去羧酶，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號4.1.1.4，催化從乙醯乙酸生成丙酮之反應之酵素的總稱。
如此者例如：Clostridium acetobutylicum(Clostridium acetobutylicum)、Clostridium beijerinckii(Clostridium beijerinckii)等梭狀芽胞桿菌屬屬細菌、Bacillus polymyxa (Bacillus polymyxa)等芽胞桿菌(Bacillus)屬細菌來源者。
作為前述乙醯乙酸去羧酶之基因，可利用從上述各來源生物獲得之具有編碼為乙醯乙酸去羧酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者可列舉梭狀芽胞桿菌屬屬細菌來源者、及芽孢桿菌屬細菌來源者，例如具有Clostridium acetobutylicum、Bacillus polymyxa來源之基因之鹼基序列之DNA。尤佳為具有Clostridium acetobutylicum來源之基因之鹼基序列之DNA。
作為前述乙醯乙酸去羧酶之基因，可利用從上述各來源生物獲得之具有編碼為乙醯乙酸去羧酶之基因之鹼基序列之DNA。理想者可列舉梭狀芽胞桿菌屬屬細菌來源者、及芽孢桿菌屬細菌來源者，例如具有Clostridium acetobutylicum、Bacillus polymyxa來源之基因之鹼基序列之DNA。尤佳為具有Clostridium acetobutylicum來源之基因之鹼基序列之DNA。
前述異丙醇去氫酶，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號1.1.1.80，催化從丙酮生成異丙醇之反應之酵素的總稱。
如此者例如：Clostridium beijerinckii(Clostridium beijerinckii)等梭狀芽胞桿菌屬屬細菌來源者。
作為前述異丙醇去氫酶之基因，可利用從上述各來源生物獲得之具有編碼為異丙醇去氫酶之基因之鹼基序列之DNA。理想者可列舉梭狀芽胞桿菌屬屬細菌者，例如具有Clostridium beijerinckii來源之基因之鹼基序列之DNA。
前述輔酶A轉移酶，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號2.8.3.8，催化從乙醯乙醯輔酶A生成乙 醯乙酸之反應之酵素的總稱。
如此者例如：Clostridium acetobutylicum(Clostridium acetobutylicum)、Clostridium beijerinckii(Clostridium beijerinckii)等梭狀芽胞桿菌屬屬細菌、Roseburia intestinalis(Roseburia intestinalis)等羅斯氏菌(Roseburia)屬細菌、Faecalibacterium prausnitzii(Faecalibacterium prausnitzii)等Faecalibacterium屬細菌、糞球菌(Coprococcus)屬細菌、Trypanosoma brucei(Trypanosoma brucei)等Trypanosoma、大腸桿菌(Escherichia coli：大腸桿菌)等埃希氏菌屬細菌來源者。
作為前述輔酶A轉移酶之基因，可利用從上述各來源生物獲得之具有編碼為輔酶A轉移酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者可列舉具有Clostridium acetobutylicum等梭狀芽胞桿菌屬屬細菌、Roseburia intestinalis等Roseburia屬細菌、Faecalibacterium prausnitzii等Faecalibacterium屬細菌、糞球菌屬細菌、Trypanosoma brucei等Trypanosoma、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。更理想者可列舉梭狀芽胞桿菌屬屬細菌及埃希氏菌屬細菌來源者，尤佳為具有Clostridium acetobutylicum及大腸桿菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
上述4種酵素各為選自於由梭狀芽胞桿菌屬屬細菌、芽孢桿菌屬細菌及埃希氏菌屬細菌構成之群組中之至少1種來源者，從酵素活性之觀點為較佳，其中乙醯乙酸去羧酶及異丙醇去氫酶為梭狀芽胞桿菌屬屬細菌來源，且輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性為埃希氏菌屬細菌來源之情形為更佳。
其中，上述4種酵素各為Clostridium acetobutylicum、Clostridium beijerinckii或大腸桿菌中之任一者來源時，從酵 素活性之觀點為較佳，乙醯乙酸去羧酶為Clostridium acetobutylicum來源的酵素且輔酶A轉移酶及硫解酶各為Clostridium acetobutylicum或大腸桿菌來源的酵素，且異丙醇去氫酶為Clostridium beijerinckii來源的酵素更佳，上述4種酵素從酵素活性之觀點，乙醯乙酸去羧酶活性為Clostridium acetobutylicum來源且前述異丙醇去氫酶活性為Clostridium beijerinckii來源且輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性為大腸桿菌來源尤佳。
大腸桿菌來源的輔酶A轉移酶基因(atoD及atoA)與硫解酶基因(atoB)，由於以atoD、atoA、atoB的順序在大腸桿菌基因體上形成操縱組(Journal of Baceteriology Vol.169 pp 42-52 Lauren Sallus Jenkins等人)，故可藉由改變atoD的啟動子而同時控制輔酶A轉移酶基因與硫解酶基因之表現。
由此，當輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性係由寄主大腸桿菌之基因體基因獲得者的情形，從獲得充分異丙醇生產能力的觀點，宜將擔任兩酵素基因之表現的啟動子取代為其他啟動子等以增強兩酵素基因之表現較佳。為了增強輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性之表現而使用的啟動子，可列舉前述大腸桿菌來源GAPDH啟動子等。
以乙醯輔酶A作為原料生產其他代謝產物之生產乙醯輔酶A之微生物，例如：以具有異丙醇生產系之大腸桿菌(以下稱為「生產異丙醇之大腸桿菌」)作為寄主，將上述各酵素活性予以賦予或強化，或失活或減活之微生物等。
前述生產異丙醇之大腸桿菌，只要是可將賦予異丙醇生產能力之各基因導入及變更的任一大腸桿菌均可。
更佳為預先賦予異丙醇生產能力的大腸桿菌，藉此能更以良 好效率生產異丙醇。
如此的生產異丙醇之大腸桿菌，例如國際公開第2009/008377號小冊記載之經賦予乙醯乙酸去羧酶活性、異丙醇去氫酶活性、輔酶A轉移酶活性、及硫解酶活性，能從植物來源原料生成異丙醇之異丙醇生成大腸桿菌等。此外，國際公開第2009/094485號小冊、國際公開第2009/094485號小冊、國際公開第2009/046929號小冊、國際公開第2009/046929號小冊記載之微生物也可列舉為生產異丙醇之大腸桿菌之例。
前述生產異丙醇之大腸桿菌，係指具備異丙醇生產路徑之大腸桿菌，且保有利用基因重組技術導入之異丙醇生產能力之大腸桿菌。如此的異丙醇生產系，只要是能使成為對象之大腸桿菌生產異丙醇者均可。
本發明之生產異丙醇之大腸桿菌，乙醯乙酸去羧酶活性、異丙醇去氫酶活性、輔酶A轉移酶活性及前述硫解酶活性之4種類之酵素活性宜從細胞外賦予較佳。
本發明中，具備異丙醇生產系之生產異丙醇之大腸桿菌之例，可列舉WO2009/008377號記載之pIPA/B株或pIaaa/B株。又，該大腸桿菌，包含在異丙醇之生產相關的酵素當中，輔酶A轉移酶活性與硫解酶活性之強化係藉由強化該大腸桿菌之基因體上之各基因之表現以進行且異丙醇去氫酶活性與乙醯乙酸去羧酶活性之強化係各基因之表現利用質體強化而得之株(本說明書中，有時稱為pIa/B：：atoDAB株)。
再者，本發明之生產異丙醇之大腸桿菌，可為轉錄抑制因子GntR之活性失活，且具備異丙醇生產系、及伴隨該GntR之活性之失活之異丙醇生產能力之維持或強化酵素活性形態之輔助酵素群的生產異丙醇之大腸桿菌。藉此，能更高地生產異丙醇。
本發明中，「輔助酵素群」係指影響如此的異丙醇生產能力的1或2種以上之酵素。又，輔助酵素群的各酵素活性，經失活、活化或強化，本發明中，「輔助酵素群之酵素活性形態」，係指僅由GntR之活性失活而獲得之提高之異丙醇生產量，能夠維持或增加之各酵素之酵素活性形態，包括1或2種以上之酵素之組合。
輔助酵素群之酵素活性形態，較佳為以下之形態：(1)葡萄糖-6-磷酸異構酶(Pgi)活性、葡萄糖-6-磷酸-1-去氫酶(Zwf)活性及磷酸葡萄糖酸(gluconic acid)去氫酶(Gnd)活性之野生型之維持、(2)葡萄糖-6-磷酸異構酶(Pgi)活性之失活、與葡萄糖-6-磷酸-1-去氫酶(Zwf)活性之強化、(3)葡萄糖-6-磷酸異構酶(Pgi)活性之失活、與葡萄糖-6-磷酸-1-去氫酶(Zwf)活性之強化、與磷酸葡萄糖酸(gluconic acid)去氫酶(Gnd)活性之失活。
其中上述(3)之輔助酵素群之酵素活性形態，從異丙醇生產能力之觀點為較佳。
又，前述輔助酵素群及其酵素活性形態，不限於該等，包括GntR之活性之失活，只要是生產異丙醇之大腸桿菌中之異丙醇生產量能增加之輔助酵素群及其酵素活性形態均包含在本發明。又，輔助酵素群不一定要由多數酵素構成，也可由1種酵素構成。
前述GntR，係指Entner-Doudoroff路徑之葡萄糖酸(gluconic acid)代謝相關的控制操縱組為負之轉錄因子。係指抑制負責葡萄糖酸(gluconic acid)之攝入及代謝之二個基因群(GntI與GntII)之作用的GntR轉錄抑制因子的總稱。
前述葡萄糖-6-磷酸異構酶(Pgi)，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號5.3.1.9，催化從D-葡萄糖-6-磷酸生成D-果糖-6-磷酸之反應之酵素的總稱。
前述葡萄糖-6-磷酸-1-去氫酶(Zwf)，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號1.1.1.49，催化從D-葡萄糖-6-磷酸生成D-葡糖酸-1,5-內酯-6-磷酸之反應之酵素的總稱。
如此者例如：Deinococcus radiophilus(Deinococcus radiophilus)等異常球菌(Deinococcus)屬菌、Aspergillus niger(Aspergillus niger)、Aspergillus aculeatus(Aspergillus aculeatus)等麴菌屬菌、Acetobacter hansenii(Acetobacter hansenii)等醋酸菌屬菌、Thermotoga maritima(Thermotoga maritima)等熱袍菌屬菌、Cryptococcus neoformans(Cryptococcus neoformans)等隱球菌屬菌、Dictyostelium discoideum(Dictyostelium discoideum)等之網柄菌屬菌、Pseudomonas fluorescens(Pseudomonas fluorescens)、Pseudomonas aeruginosa(Pseudomonas aeruginosa等假單胞菌屬、Saccharomyces cereyisiae(Saccharomyces cerevisiae)等酵母菌屬、Bacillus megaterium(Bacillus megaterium)等芽孢桿菌屬菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌來源者。
作為前述葡萄糖-6-磷酸-1-去氫酶(Zwf)之基因，可利用從上述各來源生物獲得之具有編碼為硫解酶之基因之鹼基序列之DNA或依其公知之鹼基序列合成之合成DNA序列。理想者可列舉具有Deinococcus radiophilus(Deinococcus radiophilus)等異常球菌屬菌、Aspergillus niger(Aspergillus niger)、Aspergillus aculeatus(Aspergillus aculeatus)等麴菌屬菌、Acetobacter hansenii(Acetobacter hansenii)等醋酸菌屬菌、Thermotoga maritima(Thermotoga maritima)等熱袍菌屬菌、Cryptococcus neoformans(Cryptococcus neoformans)等隱球菌屬菌、Dictyostelium discoideum(Dictyostelium discoideum)等之網 柄菌屬菌、Pseudomonas fluorescens(Pseudomonas fluorescens)、Pseudomonas aeruginosa(Pseudomonas aeruginosa等假單胞菌屬、Saccharomyces cerevisiae(Saccharomyces cerevisiae)等酵母菌屬、Bacillus megaterium(Bacillus megaterium)等芽孢桿菌屬菌、大腸桿菌等埃希氏菌屬細菌來源之基因之鹼基序列之DNA。更理想者可列舉具有異常球菌屬菌、麴菌屬菌、醋酸菌屬菌、熱袍菌屬菌、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬菌、埃希氏菌屬細菌等原核生物來源者，尤佳為具有大腸桿菌來源之基因之鹼基序列之DNA。
前述磷酸葡萄糖酸(gluconic acid)去氫酶(Gnd)，係指依據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素號1.1.1.44，催化從6-磷酸-D-葡萄糖酸(gluconic acid)生成D-核酮糖-5-磷酸與CO2之反應之酵素之總稱。
本發明中，該等酵素之活性，可藉由將從細胞外導入細胞內或寄主細菌在基因體上保有之酵素基因之啟動子活性予以強化或取代為其他啟動子而使酵素基因強表現。
本發明中酵素之活性經強化之大腸桿菌，係指以某種方法使該酵素活性予以強化之大腸桿菌。該等大腸桿菌，可例如將編碼為該酵素及蛋白質之基因使用與前述同樣之基因重組技術從細胞外使用質體導入到細胞內、或將寄主大腸桿菌在基因體上保有之酵素基因之啟動子活性予以強化或取代為其他啟動子而使酵素基因強表現、或使用該等之組合等方法製作。
前述生產異丙醇之大腸桿菌可應用之基因之啟動子，只要可控制上述任一基因之表現者即可，可為持續在微生物內作用的強力啟動子且即使於葡萄糖存在下時表現仍不易受抑制之啟動子。具體而言，可列舉甘油醛3-磷酸去氫酶(以下有時稱為GAPDH)之 啟動子或絲胺酸羥基甲基轉移酶之啟動子。
前述生產異丙醇之大腸桿菌中，啟動子係指具有Sigma因子之RNA聚合酶所結合並且開始轉錄的部位。例如大腸桿菌來源的GAPDH啟動子，於GenBank存取編號X02662之鹼基序列資訊記載為鹼基編號397~440。
前述生產異丙醇之大腸桿菌中，乳酸去氫酶(LdhA)也可已破壞。藉此，即使在氧供給受限的培養條件下，乳酸之生產仍會受抑制，能以良好效率生產異丙醇。
氧供給受限之培養條件，於氣體僅使用空氣之情形’一般指0.02vvm~2.0vvm(vvm；通氣容量[mL]/液容量[mL]/小時[分])、轉速200~600rpm。
前述乳酸去氫酶(LdhA)，係指從丙酮酸與NADH生成D-乳酸與NAD之酵素。
又，前述生產乙醯輔酶A之微生物於生產丙酮之情形，可於異丙醇生產系之中僅具有硫解酶活性、輔酶A轉移酶活性及乙醯乙酸去羧酶活性。亦即，當使用前述生產乙醯輔酶A之微生物生產丙酮之情形，也可使用不具有異丙醇去氫酶活性者。
以乙醯輔酶A作為原料生產其他代謝產物之路徑之其他例，可列舉從乙醯輔酶A生產麩胺酸之路徑。例如理想例為：以具有以良好效率生產麩胺酸之路徑之微生物(以下有時稱為「生產麩胺酸之微生物」)作為寄主，將上述由乙醯輔酶A生產麩胺酸的路徑上的各酵素活性予以賦予或強化、或將妨礙由乙醯輔酶A生產麩胺酸的酵素活性予以失活或減活而得之微生物、具有生產前述其他代謝產物之路徑之微生物、或將產生該其他代謝產物之路徑相關之酵素活性予以強化而得之微生物。
生產麩胺酸之微生物，可列舉具有生產L-胺基酸之能力之既述之微生物。
生產麩胺酸之微生物之具體例，可列舉埃希氏菌屬細菌或泛菌屬細菌等腸內細菌科屬菌、Corynebacterium glutamicum等棒型細菌等，但本發明之微生物不限於該等例。
前述麩胺酸生產菌，只要是賦予麩胺酸生產能力之各基因可導入及變更的任一微生物均可。更佳為，能為預先賦予麩胺酸生產能力之泛菌屬細菌或棒型細菌，藉此能以更好效率生產麩胺酸。
對於微生物賦予麩胺酸生產能力之方法，包括例如：改變為使編碼為L-麩胺酸生合成相關之酵素之基因之表現增大及/或過度表現。L-麩胺酸生合成酵素，例如：麩胺酸去氫酶、麩醯胺酸合成酶、麩胺酸合酶、異檸檬酸去氫酶、烏頭酸(Aconitic acid)水合酶、檸檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸去氫酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、烯醇酶、磷酸甘油變位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸去氫酶、三碳糖磷酸異構酶、果糖-2-磷酸醛醇縮酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖磷酸異構酶等。該等酵素之中，檸檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、及麩胺酸去氫酶中之1種或多種之活性增大較佳，該等3種酵素活性全部增強更佳。
如此的麩胺酸生產菌，例如日本特開2005-278643號公報記載的麩胺酸生產菌等。
L-麩胺酸生產菌，可使用於酸性條件下培養時，具有在液體培養基中累積超過L-麩胺酸之飽和濃度之量之L-麩胺酸之能力(以下有時稱為於酸性條件下之L-麩胺酸累積能力)的微生物。例如：可依歐洲公開公報1078989號記載之方法，藉由於低pH環境下取得對於L-麩胺酸之耐性提高之菌株，而賦予累積超過飽和濃 度之量之L-麩胺酸之能力。
原本於酸性條件下具有L-麩胺酸累積能力之微生物，具體而言可列舉Pantoea ananatisAJ13356株(FERM BP-6615)及AJ13601株(FERM BP-7207)(以上參照歐洲專利申請案公開0952221號說明書)等。Pantoea ananatisAJ13356係於平成10年2月19日在通產省工業技術院生命工學工業技術研究所(現名稱為獨立行政法人 製品評價技術基盤機構 特許生物寄存中心(IPOD，NITE)、地址 郵遞區號305-8566茨城縣筑波市東1丁目1號地1中央第6)以寄存號FERM P-16645寄存，於平成11年1月11日依布達佩斯條約移送保管於國際寄存並賦予寄存號FERM BP-6615。又，同株在分離時鑑別為Enterobacter agglomerans(Enterobacter agglomerans)，以Enterobacter agglomeransAJ13355之名寄存，但近年由於16S rRNA之鹼基序列解析等，再分類為Pantoea ananatis(Pantoea ananatis)(參照後述實施例)。又，從後述AJ13355誘導出的菌株AJ13356、及AJ13601，也同樣作為Enterobacter agglomerans於前述寄存機關寄存，但本說明書記載為Pantoea ananatis。AJ13601係於1999年8月18日於經濟產業省工業技術院生命工學工業技術研究所(現名稱為獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許生物寄存中心(IPOD，NITE))以寄存號FERM P-17156寄存，於2000年7月6日基於布達佩斯條約移送保管於國際寄存，並賦予寄存號FERMBP-7207。
賦予或增強L-麩胺酸生產能力的其他方法，還可列舉：賦予對於有機酸類似物或呼吸抑制劑等之耐性之方法、或賦予對於細胞壁合成抑制劑之感受性之方法。例如可列舉：賦予單氟乙酸耐性之方法(日本特開昭50-113209號公報)、賦予腺嘌呤耐性或胸腺嘧啶耐性之方法(日本特開昭57-065198號公報)、弱化尿素酶之方法(日本特開昭52-038088號公報)、賦予丙二酸耐性之方法(日本特開昭52-038088號公報)、賦予對於苯并哌哢(benzopyrone) 或萘醌類之耐性之方法(日本特開昭56-1889號公報)、賦予HOQNO耐性之方法(日本特開昭56-140895號公報)、賦予α-酮丙二酸耐性之方法(日本特開昭57-2689號公報)、賦予胍(guanidine)耐性之方法(日本特開昭56-35981號公報)、賦予對於盤尼西林之感受性之方法(日本特開平4-88994號公報)等。
如此的耐性菌之具體例可列舉如下列之菌株。
‧Brevibacterium flavumAJ3949(FERMBP-2632；參照日本特開昭50-113209號公報)
‧Corynebacterium glutamicumAJ11628(FERM P-5736；參照日本特開昭57-065198號公報)
‧Brevibacterium flavumAJ11355(FERM P-5007；參照日本特開昭56-1889號公報)
‧Corynebacterium glutamicumAJ11368(FERM P-5020；參照日本特開昭56-1889號公報)
‧Brevibacterium flavumAJ11217(FERM P-4318；參照日本特開昭57-2689號公報)
‧Corynebacterium glutamicumAJ11218(FERM P-4319；參照日本特開昭57-2689號公報)
‧Brevibacterium flavumAJ11564(FERM P-5472；參照日本特開昭56-140895公報)
Brevibacterium flavumAJ11439(FERM P-5136；參照日本特開昭56-35981號公報)
‧Corynebacterium glutamicumH7684(FERM BP-3004；參照日本特開平04-88994號公報)
‧Brevibacterium lactofermentumAJ11426(FERM P-5123；參照日本特開平56-048890號公報)
‧Corynebacterium glutamicumAJ11440(FERM P-5137；參照日本特開平56-048890號公報)
‧Brevibacterium lactofermentumAJ11796(FERM P-6402； 參照日本特開平58-158192號公報)
具有L-麩醯胺酸生產能力之微生物之較佳例，為麩胺酸去氫酶活性經強化之菌、麩醯胺酸合成酶(glnA)活性經強化之菌、麩醯胺酸酶基因經破壞之菌(歐洲專利申請案公開1229121號、1424398號說明書)。麩醯胺酸合成酶之活性增強，也可藉由麩醯胺酸腺嘌呤基轉移酶(glnE)之破壞、PII控制蛋白質(glnB)之破壞達成。又，屬於埃希氏菌屬且麩醯胺酸合成酶之397位之酪胺酸殘基經取代為其他胺基酸殘基而得之具變異型麩醯胺酸合成酶之菌株亦為理想之L-麩醯胺酸生產菌之例(美國專利申請案公開第2003-0148474號說明書)。
賦予或增強L-麩醯胺酸生產能力之其他方法，可列舉賦予6-重氮-5-側氧基-正白胺酸耐性之方法(日本特開平3-232497號公報)、賦予嘌呤類似物耐性及甲硫胺酸亞碸耐性之方法(日本特開昭61-202694號公報)、賦予α-酮馬來酸耐性之方法(日本特開昭56-151495號公報)等。具有L-麩醯胺酸生產能力之棒型細菌之具體例，可列舉以下微生物。
‧Brevibacterium flavumAJ11573(FERM P-5492；日本特開昭56-161495號公報)
‧Brevibacterium flavumAJ11576(FERM BP-10381；日本特開昭56-161495號公報)
‧Brevibacterium flavum AJ12212(FERM P-8123；日本特開昭61-202694號公報)
生產脯胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、精胺酸、瓜胺酸、鳥胺酸、聚麩胺酸之微生物之較佳例，記載於日本特開2010-41920號公報。又，生產乙酸、(聚)3-羥基丁酸、伊康酸、檸檬酸、丁酸之微生物，記載於發酵手冊(共立出版)。
製造4-胺基丁酸之微生物，例如日本特開2011-167097號公報所記載，可列舉對於生產麩胺酸之微生物導入有麩胺酸脫碳酸酵素之微生物。
製造4-羥基丁酸之微生物，例如日本特開2009-171960號公報所記載，可列舉對於生產麩胺酸之微生物導入有麩胺酸脫碳酸酵素、胺基轉移酵素、醛脫氫酵素之微生物。
製造3-羥基異丁酸之微生物，可列舉導入有例如國際公開第2009/135074號小冊或國際公開第2008/145737號小冊記載之路徑之微生物。
製造2-羥基異丁酸之微生物，可列舉導入有例如國際公開第2009/135074號小冊或國際公開第2009/156214號小冊記載之路徑之微生物。
製造3-胺基異丁酸、甲基丙烯酸之微生物，可列舉導入有例如國際公開第2009/135074號小冊記載之路徑之微生物。
本發明中，微生物係藉由至少賦予蘋果酸硫激酶與蘋果醯輔酶A裂解酶兩者，而構建有前述圖1之乙醯輔酶A生產路徑的微生物。因此，生來具有蘋果酸硫激酶與蘋果醯輔酶A裂解酶之微生物，排除於本發明之生產乙醯輔酶A之微生物之外。
生來具有Mtk與mcl之微生物，例如：Methylobacterium extorquens此類的甲烷代謝菌。該等微生物，適於甲烷同化代謝菌之載體系、甲烷代謝菌之基因體基因之改變技術不發達，比起大腸桿菌或Corynebacterium等工業微生物，基因操作較困難。又，該等微生物常會有增殖緩慢的情形，不適於生產有用代謝產物。
本發明之乙醯輔酶A、丙酮、異丙醇或麩胺酸之生產方法，包括使用前述生產乙醯輔酶A之微生物從碳源材料生產目的生產物 乙醯輔酶A、丙酮、異丙醇或麩胺酸。亦即前述乙醯輔酶A生產方法，包括：使前述生產乙醯輔酶A之微生物與碳源材料接觸並培養(以下稱為培養步驟)，並回收由接觸獲得之目的生產物(乙醯輔酶A、丙酮、異丙醇或麩胺酸)之步驟(以下稱為回收步驟)。
依照前述乙醯輔酶A生產方法，由於係使前述生產乙醯輔酶A之微生物與碳源材料接觸而培養，前述生產乙醯輔酶A之微生物能邊同化代謝碳源材料並固定二氧化碳，邊以良好效率生產目的生產物。
前述碳源材料只要是微生物可代謝之含碳源之材料即可，不特別限制，宜為植物來源原料較佳。
前述植物來源原料，係指包括根、莖、幹、枝、葉、花、種子等器官、含此等器官之植物體、此等植物器官之分解產物，再者，植物體、植物器官、或由此等之分解產物獲得之碳源當中可利用於在微生物培養時作為碳源者，都包括在植物來源原料。
如此的植物來源原料所包含之碳源中，一般者可列舉澱粉、蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖等糖類、及含有多量此等成分之草木質分解產物、纖維素水解物等、及該等之組合，再者，植物油來源的甘油或脂肪酸在本發明中也可包括於碳源。
前述植物來源原料可列舉穀物等農作物、玉米、米、小麥、大豆、甘蔗、甜菜、棉花等、及該等之組合為理想，其原料之使用形態為未加工品、榨汁、粉碎物等，不特別限定。又，也可為僅為上述碳源之形態。
培養步驟中，生產乙醯輔酶A之微生物與植物來源原料之接觸，一般係以含有植物來源原料之培養基培養生產乙醯輔酶A之微生物而進行。
前述植物來源原料與生產乙醯輔酶A之微生物之接觸密度取 決於生產乙醯輔酶A之微生物之活性而異，一般可為：就培養基中之植物來源原料之濃度而言，設定為以葡萄糖換算時，起始糖濃度相對於混合物之全部質量為20質量%以下，從生產乙醯輔酶A之微生物之耐糖性之觀點，較佳為起始糖濃度設定為15質量%以下。其他各成分，只要是對於微生物之培養基通常添加之量添加即可，不特別限制。
又，培養基中之生產乙醯輔酶A之微生物之含量，取決於微生物之種類及活性而異，但一般可設定為於培養開始時投入之前培養之菌液(OD660nm=4~8)之量相對於培養液為0.1質量%至30質量%，從培養條件控制之觀點較佳為1質量%~10質量%。
生產乙醯輔酶A之微生物之培養使用之培養基，只要是含有碳源、氮源、無機離子、及微生物為了生產目的生產物所要求之無機微量元素、核酸、維生素類等之通常使用之培養基即可，不特別限制。
於前述培養步驟之培養條件無特別的限制，例如可於好氣條件下於pH4~9，較佳為pH6~8、溫度20℃~50℃，較佳為25℃~42℃之範圍內邊適當控制pH與溫度邊培養。
氣體於前述混合物中之通氣量，不特別限制，當氣體僅使用空氣之情形，一般為0.02vvm~2.0vvm(vvm；通氣容量[mL]/液容量[mL]/小時[分])、50~600rpm，從抑制對於大腸桿菌之物理性損害的觀點，以0.1vvm~2.0vvm進行較佳，更佳為0.1vvm~1.0vvm。
培養步驟可以從培養開始繼續進行到混合物中之碳源材料消耗為止，或生產乙醯輔酶A之微生物之活性消失為止。培養步驟之期間，取決於混合物中之生產乙醯輔酶A之微生物之數及活性及碳源材料之量而異，一般進行1小時以上，較佳為4小時以上 即可。另一方面，可藉由將碳源材料或生產乙醯輔酶A之微生物再投入，而無限制地連續培養期間，但是從處理效率之觀點，一般為5日以下，較佳為72小時以下。其他條件，可直接應用通常培養使用之條件。
將培養液中累積的目的生產物回收之方法，無特別的限制，例如可採用從培養液將菌體以離心分離等除去後，以因應目的生產物之種類之條件利用蒸餾或膜分離等通常之分離方法將目的生產物予以分離之方法。
又’本發明之乙醯輔酶A生產方法’也可在前述培養步驟之前包含用以使使用之生產乙醯輔酶A之微生物成為適當菌數或/及適度活性狀態之前培養步驟。前培養步驟，可因應生產乙醯輔酶A之微生物之種類之通常使用之培養條件進行培養。
前述丙酮生產方法使用之生產乙醯輔酶A之微生物，作為生產乙醯輔酶A之微生物之一理想態樣，具有前述硫解酶活性、輔酶A轉移酶活性及乙醯乙酸去羧酶活性之生產乙醯輔酶A之微生物從丙酮之生產效率之觀點為較佳。
前述異丙醇生產方法使用之生產乙醯輔酶A之微生物，作為生產乙醯輔酶A之微生物之一理想態樣，具有前述硫解酶活性、輔酶A轉移酶活性、乙醯乙酸去羧酶活性及異丙醇去氫酶活性之生產乙醯輔酶A之微生物從異丙醇之生產效率之觀點為較佳。
又，為前述異丙醇生產方法或丙酮生產方法之情形，較佳為包含以下步驟：邊對於含有前述生產乙醯輔酶A之微生物及碳源材料之混合物中供給氣體，邊培養該生產乙醯輔酶A之微生物之培養步驟；及將前述培養生成之異丙醇或丙酮從混合物分離並回收之目的生產物回收步驟。
依照該異丙醇生產方法或丙酮生產方法，係邊對於混合物供給氣體邊培養生產乙醯輔酶A之微生物(通氣培養)。利用該通氣培養，生產的異丙醇或丙酮會釋放到混合物中，並且從混合物蒸散，結果能輕易地將生成之異丙醇或丙酮從混合物分離。又，因為將生成之異丙醇或丙酮從混合物連續的分離，可抑制混合物中之異丙醇或丙酮之濃度上升。藉此，不需特別考慮前述生產乙醯輔酶A之微生物對於異丙醇或丙酮的耐性。
又，本方法中，混合物只要是以成為寄主之微生物之培養時一般使用之基本培養基作為主體即可。針對培養條件可直接應用前述事項。
前述目的生產物回收步驟中，係回收於培養步驟生成且從混合物分離的異丙醇或丙酮。該回收方法只要可從由通常培養獲得之混合物收集蒸散之氣體狀或飛沫狀之異丙醇或丙酮者即可。如此的方法，可列舉容納於一般使用之密閉容器等收集構件等，其中從能僅將異丙醇或丙酮以高純度回收之觀點，宜包括使用於捕捉異丙醇或丙酮之捕捉液與從混合物分離之異丙醇或丙酮接觸之步驟較佳。
本異丙醇生產方法或丙酮生產方法中，異丙醇或丙酮可以溶於捕捉液或混合物之態樣回收。如此的回收方法，可列舉例如國際公開2009/008377號小冊記載之方法等。回收的異丙醇或丙酮可使用HPLC等通常之檢測手段確認。回收的異丙醇視需要可進一步精製。如此的精製方法可列舉蒸餾等。
當回收的異丙醇或丙酮為水溶液之狀態，本異丙醇生產方法或丙酮生產方法，除了回收步驟以外也可更包含脫水步驟。異丙醇或丙酮之脫水，可依常法進行。
能以溶於捕捉液或混合物之態樣回收的異丙醇或丙酮之生產方法中可應用的裝置，例如：國際公開2009/008377號小冊之圖1 所示之生產裝置。
該生產裝置中，於容納含有使用之微生物及植物來源原料之培養基之培養槽，連結著用於從裝置外部注入氣體的注入管，可對於培養基通氣。
又，培養槽經由連結管連結於容納有做為捕捉液之捕集液的捕集槽。此時往捕集槽移動之氣體或液體與捕集液接觸而產生氣泡。
藉此，於培養槽由於通氣培養生成之異丙醇或丙酮由於通氣而蒸散，可輕易地從培養基分離，且同時在捕集槽捕捉捕集液。其結果能以更為精製的形態連續且簡便地生產異丙醇或丙酮。
本發明之麩胺酸生產方法，包含使用前述生產乙醯輔酶A之微生物從碳源材料生產目的生產物麩胺酸。亦即，前述麩胺酸生產方法包含以下步驟：使前述生產乙醯輔酶A之微生物與碳源材料接觸並培養(以下稱為培養步驟)，及將由於接觸獲得之目的生產物(麩胺酸)予以回收之步驟(以下稱為回收步驟)。
依前述麩胺酸生產方法，由於使前述生產乙醯輔酶A之微生物與碳源材料接觸並培養，前述生產乙醯輔酶A之微生物會同化代謝碳源材料，並邊固定二氧化碳邊以良好效率生產目的生產物。
培養使用之培養基，可使用含有碳源、氮源、無機鹽類、其他視需要之胺基酸、維生素等有機微量營養素之通常之培養基。合成培養基或天然培養基均可使用。培養基使用之碳源及氮源只要是培養的菌株可利用者各種種類均可使用。
碳源材料，可以使用葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、澱粉水解物、糖蜜等糖類，此外乙酸、檸檬酸等有機酸、乙醇等醇類也可單獨使用或與其他碳源併用。
氮源可使用氨、硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨、乙酸銨 等銨鹽或硝酸鹽等。
有機微量營養素，可使用胺基酸、維生素、脂肪酸、核酸、以及含有該等之蛋白腖、酪蛋白胺基酸(casamino acid)、酵母萃取物、黃豆蛋白分解物等，當使用對於生長要求有胺基酸等之營養要求性變異株時，宜補添要求之營養素較佳。
無機鹽類可使用磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽、錳鹽等。
培養較佳為控制發酵溫度20~45℃、pH控制為3~9，並進行通氣培養。又，pH調整可使用無機或有機之酸性或鹼性物質，再者可使用氨氣等。藉由在如此的條件下較佳為培養約10小時~120小時，於培養液中或菌體內會累積L-胺基酸。
又，目的之L-胺基酸為L-麩胺酸之情形，也可使用調整為L-麩胺酸析出之條件之液體培養基，邊於培養基中使L-麩胺酸析出邊進行培養使生成、累積。L-麩胺酸析出之條件，例如：pH5.0~4.0，較佳為pH4.5~4.0，更佳為pH4.3~4.0，尤佳為pH4.0。又，為了兼顧於酸性條件下之生長提高及有效率的析出L-麩胺酸，pH較佳為5.0~4.0，更佳為4.5~4.0，更佳為4.3~4.0。又，於上述pH之培養，可在培養的全部期間也可為一部分的期間。
培養結束後從培養液採取L-胺基酸之方法，利用公知回收方法實施即可。例如：從培養液去除菌體之後進行濃縮晶析之方法或利用離子交換層析等採取。當於使培養基中析出L-麩胺酸之條件下培養之情形，析出培養液中之L-麩胺酸可利用離心分離或過濾等採取。於此情形，也可使溶於培養基中之L-麩胺酸晶析後再一併單離。
生產脯胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、精胺酸、瓜胺酸、鳥胺酸、乙酸、(聚)3-羥基丁酸、伊康酸、檸檬酸、丁酸、聚麩胺酸之方法，可列舉例如發酵手冊(共立出版)記載之方法。
製造4-胺基丁酸之方法，例如如日本特開2011-167097所示，利用對於生產麩胺酸之微生物導入麩胺酸脫碳酸酵素而得之微生物之生產方法。
製造4-羥基丁酸之微生物，例如如日本特開2009-171960號公報，利用對於生產麩胺酸之微生物導入有麩胺酸脫碳酸酵素、胺基轉移酵素、醛脫氫酵素而得之微生物之生產方法。
製造3-羥基異丁酸之方法，可列舉例如導入有國際公開第2009/135074號小冊或國際公開第2008/145737號小冊記載之路徑之微生物。
製造2-羥基異丁酸之方法，可列舉導入有例如國際公開第2009/135074號小冊或國際公開第2009/156214號小冊記載之路徑之微生物。
製造3-胺基異丁酸、甲基丙烯酸之方法，可列舉導入有例如國際公開第2009/135074號小冊記載之路徑之微生物。
[實施例]
以下以實施例詳細說明本發明。但是本發明不限於該等實施例。
[實施例1]
<大腸桿菌B株atoD基因體強化株之製作>
大腸桿菌MG1655株之基因體DNA之全部鹼基序列為公知(GenBank存取編號U00096)、編碼為大腸桿菌MG1655株之輔酶A轉移酶α次單元之基因(以下有時簡稱為atoD)之鹼基序列也已有人報告。亦即atoD，記載於GenBank存取編號U00096記載之大腸桿菌MG1655株基因體序列之2321469~2322131。
就用以表現上述基因所必要之啟動子之鹼基序列而言，可使用GenBank存取編號X02662之鹼基序列資訊記載於397-440之大 腸桿菌來源的甘油醛3-磷酸去氫酶(以下有時稱為GAPDH)之啟動子序列。為了取得GAPDH啟動子，以大腸桿菌MG1655株之基因體DNA作為模板，並使用CGCTCAATTGCAATGATTGACACGATTCCG(序列號1)及ACAGAATTCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(序列號2)之引子，以PCR法放大，將獲得之DNA片段以限制酶MfeI及EcoRI消化，獲得約100bp之編碼為GAPDH啟動子之DNA片段。將獲得之DNA片段、與質體pUC19(GenBank存取編號X02514)以限制酶EcoRI消化再與經鹼性磷解酶處理者予以混合，使用接合酶結合之後，對於大腸桿菌DH5 α株勝任細胞(東洋紡(股)公司DNA-903)進行轉形，獲得於含安比西林50μg/mL之LB瓊脂板生長的轉形體。將獲得之菌落10個分別於含安比西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，回收質體，以限制酶EcoRI及KpnI消化時，挑選未切出GAPDH啟動子者，再者確認DNA序列，將已正確插入有GAPDH啟動子者作為pGAP。將獲得的pGAP以限制酶EcoRI及KpnI消化。
再者，為了取得atoD，以大腸桿菌MG1655株之基因體DNA作為模板，使用CGAATTCGCTGGTGGAACATATGAAAACAAAATTGATGACATT ACAAGAC(序列號3)、及GCGGTACCTTATTTGCTCTCCTGTGAAACG(序列號4)之引子以PCR法放大，將獲得之DNA片段以限制酶EcoRI及KpnI消化，獲得約690bp之atoD片段。將該DNA片段與先前已用限制酶EcoRI及KpnI消化過的pGAP混合，使用接合酶結合之後，對於大腸桿菌DH5 α株勝任細胞(東洋紡(股)公司DNA-903)進行轉形，獲得於含安比西林50μg/mL之LB瓊脂板生長的轉形體。從獲得之菌體將質體回收，確認已正確插入atoD，將該質體命名為pGAPatoD。
又，大腸桿菌MG1655株可從美國典型菌種保藏中心(ATCC)取得。
如上述，大腸桿菌MG1655株之基因體DNA中的atoD的鹼基序列也有人報告。使用依據大腸桿菌MG1655株之atoD之5’附近 區域之基因資訊製作的GCTCTAGATGCTGAAATCCACTAGTCTTGTC(序列號5)與TACTGCAGCGTTCCAGCACCTTATCAACC(序列號6)之引子，以大腸桿菌MG1655株之基因體DNA當作模板進行PCR，將約1.1kbp的DNA片段放大。
又，使用依據大腸桿菌MG1655株之GAPDH啟動子之序列資訊製作的GGTCTAGAGCAATGATTGACACGATTCCG(序列號7)及依據大腸桿菌MG1655株之atoD之序列資訊製作之序列號4之引子，以先前製作的表現載體pGAPatoD當作模板進行PCR，獲得由GAPDH啟動子與atoD構成的約790bp的DNA片段。
將上述獲得之片段分別以限制酶PstI與XbaI、XbaI與KpnI消化，將該片段與將溫度感受性質體pTH18cs1(GenBank存取編號AB019610)[Hashimoto-Gotoh,T.,Gene,241,185-191(2000)]以PstI及KpnI消化獲得之片段混合，使用接合酶結合之後，對DH5 α株轉形，獲得在含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板於30℃生長的轉形體。將獲得之菌落於含氯黴素10μg/ml之LB液體培養基於30℃培養一晚，從獲得之菌體將質體回收。將該質體對大腸桿菌B株(ATCC11303)轉形，於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板於30℃培養一晚，獲得轉形體。將獲得之轉形體接種於含氯黴素10μg/ml之LB液體培養基，於30℃培養一晚。將獲得之培養菌體塗佈在含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板，於42℃培養，獲得菌落。將獲得之菌落於不含抗生物質之LB液體培養基於30℃培養2小時，塗佈於不含抗生物質之LB瓊脂板，獲得於42℃生長之菌落。
從出現的菌落之中隨機挑取100個菌落，各使其於不含抗生物質之LB瓊脂板及含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板生長，選擇氯黴素感受性之選殖體。再從該等選殖體之染色體DNA，利用PCR使含GAPDH啟動子與atoD之約790bp的片段放大，挑選atoD啟動子區域取代成GAPDH啟動子的菌株，將滿足以上之選殖體取名 為大腸桿菌B株atoD基因體強化株(以下有時簡稱B：：atoDAB株)。
又，大腸桿菌B株(ATCC11303)，可從為細胞‧微生物‧基因庫之美國典型菌種保藏中心取得。
[實施例2]
<大腸桿菌B株atoD基因體強化、pgi基因缺失株之製作>
大腸桿菌MG1655之基因體DNA之全部鹼基序列為公知(GenBank存取編號U00096)、編碼為大腸桿菌之磷酸葡萄糖異構酶(以下有時也稱為pgi)之基因之鹼基序列也有人報告(GenBank存取編號X15196)。為了選殖編碼為pgi之基因(1,650bp)之鹼基序列附近區域，合成CAGGAATTCGCTATATCTGGCTCTGCACG(序列號8)、CAGTCTAGAGCAATACTCTTCTGATTTTGAG(序列號9)、CAGTCTAGATCA TCGTCGATATGTAGGCC(序列號10)及GACCTGCAGATCATCCGTCAGCTGTAC GC(序列號11)所示之4種寡核苷酸引子。序列號8之引子在5’末端側具有EcoRI認識部位，序列號9及10之引子在5’末端側具有XbaI認識部位，序列號11之引子在5’末端側具有PstI認識部位。
製備大腸桿菌MG1655株(ATCC700926)之基因體DNA，以獲得之基因體DNA作為模板，利用序列號8與序列號9之引子對進行PCR，將約1.0kb之DNA片段放大(以下有時稱為pgi-L片段)。又，利用序列號10與序列號11之引子對進行PCR，將約1.0kb之DNA片段予以放大(以下有時稱為pgi-R片段)。將該等DNA片段以瓊脂糖電泳分離、回收，將pgi-L片段各以EcoRI及XbaI消化、pgi-R片段各以XbaI及PstI消化。將2種該消化片段、與溫度感受性質體pTH18cs1(GenBank存取編號AB019610)之EcoRI及PstI消化物予以混合，以T4DNA接合酶反應後，對於大腸桿菌DH5 α勝任細胞(東洋紡公司製)進行轉形，獲得於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板於30℃生長之轉形體。從獲得之轉形體回收質體，確認編碼為pgi之基因之5’上游附近片段與3’下游附近片段的2個片 段已正確插入到pTH18cs1。將獲得之質體以XbaI消化後，利用T4DNA聚合酶實施平滑末端化處理。將該DNA片段、與將pUC4K質體(GenBank存取編號X06404)(Pharmacia)以EcoRI消化而得之卡那黴素耐性基因進一步以T4DNA聚合酶實施平滑末端化處理而得之DNA片段，使用T4DNA接合酶予以連結。之後對大腸桿菌DH5 α勝任細胞轉形，獲得於含氯黴素10μg/ml與卡那黴素50μg/ml之LB瓊脂板於30℃生長之轉形體。從獲得之轉形體回收質體，確認在編碼為pgi之基因之5’上游附近片段與3’下游附近片段之間已正確插入了卡那黴素耐性基因，命為pTH18cs1-pgi。
又，大腸桿菌MG1655株可從美國典型菌種保藏中心取得。
將製作之pTHl8cs1-pgi對於實施例1製作之B：：atoDAB轉形，於含氯黴素10μg/ml與卡那黴素50μg/ml之LB瓊脂板於30℃培養一晚，獲得轉形體。將獲得之轉形體接種於含卡那黴素50μg/ml之LB液體培養基，於30℃培養一晚。其次將該培養液的一部分塗佈於含卡那黴素50μg/ml之LB瓊脂板，獲得於42℃生長的菌落。將獲得之菌落於含卡那黴素50μg/ml之LB液體培養基於30℃培養24小時，再塗佈於含卡那黴素50μg/ml之LB瓊脂板，獲得於42℃生長的菌落。
從出現的菌落之中隨機挑取100個菌落，各使於含卡那黴素50μg/ml之LB瓊脂板、及含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板生長，選出僅於含卡那黴素之LB瓊脂板生長的氯黴素感受性之選殖體。再從該等目的選殖體之染色體DNA利用PCR篩選由於pgi基因取代為卡那黴素耐性基因而使約3.3kbp片段得以放大的菌株，將獲得之菌株取名為大腸桿菌B株atoD基因體強化、pgi基因缺失株(以下有時簡稱為B：：atoDAB△pgi株)。
又，大腸桿菌MG1655株及大腸桿菌B株可從美國典型菌種保 藏中心取得。
[實施例3]
<大腸桿菌B株atoD基因體強化、pgi基因缺失、gntR基因缺失株之製作>
大腸桿菌B株之基因體DNA之全部鹼基序列為公知(GenBank accession No.CP000819)，編碼為GntR之鹼基序列記載於GenBank accession No.CP000819記載之大腸桿菌B株基因體序列之3509184~3510179。為了選殖編碼為GntR之鹼基序列(gntR)之附近區域，合成GGAATTCGGGTCAATTTTCACCCTCTATC(序列號12)、GTGGG CCGTCCTGAAGGTACAAAAGAGATAGATTCTC(序列號13)、CTCTTTTGTACCT TCAGGACGGCCCACAAATTTGAAG(序列號14)、GGAATTCCCAGCCCCGCAAGG CCGATGGC(序列號15)所示之4種寡核苷酸引子。序列號12及13之引子，在5’末端側分別具有EcoRI認識部位。
製備大腸桿菌B株之基因體DNA(GenBank accession No.CP000819)，將獲得之基因體DNA作為模板，利用序列號12與序列號13之引子對實施PCR將約1.0kb之DNA片段予以放大(以下有時稱為gntR-L片段)。又，利用序列號14與序列號15之引子對實施PCR將約1.0kb之DNA片段予以放大(以下有時稱為gntR-R片段)。將該等DNA片段以瓊脂糖電泳分離、回收，以gntR-L與gntR-R片段作為模板，利用序列號12與序列號15之引子對實施PCR，將約2.0kb之DNA片段予以放大(以下有時稱為gntR-LR片段)。將該gntR-LR片段以瓊脂糖電泳分離、回收，以EcoRI消化，與溫度感受性質體pTH18cs1(GenBank存取編號AB019610)之EcoRI消化物予以混合，以T4DNA接合酶反應後，對於大腸桿菌DH5 α勝任細胞(東洋紡公司製)進行轉形，獲得於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板於30℃生長之轉形體。從獲得之轉形體回收質體，確認gntLR片段已正確插入於pTH18cs1，取名該質體為pTH18cs1-gntR。
將如此獲得之質體pTH18cs1-gntR對於實施例2製作的大腸桿菌即B：：atoDAB△pgi株轉形，於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板於30℃培養一晚，獲得轉形體。將獲得之轉形體接種於含氯黴素10μg/ml之LB液體培養基，於30℃培養一晚。其次將該培養液之一部分塗佈於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板，獲得於42℃生長的菌落。將獲得之菌落於LB液體培養基於30℃培養24小時，再塗佈於LB瓊脂板，獲得於42℃生長的菌落。
從出現的菌落之中隨機挑取100個菌落，分別使於LB瓊脂板、及含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板生長，選取氯黴素感受性之選殖體。再從該等目的選殖體之染色體DNA，利用PCR篩選由於gntR基因缺失而使約2.0kbp片段得以放大之株，將獲得之菌株取名為B株atoD基因體強化、pgi基因缺失、gntR基因缺失株(以下有時簡稱為B：：atoDAB△pgi△gntR株)。
[實施例4]
<大腸桿菌B株atoD基因體強化、pgi基因缺失、gntR基因缺失、gnd基因缺失株之製作>
為了選殖編碼為磷酸葡萄糖酸(gluconic acid)去氫酶之基因(gnd)之鹼基序列附近區域，合成CGCCATATGAATGGCGCGGCGGGGCCGG TGG(序列號16)、TGGAGCTCTGTTTACTCCTGTCAGGGGG(序列號17)、TGGAGCTCTCTGATTTAATCAACAATAAAATTG(序列號18)、CGGGATCCACCA CCATAACCAAACGACGG(序列號19)所示之4種寡核苷酸引子。序列號16之引子在5’末端側具有NdeI認識部位，序列號17及序列號18之引子在5’末端側具有SacI認識部位。又，序列號19之引子在5’末端側具有BamHI認識部位。
製備大腸桿菌B株之基因體DNA(GenBank accession No.CP000819)，並利用序列號16與序列號17之引子對實施PCR， 將約1.0kb之DNA片段予以放大(以下有時稱為gnd-L片段)。又，利用序列號18與序列號19之引子對實施PCR，將約1.0kb之DNA片段予以放大(以下有時稱為gnd-R片段)。將該等DNA片段以瓊脂糖電泳分離、回收，將gnd-L片段以NdeI及SacI消化、gnd-R片段以SacI及BamHI消化。將該2種消化片段、與溫度感受性質體pTH18cs1(GenBank存取編號AB019610)之NdeI及BamHI消化物予以混合，以T4DNA接合酶反應後，對於s勝任細胞(東洋紡公司製)轉形，獲得於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板於30℃生長的轉形體。從獲得之轉形體回收質體，確認編碼為gnd之基因之5’上游附近片段與3’下游附近片段的2個片段已正確地插入於pTH18cs1，取名為pTH18cs1-gnd。
將如此獲得之質體pTH18cs1-gnd對於實施例3製作之大腸桿菌B：：atoDAB△pgi△gntR株轉形，於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板於30℃培養一晚，獲得轉形體。將獲得之轉形體接種於含氯黴素10μg/ml之LB液體培養基，於30℃培養一晚。其次將該培養液之一部分塗佈於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板，獲得於42℃生長之菌落。將獲得之菌落於LB液體培養基於30℃培養24小時，再塗佈於LB瓊脂板，獲得於42℃生長之菌落。
從出現的菌落之中隨機挑取100個菌落，各使其於LB瓊脂板、及含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板生長，選取氯黴素感受性之選殖體。再從該等目的選殖體之染色體DNA，利用PCR篩選由於gnd基因缺失而使約2.0kbp片段得以放大之株，將獲得之菌株取名為大腸桿菌B株atoD基因體強化、pgi基因缺失、gntR基因缺失、gnd基因缺失株、B：：atoDAB△pgi△gntR△gnd株。
[實施例5]
<大腸桿菌B株atoD基因體強化、pgi基因缺失、gntR基因缺失、gnd基因缺失、ldhA基因缺失株之製作>
為了選殖編碼為D-乳酸去氫酶(以下有時簡稱為ldhA)之基因(990bp)之鹼基序列附近區域，合成GGAATTCGACCATCGCTTACGGTCAA TTG(序列號20)、GAGCGGCAAGAAAGACTTTCTCCAGTGATGTTG(序列號21)、GGAGAAAGTCTTTCTTGCCGCTCCCCTGCAAC(序列號22)、GGAATTCTT TAGCAAATGGCTTTCTTC(序列號23)所示之4種寡核苷酸引子。序列號20及23之引子在5’末端側分別具有EcoRI認識部位。
製備大腸桿菌B株之基因體DNA(accession No.CP000819)，以獲得的基因體DNA作為模板，利用序列號20與序列號21之引子對實施PCR，將約1.0kb之DNA片段予以放大(以下有時稱為ldhA-L片段)。又，利用序列號22與序列號23之引子對實施PCR將約1.0kb之DNA片段予以放大(以下有時稱為ldhA-R片段)。將該等DNA片段以瓊脂糖電泳分離、回收，以ldhA-L與ldhA-R片段作為模板，利用序列號20與序列號23之引子對實施PCR，將約2.0kb之DNA片段予以放大(以下有時稱為ldhA-LR片段)。將該ldhA-LR片段以瓊脂糖電泳分離、回收，以EcoRI消化，並與溫度感受性質體pTH18cs1(GenBank存取編號AB019610)之EcoRI消化物混合，以T4DNA接合酶反應後，對於大腸桿菌DH5 α勝任細胞(東洋紡公司製)進行轉形，獲得於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板於30℃生長之轉形體。從獲得之轉形體回收質體，確認ldhA-LR片段已正確插入於pTH18cs1，取名該質體為pTH18cs1-ldhA。
將如此獲得之質體pTH18cs1-ldhA對於實施例4製作之大腸桿菌B株即B：：atoDAB△pgi△gntR△gnd轉形，將含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板於30℃培養一晚，獲得轉形體。將獲得之轉形體接種於含氯黴素10μg/ml之LB液體培養基，於30℃培養一晚。其次將該培養液之一部分塗佈於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板，獲得於42℃生長之菌落。將獲得之菌落於LB液體培養基於30℃培養24小時，再塗佈於LB瓊脂板，獲得於42℃生長之菌 落。
從出現的菌落之中隨機挑取100個菌落，各使其於LB瓊脂板、與含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板生長，選取氯黴素感受性之選殖體。再從該等目的選殖體之染色體DNA，利用PCR篩選由於ldhA基因為缺失而使約2.0kbp片段得以放大之菌株，將獲得之菌株取名為atoD基因體強化、pgi基因缺失、gntR基因缺失、gnd基因缺失、ldhA基因缺失株(以下有時簡稱為B：：atoDAB△pgi△gntR△gnd△ldhA株)。
[實施例6]
<atoD基因體強化、pgi基因缺失、gntR基因缺失、gnd基因缺失、ldhA基因缺失、aceBA基因缺失株之製作>
為了選殖編碼為異檸檬酸裂解酶及蘋果酸合酶(以下有時簡稱aceBA)之基因(2936bp)之鹼基序列附近區域，合成GGAATTCATTCAGCTGTTGCGCATCGATTC(序列號24)、CGGTTGTTGTTGCCG TGCAGCTCCTCGTCATGGATC(序列號25)、GGAGCTGCACGGCAACAACAACCG TTGCTGACTG(序列號26)、GGAATTCCAGGCAGGTATCAATAAATAAC(序列號27)所示之4種寡核苷酸引子。序列號24及27之引子於5’末端側各具有EcoRI認識部位。
製備大腸桿菌B株之基因體DNA(accession No.CP000819)，並以獲得之基因體DNA作為模板，以序列號24與序列號25之引子對進行PCR，而將約1.0kb之DNA片段予以放大(以下有時稱為aceBA-L片段)。又，利用以序列號26與序列號27之引子對進行PCR，將約1.0kb之DNA片段予以放大(以下有時稱為aceBA-R片段)。將該等DNA片段以瓊脂糖電泳分離、回收，並以aceBA-L與aceBA-R片段作為模板，以序列號24與序列號27之引子對進行PCR，將約2.0kb之DNA片段予以放大(以下有時稱為aceBA-LR片段)。將該aceBA-LR片段以瓊脂糖電泳分離、回收，以EcoRI消 化，與溫度感受性質體pTH18cs1(GenBank存取編號AB019610)之EcoRI消化物予以混合，並以T4DNA接合酶反應之後，對於大腸桿菌DH5 α勝任細胞(東洋紡公司製)進行轉形，獲得於含有氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板於30℃生長之轉形體。從獲得之轉形體回收質體，確認aceBA-LR片段已正確地插入於pTH18cs1，將該質體命名為pTH18cs1-aceBA。
將如此獲得之質體pTH18cs1-aceBA對於實施例5製作之大腸桿菌B株、B：：atoDAB△pgi△gntR△gnd△ldhA轉形，於含有氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板於30℃培養一晚，獲得轉形體。將獲得之轉形體接種於含有氯黴素10μg/ml之LB液體培養基，於30℃培養一晚。其次將該培養液之一部分塗佈於含有氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板，獲得於42℃生長之菌落。以獲得之菌落作為LB液體培養基，於30℃培養24小時，再塗佈於LB瓊脂板，獲得於42℃生長之菌落。
從出現的菌落之中隨機挑取100個菌落，各使其於LB瓊脂板、及含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板生長，選取氯黴素感受性之選殖體。再從該等目的選殖體之染色體DNA利用PCR篩選由於aceBA基因缺失而使約2.0kbp片段得以放大的菌株，將獲得之菌株取名為B株atoD基因體強化、pgi基因缺失、gntR基因缺失、gnd基因缺失、ldhA基因缺失、aceBA基因缺失株(以下有時簡稱為B：：atoDAB△pgi△gntR△gnd△ldhA△aceBA株)。
[實施例7]
<atoD基因體強化、pgi基因缺失、gntR基因缺失、gnd基因缺失、ldhA基因缺失、aceBA基因缺失、glcB基因缺失株之製作>
為了選殖編碼為蘋果酸合酶G(以下有時簡稱為glcB)之基因(723bp)之鹼基序列附近區域，合成GGAATTCCAGGAGAAAGGGCTGGCAC GGG(序列號28)、CTTTTTTGACGCTATGTTTATCTCCTCGTTTTCGC(序列號 29)、GAGATAAACATAGCGTCAAAAAAGCCCCGGC(序列號30)、GGAATTCCGT CCATCATTGCTACCAGCC(序列號31)所示之4種寡核苷酸引子。序列號28及31之引子各在5’末端側具有EcoRI認識部位。
製備大腸桿菌B株之基因體DNA(accession No.CP000819)，以獲得之基因體DNA作為模板，以序列號28與序列號29之引子對進行PCR，將約1.0kb之DNA片段予以放大(以下有時稱為glcB-L片段)。又，以序列號30與序列號31之引子對進行PCR，藉此將約1.0kb之DNA片段予以放大(以下有時稱為glcB-R片段)。將該等DNA片段以瓊脂糖電泳分離、回收，將glcB-L與glcB-R片段作為模板，以序列號28與序列號31之引子對，進行PCR，藉此將約2.0kb之DNA片段予以放大(以下有時稱為glcB-LR片段)。將該glcB-LR片段以瓊脂糖電泳分離、回收，以EcoRI消化，與溫度感受性質體pTH18cs1(GenBank存取編號AB019610)之EcoRI消化物混合，以T4DNA接合酶反應後，對於大腸桿菌DH5 α勝任細胞(東洋紡公司製)進行轉形，獲得在含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板於30℃生長的轉形體。從獲得之轉形體回收質體，確認glcB-LR片段已正確插入於pTH18cs1，將該質體命名為pTH18cs1-glcB。
將以此方式獲得之質體pTH18cs1-gclB對於實施例6製作之大腸桿菌B株、B：：atoDAB△pgi△gntR△gnd△ldhA△aceBA株轉形，於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板於30℃培養一晚，獲得轉形體。將獲得之轉形體接種於含氯黴素10μg/ml之LB液體培養基，於30℃培養一晚。其次將該培養液之一部分塗佈於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板，獲得於42℃生長之菌落。將獲得之菌落以LB液體培養基於30℃培養24小時，再塗佈於LB瓊脂板，獲得於42℃生長之菌落。
從出現的菌落之中隨機挑取100個菌落，使其分別生長在LB 瓊脂板、及含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板，選取氯黴素感受性之選殖體。再從該等目的選殖體之染色體DNA利用PCR篩選由於glcB基因缺失而使約2.0kbp片段得以放大的菌株，將獲得之株命名為B株atoD基因體強化、pgi基因缺失、gntR基因缺失、gnd基因缺失、ldhA基因缺失、aceBA基因缺失、glcB基因缺失株(以下有時簡稱為B：：atoDAB△pgi△gntR△gnd△ldhA△aceBA△glcB株)。
[實施例8]
<atoD基因體強化、pgi基因缺失、gntR基因缺失、gnd基因缺失、ldhA基因缺失、aceBA基因缺失、glcB基因缺失、fumAC基因缺失株之製作>
為了選殖編碼為富馬酸水合酶A及富馬酸水合酶C(以下有時簡稱為fumAC)之基因(3193bp)之鹼基序列附近區域，合成CGCCATA TGATCGCCAGCGCGCGGGATTTTTC(序列號32)、CGAGCTCTGTTCTCTCACTT ACTGCCTGG(序列號33)、ATGAGCTCTCTGCAACATACAGGTGCAG(序列號34)、CGGGATCCACTACGCGCACGATGGTCAAG(序列號35)所示之4種寡核苷酸引子。序列號32之引子於5’末端側具有NdeI認識部位。序列號33及34之引子在5’末端側分別具有SacI認識部位。序列號35之引子在5’末端側具有BamHI認識部位。
製備大腸桿菌B株之基因體DNA(accession No.CP000819)，以獲得之基因體DNA作為模板，以序列號32與序列號33之引子對進行PCR，藉此將約1.0kb之DNA片段予以放大(以下有時稱為fumA-L片段)。又，以序列號34與序列號35之引子對，進行PCR藉此將約1.0kb之DNA片段予以放大(以下有時稱為fumC-R片段)。將該等DNA片段以瓊脂糖電泳分離、回收，將fumA-L片段以NdeI、SacI處理，將fumC-R片段以SacI、BamHI處理。將該等片段與溫度感受性質體pTH18cs1(GenBank存取編號AB019610)之NdeI、BamHI消化物混合，以T4DNA接合酶反應之後， 對於大腸桿菌DH5 α勝任細胞(東洋紡公司製)進行轉形，獲得於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板於30℃生長之轉形體。從獲得之轉形體回收質體，確認fumA、fumC片段已正確插入於pTH18cs1，將該質體命名為pTH18cs1-fumAC。
將如此獲得之質體pTH18cs1-fumAC對於實施例7製作之大腸桿菌B株、B：：atoDAB△pgi△gntR△gnd△ldhA△aceBA△glcB株轉形，於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板於30℃培養一晚，獲得轉形體。將獲得之轉形體接種於含氯黴素10μg/ml之LB液體培養基，於30℃培養一晚。其次將該培養液之一部分塗佈於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板，獲得於42℃生長之菌落。將獲得之菌落以LB液體培養基於30℃培養24小時，再塗佈於LB瓊脂板，獲得於42℃生長之菌落。
從出現的菌落之中隨機挑取100個菌落，各使其生長於LB瓊脂板與含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板，選取氯黴素感受性之選殖體。再從該等目的選殖體之染色體DNA利用PCR篩選由於fumAC基因缺失而使約2.0kbp片段得以放大的菌株，將獲得之菌株命名為B株atoD基因體強化、pgi基因缺失、gntR基因缺失、gnd基因缺失、ldhA基因缺失、aceBA基因缺失、glcB基因缺失、fumAC基因缺失株(以下有時簡稱為B：：atoDAB△pgi△gntR△gnd△ldhA△aceBA△glcB△fumAC株)。
[實施例9]
<質體pIaz之製作>
梭狀芽胞桿菌屬屬細菌之乙醯乙酸去羧酶，記載於GenBank存取編號M55392，異丙醇去氫酶記載於GenBank存取編號AF157307。
為了表現上述基因群所必要之啟動子之鹼基序列，可使用在 GenBank存取編號X02662之鹼基序列資訊中記載於397-440之大腸桿菌來源的甘油醛3-磷酸去氫酶(以下有時稱為GAPDH)之啟動子序列。
為取得GAPDH啟動子，使用大腸桿菌MG1655株之基因體DNA作為模板，利用CGAGCTACATATGCAATGATTGACACGATTCCG(序列號36)、及CGCGCGCATGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(序列號37)以PCR法放大，將獲得之DNA片段以限制酶NdeI、SphI消化，藉此獲得約110bp之作為GAPDH啟動子之DNA片段。將獲得之DNA片段與將質體pBR322(GenBank存取編號J01749)以限制酶NdeI及SphI消化而獲得之片段混合，使用接合酶結合之後，對於大腸桿菌DH5 α株勝任細胞(東洋紡(股)公司DNA-903)進行轉形，獲得於含安比西林50μg/mL之LB瓊脂板生長的轉形體。將獲得之菌落於含安比西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，從獲得之菌體回收質體pBRgapP。
為了取得異丙醇去氫酶基因，使用Clostridium beijerinckii NRRL B-593之基因體DNA作為模板，利用AATATG CATGCTGGTGGAACATATGAAAGGTTTTGCAATGCTAGG(序列號38)、及ACGCGTCGAC TTATAATATAACTACTGCTTTAATTAAGTC(序列號39)，以PCR法放大，將獲得之DNA片段以限制酶SphI、SalI消化，獲得約1.1kbp之異丙醇去氫酶片段。將獲得之DNA片段與將質體pUC119以限制酶SphI及SalI消化而得之片段予以混合，使用接合酶結合之後，對於大腸桿菌DH5 α株勝任細胞進行轉形，獲得於含安比西林50μg/mL之LB瓊脂板生長的轉形體。將獲得之菌落於含安比西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，從獲得之菌體將質體回收，確認已正確插入有IPAdh，將該質體命名為pUC-I。
將質體pUC-I以限制酶SphI及EcoRI消化而獲得之含IPAdh之片段與將質體pBRgapP以限制酶SphI及EcoRI消化而得之片段 混合，使用接合酶結合之後，對於大腸桿菌DH5 α株勝任細胞進行轉形，獲得於含安比西林50μg/mL之LB瓊脂板生長的轉形體。將獲得之菌落於含安比西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，從獲得之菌體將質體回收，確認已正確插入有IPAdh，將該質體命名為pGAP-I。
為了取得乙醯乙酸去羧酶基因，使用Clostridium acetobutylicumATCC824之基因體DNA作為模板，利用ACGCGTCGAC GCTGGTGGAACATATGTTAAAGGATGAAGTAATTAAACAAATTAGC(序列號40)、及GCTCTAGAGGTACCTTACTTAAGATAATCATATATAACTTCAGC(序列號41)以PCR法放大，將獲得之DNA片段以限制酶SalI、XbaI消化，獲得約700bp之乙醯乙酸去羧酶片段。將獲得之DNA片段與先前製作之質體pGAP-I以限制酶SalI及XbaI消化而得之片段混合，使用接合酶結合之後，對於大腸桿菌DH5 α株勝任細胞進行轉形，獲得於含安比西林50μg/mL之LB瓊脂板生長的轉形體。將獲得之菌落以含安比西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，從獲得之菌體將質體回收，確認已正確插入有adc，將該質體命名為pIa。
為了取得葡萄糖6磷酸-1-去氫酶基因(zwf)，使用大腸桿菌B株之基因體DNA(GenBank accession No.CP000819)作為模板，利用GCTCTAGACGGAGAAAGTCTTATGGCGGTAACGCAAACAGCCCAGG(序列號42)、及CGGGATCCCGGAGAAAGTCTTATGAAGCAAACAGTTTATATCGCC(序列號43)，以PCR法放大，將獲得之DNA片段以限制酶BamHI、XbaI消化，藉此獲得約1500bp之葡萄糖6磷酸1-去氫酶片段。將獲得之DNA片段與將先前製作之質體pIa以限制酶XbaI及BamHI消化而得之片段予以混合，使用接合酶結合之後，對於大腸桿菌DH5 α株勝任細胞進行轉形，獲得於含安比西林50μg/mL之LB瓊脂板生長的轉形體。將獲得之菌落於含安比西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，將獲得之質體命名為pIaz。
[實施例10]
<質體pMWGKC之製作>
使用pBRgapP作為模板，利用CCGCTCGAGCATATGCTGTCGCAATGA TTGACACG(序列號44)、及GCTATTCCATATGCAGGGTTATTGTCTCATGAGC(序列號45)以PCR法放大，並將將獲得之DNA片段以T4Polynucleotide Kinase(Takara)予以磷酸化，藉此獲得含GAPDH啟動子之DNA片段。又，將質體pMW119(GenBank存取編號AB005476)以限制酶NdeI處理，並將獲得之DNA片段以KOD plus DNA polymerase(Takara)將末端予以平滑化，獲得含有pMW119之複製起點的DNA片段。將含有GAPDH啟動子之DNA片段與含有pMW119之複製起點之DNA片段予以混合，使用接合酶結合之後，對於大腸桿菌DH5 α株勝任細胞進行轉形，獲得於含安比西林50μg/mL之LB瓊脂板生長的轉形體。將獲得之菌落於含安比西林50μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，從獲得之菌體回收質體pMWG。
為了取得氯黴素耐性基因，使用pTH18cs1(GenBank accession No.AB019610)作為模板，利用TCGGCACGTAAGAGGTTCC(序列號46)及CGGGTCGAATTTGCTTTCG(序列號47)以PCR法放大，將將獲得之DNA片段以T4 Polynucleotide Kinase(Takara)予以磷酸化，而獲得含有氯黴素耐性基因之DNA片段。然後，將pMWG作為模板，利用CTAGATCTGACAGTAAGACGGGTAAGCC(序列號48)、及CTAGATCTCAGGGTTATTGTCTCATGAGC(序列號49)以PCR法放大，與含有氯黴素耐性基因之DNA片段混合，使用接合酶結合之後，對於大腸桿菌DH5 α株勝任細胞進行轉形，獲得於含有氯黴素25μg/mL之LB瓊脂板生長之轉形體。將獲得之菌落於含有氯黴素25μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚培養，將獲得之質體命名為pMWGC。
使用pMWGC基因作為模板，利用CCGCTCGAGCATATGCTGTCGCAAT GATTGACACG(序列號50)、及GCTATTCCATATGCAGGGTTATTGTCTCATGAG C(序列號51)以PCR法放大，對於大腸桿菌DH5 α株勝任細胞進行轉形，獲得於含有氯黴素25μg/mL之LB瓊脂板生長之轉形體。將獲得之菌落於含有氯黴素25μg/mL之LB液體培養基於37℃培養一晚，從獲得之菌體回收質體pMWGKC。
[實施例11]
<Methylobacterium extorquensIAM12632來源蘋果酸硫激酶表現質體之建構>
向東京大學分子細胞生物學研究所IAM培養物保存中心購買Methylobacterium extorquens(Methylobacterium extorquens)IAM12632。以NBRC之培養基號352培養IAMl2632，使用DNeasy Blood &Tissue Kit(QIAGEN(股)公司)獲得染色體DNA。
使用Methylobacterium extorquens IAM12632之染色體DNA作為模板，以AAAAGGCGGAATTCACAAAAAGGATAAAACAATGGACGTTCACGA GTACCAAGCC(序列號52)及CATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGCGAGGTT CTTTTTCCGGACTC(序列號53)作為引子實施PCR，將放大的DNA以NdeI與XbaI切斷，獲得蘋果酸硫激酶的片段。又，以Methylobacterium extorquens之染色體DNA作為模板，將GGATCC TCTAGACTGGTGGAATATATGAGCTTCACCCTGATCCAGCAG(序列號54)及GG CATGCAAGCTTTTACTTTCCGCCCATCGCGTC(序列號55)作為引子，實施PCR，將放大的DNA以XbaI及HindIII切斷，獲得蘋果醯輔酶A裂解酶的片段。將Methylobacterium extorquens之蘋果酸硫激酶與蘋果醯輔酶A裂解酶的片段，與經以NdeI與HindIII切斷的pMWGKC予以連結。將獲得之質體命名為pMWGKC_mtk(Mex)_mcl。
pMWGKC_mtk(Mex)_mcl，包含Methylobacterium extorquens來源的mcl之基因序列(序列號66)、mtkA之基因序列(序列號67)、及mtkB之基因序列(序列號68)。又， Methylobacterium extorquens來源mcl之胺基酸序列、mtkA之胺基酸序列、及mtkB之胺基酸序列，各如序列號69、序列號70、及序列號71所示。
[實施例12]
<Hyphomicrobium methylovorum NBRC 14180來源蘋果酸硫激酶表現質體之建構>
從NBRC(獨立行政法人製品評價技術基盤機構生物技術本部生物遺傳資源部門)購買Hyphomicrobium methylovorum (Hyphomicrobium methylovorum)NBRC14180。以NBRC之培養基號233培養NBRC14180，使用DNeasy Blood &Tissue Kit(QIAGEN(股)公司)獲得染色體DNA。
參考NBRC 14180之絲胺酸-乙醛酸胺基轉移酵素(GenBank Accession No.D13739)之N末端之DNA序列製作引子(序列號56)。
依據Hyphomicrobium denitrificans(Hyphomicrobium denitrificans)之磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/300021538？from=3218417 & to=3221272 & report=gbwithparts)之胺基酸序列，使用NCBI(美國立生物工程資訊中心)之同源性檢索工具比較相同性。(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM=blastp & BLAST_PROGRAMS=blastp & PAGE_TYPE=BlastSearch & SHOW_DEFAULTS=on & LINK_LOC=blasthome)
參考相同性高的胺基酸序列製作引子(序列號57)。
使用上述獲得之序列號56與序列號57之引子，以上述染色體DNA作為模板，實施PCR。將放大片段連接於將pUC19以SmaI消化而得之DNA，從Hyphomicrobium methylovorumNBRC 14180來源的絲胺酸-乙醛酸胺基轉移酵素基因選殖磷酸烯醇丙酮酸羧 化酶基因之一部分。確認選殖體之序列，再進一步製作引子(序列號58及59)。
使用Hyphomicrobium methylovorumNBRC 14180之染色體DNA作為模板，使用上述獲得之序列號58及59之引子實施PCR，將經放大之DNA以EcoRI與XbaI切斷，獲得含有Hyphomicrobium之mcl及mtk基因的DNA片段。從其將上述質體pMWGKC_mtk(Mex)_mcl以EcoRI與XbaI切斷而回收含有mcl之約4.3kb之片段，與含有Hyphomicrobium之mcl及mtk基因之DNA片段連結。將獲得之質體命名為pMWGKC_mcl(Hme)_mtk(Hme)_mcl。
pMWGKC_mcl(Hme)_mtk(Hme)_mcl，包含Hyphomicrobiummethylovorum來源的mcl之基因序列(序列號60)、mtkA之基因(序列號61)、及mtkB之基因(序列號62)。又，Hyphomicrobium methylovorum來源mcl之胺基酸序列、mtkA之胺基酸、及mtkB之胺基酸，各如序列號72、序列號73、及序列號74所示。
[實施例13]
<Rhizobium sp NGR234來源蘋果酸硫激酶表現質體之建構>
依據Rhizobium sp(Rhizobium sp)NGR234之蘋果酸硫激酶‧Beta次單元(GenBank Accession No.ACP26381)與琥珀醯基輔酶A合成酶‧Alpha次單元(GenBank Accession No.ACP26382)之胺基酸序列資訊，完全合成蘋果酸硫激酶之基因(序列號63)。將獲得之基因以NdeI與XbaI切斷，與同樣以限制酶切斷而得之pMWGKC連結。將獲得之質體命名為pMWGKC_mtk(Rhi)。又，使用Methylobacterium extorquens之染色體DNA作為模板，並使用序列號64及序列號65之引子實施PCR，將放大的DNA以XbaI與HindIII切斷，將末端予以平滑化後，與將pMWGKC_mtk(Rhi)以XbaI切斷並平滑化而成的基因予以連結。將mtk與mcl之基因導入於相同方向者命名為pMWGKC_mtk(Rhi)_mcl。Rhizobium sp來源mtkA之胺基酸、及mtkB之胺基酸，各如序列號75、及序列 號76所示。
[實施例14]
<蘋果酸硫激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶導入異丙醇生產株之製作>
對於實施例8製作之大腸桿菌B株(atoDAB，△pgi_gntR_gnd_ldhA_aceBA_glcB_fumAC)之勝任細胞，將實施例9製作之質體pIaz與mtk及mcl之各表現質體進行轉形，塗抹於含有25mg/L之氯黴素、100mg/L之安比西林之LB瓊脂培養基，將生長之菌株各命名如下(參照表2)。
又，表2記載之菌株編號，意指對於大腸桿菌B株(atoDAB，△pgi_gntR_gnd_ldhA_aceBA_glcB_fumAC)導入有pIaz及表2記載之質體之菌株。
[實施例15]
<13C標定之CO2導入於異丙醇之驗證>
於500ml之附有擋板之三角燒瓶中製備100ml之LB液體培養基，於121℃、20分鐘的高壓釜進行滅菌。於該培養基中添加安比西林使終濃度為50μg/ml、添加氯黴素使終濃度為34μg/ml後，接種一白金耳的表2的碳酸固定路徑導入株，於30℃以130rpm培養約20小時。利用離心分離(5000G×15分)從培養液僅分離出菌體，然後於10ml之生理食鹽水中將該菌體再懸浮，各獲得菌體懸 浮液。
於100mL之三角燒瓶中，準備含有100mM之經13C標定的碳酸氫鈉、50g/L的葡萄糖、34μg/ml的氯黴素、50μg/ml安比西林之30mL之M9最小培養基。接種前述菌體懸浮液3mL，以矽蓋密封，於30℃以100rpm培養24小時。獲得之培養液使用安裝有親水性PTFE濾膜(ADVANTEC公司、H050A047A、孔尺寸0.5μM、直徑47mm)之減壓過濾用濾器支座(ADVANTEC公司、KGS-47)進行減壓過濾，分離為培養上清以及菌體。
將附有菌體的濾膜立即浸入冷卻至-20℃的1.6mL甲醇(LC/MS等級)並攪拌後，於-20℃放置1小時。1小時後，加入冷卻至-20℃之1.6mL氯仿(HPLC等級)與冷卻至4℃之0.64mL純水，以Vortex攪拌30秒。之後，於4℃離心，回收上清，獲得菌體之甲醇萃取液。將其以LC-MS/MS分析，測定菌體中之乙醯輔酶A之分子量分布。結果如表3。又，乙醯輔酶A之分子量分布，係將質譜峰部之分子量：808、809及810之比例分別換算為M+0、M+1及M+2。
另一方面，從上述培養上清利用蒸餾以高濃度取出醇類及丙酮，作為分子量分布測定的原料。將培養上清中之異丙醇及乙醇之分子量分布以GC-MS分析。結果如表4及5。又，異丙醇(IPA)之分子量分布(表4)，係將質譜峰部之分子量：117、118及119之比例各換算為M+0、M+1及M+2。乙醇(EtOH)之分子量分布(表5)，係將質譜峰部之分子量：103、104及105之比例各換算為M+0、M+1及M+2。
[表3]
如表3所示，MT-1株、及MT-2株相較於對照株，未導入有13C之乙醯輔酶A(M+0)之比例低，於1原子導入有13C之乙醯輔酶A(M+1)之比例高。尤其，MT-2株之M+1之比例高。因此，可知：MT-1株、及MT-2株中係對於乙醯輔酶A導入有經13C標定之碳酸來源的碳且其效果以MT-2株較為顯著。
再者，MT-2株相較於市售異丙醇或乙醇，未導入有13C之異丙醇或乙醇(M+0)之比例較低，於1原子導入有13C之異丙醇或乙醇(M+1)之比例高(表4、表5)。因此可知：MT-2株針對異丙醇或乙醇，亦導入了經13C標定之碳酸來源的碳。
[實施例16]
<利用蘋果酸作為基質之乙醛酸生產活性測定>
將上述mtk及mcl表現株於含有25μg/ml之氯黴素、100μg/ml之安比西林之2mLLB培養基進行培養。粗酵素液之萃取依以下所示之方法進行。以離心分離回收對數增殖期的菌體，以200mM MOPS-K緩衝液(pH7.7)洗滌後，溶解於同緩衝液，進行超音波破碎。將離心上清(12,000rpm、2min)作為粗酵素萃取液。
粗酵素液之蛋白質濃度，係將粗酵素液及用於製作檢量線之濃度已知之BSA各與Quick Start Bradford Dye Reagent(BioRad公司)反應並成色後，以UV平盤讀取儀(Molecular Divices，spectra max 190)測定OD595nm，從檢量線求取蛋白濃度。
溶液中之酵素活性依以下方式求取。將MOPS-K緩衝液pH7.7，3.5mM phenylhydrazine，10mM MgCl2，3mM ATP，0.3mM輔酶A，10質量%粗酵素液在微小井(microwell)上混合，於室溫溫育30分鐘後，以UV平盤讀取儀測定OD324nm之經時變化作為背景，然後添加(S)-L-蘋果酸鈉溶液pH7.5使最終濃度為5mM，並測定OD324nm之經時變化。作為檢量線，添加乙醛酸於上述緩衝液，於室溫放置5分鐘，測定OD324nm，製作乙醛酸的檢量線。酵素活性之值，係從上述(S)-L-蘋果酸鈉添加後之OD324nm之斜率減去背景之斜率，從乙醛酸之檢量線換算為乙醛酸的消耗速度。然後，將乙醛酸之消耗速度除以蛋白濃度，求取單位蛋白之酵素活性(表6)。
如表6所示，MT-1~MT-3均確認有酵素活性。其中，可知：MT-2株及MT-3株比起MT-1株的酵素活性較高。相對於此，對照組未認為有酵素活性。
[表6]
[實施例17]
<蘋果酸硫激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶導入株之活菌數及質體保持率>
於100mL之三角燒瓶中，準備含有50g/L之葡萄糖及30μg/ml之氯黴素、100μg/ml之安比西林之30mL之M9最小培養基及LB培養基。將前述mtk及mcl表現株接種於M9最小培養基或LB培養基，以矽蓋密封，於30℃以100rpm培養24小時。將培養液以水稀釋，塗佈100μL於不含抗生物質之LB板，測定總活菌數。又，將稀釋的培養液塗佈於含30μg/ml之氯黴素之LB板，測定保持著保有mtk(smt))及mcl之質體之菌數。
如表7所示，可知：MT-2及MT-3比起MT-1株，培養液中之總活菌數之比例高，係良好地增殖。又，保有mtk、mcl之質體於MT-1~3株分別係穩定地受保持。
[實施例18]
<Granulibacter bethesdensisBAA-1260來源蘋果酸硫激酶表現質體之建構>
從ATCC買入Granulibacter bethesdensis之基因體DNA(Granulibacter bethesdensis)BAA-1260D-5。
以Granulibacter bethesdensis之基因體DNA作為模板，以CCCTGAGGAGGGTCCAAGAGATGGACGTCCATGAGTACCA(序列號77)及GCTC TAGATCAGGCTGCCTGACGCCCA(序列號78)作為引子實施PCR，獲得Granulibacter的mtk片段。又，將實施例12製作之pMWGKC_mcl(Hme)_mtk(Hme)_mcl作為模板，以GGAATTCACAAAAAGGATAAAA(序列號79)及TGGTACTCATGGACGTCCATCTCTTGGACCCTCCTCAGGG(序列號80)作為引子，實施PCR，獲得Hyphomicrobium之mcl片段。將獲得之Granulibacter之mtk片段與Hyphomicrobium之mcl片段當作模板，以序列號79及序列號78作為引子實施PCR，獲得含有Hyphomicrobium之mcl及Granulibacter之mtk片段基因之DNA片段。將以EcoRI與XbaI切斷而獲得之片段與將實施例10製作之質體pMWGKC以EcoRI與XbaI切斷而得之質體予以連結。將獲得之質體命名為pMWGKC_mcl(Hme)_mtk(Gb)。
pMWGKC_mcl(Hme)_mtk(Gb)，包含Granulibacter bethesdensis來源的mtkA之基因(序列號81)、及mtkB之基因(序列號82)。又，Granulibacter bethesdensis來源mtkA之胺基酸序列、及mtkB之胺基酸序列，各如序列號107、及序列號108所示。
[實施例19]
<Hyphomicrobium denitrificansDSM1869來源蘋果酸硫激酶表現質體之建構>
從DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Germany)買入Hyphomicrobium denitrificans(Hyphomicrobium denitrificans)DSM1869。以DSMZ之培養基號803培養DSM1869，使用DNeasy Blood &Tissue Kit(QIAGEN(股)公司)獲得染色體DNA。
將Hyphomicrobium denitrificans之基因體DNA作為模板，以ACCAGGGAATTCACAAAAAGGATAAAACAATGAGCTATACCCTCTACCCAACCG TAAGC(序列號83)及GCCCACTCTAGATCAGGCAACTTTTTTCTGCTTGCCGAG AACC(序列號84)作為引子，實施PCR，獲得Hyphomicrobium之mcl-mtk片段。將以EcoRI與XbaI切斷而得之片段與將實施例12製作之質體pMWGKC_mcl(Hme)_mtk(Hme)_mcl以EcoRI與XbaI切斷而得之質體予以連結。將獲得之質體命名為pMWGKC_mcl(Hde)_mtk(Hde)_mcl。
pMWGKC_mcl(Hde)_mtk(Hde)_mcl，包含Hyphomicrobium denitrificans來源的mcl之基因序列(序列號85)、mtkA之基因(序列號86)、及mtkB之基因(序列號87)。又，Hyphomicrobium denitrificans來源mcl之胺基酸序列、mtkA之胺基酸序列、及mtkB之胺基酸序列，各如序列號109、序列號110、及序列號111所示。
[實施例20]
<Nitrosomonas europaeaNBRC14298來源蘋果酸硫激酶表現質體之建構>
從NBRC(Biological Resource Center，NITE)買入Nitrosomonas europaea(Nitrosomonas europaea)NBRC14298。以NBRC之培養基號829培養NBRC14298，使用DNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN(股)公司)獲得染色體DNA。
使用Nitrosomonas europaea之基因體DNA作為模板，並以GCGGGGGAATTCACAAAAAGGATAAAACAATGAGTCATACCCTGTATGAACCAAAA CACC(序列號88)及CAGGCGTCTAGATTAGAGTCCGGCCAGAACTTTTGCGACG(序列號89)作為引子實施PCR，獲得Nitrosomonas europaea之mtk片段。將以EcoRI與XbaI切斷而得之片段與將實施例12製作之質體pMWGKC_mcl(Hme)_mtk(Hme)_mcl以EcoRI與XbaI切斷而得之質體予以連結。將獲得之質體命名為pMWGKC_mcl(Ne)_ mtk(Ne)_mcl。
pMWGKC_mcl(Ne)_mtk(Ne)_mcl，包含Nitrosomonas europaea來源的mcl之基因序列(序列號90)、mtkA之基因(序列號91)、及mtkB之基因(序列號92)。又，Nitrosomonas europaea來源mcl之胺基酸序列、mtkA之胺基酸序列、及mtkB之胺基酸序列，各如序列號112、序列號113、及序列號114所示。
[實施例21]
<Methylococcus capsulatusATCC33009來源蘋果酸硫激酶表現質體之建構>
從ATCC買入Methylococcus capsulatus之基因體DNA(Methylococcus capsulatus)ATCC33009D-5。
使用Methylococcus capsulatus之基因體DNA作為模板，並以GGAATTCCATATGGCTGTTAAAAATCGTCTAC(序列號93)及GCTCTAGAT CAGAATCTGATTCCGTGTTC(序列號94)作為引子，實施PCR，獲得Methylococcus之mcl-mtk片段。將以NdeI與XbaI切斷而得之片段與將實施例10製作之質體pMWGKC或pMWGC以NdeI與XbaI切斷而得之質體予以連結。將獲得之質體命名為pMWGKC_mcl(Mc)_mtk(Mc)或pMWGC_mcl(Mc)_mtk(Mc)。
pMWGKC_mcl(Mc)_mtk(Mc)或pMWGC_mcl(Mc)_mtk(Mc)，包含Methylococcus capsulatus來源的mcl之基因序列(序列號95)、mtkA之基因序列(序列號96)、及mtkB之基因序列(序列號97)。又，Methylococcus capsulatus來源mcl之胺基酸序列、mtkA之胺基酸序列、及mtkB之胺基酸序列，各如序列號115、序列號116、及序列號117所示。
[實施例22]
<未培養(uncultured)之gammaproteobacteriaGenBank：AP011641.1來源蘋果酸硫激酶表現質體之建構>
為了取得未培養之gammaproteobacteria來源mtk，依據 GenBank：AP011641.1之胺基酸序列設計gammaproteobacteria來源mtk，並利用DNA合成製作以下之DNA片段(序列號98)。
以製作的DNA片段作為模板，以GTTGAACGAGGAGATCGTCCATGAA CATTCACGAATATCA(序列號99)及GCTCTAGATTAGCCAGAAACTGCAGATCC(序列號100)作為引子實施PCR，獲得gammaproteobacteria之mtk片段。又，以實施例21製作之pMWGKC_mcl(Mc)_mtk(Mc)或pMWGC_mcl(Mc)_mtk(Mc)作為模板，以序列號93及TGATATTCGTGAATGT TCATGGACGATCTCCTCGTTCAAC(序列號101)作為引子實施PCR，獲得Methylococcus之mcl片段。以獲得之gammaproteobacteria之mtk片段與Methylococcus之mcl片段作為模板，以序列號93及序列號100作為引子實施PCR，獲得含有Methylococcus之mcl及gammaproteobacteria之mtk片段基因之DNA片段。將以NdeI與XbaI切斷而得之片段與將實施例10製作之質體pMWGKC以NdeI與XbaI切斷而得之質體予以連結。將獲得之質體命名為pMWGKC_mcl(Mc)_mtk(gamma)。
pMWGKC_mcl(Mc)_mtk(gamma)，包含未培養之gammaproteobacteria來源的mtkA之基因(序列號102)、及mtkB之基因(序列號103)。又，未培養之gammaproteobacteria來源mtkA之胺基酸序列、及mtkB之胺基酸序列，各如序列號118、及序列號119所示。
[實施例23]
<蘋果酸激酶及蘋果醯輔酶A裂解酶導入異丙醇生產atoD基因體強化、pgi基因缺失、gntR基因缺失、gnd基因缺失、ldhA基因缺失、fumAC基因缺失、aceBA基因缺失、glcB基因缺失株之製作>
對於實施例8製作之大腸桿菌B株(atoDAB，△pgi_gntR_gnd_ldhA_aceBA_glcB_fumAC)之勝任細胞，將實施例18~22製作之質體pIaz與、mtk及mcl之各表現質體進行轉形，塗抹於含25mg/L之氯黴素、100mg/L之安比西林之LB瓊脂培養基，將生 長的菌株各命名為如下(參照表8)。
又，表8記載之菌株號，意指於大腸桿菌B株(atoDAB，△pgi_gntR_gnd_ldhA_aceBA_glcB_fumAC)導入有pIaz與表8記載之質體之菌株。
[實施例24]
<以蘋果酸作為基質之乙醛酸生產活性之測定>
依與實施例16同樣的方法，求取單位蛋白之酵素活性(表9)。
如表9所示，MT-4~MT-8均確認酵素活性，且比起MT-1株之酵素活性為高。其中可知：MT-5株、MT-6株、MT-7株及MT-8株，與實施例16所示之MT-2及MT-3株有同等或更高的活性。相對於此，對照組未認為有酵素活性。
[表9]
[實施例25]
<atoD基因體強化、aceB基因缺失株之製作>
為了選殖編碼為蘋果酸合酶(以下有時簡稱為aceB)之基因(1602bp)之鹼基序列附近區域，合成GGAATTCATTCAGCTGTTGCGCATC GATTC(序列號24)、GTTATGTGGTGGTCGTGCAGCTCCTCGTCATGG(序列號104)、GAGCTGCACGACCACCACATAACTATGGAG(序列號105)、GGAATTCCA GTTGAACGACGGCGAGCAG(序列號106)所示之4種寡核苷酸引子。引子在5’末端側各具有EcoRI認識部位。
製備大腸桿菌B株之基因體DNA(accession No.CP000819)，以獲得之基因體DNA作為模板，以序列號24與序列號106之引子對進行PCR，將約1.0kb之DNA片段予以放大(以下有時稱為aceB-L片段)。又，以序列號105與序列號106之引子對進行PCR，將約1.0kb之DNA片段予以放大(以下有時稱為aceB-R片段)。將該等DNA片段以瓊脂糖電泳分離、回收，以aceB-L與aceB-R片段作為模板，以序列號24與序列號108之引子對進行PCR，將約2.0kb之DNA片段予以放大(以下有時稱為aceB-LR片段)。將該aceB-LR片段以瓊脂糖電泳分離、回收，以EcoRI消化，與溫度感受性質體pTH18cs1(GenBank存取編號AB019610)之EcoRI消化物經脫磷 酸者混合，以T4DNA接合酶反應之後，對於大腸桿菌DH5 α勝任細胞(東洋紡公司製)進行轉形，獲得於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板於30℃生長之轉形體。從獲得之轉形體回收質體，確認aceB-LR片段已正確地插入於pTH18cs1，將該質體命名為pTH18cs1-aceB。
將如此獲得之質體pTH18cs1-aceB對於實施例1製作之大腸桿菌B株、B：：atoDAB轉形，於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板於30℃培養一晚，獲得轉形體。將獲得之轉形體接種於含氯黴素10μg/ml之LB液體培養基，於30℃培養一晚。其次將該培養液之一部分塗佈於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板，獲得於42℃生長之菌落。將獲得之菌落以LB液體培養基於30℃培養24小時，再塗佈於LB瓊脂板，獲得於42℃生長之菌落。
從出現的菌落之中隨機挑取100個菌落，各使其於LB瓊脂板、與含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板生長，選取氯黴素感受性之選殖體。再從該等目的選殖體之染色體DNA利用PCR篩選由於aceB基因缺失而使約2.0kbp片段得以放大之菌株，將獲得之菌株命名為B株atoD基因體強化、aceB基因缺失株(以下有時簡稱為B：：atoDAB△aceB株)。
[實施例26]
<atoD基因體強化、aceB基因缺失、glcB基因缺失株之製作>
將實施例7製作之質體pTH18cs1-gclB對於實施例25製作之大腸桿菌B株、B：：atoDAB△aceB株進行轉形，於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板於30℃培養一晚，獲得轉形體。將獲得之轉形體接種於含氯黴素10μg/ml之LB液體培養基，於30℃培養一晚。其次將該培養液之一部分塗佈於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板，獲得於42℃生長之菌落。將獲得之菌落以LB液體培養基於30℃培養24小時，再塗佈於LB瓊脂板，獲得於42℃生長之菌落。
從出現的菌落之中隨機挑取100個菌落，各使其於LB瓊脂 板、及含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板生長，選取氯黴素感受性之選殖體。再從該等目的選殖體之染色體DNA利用PCR篩選由於glcB基因缺失而使約2.0kbp片段得以放大之菌株，將獲得之菌株命名為B株atoD基因體強化、aceB基因缺失、glcB基因缺失株(以下有時簡稱為B：：atoDAB△aceB△glcB株)。
[實施例27]
<atoD基因體強化、ldhA基因缺失株之製作>
將實施例5製作之質體pTH18cs1-ldhA對於實施例1製作之大腸桿菌B株、B：：atoDAB進行轉形，於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板於30℃培養一晚，獲得轉形體。將獲得之轉形體接種於含氯黴素10μg/ml之LB液體培養基，於30℃培養一晚。其次將該培養液之一部分塗佈於含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板，獲得於42℃生長之菌落。將獲得之菌落以LB液體培養基於30℃培養24小時，再塗佈於LB瓊脂板，獲得於42℃生長之菌落。
從出現的菌落之中隨機挑取100個菌落，各使其生長於LB瓊脂板、及含氯黴素10μg/ml之LB瓊脂板，選取氯黴素感受性之選殖體。再從該等目的選殖體之染色體DNA利用PCR篩選由於ldhA基因缺失而使約2.0kbp片段得以放大之菌株，將獲得之菌株命名為atoD基因體強化、ldhA基因缺失株(以下有時簡稱為B：：atoDAB△ldhA株)。
[實施例28]
<pBRgapP、pMWGC_mcl(Mc)_mtk(Mc)/B株、pBRgapP、pMWGC/B株之製作>
將實施例2製作之質體pBRgapP、及實施例21製作之質體pMWGC_mcl(Mc)_mtk(Mc)、或pMWGC對於大腸桿菌B株之勝任細胞進行轉形，塗抹於含有25mg/L之氯黴素、100mg/L之安比西林之LB瓊脂培養基，獲得生長的菌株。
[實施例29]
<pIa、pMWGC_mcl(Mc)_mtk(Mc)/B：：atoDAB株、pIa、pMWGC/B：：atoDAB株之製作>
將實施例9製作之質體pIa、與實施例21製作之質體pMWGC_mcl(Mc)_mtk(Mc)、或pMWGC對於實施例1製作之大腸桿菌B株(B：：atoDAB)之勝任細胞進行轉形，塗抹於含25mg/L之氯黴素、100mg/L之安比西林之LB瓊脂培養基，獲得生長的菌株。
[實施例30]
<pIa、pMWGC_mcl(Mc)_mtk(Mc)/B：：atoDAB△aceB株、pIa、pMWGC/B：：atoDAB△aceB株之製作>
將實施例9製作之質體pIa、與實施例21製作之質體pMWGC_mcl(Mc)_mtk(Mc)、或pMWGC對於實施例25製作之大腸桿菌B株(B：：atoDAB△aceB)之勝任細胞進行轉形，塗抹於含25mg/L之氯黴素、100mg/L之安比西林之LB瓊脂培養基，獲得生長之菌株。
[實施例31]
<pIa、pMWGC_mcl(Mc)_mtk(Mc)/B：：atoDAB△aceB△glcB株、pIa、pMWGC/B：：atoDAB△aceB△glcB株之製作>
將實施例9製作之質體pIa、實施例21製作之質體pMWGC_mcl(Mc)_mtk(Mc)、或pMWGC對於實施例26製作之大腸桿菌B株(B：：atoDAB△aceB△glcB)之勝任細胞進行轉形，塗抹於含25mg/L之氯黴素、100mg/L之安比西林之LB瓊脂培養基，獲得生長的菌株。
[實施例32]
<pIa、pMWGC_mcl(Mc)_mtk(Mc)/B：：atoDAB△ldhA株、pIa、pMWGC/B：：atoDAB△ldhA株之製作>
將實施例9製作之質體pIa、實施例21製作之質體pMWGC_mcl(Mc)_mtk(Mc)、或pMWGC對於實施例27製作之大腸桿菌B株 (B：：atoDAB△ldhA)之勝任細胞進行轉形，塗抹於含25mg/L之氯黴素、100mg/L之安比西林之LB瓊脂培養基，獲得生長的菌株。
[實施例33]
<異丙醇之生產>
本實施例，使用WO2009/008377號小冊圖1所示之生產裝置生產異丙醇。培養槽使用容量3公升之玻璃製品，於捕集槽注入作為捕集液之水(捕集水)，每1槽注入量為9L，並連結使用2台。
異丙醇生產評價使用之菌株之一覧如表10。
作為前培養，在裝入含25mg/L之氯黴素、100mg/L之安比西林之LB Broth，Miller培養液(Difco244620)50mL之容量500mL之三角燒瓶中接種各評價株，於培養溫度30℃、120rpm攪拌培養 一晚。將前培養45mL移到裝有以下所示之組成之培養基900g之容量3L之培養槽(ABLE公司製培養裝置BMS-PI)，進行培養。培養係於大氣壓下、通氣量0.45L/min、攪拌速度490rpm、培養溫度30℃、pH7.0(以NH3水溶液調整)進行。於培養開始至8小時後的期間，以20g/L/小時的流速添加50wt/wt%的葡萄糖水溶液。之後，以20g/L/小時的流速適當添加50wt/wt%的葡萄糖水溶液，使得培養槽內儘可能不殘存葡萄糖。從培養開始起至30小時，取樣菌體培養液數次，以離心操作去除菌體之後，以HPLC依定法測定獲得之培養上清中及捕集水中之異丙醇、丙酮及主要副產物之累積量。又，測定值係培養後之培養液與捕集槽2台之合計值。結果如表11，副產物如表12所示。
<培養基組成>
玉米浸液(日本食品化工製)：50g/L
Fe2SO4‧7H2O：0.1g/L
K2HPO4：2g/L
KH2PO4：2g/L
MgSO4‧7H2O：2g/L
(NH4)2SO4：2g/L
ADEKA NOLLG126(旭電化工業)0.1g/L
(剩餘量：水)
[表11]
[表12]
評價之結果，對照株(vec/atoDAB)之異丙醇生產量為33.2g/30h，mtk導入株(mtk_mcl/atoDAB)之生產量為34.6g/30h。丙酮之生產量，於對照株(vec/atoDAB)為6.0g/30h、mtk導入株(mtk_mcl/atoDAB)為8.8g/30h。由此可知：導入mtk+mcl較能提高異丙醇、丙酮之生產量。又，於30h，異丙醇之對糖產率於對照株(vec/atoDAB)為15.8%，於mtk+mcl導入株(mtk_mcl/atoDAB)為16.5%，異丙醇與丙酮之對糖產率，於對照株(vec/atoDAB)為18.6%，於mtk+mcl導入株(mtk_mcl/atoDAB)顯示20.7%。由此可知，藉由導入mtk+mcl的路徑，提高了糖變換為異丙醇、丙酮之變換效率。
同樣地，於atoDAB△ldhA係顯示導入有mtk+mcl之菌株，異丙醇、丙酮之生產量、對糖產率均與atoDAB同樣地提高。於 atoDAB△ldhA、atoDAB△aceB、atoDAB△aceB△glcB，就對糖產率而言，比起各菌株之對照株(vec)，導入有mtk+mcl之菌株有所提高，故可認為由於mtk+mcl使得乙醯輔酶A、乙醯輔酶A來源之有用物質有效率地增加。
表12顯示副產物。於30h，對照株(vec/B)與mtk+mcl導入株(mtk_mcl/B)相比較，乙醇、丙酮酸、琥珀酸之量有所減少，副產物之總量也意外地為：mtk+mcl導入株比起對照株為減少。同樣，於atoDAB、atoDAB△aceB、atoDAB△aceB△glcB、atoDAB△ldhA，導入有mtk+mcl之菌株就乙醇、丙酮酸、琥珀酸、副產物之總量，比起對照株有所減少。由此可知：無關乎是否有atoDAB，利用mtk+mcl可觀察到同樣的效果。
atoDAB△aceB及atoDAB△aceB△glcB中，IPA及IPA與丙酮之對糖產率，比起atoDAB株為大致同等，但是vec、mtk導入株均為副產物之總量減少，尤其mtk+mcl導入株意外地乳酸、琥珀酸之累積顯著減少。當從培養液中回收異丙醇、丙酮時，若副產物少，精製負荷可分外減輕，因此atoDAB△aceB及atoDAB△aceB△glcB在工業上較為理想。
同樣地，於atoDAB△ldhA亦為導入有mtk+mcl之菌株，異丙醇、丙酮之生產量、對糖產率均與atoDAB同樣顯示為上升。又，上述所有菌株的對糖產率比起對照株(vec)，導入有mtk+mcl之菌株有所上升，因此據認為乙醯輔酶A、乙醯輔酶A來源之有用物質有效率地增加。
atoDAB△ldhA中，副產物之總量減少，同時，於mtk+mcl導入株，丙酮酸之累積顯著減少。而且，於導入有mtk+mcl之atoDAB△ldhA，異丙醇、丙酮之對糖產率高，因此顯示異丙醇、丙酮以良好效率流入葡萄糖與mtk+mcl之路徑兩者。atoDAB△ldhA中，上述atoDAB△aceB及atoDAB△aceB△glcB同樣副產物少，除此以外，於mtk+mcl導入株之異丙醇、丙酮之對糖產率高。從回收異丙醇、丙酮時之精製負荷減輕及產率提升兩者，顯示在工業化生產異丙醇、丙酮方面，ldhA受破壞為較佳。
B株中，未導入異丙醇、丙酮之生產路徑。由於乙酸顯著增加，故據認為乙醯輔酶A主要流向乙酸側。又，預測：於mtk+mcl導入株(mtk_mcl/B)，增加的乙醯輔酶A係流往乙酸與乙醇。由此可顯示：於B株亦為由於mtk+mcl之效果，使乙醯輔酶A有所增加。
[實施例34]
<質體pGAPS之建構>
為了取得大觀黴素耐性基因，使用質體pIC156(Steinmetz et.Al.,Gene,1994,142(1)：79-83)作為模板，利用CCGCGGTACC GTATAATAAAGAATAATTATTAATCTGTAGACAAATTGTGAAAGG(序列號120)及CTTTTGTTTATAAGTGGGTAAACCGTGAATATCGTGTTCTTTTCAC(序列號121)以PCR法放大，將獲得之DNA片段以T4 Polynucleotide Kinase(Toyobo)予以磷酸化，獲得含有大觀黴素耐性基因之DNA片段。然後，將質體pGAP以PvuI處理，將DNA片段以Toyobo blunting high予以平滑化，與前述含有大觀黴素耐性基因之DNA片段連結，對於大腸桿菌DH5 α株勝任細胞進行轉形，獲得於含有大觀黴素120μg/mL之LB瓊脂板生長之轉形體。將獲得之菌落於含大觀黴素120μg/mL之LB液體培養基培養一晚，獲得之質體命名為pGAPS。
[實施例35]
<質體pGAPS_gcl之製作>
從大腸桿菌MG1655株使用DNeasy Blood &Tissue Kit(QIAGEN(股)公司)獲得染色體DNA。
參考含有乙醛酸醛連接酶(gcl，NCBI-GI：945394)之操縱組，製作2種引子AAGAACTCTAGAACAAAAAGGATAAAACAATGGCAAAAATGAGA GCCGTTGACGCGGCAATG(序列號122)及GACCAGCTGCAGTCAGGCCAGTTTA TGGTTAGCCATTAATTCCAGC(序列號123)。
又，製作2種引子ACACAACTGCAGACAAAAAGGATAAAACAATGAAGAT TGTCATTGCGCCAGACTCTTTTAAAGAGAGCT(序列號124)及GCCCCCAAGCT TTCAGTTTTTAATTCCCTGACCTATTTTAATGGCGCAGG(序列號125)。
使用上述獲得之序列號122與序列號123之引子，以大腸桿菌MG1655株之染色體DNA作為模板實施PCR，獲得約3kb的放大DNA。然後，使用上述獲得之序列號124與125之引子，使用大腸桿菌MG1655株之染色體DNA作為模板實施PCR，獲得約1.1kb之放大DNA。將經放大DNA分別以PstI切斷、連結。以該連結DNA作為模板，使用AAGAACTCTAGAACAAAAAGGATAAAACAATGGCAAAAATGAG AGCCGTTGACGCGGCAATG(序列號126)及GCCCCCAAGCTTTCAGTTTTTAAT TCCCTGACCTATTTTAATGGCGCAGG(序列號127)作為引子進行PCR，獲得放大DNA。將該放大DNA以XbaI與HindIII切斷，並與同樣經限制酶切斷之質體pGAPS連結。將大腸桿菌DH5 α轉形，以含有大觀黴素的LB瓊脂板培養，從獲得之轉形體回收質體。
將該質體以限制酶ClaI及HindIII切斷，回收含有pGAPS與gcl之基因之約4kb之DNA片段。將DNA片段的末端平滑化後，使自接合(selfligation)後將大腸桿菌DH5 α轉形，於含有120μg/mL大觀黴素之LB瓊脂板培養，並將生長之菌於含有120μg/mL大觀黴素之LB液體培養基培養，獲得轉形體。從獲得之轉形體回收質體，獲得質體pGAPS_gcl。
[實施例36]
<Pantoea ananatis PA株之取得>
從Pantoea ananatisAJ13601(專利寄存菌株BP-7207)取出質體RSFCPG。質體RSFCPG，係具有催化L-麩胺酸之生合成反應之酵素之麩胺酸去氫酶、檸檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的四環黴素耐性之質體(日本特開2001-333769號公報)。使用RSFCPG，將Pantoea ananatisAJ417(專利寄存菌株BP-8646)以CaCl2法(Molecular Cloning,3rd edition,Cold Spring Harbor press,2001)轉形，於含有10μg/mL之四環黴素之LB培養基培養，取得Pantoea ananatisAJ417/RSFCPG(以後有時簡稱PA株)。
[實施例37]
<Pantoea ananatis aceB基因缺失株之製作>
Pantoea ananatisAJ13355(專利寄存菌株BP-6614)之基因體DNA之全部鹼基序列為公知(GenBank存取編號AP012032)，編碼為Pantoea ananatis之蘋果酸合酶(以下有時稱為PAaceB)之基因之鹼基序列也有人報告(GenBank存取編號NC_017531)。為了選殖編碼為aceB之基因(1,599bp)之鹼基序列附近區域，合成GACTCTAGAGGATCCCCGGGATGACAGACTCGGTTATCAACAGTGAATTACTTTTC AG(序列號128)、GACGGGACGGCGGCTTTGTTGGCTTCCGCGTTATGAAAAA AGTAGAGAGC(序列號129)、TTGAGACACAACGTGGCTTTCCCAGCAAGGAC AGCGCGCGCAATGAATG(序列號130)、ATGACCATGATTACGAATTCTCAGG GAAGCAGGCGGTAGCCTGGCAGAGTCAG(序列號131)、所示之4種寡核苷酸引子。
又，為了選殖卡那黴素耐性基因，合成TTTTTCATAACGCGGAAGCC AACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGC(序列號132)、CGCGCGCTGTCCTTGC TGGGAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGC(序列號133)所示之2種寡核苷酸引子。
製備Pantoea ananatisAJ417株之基因體DNA，以獲得之基因體DNA作為模板，以序列號128與序列號129之引子對進行PCR，將含有aceB基因附近之序列之DNA片段予以放大(以下有時稱為PAaceB-L片段)。又，以序列號130與序列號131之引子對進行PCR，將含有aceB基因附近之序列之DNA片段予以放大(以下有時稱為PAaceB-R片段)。又，將保有卡那黴素耐性基因之質體pUC4K以序列號132與序列號133之引子對進行PCR，藉此將含有卡那黴素耐性基因之DNA片段予以放大(以下有時稱為KanR片段)。又，將質體pUC18以EcoRI與XmaI處理，製作pUC18片段。回收該等PAaceB-L片段、PAaceB-R片段、KanR片段、pUC18片段，混合各片段，使用In-fusion HD cloning kit(Invitrogen)處理，將大 腸桿菌DH5 α(NEB5 α；New England Biolabs)勝任細胞轉形，以含有30μg/mL之卡那黴素之LB板培養。從獲得之轉形體回收質體，利用DNA定序，確認已在pUC18載體中構建了aceB前方部分序列_卡那黴素耐性基因_aceB後方部分序列的序列。以該質體作為模板，以GCCGCCGAATTCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACC(序列號134)及ATGACCATGATTACGAATTCTCAGGGAAGCAGGCGGTAGCCT GGCAGAGTCAG(序列號135)進行PCR並精製，將放大產物以EcoRI切斷，利用DNA接合酶(Takara)使進行自接合，獲得不具複製起點的質體。使用該質體，將Pantoea ananatisAJ417株轉形，於含有30μg/mL之卡那黴素之LB板培養。針對獲得之菌落，利用基因體PCR以及DNA定序確認aceB基因正確地缺失。將取得之菌株使用RSFCPG以CaCl2法轉形，以含有10μg/mL之四環黴素之LB培養基培養，命名為Pantoea ananatisAJ417株aceB基因缺失株(有時簡稱為PA△aceB株)。
[實施例38]
<Pantoea ananatis fumA基因缺失株之製作>
製備Bacillus subtilis subsp.Subtilis str.168(ATCC 23857)之基因體DNA，以獲得之基因體DNA作為模板，使用AGTCTAGAGATCCTTTTTAACCCATCAC(序列號136)、及AGTCTAGAAGTCGA TAAACAGCAATATT(序列號137)之引子以PCR法放大，將獲得之DNA片段以限制酶XbaI消化，藉此獲得含有約2.0kbp之sacB基因之DNA片段。將獲得之DNA片段，與將質體pHSG298(Takara)以限制酶XbaI消化再經鹼性磷解酶處理之DNA片段予以混合，使用接合酶結合之後，對於大腸桿菌DH5 α株勝任細胞(東洋紡(股)公司DNA-903)進行轉形，獲得於含有卡那黴素25μg/mL之LB瓊脂板生長之轉形體。從獲得之菌體將質體回收，獲得於pHSG298插入有含sacB基因之DNA片段的質體pHSG-sacB。
Pantoea ananatis AJ13355原本保有的質體pEA320之全部 鹼基序列為公知(NCBI Reference Sequence NC_017533.1)，編碼為富馬酸水合酶第I類(以下有時稱為fumA)之基因之鹼基序列亦有人報告。為了選殖編碼為fumA之基因(1,647bp)之鹼基序列附近區域，合成GCAACGTTGGCTCTCATCT(序列號138)、CGGGATCC AAACACGCGGCGGAAAACA(序列號139)、CGGGATCCGTTAACGCAGGCTGAC(序列號140)及GCTGCTGGCGTACTGGTTC(序列號141)所示之4種寡核苷酸引子。
製備Pantoea ananatis AJ417株之基因體DNA，以獲得之基因體DNA作為模板，以序列號138與序列號139之引子對進行PCR，藉此將約0.7kb之DNA片段予以放大(以下有時稱為fumA-L片段)。又，以序列號140與序列號141之引子對進行PCR，將約0.9kb之DNA片段予以放大(以下有時稱為fumA-R片段)。
將該等DNA片段以瓊脂糖電泳分離、回收，將fumA-L片段及fumA-R片段分別以BamHI消化並使用接合酶結合之後，利用T4聚核苷酸激酶進行5’末端磷酸化處理。將本DNA片段，與將上述pHSG-sacB以BamHI消化並利用T4DNA聚合酶予以平滑末端化處理後再進行鹼性磷解酶處理之DNA片段予以混合，使用接合酶結合之後，對於大腸桿菌DH5 α勝任細胞(東洋紡公司製)進行轉形，獲得於含有卡那黴素25μg/ml之LB瓊脂板於30℃生長之轉形體。從獲得之轉形體回收質體，確認編碼為fumA之基因之5’上游附近片段與3’附近片段之2個片段已正確地插入於pHSG-sacB。將獲得之質體命名為psacB-PAfumA。
psacB-PAfumA係可於Pantoea ananatis內複製的質體。而為了獲得不具有複製起點、在Pantoea ananatis內無法複製之fumA基因缺失用質體，以psacB-PAfumA作為模板，使用CTTTACACTTTAT GCTTCC(序列號142)及在5’末端側具有SacI認識部位之TTGAGCT CGAGAGGTCTGCCTCGTGA(序列號143)之引子對，以PCR將約5kbp之DNA片段予以放大。將該DNA片段以SacI消化，使用接合酶予以結合，獲得質體pPAfumA。獲得之pPAfumA含有fumA-L片段、fumA-R片段、sacB基因、及卡那黴素耐性基因，且不具複製起點。 利用電穿孔法，使用pPAfumA將Pantoea ananatis AJ417轉形，將其塗佈於含有卡那黴素40μg/ml之LB瓊脂培養基。將上述培養基獲得之單一(single)交叉株於LB培養基進行一晚液體培養，將培養液塗佈於含有10%(W/V)蔗糖之LB瓊脂培養基。
其次從上述培養基獲得之選殖體選擇顯示卡那黴素感受性及於含蔗糖之培養基生長性之選殖體。再從該等選殖體之染色體DNA使用序列號138與序列號141之引子對利用PCR篩選由於fumA基因缺失而使約1.5kbp片段得以放大之菌株，將獲得之菌株命名為Pantoea ananatis AJ417株fumA基因缺失株(以下有時簡稱為PA△fumA株)。
[實施例39]
<Pantoea ananatis fumA基因缺失、fumC基因缺失株之製作>
為了選殖編碼為富馬酸水合酶第II類(以下有時稱為fumC)之基因(1,398bp)之鹼基序列附近區域，合成TCGCCATGATGCTGCTGT G(序列號144)、CGGGATCCGACTTAGCGTCATCGGTTG(序列號145)、CGGG ATCCGATGAAGATTGCTAACGACG(序列號146)及TGATGCCGACAATATTACG C(序列號147)所示之4種寡核苷酸引子。
製備Pantoea ananatis AJ417株之基因體DNA，以獲得之基因體DNA作為模板，以序列號144與序列號145之引子對進行PCR，將約0.8kb之DNA片段予以放大(以下有時稱為fumC-L片段)。又，以序列號146與序列號147之引子對，進行PCR，將約0.7kb之DNA片段予以放大(以下有時稱為fumC-R片段)。
將該等DNA片段以瓊脂糖電泳分離、回收，將fumC-L片段及fumC-R片段分別以BamHI消化，使用接合酶結合之後，利用T4聚核苷酸激酶進行5’末端磷酸化處理。將該DNA片段，與將實施例38製作之pHSG-sacB以BamHI消化並利用T4DNA聚合酶予以平滑末端化處理後再經鹼性磷解酶處理之DNA片段予以混合，使用接合酶結合之後，對於大腸桿菌DH5 α勝任細胞(東洋紡公司製) 進行轉形，獲得於含有卡那黴素25μg/ml之LB瓊脂板於30℃生長之轉形體。從獲得之轉形體回收質體，確認編碼為fumC之基因之5’上游附近片段與3附近片段之2個片段已正確插入於pHSG-sacB。將獲得之質體命名為psacB-PAfumC。
將質體psacB-PAfumA變更為psacB-PAfumC，除此以外與實施例38以同樣的方法，獲得不具有複製起點之無法在Pantoea ananatis內複製之fumC基因缺失用質體pPAfumC。再者，將實施例38用之質體pPAfumA替換為pPAfumC，並將轉形使用之Pantoea ananatis AJ417株替換為PA△fumA株，除此以外與實施例38以同樣的方法，篩選顯示卡那黴素感受性及含蔗糖之培養基生長性之選殖體。再從該等選殖體之染色體DNA使用序列號138與序列號141之引子對，利用PCR篩選由於fumC基因缺失而得以放大約1.5kbp片段之菌株。將取得之菌株使用RSFCPG以CaCl2法轉形，於含有10μg/mL之四環黴素之LB培養基培養，命名為Pantoea ananatis fumA基因缺失、fumC基因缺失株(以下有時簡稱為PA△fumAC株)。
[實施例40]
<Pantoea ananatis評價株之建構>
使用實施例36、37、及39製作的Pantoea ananatisPA株、PA△aceB株、PA△fumAC株，將實施例34之pGAPS、實施例35之pGAPS_gcl、實施例10之pMWGKC、及實施例21之pMWGKC_mcl(Mc)_mtk(Mc)以CaCl2法或電穿孔法轉形。將各自的菌株塗佈於含有30μg/mL氯黴素、120μg/mL大觀黴素、15μg/mL四環黴素之LB瓊脂培養基，將生長之菌株作為評價株。該等菌株整理於表13。
[表13]
[實施例41]
<Pantoea株將13C標定的CO2導入麩胺酸之驗證>
將成為對象之Pantoea株於含有30μg/mL氯黴素、120μg/mL大觀黴素、15μg/mL四環黴素之LB培養基，以220rpm、30℃之條件進行前培養。從前培養液以離心分離(5000rpm、5分鐘)回收菌體。然後準備含有20g/L葡萄糖、30μg/mL氯黴素、120μg/mL大觀黴素、15μg/mL四環黴素之2mL之Pantoea用最小培養基(17g/L Na2HPO4‧12H2O、3g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、1g/L NH4Cl、10mM MgSO4、10μM CaCl2、50mg/L L-lysine、50mg/L L-Methionine、pH6.0)，添加前培養菌體調整使OD成為1~5之範圍內。蓋緊後，於30℃、220rpm培養1日。定期取樣培養液，並離心分離(12,000rpm、3分鐘)去除菌體，將上清以親水性PTFE濾膜(MILLIPORE公司、MSGVN2B50)過濾，製成培養樣本。作為培養樣本使用之菌株整理於表13。
測定培養樣本之麩胺酸中之13C含量時，將適量樣本以冷凍乾燥或減壓乾燥等予以乾燥後，添加500μL之MTBSTFA+1%TBDMSC1(Sigma Aldrich公司製、375934)及500μL之無水DMF，於80℃加熱2小時，離心分離(14,000rpm、5分鐘)後，將上清以GC-MS(Agilent 7890A及5975c)分析。測定預想衍生化之麩胺酸之第三丁基有一處脫離之結構之分子量432、433、434之質譜峰部之面積。又，據認為：分子量432為所有原子都是由最豐富的同位體構成的結構，分子量433及434為更包含1個及2個中子的結構。分子量為432、433、434之峰部各令為[M+0]、[M+1]及[M+2]，將[M+1]/[M+0]之值作為x軸、[M+2]/[M+0]之值 作為y軸，分析結果如圖4。
於通常之麩胺酸發酵，NaH13CO3來源的13C由於係經由草醯乙酸並僅導入於麩胺酸之1位或5位之碳中任一者，所以成為記載之基準線上之值。又，基準線係依下式求取。
x=(x0-x0×α+α)/(1-α)
y=(y0-y0×α+x0×α)/(1-α)
α表示麩胺酸中之CO2來源碳(1位或5位)之13C同位體之比例{≒13C/(13C+12C)}。x及y表示基準線上之任意點的座標。x0、y0，係假定麩胺酸中之CO2來源的碳(麩胺酸之1位或5位中任一者之碳)在同位體比中之12C之比例為100%且其他原子與天然同位體比為相等時之x及y之值(亦即，α=0時之x及y之值)，各設定為0.358527、0.16822084314。若求解上式，基準線如下式所示。
y=x0‧x+y0-x0 2
原本之麩胺酸生產路徑中，NaH13CO3來源的13C係由磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸羧化酶(pyc)、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(pck)此類之碳酸固定酵素所固定，並經由草醯乙酸而僅導入於麩胺酸之1位或5位之碳中之一者。在此，依ppc所納入之12CO2與13CO2之比例，[M+1]或[M+2]之值有所改變，但當導入之部位為一處時，會一直成為基準線上之值。另一方面，若推想之碳酸固定路徑有作用的情形，由於13C會經由草醯乙酸與乙醯輔酶A兩者，故可能會同時導入麩胺酸之碳之1位與5位，其結果[M+2]之值會相對上升，應該會成為比起基準線更為上部之值。
依圖4，PA/mtk_mcl_gcl株、PA△aceB/mtk_mcl_gcl株、PA△fumAC/mtk_mcl_gcl株中，明顯為比起基準線更上部之值。亦即，據認為：經固定的CO2會經由乙醯輔酶A而導入於麩胺酸。 另一方面，對照株(PA/vec)中，繪製於基準線上，未觀察到經由乙醯輔酶A之13C導入。又，僅有mtk+mcl之導入株(PA/mtk_mcl)，也未觀察到經由乙醯輔酶A之13C導入。據認為Pantoea ananatis由於不具有gcl，僅是賦予mtk與mcl，乙醛酸仍無去處，反應不會進行。因此，如圖1，顯示不僅導入mtk與mcl且連接gcl以後的路徑，能將CO2變換為乙醯輔酶A。
[實施例42]
<利用Pantoea株生產麩胺酸>
測定實施例41之培養液中之麩胺酸量及副產物之量。培養樣本中之麩胺酸之定量係使用安裝著NN-814(昭和電工公司)管柱的HPLC(Waters公司2695)與UV/Vis檢測器(Waters公司2489)。濾液中之葡萄糖、及其他產物之定量，係使用安裝著ULTRON PS-80H(信和化工公司)管柱之HPLC(Waters公司2695)與RI檢測器(Waters公司2414)。結果如表14及15。
[表15]
賦予有mtk+mcl+gcl之菌株(PA/mtk_mcl/gcl)，顯示比對照株(PA/vec)或賦予mtk+mcl之菌株(PA/mtk_mcl)為高之對糖產率。又，若破壞aceB基因或fumAC基因，對糖產率會更提高(PA△aceB/mtk_mcl/gcl、PA△fumAC/mtk_mcl/gcl)。
關於副產物量，若比較mtk+mcl+gcl導入株(PA/mtk_mcl/gcl)與對照株(PA/vec)，意外地得知：琥珀酸與2,3-丁二醇(2,3-BDO)之量減少，且副產物之總量也減少。再者，若比較aceB基因已破壞之菌株(PA△aceB/mtk_mcl/gcl)與破壞前(PA/mtk_mcl/gcl)，意外地得知：琥珀酸及乙酸減少且副產物總量也大幅減少。fumAC基因破壞株(PA△fumAC/mtk_mcl/gcl)比起破壞前(PA/mtk_mcl/gcl)，琥珀酸量大幅減少，但是乙酸量增加，副產物總量也減少。當從培養液中回收麩胺酸時，若副產物之量少，能分外減輕精製負荷，故於工業利用時之有用性大。
又，上述副產物減低效果，於未保有RSFCPG之PA株也可見到同樣的效果。
[實施例43]
<質體pCASET之製作>
以pHSG298(Takara)作為模板，使用CGCCTCGAGTGACTCATACCAG GCCTG(序列號148)、及CGCCTCGAGGCAACACCTTCTTCACGAG(序列號149)之引子以PCR法放大，並將獲得之DNA片段以限制酶XhoI消 化，使用接合酶結合之後對於大腸桿菌DH5 α株勝任細胞(東洋紡(股)公司DNA-903)進行轉形，獲得於含有卡那黴素25μg/mL之LB瓊脂板生長之轉形體。從獲得之菌體將質體回收，將於pHSG298插入有XhoI之認識序列之質體命名為pHSG298-XhoI。
為了取得tac啟動子，以pKK223-3(Pharmacia)作為模板，使用ATCATCCAGCTGTCAGGCAGCCATCGGAAG(序列號150)、及ATCCCCGGG AATTCTGTT(序列號151)之引子以PCR法放大，將獲得之DNA片段以限制酶PvuII及SmaI消化，獲得約0.2kbp之編碼為tac啟動子之DNA片段。將獲得之DNA片段，與將質體pHSG298-XhoI以限制酶PvuII消化並經鹼性磷解酶處理之約2.4kbp之DNA片段予以混合，使用接合酶結合之後，對於大腸桿菌DH5 α株勝任細胞(東洋紡(股)公司DNA-903)進行轉形，獲得於含有卡那黴素25μg/mL之LB瓊脂板生長之轉形體。從獲得之菌體將質體回收，將pHSG298-XhoI之lac啟動子取代為tac啟動子，獲得tac啟動子的方向與原本的lac啟動子朝向相同方向的質體pHSGT1。
為了於獲得之pHSGT1之tac啟動子之下游連結pHSG298之多重選殖部位，將pHSG298以限制酶EcoRI及ClaI消化，獲得含有pHSG298之多重選殖部位之約1.0kbp之DNA片段。將獲得之DNA片段，與將質體pHSGT1以限制酶EcoRI及ClaI消化並經鹼性磷解酶處理之約1.7kbp之DNA片段予以混合，使用接合酶結合之後，對於大腸桿菌DH5 α株勝任細胞(東洋紡(股)公司DNA-903)進行轉形，獲得於含有卡那黴素25μg/mL之LB瓊脂板生長之轉形體。從獲得之菌體將質體回收，獲得於tac啟動子之下游連結有pHSG298之多重選殖部位之質體pHSGT2。
以DNA合成製作含有從Corynebacterium casei JCM 12072單離之pCASE1(Appl Microbiol Biotechnol(2009)81：1107-1115)之複製起點、repA及repB之DNA片段(序列號152)。序列如以下所示。
將所製作之DNA片段以限制酶XhoI消化而獲得之DNA片段與將質體pHSGT2以限制酶XhoI消化再經鹼性磷解酶處理之DNA片段予以混合，使用接合酶結合之後，對於大腸桿菌DH5 α株勝任細胞(東洋紡(股)公司DNA-903)進行轉形，獲得於含有卡那黴素25μg/mL之LB瓊脂板生長之轉形體。從獲得之菌體將質體回收，將於pHSGT2之XhoI認識部位插入了含有pCASE1之複製起點、repA及repB之DNA片段的質體命名為pCASET。回收的pCASET，pCASE1 來源repA的方向與tac啟動子為相反方向。
[實施例44]
<質體pCASEL之建構>
將實施例43所合成之含有pCASE1之複製起點、repA及repB之DNA片段(序列號152)以限制酶XhoI消化而獲得之DNA片段、與實施例43製作之質體pHSG298-XhoI以限制酶XhoI消化再經鹼性磷解酶處理之DNA片段予以混合，使用接合酶結合之後，對於大腸桿菌DH5 α轉形，獲得於含有卡那黴素25μg/mL之LB瓊脂板生長之轉形體。從獲得之菌體將質體回收，將於pHSG298-XhoI之XhoI認識部位插入了含有pCASE1之複製起點、repA及repB之DNA片段的質體命名為pCASEL。回收的pCASEL，pCASE1來源repA的方向與pHSG298來源lac啟動子為相反方向。
[實施例45]
<Methylococcus capsulatus來源mtk及mcl表現質體之建構>
以pMWGKC_mcl(Mc)_mtk(Mc)作為模板，以GGAATTCACAAAAAG GATAAAACAATGGCTGTCAAGAACCGTCTAC(序列號153)及CGAATTCTCA GAATCTGATTCCGTGTTCCTG(序列號154)之引子對實施PCR，獲得含有Methylococcus之mcl-mtk之DNA片段。序列號153及154之引子在5’末端側具有EcoRI認識部位。將該DNA片段及質體pCASET以EcoRI切斷，將pCASET脫磷酸化後，將兩者予以連結。同樣，將此DNA片段與質體pCASEL連結。利用DNA定序，確認mcl-mtk片段已插入適於利用質體之啟動子表現的方向，將該等質體命名為pCASET_mcl(Mc)_mtk(Mc)及pCASEL_mcl(Mc)_mtk(Mc)。
[實施例46]
<Granulibacter bethesdensis、Nitrosomonas europaea、 Hyphomicrobium methylovorum來源mtk表現質體之建構>
分別使用pMWGKC_mcl(Hme)_mtk(Gb)、pMWGKC_mcl(Hme)_mtk(Hme)_mcl、pMWGKC_mcl(Ne)_mtk(Ne)，將dam - /dcm - Competent E.coli(New England Biolabs公司)轉形，於含有30μg/mL氯黴素之LB培養基使增殖並回收質體，以限制酶EcoRI及XbaI切斷，回收含有mtk與mcl之約3kb之DNA片段。然後將質體pCASEL以限制酶EcoRI及XbaI切斷，與含有mtk與mcl之DNA片段連結，製作用以使Corynebacterium表現mtk及mcl之載體pCASEL_mcl(Hme)_mtk(Gb)、pCASEL_mcl(Hme)_mtk(Hme)、pCASEL_mcl(Ne)_mtk(Ne)。各保有Granulibacter bethesdensis、Nitrosomonas europaea、Hyphomicrobium methylovorum之mtk。
至此為止製作之Corynebacterium用質體如表16。
[實施例47]
<Corynebacterium之mtk之活性測定>
使用實施例45及實施例46製作之質體，將Corynebacterium glutamicumATCC13012株以電穿孔法轉形，塗佈於含有15μg/mg之卡那黴素之LB瓊脂培養基，於30℃培養1~4日。將生長的菌株於含有15μg/mg之卡那黴素之LB液體培養基於30℃培養1~4日，以離心分離回收菌體。將菌體懸浮於MOPS-K緩衝液pH7.7，使用0.1mm玻璃珠，以Beads Shocker(安井器械公司、MB5000) 破碎。以離心上清(13,000rpm、2min)作為變異體粗酵素萃取液，以後與實施例16以同樣方法進行菌體之活性測定。結果如表17所示。
當以pCASEL作為表現載體之情形，表現Methylococcus capsulatus來源mtk之質體顯示最高值。又，與表9比較之情形，高活性mtk與低活性mtk之順序的相關性大約相同。然後，評價導入於pCASEL與pCASET之Methylococcus capsulatus來源mtk之活性，結果為導入於pCASET之菌株顯示較高活性。
[實施例48]
<Corynebacterium用mtk、mcl、gcl、及glxR表現質體之建構>
從NBRC(獨立行政法人製品評價技術基盤機構生物技術本部生物遺傳資源部門)買入Rhodococcus jostiiNBRC16295。以NBRC之培養基號802培養NBRC16295，使用DNeasy Blood &Tissue Kit(QIAGEN(股)公司)獲得基因體DNA。以該基因體DNA作為模板，以CGAGCTCAAGCTTACAAAAAGGATAAAACAATGAGCACCATTGCATTCATC GG(序列號155)CGGGATCCCTAGTCCAGCAGCATGAGAG(序列號156)作為引子實施PCR，獲得Rhodococcus之glxR-gcl片段(序列號157)。將以SacI與BamHI切斷獲得之片段，與將pCASET_mcl(Mc)_mtk(Mc)以SacI與BamHI切斷而得之片段予以連結。將該質體命 名為pCASET_mcl(Mc)_mtk(Mc)_glxR(Rj)_gcl(Rj)。
[實施例49]
<Corynebacterium glutamicum中之麩胺酸生產及13C導入評價株之建構>
使用Corynebacterium glutamicumDSM1412(以下有時稱為「CG株」。)實施例43、45、及48構建之質體，以電穿孔法進行轉形。將各自的菌株塗佈於含有15μg/mL卡那黴素之LB瓊脂培養基，以生長的菌株作為評價株。此等菌株整理於表18。
[實施例50]
<利用Corynebacterium株將13C標定之CO2導入麩胺酸之驗證>
將成為對象之微生物株利用含有15μg/mL卡那黴素之2mL之LB液體培養基於30℃、280rpm的條件培養至可觀察到充分生長為止。然後於100mL之附葉之三角燒瓶中，調製含有20g/L之葡萄糖、及15μg/mL卡那黴素之10ml之Corynebacterium用最小培養基{30g/L(NH4)2SO4、3g/L Na2HPO4、6g/L KH2PO4、2g/L NaCl、84mg/L CaCl2、3.9mg/L FeCl3、0.9mg/L ZnSO4‧7H2O、0.3mg/L CuCl2‧H2O、5.56mg/L MnSO4‧5H2O、0.1mg/L(NH4)6Mo7O24‧4H2O、0.3mg/L Na2B4O7‧10H2O、0.4g/L MgSO4‧7H2O、40mg/L FeSO4‧7H2O、500μg/L Vitamine Bl‧HCl、0.1g/L EDTA、10μg/L Biotin}，添加前述LB液體培養基所製得之培養液1mL，培養1日~4日至可觀察到充分增殖為止，作為前培養液。從前培養液以離心分離(5000rpm、5 分鐘)回收菌體。
準備含有100mM之碳酸氫鈉(13C標定)、20g/L之葡萄糖、1.5%(w/v)之Tween60(Sigma Aldrich公司製)、及15μg/mL卡那黴素之2mL之Corynebacterium用最小培養基(惟，Biotin最終濃度改為2μg/L)，調整並添加前培養菌體使OD成為1~5之範圍內。蓋緊後於30℃、150rpm培養1~2日。定期取樣培養液，進行離心分離(MILLIPORE公司12,000rpm、3分鐘)去除菌體，將上清以親水性PTFE濾膜(MILLIPORE公司、MSGVN2B50)過濾，作為培養樣本。培養樣本之13C分析與實施例41以同樣方法實施。亦即，GC-MS分析時之MW432、433、434之峰部面積各令為[M]、[M+1]、[M+2]，橫軸代表[M+1]/[M]、縱軸代表[M+2]/[M]。基準線依實施例41記載之方法計算。
依圖5，由於mtk+mcl+gcl+glxR導入株(CG/mtk_mcl_gcl_glxR)顯示比基準線更為上方之值，因此據認為固定的CO2係經由乙醯輔酶A導入了麩胺酸。另一方面，對照株(CG/vec)，大致繪製在基準線上，未觀察到有經由乙醯輔酶A之13C導入。又，導入有mtk+mcl之菌株(CG/mtk_mcl)，亦為大致繪製在基準線上，未觀察到有經由乙醯輔酶A之13C導入。Corynebacterium glutamicum由於沒有gcl、glxR，故與Pantoea ananatis同樣，據認為僅是mtk與mcl，反應不會進行。
[實施例51]
<利用Corynebacterium株生產麩胺酸之試驗>
測定實施例50之培養液中之麩胺酸量及副產物之量。將培養液中之麩胺酸、葡萄糖、其他有機化合物，與實施例42以同樣方法分析。結果如表19及表20所示。
[表19]
賦予有mtk+mcl+gcl+glxR之株(CG/mtk_mcl_gcl_glxR)，顯示比起對照株(CG/vec)或僅導入mtk+mcl之導入株(CG/mtk_mcl)為較高之對糖產率。
關於副產物量，若比較mtk+mcl+gcl+glxR導入株(CG/mtk_mcl_gcl_glxR)株與對照株(CG/vec)，意外地得知：乳酸主要減少，副產物之總量也減少。僅導入mtk+mcl之導入株(CG/mtk_mcl)，關於副產物量大致與對照株為相同。
[實施例52]
<利用對於Methylobacterium extorquens來源蘋果酸硫激酶基因導入變異所致之活性提高>
以pMWGKC_mtk(Mex)_mcl作為模板，以表21記載之序列號之引子對進行PCR，以限制酶DpnI處理將模板分解之後，將大腸桿菌DH5 α株勝任細胞予以轉形，獲得於含有氯黴素10μg/mL之LB瓊脂板生長之轉形體。將獲得之菌落於含有氯黴素10μg/mL之LB液體培養基於30℃培養一晚。從培養液之一部分回收質體，確認DNA序列，以正確導入有目的變異者作為變異體樣本。將該 樣本於含有氯黴素10μg/mL之LB液體培養基進行前培養後，接種於含有氯黴素10μg/mL之LB液體培養基3mL，於30℃、280rpm培養一晚。其中，將2mL以10,000rpm離心5分鐘，去除上清之後，添加2mL之10mM磷酸緩衝液(pH7.0)並洗滌。再實施一次該洗滌操作後，懸浮於500μL之pH7之10mM磷酸緩衝液(pH7.0)。將懸浮液使用0.1mm玻璃珠以Beads shocker(安井器械公司、MB5000)破碎。將離心上清(13,000rpm、2min)作為變異體粗酵素萃取液。
針對各變異體粗酵素萃取液，依[實施例16]之方法評價活性。結果如表21所示。其結果，mtkB之Q244E變異、及mtkB之L144I變異比起變異導入前可觀察到活性值提高。又，當於mtkB之Q244位導入其他胺基酸，於A、L、I、M、N、Y、K、R觀察到活性提高。又，當於mtkB之L144位導入變異，觀察到由於N、D、K、R、H、Q、P之變異使活性提高。
如上所述，依照本發明可將CO2變換為乙醯輔酶A。又，依照本發明，能以良好效率生產來自於乙醯輔酶A之物質，例如異丙醇、丙酮、及麩胺酸。
2011年7月29日提申之日本申請號第2011-167808號之揭示其全體納於本說明書中作為參照。
本說明書記載之所有文獻、專利申請案、及技術規格，將各文獻、專利申請案、及技術規格以參照納入與具體且分別記載之情形以同程度納入於本說明書中作為參照。
圖1顯示說明本發明之二氧化碳固定路徑之概要之路徑圖。
圖2A及圖2B顯示各種mtkB之序列相同性之圖。
圖3A及圖3B顯示各種mtkA之序列相同性之圖。
圖4顯示實施例41之將13C導入各種泛菌屬細菌生產之麩胺酸之形態。
圖5顯示實施例50之將13C導入各種棒桿菌屬細菌生產之麩胺酸之形態。
<110> Mitsui Chemicals,Inc.
<120> Microorganism containing carbon dioxide fixation pathway
<130> P0011000634
<150> JP2011-167808
<151> 2011-07-29
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 104
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<212> DNA
<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
<223> primer
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<212> PRT
<213> Granulibacter bethesdensis
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<212> PRT
<213> Granulibacter bethesdensis
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<213> Hyphomicrobium denitrificans
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<212> PRT
<213> Hyphomicrobium denitrificans
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<212> PRT
<213> Hyphomicrobium denitrificans
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<213> Nitrosomonas europaea
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<213> Nitrosomonas europaea
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<213> Nitrosomonas europaea
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<213> Methylococcus capsulatus
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<213> Methylococcus capsulatus
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<213> Methylococcus capsulatus
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<213> Uncultured gamma proteobacterium
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<212> PRT
<213> Uncultured gamma proteobacterium
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<223> primer
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<211> 53
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
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<211> 27
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
<223> primer
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<213> Artificial
<220>
<223> primer
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
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<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 151
<210> 152
<211> 1352
<212> DNA
<213> Corynebacterium casei
<400> 152
<210> 153
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 153
<210> 154
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 154
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<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 155
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
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<212> DNA
<213> Rhodococcus jostii
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 158
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 159
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 160
<210> 161
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 161
<210> 162
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 162
<210> 163
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 163
<210> 164
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 164
<210> 165
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 165
<210> 166
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 166
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 167
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 168
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 169
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 170
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 171
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 172
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 173
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 174
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 175
<210> 176
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 176
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 177
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 178
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 180
<210> 181
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 181
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 182
<210> 183
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 183
<210> 184
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 184
<210> 185
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 185
<210> 186
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 186
<210> 187
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 187
<210> 188
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 188
<210> 189
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 189
<210> 190
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 190
<210> 191
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 191

Claims (16)

  1. 一種生產乙醯輔酶A之微生物，具有乙醯輔酶A生產循環，其係對於下列(a)、(b)、(c)、(d)及(e)中之任一者均不具有的微生物，(a)、(b)、(c)及(d)中之任一者均不賦予或即使賦予了也不發揮其機能，藉由賦予選自於由蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶、2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶、及羥基丙酮酸還原酶構成之群組中之至少1種之酵素活性而得；(a)具有從丙二醯基輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應的碳酸固定循環、(b)具有從乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應之碳酸固定循環、(c)具有從巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯基輔酶A或戊烯二醯基(glutoconyl)輔酶A之酵素反應之碳酸固定循環、(d)具有從CO2至甲酸之酵素反應之碳酸固定循環、以及(e)選自於由蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶構成之群組中之至少1種。
  2. 如申請專利範圍第1項之生產乙醯輔酶A之微生物，其係具有乙醯輔酶A生產循環，該乙醯輔酶A生產循環係磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸經由草醯乙酸，再者，藉由蘋果酸硫激酶、蘋果醯輔酶A裂解酶、乙醛酸醛連接酶獲得之2-羥基-3-側氧基丙酸進一步經由2-磷酸甘油酸而再度變換為磷酸烯醇丙酮酸。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之生產乙醯輔酶A之微生物，其係具有由以下構成之乙醯輔酶A生產循環：(f)選自於由丙酮酸激酶及丙酮酸羧化酶、或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、或磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶構成之群組中之至少一種；(g)蘋果酸去氫酶；(h)蘋果酸硫激酶；(i)蘋果醯輔酶A裂解酶；(j)乙醛酸醛連接酶；(k)選自於由2-羥基-3-側氧基丙酸還原酶、或羥基丙酮酸異 構酶及羥基丙酮酸還原酶構成之群組中之至少一種；(1)選自於由甘油酸2-激酶、或磷酸甘油酸變位酶及甘油酸3-激酶構成之群組中之至少一種；及(m)烯醇酶。
  4. 如申請專利範圍第1或2項之生產乙醯輔酶A之微生物，其中，該微生物係屬於腸內細菌科之微生物或屬於棒型細菌之微生物。
  5. 如申請專利範圍第1或2項之生產乙醯輔酶A之微生物，其中，該微生物係埃希氏菌屬細菌或泛菌屬細菌的屬於腸內細菌科之微生物、或係棒桿菌屬細菌的屬於棒型細菌之微生物。
  6. 如申請專利範圍第1或2項之生產乙醯輔酶A之微生物，其中，該微生物為埃希氏菌屬細菌且埃希氏菌屬細菌具有之乳酸去氫酶之活性係失活或減活。
  7. 如申請專利範圍第1或2項之生產乙醯輔酶A之微生物，其中，該微生物為埃希氏菌屬細菌，且埃希氏菌屬細菌具有之選自於由異檸檬酸裂解酶及蘋果酸合酶構成之群組中之至少1種酵素之活性係失活或減活。
  8. 如申請專利範圍第1或2項之生產乙醯輔酶A之微生物，其中，該微生物係埃希氏菌屬細菌且已對於埃希氏菌屬細菌賦予或強化硫解酶活性、輔酶A轉移酶活性及乙醯乙酸去羧酶活性。
  9. 如申請專利範圍第1或2項之生產乙醯輔酶A之微生物，其中，該微生物係埃希氏菌屬細菌且已對於埃希氏菌屬細菌賦予或強化硫解酶活性、輔酶A轉移酶活性、乙醯乙酸去羧酶活性及異丙醇去氫酶活性。
  10. 如申請專利範圍第1或2項之生產乙醯輔酶A之微生物，其中，該微生物為泛菌屬細菌，且泛菌屬細菌具有之富馬酸水合酶A及富馬酸水合酶C之活性係失活或減活。
  11. 如申請專利範圍第1或2項之生產乙醯輔酶A之微生物，其中，該微生物為泛菌屬細菌，且泛菌屬細菌具有之蘋果酸合酶之活性係失活或減活。
  12. 如申請專利範圍第1或2項之生產乙醯輔酶A之微生物，其中，該蘋果酸硫激酶，係使用相當於Methylobacterium extorquens來源之mtkB之144號胺基酸的胺基酸為異白胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、麩醯胺酸或脯胺酸，及/或244號胺基酸係使用麩胺酸、丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、天冬醯胺酸、酪胺酸、離胺酸或精胺酸的蘋果酸硫激酶。
  13. 一種乙醯輔酶A生產方法，係包含使用如申請專利範圍第1至12項中任一項之生產乙醯輔酶A之微生物從碳源材料生產乙醯輔酶A。
  14. 一種丙酮生產方法，係包含使用如申請專利範圍第8、9或12項記載之生產乙醯輔酶A之微生物從碳源材料生產丙酮。
  15. 一種異丙醇生產方法，係包含使用如申請專利範圍第9或12項記載之生產乙醯輔酶A之微生物從碳源材料生產異丙醇。
  16. 一種麩胺酸生產方法，係包含使用如申請專利範圍第5、10、11或12項記載之生產乙醯輔酶A之微生物從碳源材料生產麩胺酸。
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