CN105518148A - 具有逆向乙醛酸支路的重组植物和微生物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了表达或过表达催化四碳代谢物(苹果酸)向乙酰辅酶A转化的酶的微生物和植物。还提供了产生这样的生物体和植物的方法以及使用这样的生物体和植物合成生物质、生物燃料、油、化学品以及生物化学品的方法。

Description

具有逆向乙醛酸支路的重组植物和微生物
关于联邦政府资助的研究的声明
本发明是在政府支持下根据由美国能源部(U.S.DepartmentofEnergy)授予的基金号DE-AR0000085和DE-AR0000201作出的。政府拥有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年6月29日提交的美国临时申请序列号61/841,310的优先权，该美国临时申请的公开内容以引用的方式整体并入本文。
技术领域
提供了代谢修饰的微生物和植物以及产生这样的生物体和植物的方法。还提供了通过使合适的底物与本公开的代谢修饰的微生物或植物以及酶制剂接触来生产化学品的方法。
背景技术
乙酰辅酶A是细胞生长以及多种细胞成分和产物的生物合成这两者的中心代谢关键，所述细胞成分和产物包括脂肪酸、氨基酸、类异戊二烯、以及醇。通常，恩布顿-迈耶霍夫-帕纳斯(Embden-Meyerhof-Parnas，EMP)途径、恩特纳-杜德洛夫(Entner-Doudoroff，ED)途径以及它们的变化形式用于经由丙酮酸的氧化脱羧由糖产生乙酰辅酶A。
大部分的中心代谢途径，如糖酵解、脂肪酸合成、以及TCA循环具有沿逆向进行的补充途径以允许对资源的灵活储存和利用。然而，允许由乙酰辅酶A合成四碳TCA循环中间产物的乙醛酸支路迄今为止尚未被发现是可逆的。因此，葡萄糖在异养生物中仅可以经由三碳分子丙酮酸的脱羧而被转化成乙酰辅酶A。
在过去的几十年内，植物的遗传修饰已经与常规的育种计划组合而使得农业产量有很大的提高。可以针对一种或多种农业性状，例如通过编码酶的序列(例如提供除草剂抗性的酶)的表达对遗传修饰的植物进行选择。对涉及植物生长或植物产量的基因进行的遗传操作可以使得能够提高有价值的经济作物的产量，从而产生农业效益和诸如生物燃料之类的替代能源的开发。
植物生物质含量最近由于范围广泛的商业应用而变成一个密集的研究领域并且植物生物质直接与光合效率相关。光合速率的显著提高不仅可以在提高植物生物质方面起至关重要的作用，而且它还可以为每个人带来健康的生活方式，这是因为健康的植物可以更好的方式满足我们的营养需求。对具有改良的或提高的光合速率的植物的开发还将在生物燃料和动物饲料的生产方面具有显著的益处，并且可以潜在地具有广泛的其它有益的应用。然而，对植物进行遗传修饰以通过改良光合机制来实现这些目标还没有被实现。
提高植物中的光合作用的一个主要的绊脚石是Rubisco，即可以使用O2和CO2这两者作为底物的酶。由于高的加氧酶活性，因此植物通常表现不佳并且从未达到最佳的生产力水平。这些年来，植物科学研究人员已经在各种水平上尝试提高光合效率，但是没有人已经尝试或证实置换现有的光合系统。
发明内容
本公开提供了一种重组微生物或植物，所述重组微生物或植物包含使用包含具有苹果酸硫激酶(MTK)活性、苹果酰辅酶A裂解酶(MCL)活性以及异柠檬酸裂解酶(ICL)活性的酶的途径由C4化合物合成乙酰辅酶A和异柠檬酸的代谢途径。在一个实施方案中，所述微生物是原核生物或真核生物。在另一个实施方案中，所述微生物是酵母。在又另一个实施方案中，所述微生物是原核生物。在另一个实施方案中，所述微生物衍生自大肠杆菌微生物。在前述实施方案中的任一个的又另一个实施方案中，所述生物体被工程化以表达苹果酸硫激酶。在另一个实施方案中，所述苹果酸硫激酶是从荚膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus)克隆的。在又另一个实施方案中，苹果酸硫激酶包含来自荚膜甲基球菌的sucC-2和sucD-2的异二聚体。在又另一个实施方案中，所述苹果酸硫激酶包含与SEQIDNO:2和4具有至少40％至100％同一性的序列并且将苹果酸转化成苹果酰辅酶A。在另一个实施方案中，重组植物可以包含编码苹果酸硫激酶(mtkA)的多核苷酸，与SEQIDNO:28具有40％至100％同一性的序列。所述多核苷酸可以包含具有如SEQIDNO:27中所示的序列，与35S启动子或其它合适的植物启动子可操作地连接。在另一个实施方案中，重组植物可以包含编码苹果酸硫激酶(mtkB)的多核苷酸，与SEQIDNO:30具有40％至100％同一性的序列。所述多核苷酸可以包含具有SEQIDNO:29中所示的序列，与35S启动子或其它合适的植物启动子可操作地连接。在前述实施方案中的任一个的另一个实施方案中，所述重组微生物或重组植物被工程化以表达苹果酰辅酶A裂解酶。在另一个实施方案中，所述苹果酰辅酶A裂解酶是从类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)克隆的。在又另一个实施方案中，所述苹果酰辅酶A裂解酶包含来自类球红细菌的mcl1。在再又另一个实施方案中，所述苹果酰辅酶A裂解酶包含与SEQIDNO:8具有至少40％至100％同一性的序列并且将苹果酰辅酶A转化成乙醛酸。在前述实施方案中的任一个的另一个实施方案中，所述重组微生物或重组植物被工程化以表达或过表达异柠檬酸裂解酶。在另一个实施方案中，所述异柠檬酸裂解酶是从大肠杆菌(E.coli)克隆的。在又另一个实施方案中，所述异柠檬酸裂解酶包含来自大肠杆菌的aceA。在又另一个实施方案中，所述异柠檬酸裂解酶包含与SEQIDNO:10具有至少40％至100％同一性的序列并且将乙醛酸和丁二酸转化成异柠檬酸。在前述实施方案中的任一个的另外的实施方案中，所述微生物或植物表达或过表达苹果酸脱氢酶。在又另一个实施方案中，前述实施方案中的任一个的重组微生物或重组植物被工程化以异源表达下列酶中的一种或多种：
(a)苹果酸硫激酶；
(b)苹果酰辅酶A裂解酶；以及
(c)异柠檬酸裂解酶。
在另一个实施方案中，所述微生物或植物被进一步工程化以表达或过表达苹果酸脱氢酶。在另一个实施方案中，所述微生物或植物被进一步工程化以表达或过表达顺乌头酸酶。在又另一个实施方案中，所述微生物或植物被进一步工程化以表达或过表达ATP柠檬酸裂解酶。在另一个实施方案中，所述微生物或植物进一步包含选自由以下各项组成的组的一种或多种基因：atoB、hbd、crt、ter、以及adhE2，并且其中所述微生物或植物产生1-丁醇。在另一个实施方案中，所述重组微生物或重组植物包含前述途径中的任一种并且进一步包含附图中所示的一种或多种基因用于产生乙醇、脂肪酸以及类异戊二烯。在一个实施方案中，所述微生物或植物包含如前述实施方案中的任一个中所阐述的由C4底物产生乙酰辅酶A的途径联同CO2固定途径。在另一个实施方案中，前述实施方案中的任一个的重组微生物或重组植物进一步包含选自由以下各项组成的组的一处或多处基因敲除：Δicd、ΔgltA、ΔadhE、以及Δack。
本公开提供了一种重组微生物或重组植物，所述重组微生物或重组植物使用图1的rGS途径由C4底物/代谢物产生乙酰辅酶A，其中所述途径被进一步延伸以使用图12a-f中的一个或组合中所示的途径利用乙酰辅酶A或丙酮酸产生醇、脂肪酸、类异戊二烯等。
本公开还提供了一种产生所期望的代谢物的方法，所述方法包括使用合适的底物培养前述实施方案中的重组微生物或重组植物中的任一种以产生所述代谢物。所述方法进一步包括分离所述代谢物。
本公开还提供了一种包含逆向乙醛酸支路(rGS)途径的转基因植物或植物部分。所述rGS途径包含顺乌头酸酶、NADP-苹果酸脱氢酶、反丁烯二酸酶、反丁烯二酸还原酶、苹果酸硫激酶、苹果酰辅酶A、异柠檬酸裂解酶、ATP-柠檬酸裂解酶、丙酮酸氧化还原酶、以及丙酮酸羧化酶，其中所述植物与野生型植物相比表现出提高的植物生物质。在一些实施方案中，所述植物部分是细胞、根、叶、花粉囊、花、种子、秆或叶柄。
本公开还提供了一种提高光合效率的方法，所述方法是通过利用更少的ATP分子以及提高光合率而实现的。在一个实施方案中，将rGS途径引入到sbpase(景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶)突变体中会由于植物中提高的CO2固定而使得植物生长更好并且达到更大的植物高度。
本公开还提供了转基因植物，所述转基因植物与野生型植物或亲本植物相比包含增加的油含量。本公开还提供了一种改良油料作物或生物燃料作物的方法，所述方法包括使rGS基因/途径在植物中表达，其中在与缺乏rGS基因的表达的植物相比时，所述植物包含增加的乙酰辅酶A或增加的乙酰辅酶A通量，以及增加的脂肪酸含量和组成，并且进一步包含有益的性状。在一个实施方案中，本公开提供了一种种子，所述种子是由这样的植物或这样的植物的含有DNA的植物部分产生的。在另一个实施方案中，这样的植物部分被进一步定义为细胞、分生组织、根、叶、茎节、雌蕊、花粉囊、花、种子、胚芽、秆或叶柄。
本公开还提供了一种产生植物生物质的方法，所述方法包括：(a)获得表现出rGS途径的表达的植物；(b)在植物生长条件下使所述植物生长以由所述植物产生植物组织；以及(c)由所述植物组织制备生物质。在一个实施方案中，所述制备生物质包括收获所述植物组织。在另一个实施方案中，这样的方法进一步包括使用所述生物质进行生物燃料生产。
本公开还提供了一种制造商品的方法，所述方法包括：(a)获得表现出rGS途径的表达的植物，其中在与缺乏所述rGS途径的表达的植物相比时，所述植物的糖含量增加；(b)在植物生长条件下使所述植物生长以由所述植物产生植物组织；以及(c)由所述植物组织制备商品。在一个实施方案中，制备所述商品包括收获所述植物组织。在另一个实施方案中，所述商品选自由以下各项组成的组：植物油、乙醇、丁醇、生物柴油、生物气体、碳纤维、动物饲料、脂肪酸、类异戊二烯以及可发酵的生物燃料原料。
本公开提供了一种重组植物，所述重组植物与野生型植物或亲本植物相比具有提高的CO2利用率，所述重组植物被工程化以表达具有选自由以下各项组成的组的活性的一种或多种酶：苹果酸硫激酶活性、苹果酰辅酶A裂解酶活性以及丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶活性。在一个实施方案中，所述植物与野生型植物或亲本植物相比表现出增加的生物质。在另一个实施方案中，所述植物具有突变的sbpase基因。在又另一个实施方案中，所述植物包含降低的RuBisco表达或活性。在前述实施方案中的任一个的另一个实施方案中，所述植物是用于生物燃料、谷物或草料(forage)的作物植物。在前述实施方案中的任一个的另一个实施方案中，所述植物是拟南芥(Arabidopsis)、坎诺拉(canola)或亚麻荠(camelina)作物植物。在前述实施方案中的任一个的另一个实施方案中，所述植物是单子叶植物。在前述实施方案中的任一个的另一个实施方案中，所述植物是双子叶植物。在前述实施方案中的任一个的另一个实施方案中，所述重组植物与野生型植物或亲本植物相比包含升高的乙酰辅酶A含量或合成通量。在前述实施方案中的任一个的另一个实施方案中，所述重组植物与野生型植物或亲本植物相比包含升高的油含量。在前述实施方案中的任一个的另一个实施方案中，所述植物表达或过表达选自由以下各项组成的组的酶：顺乌头酸酶、NADP-苹果酸脱氢酶、反丁烯二酸酶、反丁烯二酸还原酶、ATP-柠檬酸裂解酶、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、苹果酸硫激酶、苹果酰辅酶A裂解酶、异柠檬酸裂解酶、丙酮酸羧化酶以及其任何组合。在前述实施方案中的任一个的另一个实施方案中，所述植物包含acn、mdh、fumc、frd、acl、nifJ、mtkA、mtkB、mcl、icl、以及pyc的基因型。
本公开还提供了一种从本公开的重组植物获得的植物部分。在一个实施方案中，所述植物部分是原生质体、细胞、分生组织、根、雌蕊、花粉囊、花、种子、胚芽、秆或叶柄。
本公开还提供了一种由本公开的重组植物生产的产品。
本公开还提供了一种由所述植物部分生产的产品。
本公开提供了一种用于在植物中提高碳固定和/或提高生物质产生的方法，所述方法包括：向植物、植物部分、和/或植物细胞中引入编码具有以下各项的酶活性的多肽的一种或多种异源性多核苷酸：顺乌头酸酶、NADP-苹果酸脱氢酶、反丁烯二酸酶、反丁烯二酸还原酶、ATP-柠檬酸裂解酶、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、苹果酸硫激酶、苹果酰辅酶A裂解酶、异柠檬酸裂解酶、以及丙酮酸羧化酶，以产生表达所述一种或多种异源性多核苷酸的稳定转化的植物、植物部分和/或植物细胞。在一个实施方案中，所述一种或多种异源性多核苷酸被引入到所述植物、植物部分、和/或植物细胞的核和/或叶绿体中。在前述实施方案中的任一个的另一个实施方案中，所述多肽中的一种或多种与使所述多肽靶向叶绿体的氨基酸序列可操作地连接。
本公开还提供了一种通过上文所述的方法所产生的稳定转化的植物、植物部分或植物细胞。
本公开还提供了一种稳定转化的植物、植物部分或植物细胞，所述植物、植物部分或植物细胞包含编码具有以下各项的酶活性的多肽的一种或多种异源性多核苷酸：顺乌头酸酶、NADP-苹果酸脱氢酶、反丁烯二酸酶、反丁烯二酸还原酶、ATP-柠檬酸裂解酶、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、苹果酸硫激酶、苹果酰辅酶A裂解酶、异柠檬酸裂解酶、以及丙酮酸羧化酶。
本公开还提供了本公开的稳定转化的植物的种子，所述种子在它的基因组中包含编码具有以下各项的酶活性的多肽的一种或多种异源性多核苷酸：顺乌头酸酶、NADP-苹果酸脱氢酶、反丁烯二酸酶、反丁烯二酸还原酶、ATP-柠檬酸裂解酶、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、苹果酸硫激酶、苹果酰辅酶A裂解酶、异柠檬酸裂解酶、以及丙酮酸羧化酶。
本公开还提供了一种由所述稳定转化的植物、植物部分或植物细胞生产的产品。
本公开还提供了一种由所述稳定转化的种子生产的产品。
在前述产品实施方案中的任一个中，所述产品可以是食品、饮料、动物饲料、纤维、油、药物和/或生物燃料。
本公开的一个或多个实施方案的细节阐述于附图和以下说明中。其它特征、目的以及优势根据所述说明和附图以及权利要求书将是显而易见的。
附图说明
被并入本说明书中并且构成本说明书的一部分的附图图示了本公开的一个或多个实施方案并且连同具体实施方式一起用来阐明本发明的原理和实现方式。
图1示出了在大肠杆菌中心代谢的背景下的乙醛酸循环。示出了如由Kornberg和Krebs所述的天然乙醛酸循环以及逆向乙醛酸循环。已知ACN和MDH是天然可逆的。MS和CS是不容易可逆的，但是ATP驱动的酶可以实现逆反应。CS＝柠檬酸合酶；ACN＝顺乌头酸酶；ICL＝异柠檬酸裂解酶；MS＝苹果酸合酶；MDH＝苹果酸脱氢酶；ACL＝ATP-柠檬酸裂解酶；MTK＝苹果酸硫激酶；MCL＝苹果酰辅酶A裂解酶。
图2示出了用于测试乙醛酸支路酶的可逆性的遗传学背景。使基因prpC和gltA缺失以构建用于测试乙醛酸支路在体内的可逆性的谷氨酸营养缺陷型菌株。黑线示出了引起谷氨酸生物合成的天然大肠杆菌代谢。‘X’表示基因敲除。该图中所描绘的水平途径示出了使用这一设计所测试的基因。空心方框箭头指示生长培养基中所供应的碳源。
图3A-B示出了天然乙醛酸支路酶的可逆性。(A)测试过表达天然MS和ICL基因的组合的Glu-菌株型在具有在每一个平板下方所示的添加剂的葡萄糖基本培养基上生长的能力。所测试的菌株表达苹果酸转运蛋白BsdctA和(1)无另外的基因；(2)EcaceA；(3)EcaceA+EcaceB；(4)EcaceA+EcglcB。在37℃孵育4天之后扫描图像。关于菌株的详细基因型，参见表1。(B)在体外测试纯化的AceA的酶活性。在这一偶联测定中以过量使用市售的异柠檬酸脱氢酶。
图4A-B示出了使用异源基因使乙醛酸支路逆转。(A)在体外使用来自表达McSucCD-2的大肠杆菌细胞的裂解物测试荚膜甲基球菌sucCD-2的MTK酶活性。在这一偶联测定中以过量使用纯化的类球红细菌Mcl1。(B)测试过表达异源MTK和MCL基因以及天然ICL的组合的Glu-菌株型在具有在每一个平板下方所示的添加剂的葡萄糖基本培养基上生长的能力。所测试的菌株表达苹果酸转运蛋白BsdctA和(5)类球红细菌mcl1、荚膜甲基球菌sucCD-2；(6)EcaceA、Rsmcl1、McsucCD-2；(7)EcaceA、Rsmcl1；(8)EcaceA、McsucCD-2。在37℃孵育4天之后扫描图像。关于菌株的详细基因型，参见表1。
图5示出了用于测试rGC基因产生草酰乙酸的能力的遗传学背景。这一示意图代表用于测试延伸的乙醛酸支路途径在体内的可逆性的天冬氨酸营养缺陷型选择菌株(Asp-)。示出了天然的大肠杆菌代谢。‘X’表示已经通过基因敲除干扰反应。还示出了逆转乙醛酸支路和补充天冬氨酸营养缺陷的成功策略，包括通过Acl进行的柠檬酸向草酰乙酸的转化、通过acnAB进行的柠檬酸向异柠檬酸的转化、通过aceA进行的乙醛酸和异柠檬酸的转化、异柠檬酸向丁二酸的转化、通过Mtk进行的苹果酸向苹果酰辅酶A的转化、以及通过Mcl进行的苹果酰辅酶A向乙醛酸的转化。应当指出的是，还针对由柠檬酸形成OAA单独地测试了gltA反应和citDEF反应(参见图6)。空心方框箭头指示生长培养基中所供应的碳源。
图6A-C示出了从柠檬酸到OAA的途径的活性。(A)在具有柠檬酸盐的葡萄糖基本培养基上培养表达来自肠道沙门氏菌(S.enterica)的柠檬酸转运蛋白citA的Asp-型式以测试三种OAA产生途径：(9)没有过表达，CL敲除；(10)EcgltA过表达，CL敲除；(11)没有过表达，天然表达CL；(12)微温绿硫细菌(C.tepidum)aclAB过表达，CL敲除。在37℃孵育2天之后对平板进行扫描。(B)在体外测试纯化的ACL的酶活性。在这一偶联测定中以过量使用市售的苹果酸脱氢酶。(C)异柠檬酸分支点的优化。在表达EcaceA的Asp-菌株中联合(菌株13-18，参见图表插图)测试icd缺失和EcacnA或EcacnB过表达的作用。在补充有乙醛酸盐和丁二酸盐的液体葡萄糖基本培养基中测试生长。
图7A-B示出了从苹果酸到OAA的途径。(A)优化的Asp-菌株在补充有葡萄糖和10mM的在每一个平板的下方所示的补充剂的基本培养基上的生长。除了表达苹果酸转运蛋白BsdctA之外，菌株(19)还表达McsucCD-2、Rsmcl1、EcaceA、以及CtaclAB。阴性对照菌株不过表达下列基因：(20)不过表达aclAB；(21)不过表达mcl1；(22)不过表达acnA和aceA。在37℃孵育7天之后对平板进行扫描。关于菌株的详细基因型，参见表1。(B)在补充有天冬氨酸盐(短虚线)；苹果酸盐和丁二酸盐(实线)；或没有补充剂(长虚线)的液体葡萄糖基本培养基中比较菌株(19)(三角形)和(21)(正方形)的生长速率。
图8A-C示出了枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)DctA转运蛋白在大肠杆菌Δppc突变体中允许吸收苹果酸。(A)没有补充剂；或(B)补充有20mM苹果酸；或(C)补充有20mM丁二酸的M9平板(2％葡萄糖、100μM的IPTG)。在37℃孵育1天之后进行扫描。所有的菌株是表达质粒(分别是ΔppcpEcDctA或ΔppcpBsDctA。在正文表1中，这些质粒分别被称为pSM13和pSM22)上的大肠杆菌或枯草芽孢杆菌dctA基因的大肠杆菌JW3928(Δppc)。Δppc菌株不能在具有葡萄糖的基本培养基上生长，这是因为它缺乏OAA的回补供应以补充TCA循环(A)。它可以在具有丁二酸补充剂的M9葡萄糖上生长，这是因为它能够特异性吸收这种二羧酸(C)。另一方面，在葡萄糖存在下苹果酸被极其不良地转运，如由在苹果酸补充剂存在下缓慢的生长所证实(B)。大肠杆菌苹果酸转运蛋白dctA的过表达对在这些条件下的苹果酸吸收没有帮助。然而，枯草芽孢杆菌dctA基因的过表达却允许Δppc突变体在补充有葡萄糖和苹果酸的M9上快速生长。
图9示出了对在大肠杆菌中表达的各种MTK同源蛋白的体外活性的生物勘探。x轴上的标记指的是基因所克隆自的生物体。Rpome：帕氏鲁杰氏菌(Ruegeriapomeroyi)；Cauri：橙色绿屈挠菌(Chloroflexusauriantacus)；Hmari：死海盐盒菌(Haloarculamarismortui)ATCC43049；Iloih：热液海源菌(Idiomarinaloihiensis)L2TR；Kpneu：克雷伯氏肺炎菌(Klebsiellapneumoniae)342；Mcaps：荚膜甲基球菌Bath菌株；Mflag：鞭毛甲基小杆菌(Methylobacillusflagellatus)KT；Psyri：丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonassyringaepv.syringae)；Saure：金黄色葡萄球菌金黄色亚种(Staphylococcusaureussubsp.aureus)USA300_TCH959；Sente：肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒血清型CT18菌株(Salmonellaentericasubsp.entericaserovarTyphistr.CT18)；Rspha：类球红细菌ATCC17025；Bsubt：枯草芽孢杆菌；Patla：大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonasatlantica)T6c；Cpsyc：冷红科尔韦尔氏菌(Colwelliapsychrerythraea)34H；Reutr：真氧产碱杆菌(Ralstoniaeutropha)；Ecoliwt：大肠杆菌K-12MG1655亚株；Ecolix/y/z/xy/xz/yz：大肠杆菌K-12亚株。针对改变对苹果酸的底物特异性测试了带有突变x和/或y和/或z的MG1655sucCD基因(参见图10)。
图10A-B示出了MtkA/sucC和MtkB/SucD序列的蛋白质比对。下方的深色条带指示活性位点周围的残基；浅色条带指示大肠杆菌SucCD蛋白质上所测试的突变。SucC中的G320A和V323N突变被称作突变“x”，SucD中的P125A和T158A分别被称作突变“y”和“z”。Me：扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)；Rp：帕氏鲁杰氏菌；Re：真氧产碱杆菌；Sa：肠道沙门氏菌；Ec：大肠杆菌。在Geneious软件(Biomatters公司；DrummondAJ,2011)上生成比对。(A)mtkA(Me)＝SEQIDNO:50；mtkA(Rp)＝SEQIDNO:52；sucC(Re)＝SEQIDNO:54；sucC(Cc)＝SEQIDNO:55；sucC(Ec)＝SEQIDNO:57。(B)mtkB(Me)＝SEQIDNO:59；mtkB(Rp)＝SEQIDNO:61；sucD(Re)＝SEQIDNO:63；sucD(Sa)＝SEQIDNO:65；sucD(Ec)＝SEQIDNO:67。
图11示出了在MtkAB同源基因克隆和诱变中所用的引物。粗体字指示与载体的重叠；小写字母指示定点诱变引物(SEQIDNO:68-106)中的错配。
图12A-D示出了可以从乙酰辅酶A的rGS产生中延伸的途径。(A)示出了本公开的rGS途径的延伸以包括碳固定(丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(丙酮酸+2氧化型铁氧还蛋白+辅酶A<＝>乙酰辅酶A+CO2+2还原型铁氧还蛋白+H+)，如来自大肠杆菌K-12菌株MG1655亚株的ydbK，蛋白质登录号：NP_415896.1，基因ID：946587或由1个、2个或4个亚基构成的同源基因；以及丙酮酸羧化酶(丙酮酸+碳酸氢盐+ATP<＝>草酰乙酸+ADP+磷酸+H+)，如来自枯草芽孢杆菌枯草亚种168菌株的pycA，蛋白质登录号：NP_389369.1，基因ID：935920或同源基因；或丙酮酸激酶(丙酮酸+ATP<＝>磷酸烯醇丙酮酸+ADP+H+)，如来自大肠杆菌K-12菌株MG1655亚株的pykF，蛋白质登录号：NP_416191.1，基因ID：946179或同源基因；以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(草酰乙酸+磷酸<＝>磷酸烯醇丙酮酸+碳酸氢盐)，如来自大肠杆菌K-12菌株MG1655亚株的ppc，蛋白质登录号：NP_418391.1，基因ID：948457或同源基因。(B)示出了乙醇的产生(乙醛脱氢酶(EC编号：1.2.1.10)和乙醇脱氢酶(EC编号：1.1.1.1)(这可以是双功能的酶))。(C)示出了类异戊二烯的产生(ATOB：乙酰乙酰辅酶A硫解酶，EC编号：2.3.1.9；HMGS：羟甲基戊二酸单酰辅酶A合酶，EC编号：2.3.3.10；HMGR：羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶，EC编号：1.1.1.34；MK：甲羟戊酸激酶，EC编号：2.7.1.36；PMK：磷酸甲羟戊酸激酶，EC编号：2.7.4.2；MVD1：甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶，EC编号：4.1.1.33；以及IDI：异戊二烯焦磷酸异构酶，EC编号：5.3.3.2)。(D)示出了脂肪酸的产生(ACC：乙酰辅酶A羧化酶，EC编号：6.4.1.2；FabD：丙二酰辅酶A:ACP酰基转移酶，EC编号：2.3.1.39/2.3.1.85/2.3.1.86；FabH：β-酮-酰基-ACP合酶III，EC编号：2.3.1.180；FabB：β-酮-酰基-ACP合酶I，EC编号：2.3.1.41；FabG：β-酮-酰基-ACP还原酶，EC编号：1.1.1.100；FabZ：β-羟基酰基-ACP脱水酶，EC编号：4.2.1.59；FabI：烯酰基-酰基-ACP还原酶，EC编号：1.3.1.9；以及TesA：酰基-ACP硫酯酶，EC编号：3.1.2.14)。(E)示出了由通过rGS产生的乙酰辅酶A产生正丁醇的途径。(f)示出了由通过rGS产生的乙酰辅酶A产生异丙醇。
图13示出了用于植物中的rGS途径。
图14示出了被整合到用于植物的rGS途径中的启动子-基因-终止序列排列的示意图。
图15示出了带有如图32中所示的完整rGS途径的两种双元载体的示意图。
图16示出了T-DNA插入系sbpase的插入位点并且示出了T-DNA插入系sbpase的受影响的基因组区域。
图17示出了叶绿体中rGS基因的表达。经过rGS基因-叶绿体特异性瞬时肽-GFP构建体转化的植物在叶绿体中显示rGS基因表达。
图18示出了sbpase突变体的比较性地上部分生长分析。对80天大的sbpase突变体和sbpase补充转化系[SBPase(sbpase::rGS)进行比较并且补充系相对于突变体在植物高度和植物生物质方面显示出显著的提高。
图19示出了针对转移基因组中所有的rGS基因的存在对sbp::rgS系进行的基因分型。sbp::rGS系的基因分型已经确认在转移基因组中所有rGS基因的存在(顺乌头酸酶、NADP-MDH、反丁烯二酸酶、FRD、mTK、ICl、PyC、acl以及NifJ/POR)。
图20示出了对野生型系和rGS::WT转基因系进行的比较性地上部分生长分析；对60天大的WT-Col-0植物和转基因系[WT::rGS]进行比较并且补充系rGS3和rGS5在植物生物质方面显示出22％和27％的显著提高(n的平均值＝5)。统计显著性差异t检验(P<0.05)。
具体实施方式
除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所用的单数形式“a/an(一)”和“所述”包括复数指代对象。因此，举例来说，提到“apolynucleotide(一种/个多核苷酸)”时，包括多种/个这样的多核苷酸，并且提到“所述微生物”时，包括提到一种/个或多种/个微生物，诸如此类。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语所具有的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常所了解的含义相同。虽然在实施所公开的方法和组合物时可以使用与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料，但在本文中描述了示例性方法、装置以及材料。
而且，除非另外说明，否则使用“或”意指“和/或”。类似地，“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(include)”、“包括(includes)”以及“包括(including)”是可互换的并且不意图具限制性。
应当进一步了解的是，在对各种实施方案的说明使用术语“包含”的情况下，本领域技术人员应当了解，在一些特定情况下，可以替代性地使用表述“基本上由……组成”或“由……组成”来描述一个实施方案。
提供上文以及贯穿全文所论述的任何出版物仅仅是因为其在本申请的申请日之前公开。本文的任何信息并不被理解为承认本申请的发明人无权因在先的公开而先于这样的公开。
本公开提供了重组微生物和重组植物，所述重组微生物和重组植物包含使C4羧酸转化成两个乙酰辅酶A分子而不损失CO2的逆向乙醛酸支路(rGS)。作为一种示例性微生物，使用大肠杆菌将这种途径工程化以使苹果酸和丁二酸转化成草酰乙酸和两个乙酰辅酶A分子。在另一个实施方案中，将一种示例性植物拟南芥用rGS途径工程化。在热力学上不利的步骤中使用ATP偶联异源性酶以在所期望的方向上驱动所述途径。这一合成途径实质上以ATP作为代价逆转了乙醛酸支路。当与中心代谢整合时，这一途径可以提高异养微生物中由许多碳源产生的乙酸盐和生物燃料的碳收率，并且提供新型碳固定循环的基础。本公开提供了方法和组合物(包括无细胞系统和重组生物体)。
三羧酸(TCA)循环除了为细胞代谢产生能量和还原能力之外还提供了对于许多细胞结构单元来说为必要的前体的中间产物。在每一轮TCA循环的情况下，一个乙酰辅酶A(C2)分子被转化成游离辅酶A、2个CO2分子、呈ATP形式的能量、呈NAD(P)H形式的还原当量、以及水。首先由Kornberg和Krebs在1957年描述的乙醛酸支路避免了TCA循环的两个脱羧步骤，从而允许乙酰辅酶A被转化成TCA循环中间产物而没有碳损失(参见例如图1A黑线)。这一支路是乙醛酸循环的特征，所述乙醛酸循环允许细胞在碳水化合物有限时依靠诸如乙酸盐或脂肪衍生的乙酰辅酶A之类的C2化合物生长。所述乙醛酸支路涉及两种酶，即异柠檬酸裂解酶(ICL)和苹果酸合酶(MS)，它们将异柠檬酸和乙酰辅酶A转化成苹果酸和丁二酸。虽然诸如糖酵解、TCA循环、以及脂肪酸的β-氧化之类的大部分的中心代谢过程在合成代谢方向上具有相反过程(分别是糖异生、还原性TCA循环、以及脂肪酸合成)，但是乙醛酸支路仅被发现在乙酰辅酶A同化方向上进行，而不在乙酰辅酶A产生方向上进行。由于这种不可逆性，大部分的常见糖仅可以经由三碳分子丙酮酸的脱羧而被代谢成乙酰辅酶A。这一限制造成了在异养生物体利用碳水化合物来合成乙酰辅酶A中主要的碳损失，所述乙酰辅酶A是醇、脂肪酸、类异戊二烯以及其它有用的生物能化合物的前体。如本文所述的基于乙醛酸支路的逆向型式的一种合成途径提供了一种将C4TCA中间产物直接分成两个乙酰辅酶A分子的方法(图1)。由于自然界中没有已知的逆向乙醛酸支路(rGS)，因此设计了合成性rGS，并且为了对所述途径进行举例说明，将所述合成性rGS并入到大肠杆菌中(图1，(MTK)、(MCL)、(ICL))。通过引入另外的步骤以将异柠檬酸转化成乙酰辅酶A和草酰乙酸(OAA)(图1(CAN))，从而构建了允许将两个C4分子转化成一个C4分子和两个C2分子的途径来延伸所述逆向支路。进行遗传学测试来测定所述途径中单个步骤的活性以及从苹果酸和丁二酸到草酰乙酸和两个乙酰辅酶A的途径的组合活性。
本公开的途径是使用热力学原理以利用ATP水解来驱动关键步骤以将途径在天然不利的方向上工程化而研发的。使用遗传选择来单独地以及以组合形式证实所述途径的每一个步骤的活性。需要对天然基因进行代谢工程化以在所期望的方向上引导通量。使用这种一般方法，本公开为代谢工程师的工具包提供了一种新型途径，该途径允许将C4羧酸转化成乙酰辅酶A而没有作为CO2的碳损失。
基于rGS的这一途径存在许多用途。举例来说，通过添加苹果酸脱氢酶(MDH)来延伸所述途径将使OAA与苹果酸相连并且允许苹果酸循环，同时将丁二酸转化成乙酰辅酶A。另外，为了将苹果酸转化成丁二酸以及将在此所述的途径与中心代谢整合，使用两种另外的酶(没有正式参与乙醛酸支路)：反丁烯二酸酶和反丁烯二酸还原酶。大肠杆菌编码三种反丁烯二酸酶，其中至少一种在有氧条件或厌氧条件期间表达。反丁烯二酸还原酶(Frd)一般仅在厌氧条件下表达，并且对于全途径整合来说，可能需要是失调的。先前已经在丁二酸脱氢酶基因敲除菌株中针对有氧生长进行的选择中发现了失调的Frd突变体。各种反丁烯二酸还原酶是本领域已知的。
如果例如经由天然大肠杆菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶与中心代谢整合，那么这种途径在理论上可以允许将一摩尔的葡萄糖转化成3摩尔的乙酰辅酶A，从而相对于糖酵解实现50％的收率提高。这样的收率提高可以被引导到工业上相关的化合物，如类异戊二烯、脂肪酸或长链醇(参见图1和图12A-F)。所述rGS途径还允许以高于其它已知途径的碳收率将许多氨基酸转化成乙酰辅酶A。蛋白质向生物燃料的转化已经受到关注并且将受益于这种途径。最终，CO2固定循环可以基于在此所述的途径。添加一种将乙酰辅酶A转化成丙酮酸的酶(例如丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶)将会将线性CO2固定途径闭合成循环并且与还原能力的来源组合可以允许使用CO2作为唯一的碳源(图13)进行生长。在实验中，通过葡萄糖的代谢提供ATP。
在依靠CO2生长的情况下，可以由诸如H2的无机电子源的氧化来提供ATP。本公开证实了通过引入3种外来酶，即适当的代谢调谐，逆向乙醛酸支路途径在大肠杆菌体内运行并且可以同等地被修饰到包括例如酵母和植物在内的其它生物体中。
应当认识到的是，本公开描述了各种实施方案中的所述途径并且示意性地描绘于图1中。将进一步认识到的是，一旦产生乙酰辅酶A，所述分子就可以使用所述的途径被进一步代谢以产生乙酸盐、脂肪酸、类异戊二烯以及其它化学品和生物燃料(参见例如国际申请公开WO2008/098227；WO2008/124523；WO/2009/049274；WO2010/071851；WO2010/045629；WO2011/037598；WO2011/057288；WO2011/088425；WO2012/099934；WO2012/135731；WO2013/123454；WO2013/126855，所有这些国际申请公开均以引用的方式并入本文，包括所有的序列在内)。
在(图1中)所示的途径中，可以使用苹果酸、苹果酰辅酶A、丁二酸以及其它C4分子作为输入分子。所述途径使用例如像苹果酸、苹果酰辅酶A以及丁二酸的4碳分子的投入，这些4碳分子会被分解和重组以产生乙酰辅酶A而没有损失CO2。rGS利用3种基础反应和相应的酶。一种反应是将苹果酸转化成苹果酰辅酶A。对于这一反应有用的酶是苹果酸硫激酶(MTK)。MTK通常以两种多肽的异二聚体的形式存在：(i)sucC-2和SucD-2(或其同源物)。另一种反应是将苹果酰辅酶A转化成乙醛酸和乙酰辅酶A。对于这一反应有用的酶是苹果酰辅酶A裂解酶(MCL)。可用于本公开中的MCL可以衍生自类球红细菌mcl1柠檬酸(Pro-3S)裂解酶。第三种反应是将乙醛酸和丁二酸转化以形成异柠檬酸。对于这一反应有用的酶是异柠檬酸裂解酶(ICL)。可用于本公开的组合物和方法中的ICL可以从大肠杆菌aceA基因获得。
本公开因此提供了重组生物体，所述重组生物体包含代谢工程化的生物合成途径，所述途径包含非CO2产生途径以由诸如苹果酸、苹果酰辅酶A、以及丁二酸之类的C4分子产生乙酰辅酶A。这种途径可以被进一步延伸以将乙酰辅酶A转化成理想的产物。
在一个实施方案中，本公开提供了一种重组微生物或重组植物，所述重组微生物或重组植物与亲本微生物或亲本植物相比包含至少一种靶酶的升高的表达，或编码不存在于亲本生物体中的酶。在另一个或进一步的实施方案中，所述微生物或植物包含至少一种基因的减少、破坏或敲除，所述基因编码与为产生所期望的代谢物所需的代谢物竞争的或产生无用产物的酶。所述重组微生物或重组植物产生参与用于产生例如乙酰辅酶A的生物合成途径的至少一种代谢物。一般来说，所述重组微生物或重组植物包含至少一种包含靶酶的重组代谢途径并且可以进一步包括竞争性生物合成途径中的酶的活性或表达的降低。所述途径用以在例如乙酰辅酶A的产生中修饰底物或代谢中间产物。所述靶酶是由源自于合适的生物来源的多核苷酸编码和表达的。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含源自于细菌来源或酵母来源并且被重组工程化到本公开的微生物或植物中的基因。在另一个实施方案中，编码所期望的靶酶的多核苷酸在所述生物体中是天然存在的，但是被重组工程化以与天然表达水平相比过表达。
如本文所用的酶的“活性”是它催化产生代谢物的反应，即“发挥功能”的能力的量度，并且可以被表示为产生所述反应的代谢物的速率。举例来说，酶活性可以被表示为每单位时间或每单位的酶产生的代谢物的量(例如由浓度或重量度量的单位)，或用亲和力或解离常数表示。
术语“生物合成途径”也被称为“代谢途径”，指的是一组用于将一种化学物质转化(转变)成另一种化学物质的合成代谢或分解代谢生物化学反应。如果基因产物并行地或连续地作用于相同的底物、产生相同的产物、或作用于或产生相同底物与代谢终产物之间的代谢中间产物(即代谢物)，那么它们属于相同的“代谢途径”。本公开提供了具有用于产生所期望的产物或中间产物的代谢工程化的途径的重组微生物或重组植物。
相应地，代谢“工程化”或“修饰”的微生物或植物是经由将遗传物质引入到所选择的宿主或亲本微生物或植物中，从而改造或改变所述微生物或植物的细胞生理学和生物化学以提供重组代谢途径而产生的。经由遗传物质的引入，亲本微生物或亲本植物获得了新的特性，例如产生新的或更大量的细胞内代谢物的能力。在一个说明性实施方案中，将遗传物质引入到亲本微生物或亲本植物中产生新的或改良的能力以经由非CO2演化途径产生乙酰辅酶A以达到最佳的碳利用率。被引入到亲本微生物或亲本植物中的遗传物质含有编码参与用于产生乙酰辅酶A的生物合成途径的一种或多种酶的一种或多种基因、或一种或多种基因的部分，并且还可以包括用于表达这些基因和/或调节这些基因的表达的另外的元件，例如启动子序列。
作为向宿主或亲本微生物中引入遗传物质的替代方案或除此之外，工程化的或修饰的微生物或植物还可以包括基因或多核苷酸的表达减少、破坏、缺失或敲除以改变所述微生物或植物的细胞生理学和生物化学。经由基因或多核苷酸的减少、破坏或敲除，所述微生物或植物获得新的或改良的特性(例如下述的能力：产生新的或更大量的细胞内代谢物、提高代谢物沿所期望的途径的通量、和/或减少不希望有的副产物的产生)。
“酶”意指如下的任何物质，所述物质通常全部或大部分由氨基酸组成，所述氨基酸构成不同程度特异性地催化或促进一种或多种化学反应或生物化学反应的蛋白质或多肽。
关于基因或多核苷酸的术语“表达”指的是所述基因或多核苷酸的转录，并且在适当时，指的是所得的mRNA转录物被翻译成蛋白质或多肽。因此，如根据上下文将清楚的是，蛋白质或多肽的表达由开放阅读框的转录和翻译所引起。
如本文所用的术语“代谢工程化的”或“代谢工程化”涉及合理的途径设计和生物合成基因、与操纵子相关的基因、以及这些多核苷酸的控制元件的组装，以在微生物或植物中产生所期望的代谢物，如乙酰磷酸盐和/或乙酰辅酶A、高级醇或其它化学品。“代谢工程化的”可以进一步包括利用遗传工程化和适当的培养条件来调节和优化转录、翻译、蛋白质稳定性以及蛋白质功能性而实现的代谢通量优化，包括减少、破坏、或敲除与引起所期望途径的中间产物竞争的竞争性代谢途径。这样的代谢工程化可以包括对用于特定途径的辅因子进行的选择性修饰(例如NADH、NADPH、NAD+、NADP+、ATP、ADP、辅酶A等)。生物合成基因对于宿主微生物或宿主植物来说可以是异源性的，这或者是因为它对于宿主来说是外来的，或者它在内源性宿主细胞中被诱变、重组和/或与异源性表达控制序列缔合而修饰，所述诱变、重组和/或缔合使得与野生型生物体相比有更高的表达。在一个实施方案中，在多核苷酸对于宿主生物体来说是异种的情况下，可以对所述多核苷酸进行密码子优化。
“代谢物”指的是由代谢产生的任何物质或为特定的代谢过程所需的或参与特定的代谢过程的物质，所述代谢过程产生所期望的代谢物、化学品、醇或酮。代谢物可以是作为代谢的起始物质(例如丁二酸、苹果酸、苹果酰辅酶A、乙醛酸等(参见例如图1))、中间产物(例如乙酰辅酶A)、或终产物(例如1-丁醇)的有机化合物。代谢物可以用于构建更复杂的分子，或它们可以被分解成更简单的分子。中间代谢物可以由其它代谢物合成而来，或许被用于产生更复杂的物质，或分解成更简单的化合物，这常常伴有化学能的释放。
“天然”或“野生型”蛋白质、酶、多核苷酸、基因、或细胞意指在自然界中存在的蛋白质、酶、多核苷酸、基因或细胞。如上所述，在一些实施方案中，野生型蛋白质或多核苷酸可以与异源性启动子或调节元件连接并且在这样的情况下将被重组表达。
“亲本微生物”或“亲本植物”指的是用于产生重组微生物或重组植物的细胞。术语“亲本微生物”或“亲本植物”描述了在自然界中存在的细胞，即没有经过遗传修饰的“野生型”细胞。术语“亲本微生物”或“亲本植物”还描述了用作“亲本”进行进一步工程化的细胞。举例来说，野生型微生物或野生型植物可以被遗传修饰以表达或过表达诸如苹果酸硫激酶的第一靶酶。这种微生物或植物可以在产生被修饰以表达或过表达第二靶酶，例如苹果酰辅酶A裂解酶的微生物或植物中充当亲本微生物或亲本植物。进而，所述微生物或植物可以被修饰以表达或过表达第三酶，例如异柠檬酸裂解酶，可以被进一步修饰以表达或过表达第四靶酶，例如顺乌头酸酶等。
因此，亲本微生物或亲本植物充当连续的遗传修饰事件的参考细胞。每一个修饰事件可以通过将一种或多种核酸分子引入到参考细胞中来实现。多核苷酸的引入促进一种或多种靶酶的表达或过表达或者一种或多种靶酶的减少或消除。应当了解的是，术语“促进”涵盖了经由对亲本微生物或亲本植物中的例如启动子序列进行遗传修饰来激活编码靶酶的内源性多核苷酸。应当进一步了解的是，术语“促进”涵盖了将编码靶酶的外源性多核苷酸引入到亲本微生物或亲本植物中。
“蛋白质”或“多肽”(这些术语在本文可互换使用)包含被称作氨基酸的化学构造单元的一条或多条链，所述化学结构单元由被称作肽键的化学键连接在一起。蛋白质或多肽可以充当酶。
术语“多核苷酸”、“核酸”或“重组核酸”指的是多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)，并且在适当时，指的是核糖核酸(RNA)。
编码可用于产生代谢物的酶(例如，诸如苹果酸硫激酶、苹果酰辅酶A裂解酶、异柠檬酸裂解酶、顺乌头酸酶等酶)的多核苷酸被用于引导这些多肽在诸如细菌细胞或酵母细胞的适当的宿主细胞中表达的重组核酸分子中，所述酶包括其同源物、变体、片段、相关融合蛋白或功能等同物。应当了解的是，添加不会改变核酸分子的编码活性的序列，如添加非功能或非编码序列是基本核酸的保守变异。
应当了解的是，上文所述的多核苷酸包括“基因”并且上文所述的核酸分子包括“载体”或“质粒”。举例来说，编码苹果酸硫激酶的多核苷酸可以包含sucC-2/sucD-2基因或其同源物。因此，术语“基因”也被称作“结构基因”，指的是编码特定多肽的多核苷酸，所述特定多肽包含构成一种或多种蛋白质或酶的全部或一部分的氨基酸的序列，并且可以包括决定例如所述基因被表达的条件的调节(非转录)DNA序列，如启动子区或表达控制元件。基因的转录区可以包括非翻译区，包括内含子、5'-非翻译区(UTR)和3'-UTR；以及编码序列。
本领域技术人员将认识到的是，由于遗传密码的简并性，多种在核苷酸序列方面不同的密码子可以用于编码给定的氨基酸。在本文提到编码上文所述的生物合成酶或多肽的特定的多核苷酸或基因序列时，仅仅是为了说明本公开的一个实施方案，并且本公开包括下述的任何序列的多核苷酸，所述任何序列的多核苷酸编码包含本公开的方法中所利用的酶的多肽和蛋白质的相同氨基酸序列的多肽。以类似的方式，多肽通常可以容许在它的氨基酸序列中有一处或多处氨基酸取代、缺失、以及插入而没有丧失或显著丧失所期望的活性。本公开包括这样的具有替代性氨基酸序列的多肽，并且由本文所示的DNA序列编码的氨基酸序列仅仅说明了本公开的某些实施方案。这样的多肽可以具有1-50处(例如1-10处、10-20处、20-30处、30-40处、或40-50处)如本文所述的保守氨基酸取代，而保持它们的催化活性。
本公开提供了呈重组DNA表达载体或质粒形式的多核苷酸，如本文别处所更详细地描述，它们编码一种或多种靶酶。一般来说，这些载体可以在宿主微生物或宿主植物的细胞质中复制或整合到宿主微生物或宿主植物的染色体DNA中。在任一种情况下，载体可以是稳定载体(即，即使只有选择压力，载体经过多次细胞分裂仍存在)或瞬时载体(即，载体随着细胞分裂次数增加而逐渐由宿主微生物丧失)。本公开提供了呈分离形式(即不纯，但是以在自然界中不存在的丰度和/或浓度存在于制剂中)和纯化形式(即，基本上不含污染物质或基本上不含在自然界中将与相应DNA一起存在的物质)的DNA分子。本公开还包括编码可用于本公开中的多肽的非天然存在的cDNA分子。此外，本公开包括包含天然序列的修饰的序列，其中一个或多个核苷酸与天然存在的型式相比已经发生变化。这样的修饰型式可以编码与由天然存在的序列所编码的蛋白质相比相同的多肽序列或修饰的多肽序列。
本公开的多核苷酸可以使用cDNA、mRNA或替代地使用基因组DNA作为模板以及使用适当的寡核苷酸引物，根据标准PCR扩增技术和以下实施例部分中所述的那些程序来扩增。如此所扩增的核酸可以被克隆到适当的载体中并且由DNA序列分析表征。此外，对应于核苷酸序列的寡核苷酸可以通过标准合成技术，例如使用自动化DNA合成器来制备。
还应当了解的是，编码与本文所述的酶同源的多肽的分离的多核苷酸分子可以通过将一处或多处核苷酸取代、添加或缺失引入到编码所述特定多肽的核苷酸序列中，以使得向编码的蛋白质中引入一处或多处氨基酸取代、添加或缺失而形成。可以通过标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变将突变引入到多核苷酸中。与其中可能期望进行非保守氨基酸取代的那些位置相反，在一些位置中，优选的是，进行保守氨基酸取代。
如本领域技术人员所将了解，可能有利的是，对编码序列进行修饰以增强它在特定宿主中的表达。遗传密码是冗余的而存在64种可能的密码子，但是大部分的生物体通常使用这些密码子的子集。在物种中被最常利用的密码子被称作最佳密码子，并且不经常被利用的那些被分类为稀有密码子或低使用率密码子。密码子可以被取代以反映宿主偏好的密码子使用，这一过程有时被称作“密码子优化”或“控制物种密码子偏好性”。
含有特定的原核宿主或真核宿主所偏好的密码子的优化的编码序列(还参见Murray等,(1989)Nucl.AcidsRes.17:477-508)可以被制备以例如提高翻译速率或产生与由非优化序列产生的转录物相比，具有理想的特性，如更长的半衰期的重组RNA转录物。翻译终止密码子也可以被修饰以反映宿主的偏好。举例来说，酿酒酵母(S.cerevisiae)和哺乳动物的典型的终止密码子分别是UAA和UGA。单子叶植物的典型的终止密码子是UGA，而昆虫和大肠杆菌通常使用UAA作为终止密码子(Dalphin等(1996)Nucl.AcidsRes.24:216-218)。用于优化用于在植物中表达的核苷酸序列的方法提供于例如美国专利号6,015,891和其中所引用的参考文献中。
术语“重组微生物”、“重组植物”以及“重组宿主细胞”在本文可互换使用并且指的是已经被遗传修饰以表达或过表达内源性多核苷酸、或表达非内源性序列，如载体中所包括的那些序列的微生物或植物。所述多核苷酸一般编码参与用于产生如上文所述的所期望的代谢物的代谢途径的靶酶，但是还可以包括为调节或活性或转录所需的蛋白质因子。因此，本文所述的重组微生物或重组植物已经被遗传工程化以表达或过表达亲本微生物或亲本植物先前不表达或不过表达的靶酶。应当了解的是，术语“重组微生物”、“重组植物”以及“重组宿主细胞”不仅指的是特定的重组微生物或重组植物，而且还指的是这样的微生物或植物的后代或潜在后代。
术语“底物”或“合适的底物”指的是在酶的作用下被转化或欲被转化成另一种化合物的任何物质或化合物。所述术语不仅包括单一化合物，而且还包括化合物的组合，如含有至少一种底物或其衍生物的溶液、混合物以及其它物质。此外，术语“底物”不仅涵盖了提供适于用作起始物质的碳源的化合物，而且还涵盖了与如本文所述的代谢工程化的微生物或植物相关的途径中所用的中间代谢物和终产物代谢物。对于本文所述的rGS途径，起始物质可以是任何合适的碳源，包括但不限于丁二酸、苹果酸、苹果酰辅酶A等。丁二酸在进入rGS途径之前例如可以被转化成异柠檬酸或苹果酸，如图1中所示。
“转化”指的是用以将载体引入到宿主细胞中的过程。转化(或转导、或转染)可以通过许多手段中的任一种来实现，包括电穿孔、显微注射、生物射弹(或粒子轰击介导的递送)、或农杆菌(agrobacterium)介导的转化。
“载体”一般指的是可以在生物体、细胞、或细胞组分之间传递和/或转移的多核苷酸。载体包括病毒、噬菌体、原病毒、质粒、噬菌粒、转座子、以及人工染色体，如YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)、以及PLAC(植物人工染色体)等，它们是“游离体”，即自主复制或可以整合到宿主细胞的染色体中。载体还可以是裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、由同一条链内的DNA和RNA这两者构成的多核苷酸、与聚赖氨酸缀合的DNA或RNA、与肽缀合的DNA或RNA、与脂质体缀合的DNA等，它们性质上不是游离型的，或所述载体可以是包含上述多核苷酸构建体中的一种或多种的生物体，如农杆菌或细菌。
表达载体的各种组分可以广泛不同，这取决于载体的预期用途以及其中载体意图复制或驱动表达的一种或多种宿主细胞。适用于在大肠杆菌、酵母、链霉菌(Streptomyces)以及其它常用的细胞中表达基因和维持载体的表达载体组分是众所周知的并且是可商购获得的。举例来说，用于包括在本公开的表达载体中的合适的启动子包括在真核或原核宿主微生物中起作用的那些。启动子可以包含调节序列，所述调节序列允许相对于宿主微生物或宿主植物的生长调节表达或响应于化学刺激或物理刺激使得基因的表达开启或关闭。对于大肠杆菌和某些其它细菌宿主细胞，可以使用源自于生物合成酶、赋予抗生素抗性的酶、以及噬菌体蛋白质的基因的启动子并且所述启动子包括例如半乳糖启动子、乳糖(lac)启动子、麦芽糖启动子、色氨酸(trp)启动子、β-内酰胺酶(bla)启动子、噬菌体λPL启动子、以及T5启动子。此外，还可以使用合成启动子，如tac启动子(美国专利号4,551,433，其以引用的方式整体并入本文)。对于大肠杆菌表达载体，包括大肠杆菌复制起点，如来自pUC、p1P、p1以及pBR的复制起点是有用的。
因此，重组表达载体含有至少一种表达系统，所述表达系统进而由与启动子和任选的终止序列可操作地连接的基因编码序列的至少一部分构成，所述启动子和所述任选的终止序列起作用以实现所述编码序列在相容的宿主细胞中的表达。宿主细胞是通过用本公开的重组DNA表达载体进行转化以含有作为染色体外元件或被整合到染色体中的表达系统序列而得以修饰的。
本公开提供了用于使涉及乙酰磷酸合成、乙酰辅酶A生物合成或由其衍生的其它代谢物的生物合成基因或多核苷酸中的一种或多种进行异源表达的方法以及可用于所述方法中的重组DNA表达载体。因此，在本公开的范围内包括了包括这些核酸的重组表达载体。
本文所提供的重组微生物和重组植物可以表达参与由合适的碳底物产生乙酰辅酶A或由其衍生的其它代谢物的途径的多种靶酶，所述碳底物例如可以进入所述途径的苹果酸、丁二酸以及类似的C4分子。所述碳源可以被代谢成例如乙酰辅酶A，所述乙酰辅酶A可以被进一步代谢成例如脂肪酸、醇、以及类异戊二烯等等化合物。例如丁二酸、反丁烯二酸、草酰乙酸以及苹果酸的来源是已知的。
本公开证实了编码以下各项的一种或多种异源性多核苷酸的表达或过表达或者编码以下各项的一种或多种天然多核苷酸的过表达可以利用C4碳源并且产生乙酰辅酶A而没有CO2损失：(i)催化由苹果酸产生苹果酰辅酶A的多肽；(ii)催化苹果酰辅酶A转化成乙醛酸和乙酰辅酶A的多肽；以及(iii)催化乙醛酸和丁二酸转化成异柠檬酸的多肽。在其它实施方案中，将异柠檬酸转化成顺乌头酸、将顺乌头酸转化成柠檬酸、将柠檬酸转化成草酰乙酸和乙酰辅酶A、以及将草酰乙酸转化成苹果酸的另外的多肽可以被并入以提供用于产生乙酰辅酶A的有效循环。
本文所提供的微生物和植物被修饰以大量产生代谢物并且与亲本微生物或亲本植物相比，更有效地利用碳源或者利用不容易被代谢的碳源。具体来说，所述重组微生物或重组植物包含使用C4代谢物产生乙酰辅酶A而保持碳守恒或没有产生CO2的代谢途径。“使碳守恒”的意思是将C4代谢物转化成乙酰辅酶A的代谢途径从起始C4代谢物到乙酰辅酶A有最低限度的碳损失或没有碳损失。举例来说，在一个实施方案中，所述重组微生物或重组植物由输入碳源中相同数目的碳产生化学计量上守恒量的碳产物(例如1个丁二酸(C4代谢物)产生2个乙酰磷酸(两个2-碳代谢物))。
因此，本公开提供了一种重组微生物或重组植物，所述重组微生物或重组植物产生乙酰辅酶A或由其衍生的其它代谢物并且与亲本微生物或亲本植物相比，包括靶酶的表达或升高的表达，所述靶酶诸如苹果酸硫激酶(例如sucC-2/sucD-2)、苹果酰辅酶A裂解酶(例如mcl1柠檬酸(pro-3S)裂解酶)、异柠檬酸裂解酶(例如aceA)、顺乌头酸酶(例如acn)、苹果酸脱氢酶(例如Mdh)、或其任何组合。所述重组微生物或重组植物可以进一步包括以下各项的表达或活性降低或基因敲除：(i)将柠檬酸转化成草酰乙酸的酶(例如citDEF)；(ii)将草酰乙酸和乙酰辅酶A转化成柠檬酸的酶(例如gltA)；(iii)将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸的酶(例如ppc)；(iv)将草酰乙酸转化成苹果酸的酶(例如mdh/mqo)；或(i)-(iv)的任何组合。
在欲将乙酰辅酶A产物进一步代谢的一些实施方案中，重组微生物或重组植物可以表达或过表达磷酸转乙酰酶(例如pta)，并且任选地可以包括乙酸激酶的表达或过表达。此外，在这些延伸途径中，所述微生物或植物与亲本微生物或亲本植物相比可以包括优先地使用乙酰辅酶A作为底物的醇/乙醛脱氢酶(例如adhE基因)表达的破坏、缺失或基因敲除。在一些实施方案中，另外的基因敲除可以包括乳酸脱氢酶(例如ldh)和frdBC的基因敲除。
将认识到的是，内在地具有前述酶中的一种或多种(但并非全部)的生物体可以被用作亲本生物体。如下文所更充分地描述，本公开的微生物或植物包含编码上述一种或多种酶的一种或多种重组基因，并且可以进一步包括使乙酰辅酶A产物延伸的另外的酶，所述乙酰辅酶A产物然后可以被延伸以产生例如丁醇、异丁醇、2-戊酮等。
因此，本文所提供的重组微生物或重组植物包括至少一种靶酶，如aceA或编码异二聚体sucC-2和sucD-2的基因的升高的表达。在其它实施方案中，重组微生物或重组植物可以表达多种靶酶，所述多种靶酶参与由C4碳源如图1和图12A-F中所描绘产生乙酰辅酶A或由其衍生的其它代谢物的途径，所述C4碳源诸如丁二酸、苹果酸等。在一个实施方案中，所述重组微生物或重组植物包含异源性酶的表达或内源性酶的过表达，所述酶选自苹果酸硫激酶、苹果酰辅酶A裂解酶、异柠檬酸裂解酶以及(i)苹果酸脱氢酶和/或(ii)顺乌头酸酶中的任一种或这两者。
如先前所指出，在整个本公开中所描述的靶酶一般产生代谢物。此外，在整个本公开中所描述的靶酶由多核苷酸编码。举例来说，苹果酸硫激酶可以由来自荚膜甲基球菌的sucC-2基因和sucD-2基因、多核苷酸或其同源物编码。所述基因可以源自于包括荚膜甲基球菌在内的提供编码具有苹果酸硫激酶活性的合适的酶的合适的核酸序列的任何生物来源。
因此，在一个实施方案中，与亲本微生物或亲本植物相比，本文所提供的重组微生物或重组植物包括苹果酸硫激酶(sucC-2和sucD2的异二聚体)的表达。这种表达可以与如本文在上文和下文中所述的用于产生乙酰辅酶A或由其衍生的其它代谢物的代谢途径中其它酶的表达或过表达组合。所述重组微生物或重组植物由苹果酸、ATP以及辅酶A产生包括苹果酰辅酶A的代谢物。苹果酸硫激酶可以由基因sucC-2和sucD2、多核苷酸或其同源物编码。sucC-2和sucD2基因或多核苷酸可以源自于荚膜甲基球菌。
除了上述之外，术语“苹果酸硫激酶”或“sucC-2/sucD-2”还指的是能够催化由苹果酸、辅酶A以及ATP形成苹果酰辅酶A的异二聚蛋白质，并且所述蛋白质与SEQIDNO:2、4、28或30共有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性、或至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列相似性，如通过NCBIBLAST使用默认参数所计算。另外的同源物包括：具有至少50％同源性的序列(应当指出的是，这些序列可以被标注为丁二酰辅酶A合成酶、苹果酸硫激酶或苹果酸辅酶A连接酶)：扭脱甲基杆菌AM1，MtkA：苹果酸硫激酶，大亚基，蛋白质登录号：YP_002962851.1(57％同一性)，将苹果酸转化成苹果酰辅酶A；帕氏鲁杰氏菌，苹果酸辅酶A连接酶β亚基，蛋白质登录号：YP_166809.1(58％同一性)，将苹果酸转化成苹果酰辅酶A；金黄色葡萄球菌金黄色亚种USA300_TCH959，丁二酸辅酶A连接酶，β亚基，蛋白质登录号：EES93003.1(55％同一性)，将苹果酸转化成苹果酰辅酶A。具有至少50％同源性的sucD-2序列同源物是(应当指出的是，这些序列可以被标注为丁二酰辅酶A合成酶或苹果酸硫激酶)：扭脱甲基杆菌AM1，MtkB：苹果酸硫激酶，小亚基，蛋白质登录号：YP_002962852.1(58％同一性)，将苹果酸转化成苹果酰辅酶A；帕氏鲁杰氏菌DSS-3，丁二酰辅酶A合成酶，α亚基，蛋白质登录号：YP_165609.1(53％同一性)，将苹果酸转化成苹果酰辅酶A；以及金黄色葡萄球菌金黄色亚种USA300_TCH959，丁二酸辅酶A合成酶，α亚基，蛋白质登录号：EES93004.1(54％同一性)，将苹果酸转化成苹果酰辅酶A。与前述登录号相关的序列以引用的方式并入本文。
在另一个实施方案中，与亲本微生物或亲本植物相比，本文所提供的重组微生物或重组植物包括升高的苹果酸脱氢酶(Mdh)表达。这种表达可以与如本文在上文和下文中所述的用于产生乙酰辅酶A或由其衍生的其它代谢物的代谢途径中其它酶的表达或过表达组合。所述重组微生物或重组植物由包括草酰乙酸和NADH的底物产生包括苹果酸的代谢物。苹果酸脱氢酶可以由Mdh基因、多核苷酸或其同源物编码。所述Mdh基因或多核苷酸可以源自于包括大肠杆菌在内的各种微生物。
除了上述之外，术语“苹果酸脱氢酶”或“Mdh”还指的是能够催化由草酰乙酸和NADH形成苹果酸的蛋白质，并且所述蛋白质与SEQIDNO:6或34共有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性、或至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列相似性，如通过NCBIBLAST使用默认参数所计算。苹果酸脱氢酶(EC1.1.1.37)是在正向和逆向这两个方向上起作用的酶。酿酒酵母具有三个拷贝的苹果酸脱氢酶，即MDH1(McAlister-Henn和Thompson,J.Bacteriol.169:5157-5166(1987))、MDH2(Minard和McAlister-Henn,Mol.Cell.Biol.11:370-380(1991)；Gibson和McAlister-Henn,J.Biol.Chem.278:25628-25636(2003))、以及MDH3(Steffan和McAlister-Henn,J.Biol.Chem.267:24708-24715(1992))，它们分别定位于线粒体、细胞溶质、以及过氧化物酶体。已知大肠杆菌具有由mdh编码的活性苹果酸脱氢酶。可以用于本公开的方法和组合物中的与SEQIDNO:6具有50％或更大的同一性的其它同源物包括巴斯德驹形氏酵母(Komagataellapastoris)GS115，线粒体苹果酸脱氢酶，蛋白质登录号：XP_002491128.1(50％同一性)，催化苹果酸和草酰乙酸的相互转化；克雷伯氏肺炎菌，苹果酸脱氢酶，蛋白质登录号：WP_004206230.1(95％同一性)，催化苹果酸和草酰乙酸的相互转化；以及土曲霉(Aspergillusterreus)NIH2624，苹果酸脱氢酶，线粒体前体，蛋白质登录号：XP_001215536.1(51％同一性)，催化苹果酸和草酰乙酸的相互转化。
在另一个实施方案中，与亲本微生物或亲本植物相比，本文所提供的重组微生物或重组植物包括升高的苹果酰辅酶A裂解酶表达。这种表达可以与如本文在上文和下文中所述的用于产生乙酰辅酶A或由其衍生的其它代谢物的代谢途径中其它酶的表达或过表达组合。所述重组微生物或重组植物由包括苹果酰辅酶A的底物产生包括乙醛酸和乙酰辅酶A的代谢物。苹果酰辅酶A裂解酶可以由mcl1柠檬酸(pro-3S)裂解酶基因、多核苷酸或其同源物编码。mcl1基因或多核苷酸可以源自于包括类球红细菌在内的各种生物体。在另一个实施方案中，苹果酰辅酶A裂解酶源自于扭脱甲基杆菌。在另一个实施方案中，在植物中，编码MCL的多核苷酸与35S启动子或甘露氨酸(mannopine)合酶启动子可操作地连接。
除了上述之外，术语“苹果酰辅酶A裂解酶”或“mcl1”或“MCL”还指的是能够催化由苹果酰辅酶A形成乙醛酸和乙酰辅酶A的蛋白质，并且所述蛋白质与SEQIDNO:8或40共有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性、或至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列相似性，如通过NCBIBLAST使用默认参数所计算。具有至少50％同源性的类球红细菌mcl1同源物的实例包括例如：扭脱甲基杆菌AM1，苹果酰辅酶A裂解酶，mclA，蛋白质登录号：AAB58884.1(58％同一性)，将苹果酰辅酶A转化成乙酰辅酶A和乙醛酸；鲁杰氏菌属菌物种(Ruegeriasp.)TW15，苹果酰辅酶A裂解酶，蛋白质登录号：WP_010437801(57％同一性)，将苹果酰辅酶A转化成乙酰辅酶A和乙醛酸；以及反硝化玫瑰杆菌(Roseobacterdenitrificans)OCh114，苹果酰辅酶A裂解酶，蛋白质登录号：YP_684363(57％同一性)，将苹果酰辅酶A转化成乙酰辅酶A和乙醛酸。与前述登录号相关的序列以引用的方式并入本文。
在另一个实施方案中，与亲本微生物或亲本植物相比，本文所提供的重组微生物或重组植物包括升高的异柠檬酸裂解酶表达。这种表达可以与如本文在上文和下文中所述的用于产生乙酰辅酶A或由其衍生的其它代谢物的代谢途径中其它酶的表达或过表达组合。所述重组微生物或重组植物由包括丁二酸和乙醛酸的底物产生包括异柠檬酸的代谢物。异柠檬酸裂解酶可以由aceA基因、多核苷酸或其同源物编码。aceA基因或多核苷酸可以源自于包括大肠杆菌和真氧产碱杆菌在内的各种生物体。在另一个实施方案中，在植物中，编码异柠檬酸裂解酶的多核苷酸与35S启动子或甘露氨酸合酶启动子可操作地连接。
除了上述之外，术语“异柠檬酸裂解酶”或“aceA”或“ICL”还指的是能够催化由丁二酸和乙醛酸形成异柠檬酸的蛋白质，并且所述蛋白质与SEQIDNO:10或42共有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性、或至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列相似性，如通过NCBIBLAST使用默认参数所计算。另外的同源物包括：真氧产碱杆菌H16的iclA，蛋白质登录号：YP_726692.1(70％同一性)，将乙醛酸和丁二酸转化成异柠檬酸；丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000I菌株(Pseudomonassyringaepv.tomatostr.DC3000I)的aceA，蛋白质登录号：NP_793147.1(73％同一性)，将乙醛酸和丁二酸转化成异柠檬酸；以及来自格氏根瘤菌(Rhizobiumgrahamii)CCGE502的icl1异柠檬酸裂解酶1，蛋白质登录号：EPE99766.1(59％同一性)，将乙醛酸和丁二酸转化成异柠檬酸。与前述登录号相关的序列以引用的方式并入本文。
在另一个实施方案中，与亲本微生物或亲本植物相比，本文所提供的重组微生物或重组植物包括升高的顺乌头酸酶(Acn)表达。这种表达可以与如本文在上文和下文中所述的用于产生乙酰辅酶A或由其衍生的其它代谢物的代谢途径中其它酶的表达或过表达组合。所述重组微生物或重组植物由包括异柠檬酸的底物产生包括顺乌头酸的代谢物。顺乌头酸酶可以由Acn基因、多核苷酸或其同源物编码。Acn基因或多核苷酸可以源自于包括拟南芥(Arabidopsisthaliana)在内的各种生物体。
除了上述之外，术语“顺乌头酸酶”或“Acn”还指的是能够催化由异柠檬酸形成顺乌头酸的蛋白质，并且所述蛋白质与SEQIDNO:32共有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性、或至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列相似性，如通过NCBIBLAST使用默认参数所计算。
在另一个实施方案中，与亲本微生物或亲本植物相比，本文所提供的重组微生物或重组植物包括升高的反丁烯二酸酶(fumc)表达。这种表达可以与如本文在上文和下文中所述的用于产生乙酰辅酶A或由其衍生的其它代谢物的代谢途径中其它酶的表达或过表达组合。所述重组微生物或重组植物由包括反丁烯二酸的底物产生包括苹果酸的代谢物。反丁烯二酸酶可以由fumc基因、多核苷酸或其同源物编码。fumc基因或多核苷酸可以源自于包括集胞藻属物种(Synechocystissp.)PCC6803在内的各种生物体。在一个实施方案中，在植物中，编码fumc的多核苷酸与甘露氨酸合酶启动子可操作地连接。
除了上述之外，术语“反丁烯二酸酶”或“fumc”还指的是能够催化由反丁烯二酸形成苹果酸的蛋白质，并且所述蛋白质与SEQIDNO:36共有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性、或至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列相似性，如通过NCBIBLAST使用默认参数所计算。
在另一个实施方案中，与亲本微生物或亲本植物相比，本文所提供的重组微生物或重组植物包括升高的反丁烯二酸还原酶(frd)表达。这种表达可以与如本文在上文和下文中所述的用于产生乙酰辅酶A或由其衍生的其它代谢物的代谢途径中其它酶的表达或过表达组合。所述重组微生物或重组植物由包括反丁烯二酸的底物产生包括丁二酸的代谢物。反丁烯二酸还原酶可以由frd基因、多核苷酸或其同源物编码。frd基因或多核苷酸可以源自于包括酿酒酵母在内的各种生物体。在一个实施方案中，在植物中，编码frd的多核苷酸与35S启动子可操作地连接。
除了上述之外，术语“反丁烯二酸还原酶”或“frd”还指的是能够催化由反丁烯二酸形成丁二酸的蛋白质，并且所述蛋白质与SEQIDNO:38共有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性、或至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列相似性，如通过NCBIBLAST使用默认参数所计算。
在另一个实施方案中，与亲本微生物或亲本植物相比，本文所提供的重组微生物或重组植物包括升高的ATP柠檬酸裂解酶(ACL)表达。这种表达可以与如本文在上文和下文中所述的用于产生乙酰辅酶A或由其衍生的其它代谢物的代谢途径中其它酶的表达或过表达组合。所述重组微生物或重组植物由包括柠檬酸和ATP的底物产生包括草酰乙酸和乙酰辅酶A的代谢物。ATP柠檬酸裂解酶可以由acl基因、多核苷酸或其同源物编码。acl基因或多核苷酸可以源自于包括智人(Homosapiens)在内的各种生物体。在一个实施方案中，在植物中，编码ACL的多核苷酸与35S启动子或甘露氨酸合酶启动子可操作地连接。
除了上述之外，术语“ATP柠檬酸裂解酶”或“acl”还指的是能够催化草酰乙酸和乙酰辅酶A的形成的蛋白质，并且所述蛋白质与SEQIDNO:44共有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性、或至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列相似性，如通过NCBIBLAST使用默认参数所计算。
在另一个实施方案中，与亲本微生物或亲本植物相比，本文所提供的重组微生物或重组植物包括升高的丙酮酸氧化还原酶(aka丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶)(nifJ基因；PFOR)表达。这种表达可以与如本文在上文和下文中所述的用于产生乙酰辅酶A或由其衍生的其它代谢物的代谢途径中其它酶的表达或过表达组合。所述重组微生物或重组植物由包括乙酰辅酶A的底物产生包括丙酮酸的代谢物。丙酮酸氧化还原酶可以由nifJ基因、多核苷酸或其同源物编码。nifJ基因或多核苷酸可以源自于包括集胞藻属物种PCC6803在内的各种生物体。在一个实施方案中，在植物中，编码PFOR的多核苷酸与35S启动子或甘露氨酸合酶启动子可操作地连接。
除了上述之外，术语“丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶”或“PFOR”还指的是能够催化由乙酰辅酶A形成丙酮酸的蛋白质，并且所述蛋白质与SEQIDNO:46共有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性、或至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列相似性，如通过NCBIBLAST使用默认参数所计算。
在另一个实施方案中，与亲本微生物或亲本植物相比，本文所提供的重组微生物或重组植物包括升高的丙酮酸羧化酶(pyc)(EC6.4.1.1)表达。这种表达可以与如本文在上文和下文中所述的用于产生乙酰辅酶A或由其衍生的其它代谢物的代谢途径中其它酶的表达或过表达组合。所述重组微生物或重组植物由包括丙酮酸和ATP的底物产生包括草酰乙酸的代谢物。丙酮酸羧化酶可以由pyc基因、多核苷酸或其同源物编码。pyc基因或多核苷酸可以源自于包括乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)在内的各种生物体。在一个实施方案中，在植物中，编码pyc的多核苷酸与35S启动子或甘露氨酸合酶启动子可操作地连接。
除了上述之外，术语“丙酮酸羧化酶”或“Pyc”还指的是能够催化由丙酮酸形成草酰乙酸的蛋白质，并且所述蛋白质与SEQIDNO:48共有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性、或至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列相似性，如通过NCBIBLAST使用默认参数所计算。
如本文所述和附图中所描绘，逆向乙醛酸支路(rGS)可以与可以将乙酰辅酶A(rGS的产物)代谢成包括生物燃料在内的各种化学品的另外的途径酶组合。因此，下列酶途径中的一种或多种可以被进一步工程化到包含rGS途径的重组微生物或重组植物中以产生这些代谢物(例如高级醇、脂肪酸以及类异戊二烯)。
因此，在又另一个实施方案中，与亲本微生物或亲本植物相比，本文所提供的重组微生物或重组植物包括升高的巴豆酰辅酶A还原酶表达。这种表达可以与用于产生正丁醇、异丁醇、丁酰辅酶A和/或丙酮的代谢途径中其它酶的表达或过表达组合。所述微生物由包括巴豆酰辅酶A的底物产生包括丁酰辅酶A的代谢物。巴豆酰辅酶A还原酶可以由ccr基因、多核苷酸或其同源物编码。ccr基因或多核苷酸可以源自于链霉菌属。
巴豆酰辅酶A还原酶催化巴豆酰辅酶A向丁酰辅酶A的还原。根据所用的生物体，异源性巴豆酰辅酶A还原酶可以被工程化以在生物体中表达。或者，天然巴豆酰辅酶A还原酶可以被过表达。巴豆酰辅酶A还原酶在天蓝色链霉菌(S.coelicolor)中由ccr编码。CCR同源物和变体是已知的。举例来说，这些同源物和变体包括例如巴豆酰辅酶A还原酶(天蓝色链霉菌A3(2))gi|21224777|ref|NP_630556.1|(21224777)；巴豆酰辅酶A还原酶(天蓝色链霉菌A3(2))gi|4154068|emb|CAA22721.1|(4154068)；巴豆酰辅酶A还原酶(甲基杆菌属物种(Methylobacteriumsp.)4-46)gi|168192678|gb|ACA14625.1|(168192678)；巴豆酰辅酶A还原酶(恒雄芝氏沟鞭藻玫瑰杆菌(Dinoroseobactershibae)DFL12)gi|159045393|ref|YP_001534187.1|(159045393)；巴豆酰辅酶A还原酶(栖沙盐水孢菌(Salinisporaarenicola)CNS-205)gi|159039522|ref|YP_001538775.1|(159039522)；巴豆酰辅酶A还原酶(扭脱甲基杆菌PA1)gi|163849740|ref|YP_001637783.1|(163849740)；巴豆酰辅酶A还原酶(扭脱甲基杆菌PA1)gi|163661345|gb|ABY28712.1|(163661345)；巴豆酰辅酶A还原酶(双向伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaambifaria)AMMD)gi|115360962|ref|YP_778099.1|(115360962)；巴豆酰辅酶A还原酶(食清洁剂细小棒菌(Parvibaculumlavamentivorans)DS-1)gi|154252073|ref|YP_001412897.1|(154252073)；巴豆酰辅酶A还原酶(硅杆菌属物种(Silicibactersp.)TM1040)gi|99078082|ref|YP_611340.1|(99078082)；巴豆酰辅酶A还原酶(自养黄色杆菌(Xanthobacterautotrophicus)Py2)gi|154245143|ref|YP_001416101.1|(154245143)；巴豆酰辅酶A还原酶(类诺卡氏菌属物种(Nocardioidessp.)JS614)gi|119716029|ref|YP_922994.1|(119716029)；巴豆酰辅酶A还原酶(类诺卡氏菌属物种JS614)gi|119536690|gb|ABL81307.1|(119536690)；巴豆酰辅酶A还原酶(栖沙盐水孢菌CNS-205)gi|157918357|gb|ABV99784.1|(157918357)；巴豆酰辅酶A还原酶(恒雄芝氏沟鞭藻玫瑰杆菌DFL12)gi|157913153|gb|ABV94586.1|(157913153)；巴豆酰辅酶A还原酶(双向伯克霍尔德氏菌AMMD)gi|115286290|gb|ABI91765.1|(115286290)；巴豆酰辅酶A还原酶(自养黄色杆菌Py2)gi|154159228|gb|ABS66444.1|(154159228)；巴豆酰辅酶A还原酶(食清洁剂细小棒菌DS-1)gi|154156023|gb|ABS63240.1|(154156023)；巴豆酰辅酶A还原酶(耐辐射甲基杆菌(Methylobacteriumradiotolerans)JCM2831)gi|170654059|gb|ACB23114.1|(170654059)；巴豆酰辅酶A还原酶(禾谷伯克霍尔德氏菌(Burkholderiagraminis)C4D1M)gi|170140183|gb|EDT08361.1|(170140183)；巴豆酰辅酶A还原酶(甲基杆菌属物种4-46)gi|168198006|gb|ACA19953.1|(168198006)；巴豆酰辅酶A还原酶(弗兰克氏菌属物种(Frankiasp.)EAN1pec)gi|158315836|ref|YP_001508344.1|(158315836)，与所述登录号相关的每一个序列均以引用的方式整体并入本文。
作为另外一种选择或除此之外，与亲本微生物或亲本植物相比，本文所提供的微生物或植物包括升高的反式-2-己烯酰辅酶A还原酶表达。所述微生物或植物由包括巴豆酰辅酶A的底物产生包括丁酰辅酶A的代谢物。反式-2-己烯酰辅酶A还原酶还可以将反式-2-己烯酰辅酶A转化成己酰辅酶A。反式-2-己烯酰辅酶A还原酶可以由ter基因、多核苷酸或其同源物编码。ter基因或多核苷酸可以源自于裸藻属(Euglena)。ter基因或多核苷酸可以源自于齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)。来自纤细裸藻(Euglenagracilis)的酶作用于巴豆酰辅酶A并且更缓慢地作用于反式-己-2-烯酰辅酶A和反式-辛-2-烯酰辅酶A。
反式-2-烯酰辅酶A还原酶或TER是能够催化巴豆酰辅酶A向丁酰辅酶A的转化以及反式-2-己烯酰辅酶A向己酰辅酶A的转化的蛋白质。在某些实施方案中，重组微生物或重组植物表达与来自梭菌(Clostridia)和其它细菌物种的Bcd/EtfA/EtfB催化相同反应的TER。已经描述了来自纤细裸藻的线粒体TER，并且源自于许多物种的多种TER蛋白质和具有TER活性的蛋白质已经被鉴定，从而形成TER蛋白质家族(参见例如Cirpus等的美国专利申请2007/0022497；以及Hoffmeister等,J.Biol.Chem.,280:4329-4338,2005，这两篇文献以引用的方式整体并入本文)。纤细裸藻基因的截短型cDNA已经功能性表达于大肠杆菌中。
还可以通过一般公知的生物信息学方法，如BLAST来鉴定TER蛋白质。TER蛋白质的实例包括但不限于来自诸如以下各项的物种的TER：裸藻属物种，包括但不限于纤细裸藻；气单胞菌属物种(Aeromonasspp.)，包括但不限于嗜水气单胞菌(A.hydrophila)；嗜冷单胞菌属物种(Psychromonasspp.)，包括但不限于英氏嗜冷单胞菌(P.ingrahamii)；发光菌属物种(Photobacteriumspp.)，包括但不限于深海发光杆菌(P.profundum)；弧菌属物种(Vibriospp.)，包括但不限于狭小弧菌(V.angustum)、霍乱弧菌(V.cholerae)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、创伤弧菌(V.vulnificus)、费氏弧菌(V.fischeri)、灿烂弧菌(V.splendidus)；希瓦氏菌属物种(Shewanellaspp.)，包括但不限于亚马逊希瓦氏菌(S.amazonensis)、武氏希瓦氏菌(S.woodyi)、冷海希瓦氏菌(S.frigidimarina)、乌贼希瓦氏菌(S.paeleana)、波罗的海希瓦氏菌(S.baltica)、反硝化希瓦氏菌(S.denitrificans)；大洋螺菌属物种(Oceanospirillumspp.)；黄单胞菌属物种(Xanthomonasspp.)，包括但不限于水稻黄单胞菌(X.oryzae)、野油菜黄单胞菌(X.campestris)；色盐杆菌属物种(Chromohalobacterspp.)，包括但不限于需盐色盐杆菌(C.salexigens)；海源菌属物种(Idiomarinaspp.)，包括但不限于波罗的海海源菌(I.baltica)；假交替单胞菌属物种(Pseudoalteromonasspp.)，包括但不限于大西洋假交替单胞菌(P.atlantica)；交替单胞菌属物种(Alteromonasspp.)；噬糖菌属物种(Saccharophagusspp.)，包括但不限于降解噬糖菌(S.degradans)、海洋γ变形菌噬糖菌(S.marinegammaproteobacterium)、α变形菌噬糖菌(S.alphaproteobacterium)；假单胞菌属物种(Pseudomonasspp.)，包括但不限于绿脓杆菌(P.aeruginosa)、恶臭假单胞菌(P.putida)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)；伯克霍尔德氏菌属物种(Burkholderiaspp.)，包括但不限于强壮植物伯克霍尔德氏菌(B.phytofirmans)、新洋葱伯克霍尔德氏菌(B.cenocepacia)、洋葱伯克霍尔德氏菌(B.cepacia)、双向伯克霍尔德氏菌、越南伯克霍尔德氏菌(B.vietnamensis)、多噬伯克霍尔德氏菌(B.multivorans)、勉强伯克霍尔德氏菌(B.dolosa)；甲基菌属物种(Methylbacillusspp.)，包括但不限于鞭毛甲基菌(M.flageliatus)；寡养单胞菌属物种(Stenotrophomonasspp.)，包括但不限于嗜麦芽寡养单胞菌(S.maltophilia)；聚集杆菌属物种(Congregibacterspp.)，包括但不限于岸滨聚集杆菌(C.litoralis)；沙雷氏菌属物种(Serratiaspp.)，包括但不限于变形斑病沙雷氏菌(S.proteamaculans)；海单胞菌属物种(Marinomonasspp.)；木杆菌属物种(Xytellaspp.)，包括但不限于苛养木杆菌(X.fastidiosa)；瑞氏菌属物种(Reinekeaspp.)；科尔韦尔氏菌属物种(Colweffiaspp.)，包括但不限于冷红科尔韦尔氏菌；耶尔森氏菌属物种(Yersiniaspp.)，包括但不限于鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)、假结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis)；甲基小杆菌属物种(Methylobacillusspp.)，包括但不限于鞭毛甲基小杆菌(M.flagellatus)；噬细胞菌属物种(Cytophagaspp.)，包括但不限于哈氏噬细胞菌(C.hutchinsonii)；黄杆菌属物种(Flavobacteriumspp.)，包括但不限于约氏黄杆菌(F.johnsoniae)；微颤菌属物种(Microscillaspp.)，包括但不限于海洋微颤菌(M.marina)；极地杆菌属物种(Polaribacterspp.)，包括但不限于伊氏极地杆菌(P.irgensii)；梭菌属物种(Clostridiumspp.)，包括但不限于丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、拜氏梭菌(C.beijerenckii)、解纤维素梭菌(C.cellulolyticum)；考克斯氏体属物种(Coxiellaspp.)，包括但不限于伯氏考克斯氏体(C.burnetii)。
除了上述之外，术语“反式-2-烯酰辅酶A还原酶”或“TER”还指的是能够催化巴豆酰辅酶A向丁酰辅酶A的转化或反式-2-己烯酰辅酶A向己酰辅酶A的转化的蛋白质，并且所述蛋白质与截短型纤细裸藻TER或全长嗜水气单胞菌TER中的任一者或这两者共有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性、或至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列相似性，如由NCBIBLAST使用默认参数所计算。
在又另一个实施方案中，与亲本微生物或亲本植物相比，本文所提供的重组微生物或重组植物包括升高的丁酰辅酶A脱氢酶表达。这种表达可以与如本文在上文和下文中所述的用于产生1-丁醇、异丁醇、丙酮、辛醇、己醇、2-戊酮、以及丁酰辅酶A的代谢途径中其它酶的表达或过表达组合。所述重组微生物或重组植物由包括巴豆酰辅酶A的底物产生包括丁酰辅酶A的代谢物。丁酰辅酶A脱氢酶可以由bcd基因、多核苷酸或其同源物编码。bcd基因、多核苷酸可以源自于丙酮丁醇梭菌、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)或埃氏巨球形菌(Megasphaeraelsdenii)。
在另一个实施方案中，与亲本微生物或亲本植物相比，本文所提供的重组微生物或重组植物包括乙酰辅酶A乙酰转移酶的表达或升高的表达。所述微生物或植物由包括乙酰辅酶A的底物产生包括乙酰乙酰辅酶A的代谢物。乙酰辅酶A乙酰转移酶可以由thlA基因、多核苷酸或其同源物编码。thlA基因或多核苷酸可以源自于梭菌属。
丙酮酸甲酸裂解酶(甲酸乙酰转移酶)是催化丙酮酸向乙酰辅酶A和甲酸转化的酶。它由pfl激活酶在厌氧条件下通过产生有机自由基而被诱导并且在磷酸盐限制期间显著减少。甲酸乙酰转移酶在大肠杆菌中由pflB编码。PFLB同源物和变体是已知的。举例来说，这些同源物和变体包括例如甲酸乙酰转移酶1(丙酮酸甲酸裂解酶1)gi|129879|sp|P09373.2|PFLB_ECOLI(129879)；甲酸乙酰转移酶1(鼠疫耶尔森氏菌CO92)gi|16121663|ref|NP_404976.1|(16121663)；甲酸乙酰转移酶1(假结核耶尔森氏菌IP32953)gi|51595748|ref|YP_069939.1|(51595748)；甲酸乙酰转移酶1(鼠疫耶尔森氏菌田鼠型生物变种91001菌株)gi|45441037|ref|NP_992576.1|(45441037)；甲酸乙酰转移酶1(鼠疫耶尔森氏菌CO92)gi|115347142|emb|CAL20035.1|(115347142)；甲酸乙酰转移酶1(鼠疫耶尔森氏菌田鼠型生物变种91001菌株)gi|45435896|gb|AAS61453.1|(45435896)；甲酸乙酰转移酶1(假结核耶尔森氏菌IP32953)gi|51589030|emb|CAH20648.1|(51589030)；甲酸乙酰转移酶1(肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒血清型CT18菌株)gi|16759843|ref|NP_455460.1|(16759843)；甲酸乙酰转移酶1(肠道沙门氏菌肠道亚种甲型副伤寒血清型ATCC9150菌株)gi|56413977|ref|YP_151052.1|(56413977)；甲酸乙酰转移酶1(肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒血清型)gi|16502136|emb|CAD05373.1|(16502136)；甲酸乙酰转移酶1(肠道沙门氏菌肠道亚种甲型副伤寒血清型ATCC9150菌株)gi|56128234|gb|AAV77740.1|(56128234)；甲酸乙酰转移酶1(痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)Sd197)gi|82777577|ref|YP_403926.1|(82777577)；甲酸乙酰转移酶1(福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)2a2457T菌株)gi|30062438|ref|NP_836609.1|(30062438)；甲酸乙酰转移酶1(福氏志贺氏菌2a2457T菌株)gi|30040684|gb|AAP16415.1|(30040684)；甲酸乙酰转移酶1(福氏志贺氏菌58401菌株)gi|110614459|gb|ABF03126.1|(110614459)；甲酸乙酰转移酶1(痢疾志贺氏菌Sd197)gi|81241725|gb|ABB62435.1|(81241725)；甲酸乙酰转移酶1(大肠杆菌O157:H7EDL933)gi|12514066|gb|AAG55388.1|AE005279_8(12514066)；甲酸乙酰转移酶1(鼠疫耶尔森氏菌KIM)gi|22126668|ref|NP_670091.1|(22126668)；甲酸乙酰转移酶1(无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)A909)gi|76787667|ref|YP_330335.1|(76787667)；甲酸乙酰转移酶1(鼠疫耶尔森氏菌KIM)gi|21959683|gb|AAM86342.1|AE013882_3(21959683)；甲酸乙酰转移酶1(无乳链球菌A909)gi|76562724|gb|ABA45308.1|(76562724)；甲酸乙酰转移酶1(小肠结肠炎耶尔森氏菌小肠结肠炎亚种(Yersiniaenterocoliticasubsp.enterocolitica)8081)gi|123441844|ref|YP_001005827.1|(123441844)；甲酸乙酰转移酶1(福氏志贺氏菌58401菌株)gi|110804911|ref|YP_688431.1|(110804911)；甲酸乙酰转移酶1(大肠杆菌UTI89)gi|91210004|ref|YP_539990.1|(91210004)；甲酸乙酰转移酶1(鲍氏志贺氏菌(Shigellaboydii)Sb227)gi|82544641|ref|YP_408588.1|(82544641)；甲酸乙酰转移酶1(宋内氏志贺氏菌(Shigellasonnei)Ss046)gi|74311459|ref|YP_309878.1|(74311459)；甲酸乙酰转移酶1(克雷伯氏肺炎菌肺炎亚种(Klebsiellapneumoniaesubsp.pneumoniae)MGH78578)gi|152969488|ref|YP_001334597.1|(152969488)；甲酸乙酰转移酶1(肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒血清型Ty2)gi|29142384|ref|NP_805726.1|(29142384)；甲酸乙酰转移酶1(福氏志贺氏菌2a301菌株)gi|24112311|ref|NP_706821.1|(24112311)；甲酸乙酰转移酶1(大肠杆菌O157:H7EDL933)gi|15800764|ref|NP_286778.1|(15800764)；甲酸乙酰转移酶1(克雷伯氏肺炎菌肺炎亚种MGH78578)gi|150954337|gb|ABR76367.1|(150954337)；甲酸乙酰转移酶1(鼠疫耶尔森氏菌CA88-4125)gi|149366640|ref|ZP_01888674.1|(149366640)；甲酸乙酰转移酶1(鼠疫耶尔森氏菌CA88-4125)gi|149291014|gb|EDM41089.1|(149291014)；甲酸乙酰转移酶1(小肠结肠炎耶尔森氏菌小肠结肠炎亚种8081)gi|122088805|emb|CAL11611.1|(122088805)；甲酸乙酰转移酶1(宋内氏志贺氏菌Ss046)gi|73854936|gb|AAZ87643.1|(73854936)；甲酸乙酰转移酶1(大肠杆菌UTI89)gi|91071578|gb|ABE06459.1|(91071578)；甲酸乙酰转移酶1(肠道沙门氏菌肠道亚种伤寒血清型Ty2)gi|29138014|gb|AAO69575.1|(29138014)；甲酸乙酰转移酶1(鲍氏志贺氏菌Sb227)gi|81246052|gb|ABB66760.1|(81246052)；甲酸乙酰转移酶1(福氏志贺氏菌2a301菌株)gi|24051169|gb|AAN42528.1|(24051169)；甲酸乙酰转移酶1(大肠杆菌O157:H7Sakai菌株)gi|13360445|dbj|BAB34409.1|(13360445)；甲酸乙酰转移酶1(大肠杆菌O157:H7Sakai菌株)gi|15830240|ref|NP_309013.1|(15830240)；甲酸乙酰转移酶I(丙酮酸甲酸裂解酶1)(发光光杆状菌劳氏亚种(Photorhabdusluminescenssubsp.laumondii)TTO1)gi|36784986|emb|CAE13906.1|(36784986)；甲酸乙酰转移酶I(丙酮酸甲酸裂解酶1)(发光光杆状菌劳氏亚种TTO1)gi|37525558|ref|NP_928902.1|(37525558)；甲酸乙酰转移酶(金黄色葡萄球菌金黄色亚种Mu50)gi|14245993|dbj|BAB56388.1|(14245993)；甲酸乙酰转移酶(金黄色葡萄球菌金黄色亚种Mu50)gi|15923216|ref|NP_370750.1|(15923216)；甲酸乙酰转移酶(丙酮酸甲酸裂解酶)gi|81706366|sp|Q7A7X6.1|PFLB_STAAN(81706366)；甲酸乙酰转移酶(丙酮酸甲酸裂解酶)gi|81782287|sp|Q99WZ7.1|PFLB_STAAM(81782287)；甲酸乙酰转移酶(丙酮酸甲酸裂解酶)gi|81704726|sp|Q7A1W9.1|PFLB_STAAW(81704726)；甲酸乙酰转移酶(金黄色葡萄球菌金黄色亚种Mu3)gi|156720691|dbj|BAF77108.1|(156720691)；甲酸乙酰转移酶(胡萝卜软腐欧文氏菌黑胫亚种(Erwiniacarotovorasubsp.atroseptica)SCRI1043)gi|50121521|ref|YP_050688.1|(50121521)；甲酸乙酰转移酶(胡萝卜软腐欧文氏菌黑胫亚种SCRI1043)gi|49612047|emb|CAG75496.1|(49612047)；甲酸乙酰转移酶(金黄色葡萄球菌金黄色亚种Newman菌株)gi|150373174|dbj|BAF66434.1|(150373174)；甲酸乙酰转移酶(奥奈达湖希瓦氏菌(Shewanellaoneidensis)MR-1)gi|24374439|ref|NP_718482.1|(24374439)；甲酸乙酰转移酶(奥奈达湖希瓦氏菌MR-1)gi|24349015|gb|AAN55926.1|AE015730_3(24349015)；甲酸乙酰转移酶(胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)3型血清型JL03菌株)gi|165976461|ref|YP_001652054.1|(165976461)；甲酸乙酰转移酶(胸膜肺炎放线杆菌3型血清型JL03菌株)gi|165876562|gb|ABY69610.1|(165876562)；甲酸乙酰转移酶(金黄色葡萄球菌金黄色亚种MW2)gi|21203365|dbj|BAB94066.1|(21203365)；甲酸乙酰转移酶(金黄色葡萄球菌金黄色亚种N315)gi|13700141|dbj|BAB41440.1|(13700141)；甲酸乙酰转移酶(金黄色葡萄球菌金黄色亚种Newman菌株)gi|151220374|ref|YP_001331197.1|(151220374)；甲酸乙酰转移酶(金黄色葡萄球菌金黄色亚种Mu3)gi|156978556|ref|YP_001440815.1|(156978556)；甲酸乙酰转移酶(聚球藻属物种(Synechococcussp.)JA-2-3B'a(2-13))gi|86607744|ref|YP_476506.1|(86607744)；甲酸乙酰转移酶(聚球藻属物种JA-3-3Ab)gi|86605195|ref|YP_473958.1|(86605195)；甲酸乙酰转移酶(肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)D39)gi|116517188|ref|YP_815928.1|(116517188)；甲酸乙酰转移酶(聚球藻属物种JA-2-3B'a(2-13))gi|86556286|gb|ABD01243.1|(86556286)；甲酸乙酰转移酶(聚球藻属物种JA-3-3Ab)gi|86553737|gb|ABC98695.1|(86553737)；甲酸乙酰转移酶(诺氏梭菌(Clostridiumnovyi)NT)gi|118134908|gb|ABK61952.1|(118134908)；甲酸乙酰转移酶(金黄色葡萄球菌金黄色亚种MRSA252)gi|49482458|ref|YP_039682.1|(49482458)；以及甲酸乙酰转移酶(金黄色葡萄球菌金黄色亚种MRSA252)gi|49240587|emb|CAG39244.1|(49240587)，与所述登录号相关的每一个序列均以引用的方式整体并入本文。
乙酰乙酰辅酶A硫解酶(有时也被称为乙酰辅酶A乙酰转移酶)催化由两个乙酰辅酶A分子产生乙酰乙酰辅酶A。根据所用的生物体，异源性乙酰乙酰辅酶A硫解酶(乙酰辅酶A乙酰转移酶)可以被工程化以在生物体中表达。或者，天然乙酰乙酰辅酶A硫解酶(乙酰辅酶A乙酰转移酶)可以被过表达。乙酰乙酰辅酶A硫解酶在大肠杆菌中由thl编码。乙酰辅酶A乙酰转移酶在丙酮丁醇梭菌中由atoB编码。THL和AtoB同源物和变体是已知的。举例来说，这些同源物和变体包括例如乙酰辅酶A乙酰转移酶(硫解酶)(天蓝色链霉菌A3(2))gi|21224359|ref|NP_630138.1|(21224359)；乙酰辅酶A乙酰转移酶(硫解酶)(天蓝色链霉菌A3(2))gi|3169041|emb|CAA19239.1|(3169041)；乙酰辅酶A乙酰转移酶(硫解酶)(泊库岛食烷菌(Alcanivoraxborkumensis)SK2)gi|110834428|ref|YP_693287.1|(110834428)；乙酰辅酶A乙酰转移酶(硫解酶)(泊库岛食烷菌SK2)gi|110647539|emb|CAL17015.1|(110647539)；乙酰辅酶A乙酰转移酶(硫解酶)(红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)NRRL2338)gi|133915420|emb|CAM05533.1|(133915420)；乙酰辅酶A乙酰转移酶(硫解酶)(红色糖多孢菌NRRL2338)gi|134098403|ref|YP_001104064.1|(134098403)；乙酰辅酶A乙酰转移酶(硫解酶)(红色糖多孢菌NRRL2338)gi|133911026|emb|CAM01139.1|(133911026)；乙酰辅酶A乙酰转移酶(硫解酶)(肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)AATCC3502菌株)gi|148290632|emb|CAL84761.1|(148290632)；乙酰辅酶A乙酰转移酶(硫解酶)(绿脓杆菌UCBPP-PA14)gi|115586808|gb|ABJ12823.1|(115586808)；乙酰辅酶A乙酰转移酶(硫解酶)(耐金属贪铜菌(Ralstoniametallidurans)CH34)gi|93358270|gb|ABF12358.1|(93358270)；乙酰辅酶A乙酰转移酶(硫解酶)(耐金属贪铜菌CH34)gi|93357190|gb|ABF11278.1|(93357190)；乙酰辅酶A乙酰转移酶(硫解酶)(耐金属贪铜菌CH34)gi|93356587|gb|ABF10675.1|(93356587)；乙酰辅酶A乙酰转移酶(硫解酶)(真氧产碱杆菌JMP134)gi|72121949|gb|AAZ64135.1|(72121949)；乙酰辅酶A乙酰转移酶(硫解酶)(真氧产碱杆菌JMP134)gi|72121729|gb|AAZ63915.1|(72121729)；乙酰辅酶A乙酰转移酶(硫解酶)(真氧产碱杆菌JMP134)gi|72121320|gb|AAZ63506.1|(72121320)；乙酰辅酶A乙酰转移酶(硫解酶)(真氧产碱杆菌JMP134)gi|72121001|gb|AAZ63187.1|(72121001)；乙酰辅酶A乙酰转移酶(硫解酶)(大肠杆菌)gi|2764832|emb|CAA66099.1|(2764832)，与所述登录号相关的每一个序列均以引用的方式整体并入本文。
丁酰辅酶A脱氢酶是催化巴豆酰辅酶A向丁酰辅酶A的还原的蛋白质途径中的酶。丁酰辅酶A脱氢酶复合体(Bcd/EtfAB)使巴豆酰辅酶A向丁酰辅酶A的还原与铁氧还蛋白的还原偶联。根据所用的生物体，异源性丁酰辅酶A脱氢酶可以被工程化以在生物体中表达。或者，天然丁酰辅酶A脱氢酶可以被过表达。丁酰辅酶A脱氢酶在丙酮丁醇梭菌和埃氏巨球形菌中由bcd编码。BCD同源物和变体是已知的。举例来说，这些同源物和变体包括例如丁酰辅酶A脱氢酶(丙酮丁醇梭菌ATCC824)gi|15895968|ref|NP_349317.1|(15895968)；丁酰辅酶A脱氢酶(丙酮丁醇梭菌ATCC824)gi|15025744|gb|AAK80657.1|AE007768_11(15025744)；丁酰辅酶A脱氢酶(肉毒梭菌AATCC3502菌株)gi|148381147|ref|YP_001255688.1|(148381147)；丁酰辅酶A脱氢酶(肉毒梭菌AATCC3502菌株)gi|148290631|emb|CAL84760.1|(148290631)，与所述登录号相关的每一个序列均以引用的方式整体并入本文。BCD可以与黄素蛋白电子转移蛋白组合表达。有用的黄素蛋白电子转移蛋白亚基在丙酮丁醇梭菌和埃氏巨球形菌中由基因etfA和etfB(或操纵子etfAB)表达。ETFA、ETFB以及ETFAB同源物和变体是已知的。举例来说，这些同源物和变体包括例如电子转移黄素蛋白的推定α-亚基，gi|1055221|gb|AAA95970.1|(1055221)；电子转移黄素蛋白的推定β-亚基，gi|1055220|gb|AAA95969.1|(1055220)，与所述登录号相关的每一个序列均以引用的方式整体并入本文。
在另外的其它实施方案中，除了前述物质中的任一种以及前述物质的组合之外，还可以使用另外的基因/酶产生所期望的产物。举例来说，下表提供了可以与rGS途径酶组合用于产生1-丁醇的酶：
*基因敲除或表达的减少在产物的合成中是任选的，然而，这些基因敲除增加了各种底物中间产物并且提高了收率。
除此之外并且如上所述，可用于产生代谢物的酶的同源物由本文所提供的微生物、植物以及方法所涵盖。对于第一家族或物种的原始酶或基因所使用的术语“同源物”指的是第二家族或物种的不同的酶或基因，它们由功能分析、结构分析或基因组分析确定为对应于第一家族或物种的原始酶或基因的第二家族或物种的酶或基因。最经常，同源物将具有功能相似性、结构相似性或基因组相似性。用以使得酶或基因的同源物可以容易地使用基因探针和PCR进行克隆的技术是已知的。可以使用功能测定和/或通过对基因进行基因组定位来确认所克隆的序列作为同源物的身份。
如果编码蛋白质的核酸序列与编码第二蛋白质的核酸序列具有类似的序列，那么所述蛋白质与所述第二蛋白质具有“同源性”或是“同源的”。或者，如果蛋白质和第二蛋白质具有“类似的”氨基酸序列，那么这两种蛋白质具有同源性。(因此，术语“同源蛋白”被定义为意指两种蛋白质具有类似的氨基酸序列)。
如本文所用，当氨基酸序列具有至少约30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性时，两种蛋白质(或所述蛋白质的区域)是基本上同源的。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，将所述序列比对以实现最佳比较的目的(例如，可以将空位引入到第一氨基酸或核酸序列和第二氨基酸或核酸序列中的一个或这两者中以进行最佳比对并且出于比较目的，可以不考虑非同源序列)。在一个实施方案中，参考序列的出于比较目的所比对的长度是参考序列的长度的至少30％，通常至少40％，更通常至少50％，甚至更通常至少60％，并且甚至更通常至少70％、80％、90％、100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置与第二序列中的相应位置由相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置处是相同的(如本文所用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。在考虑到需要被引入以将两个序列进行最佳比对的空位数目以及每一个空位的长度的情况下，两个序列之间的同一性百分比是所述序列共有的相同位置的数目的函数。
当关于蛋白质或肽使用“同源”时，应当认识到的是，不相同的残基位置往往区别在于保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被含有具有类似的化学特性(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基取代的氨基酸取代。一般来说，保守氨基酸取代将基本上不改变蛋白质的功能特性。在其中两个或更多个氨基酸序列彼此不同之处在于保守取代的情况下，序列同一性百分比或同源度可以向上调整以针对取代的保守性进行校正。用于作出这种调整的手段是本领域技术人员公知的(参见例如Pearson等,1994，其在此以引用的方式并入本文)。
在一些情况下，可以使用“同工酶”，所述同工酶进行相同的功能性转化/反应，但是在结构上是如此不相似以使得它们通常被确定为不“同源的”。举例来说，tktB是tktA的同工酶，talA是talB的同工酶并且rpiB是rpiA的同工酶。
“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基所置换的保守氨基酸取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已加以定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。以下六组各自含有彼此是保守取代的氨基酸：1)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)；以及6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
多肽的序列同源性还可以被称为序列同一性百分比，通常是使用序列分析软件来测量的。参见例如威斯康星州麦迪逊的大学街910号威斯康星大学生物技术中心遗传学计算机组(GCG)(邮编：53705)(GeneticsComputerGroup(GCG),UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter,910UniversityAvenue,Madison,Wis.53705)的序列分析软件包。蛋白质分析软件使用分配给包括保守氨基酸取代在内的各种取代、缺失以及其它修饰的同源性度量来匹配类似的序列。举例来说，GCG含有诸如“Gap”和“Bestfit”的程序，所述程序可以应用默认参数确定密切相关的多肽，如来自不同物种的生物体的同源多肽之间或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见例如GCG6.1版。
用于将分子序列与含有来自不同生物体的很多序列的数据库比较的典型算法是计算机程序BLAST(Altschul,1990；Gish,1993；Madden,1996；Altschul,1997；Zhang,1997)，特别是blastp或tblastn(Altschul,1997)。BLASTp的典型参数是：期望值：10(默认)；过滤程序：seg(默认)；空位开放罚分：11(默认)；空位延伸罚分：1(默认)；最大比对：100(默认)；字长：11(默认)；说明数：100(默认)；罚分矩阵：BLOWSUM62。
当搜索含有来自很多不同的生物体的序列的数据库时，比较氨基酸序列是典型的。使用氨基酸序列进行的数据库搜索可以通过除blastp以外的本领域已知的算法来测量。举例来说，可以使用FASTA来比较多肽序列，所述FASTA是GCG6.1版中的一个程序。FASTA提供了查询序列与搜索序列之间最佳重叠区的比对和序列同一性百分比(Pearson,1990，其在此以引用的方式并入本文)。举例来说，可以使用FASTA以它的默认参数(字长2和PAM250得分矩阵)来确定氨基酸序列之间的序列同一性百分比，如GCG6.1版中所提供，该GCG6.1版在此以引用的方式并入本文。
本公开提供了可用于产生本文所述的重组微生物或重组植物的各种基因、同源物以及变体的登录号。应当了解的是，本文所述的同源物和变体是示例性的和非限制性的。另外的同源物、变体以及序列可由本领域技术人员使用各种数据库来获得，所述数据库包括例如可在万维网(World-Wide-Web)上进行访问的国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI)。
适用于本文所提供的重组微生物或重组植物的生长和维持的培养条件描述于以下实施例中。本领域技术人员将认识到的是，这些条件可以被改动以适应每一种微生物或植物的要求。可用于产生乙酰磷酸、乙酰辅酶A或由其衍生的包括但不限于1-丁醇、正己醇、2-戊酮和/或辛醇产物的其它代谢物的适当的培养条件包括以下条件：培养基pH值、离子强度、营养含量等；温度；氧气/CO2/氮气含量；湿度；光以及容许由宿主微生物或植物，即通过微生物或植物的代谢作用产生所述化合物的其它培养条件。用于可以用作宿主细胞的微生物和植物(包括植物细胞)的适当的培养条件是公知的。
应当了解的是，多种微生物和植物可以被修饰以包括适用于产生其它化学品，如正丁醇、正己醇以及辛醇的重组代谢途径。还应当了解的是，各种微生物或植物可以充当编码适用于本文所提供的重组微生物或重组植物中的靶酶的遗传物质的“来源”。
术语“微生物”包括来自古菌域(Archaea)、细菌域(Bacteria)以及真核生物域(Eucarya)的原核微生物物种和真核微生物物种，后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类、或高等原生生物。术语“微生物细胞”和“微生物(microbe)”与术语微生物(microorganism)可互换使用。
术语“原核生物”是本领域公认的并且指的是不含核或其它细胞器的细胞。原核生物一般被分类为细菌域和古菌域这两个域之一。古菌域和细菌域的生物体之间的明确差异是基于16S核糖体RNA在核苷酸碱基序列上的根本差异。
术语“古菌”指的是疵壁菌门(Mendosicutes)的生物体的分类，它们通常存在于不寻常的环境中并且根据若干标准区别于其余原核生物，所述标准包括核糖体蛋白的数量以及细胞壁中胞壁酸的缺乏。基于ssrRNA分析，古菌由两个在系统发育上不同的种群组成：泉古菌门(Crenarchaeota)和广古菌门(Euryarchaeota)。基于它们的生理机能，古菌可以被组织成三种类型：产甲烷菌(产生甲烷的原核生物)；极端嗜盐菌(在非常高的盐([NaCl])浓度下生存的原核生物)；以及极端(超)嗜热菌(在非常高的温度下生存的原核生物)。除了将它们与细菌区分开来的统一的古菌特征(即细胞壁中无胞壁质、酯连接的膜脂质等)之外，这些原核生物还表现出独特的结构属性或生物化学属性，这些属性使它们适应于它们特定的生境。泉古菌门主要由超嗜热性硫依赖性原核生物组成并且广古菌门含有产甲烷菌和极端嗜盐菌。
“细菌”或“真细菌(eubacteria)”指的是原核生物体的一个域。细菌包括如下的至少11个不同的种群：(1)革兰氏阳性(gram+)细菌，其中存在两个主要的分支：(1)高G+C群(放线菌(Actinomycetes)、分枝杆菌(Mycobacteria)、微球菌(Micrococcus)等)，(2)低G+C群(芽孢杆菌(Bacillus)、梭菌、乳酸杆菌(Lactobacillus)、葡萄球菌(Staphylococci)、链球菌(Streptococci)、支原体(Mycoplasmas))；(2)变形菌门(Proteobacteria)，例如紫色光合+非光合革兰氏阴性细菌(包括大部分“常见的”革兰氏阴性细菌)；(3)蓝细菌(Cyanobacteria)，例如生氧光能利用菌；(4)螺旋体和相关物种；(5)浮霉状菌属(Planctomyces)；(6)拟杆菌属(Bacteroides)、黄杆菌属(Flavobacteria)；(7)衣原体；(8)绿色硫细菌；(9)绿色非硫细菌(也是厌氧光能利用菌)；(10)耐辐射微球菌(Radioresistantmicrococci)和相关细菌；以及(11)热袍菌属(Thermotoga)和嗜热栖热腔菌(Thermosiphothermophiles)。
“革兰氏阴性细菌”包括球菌、非肠道杆菌、以及肠道杆菌。革兰氏阴性细菌属包括例如奈瑟菌属(Neisseria)、螺旋菌属(Spirillum)、巴氏杆菌属(Pasteurella)、布鲁氏菌属(Brucella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、波氏杆菌属(Bordetella)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、弧菌属(Vibrio)、假单胞菌属(Pseudomonas)、拟杆菌属(Bacteroides)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、气杆菌属(Aerobacter)、农杆菌属(Agrobacterium)、固氮菌属(Azotobacter)、螺菌属(Spirilla)、沙雷氏菌属(Serratia)、弧菌属、根瘤菌属(Rhizobium)、衣原体属、立克次氏体属(Rickettsia)、密螺旋体属(Treponema)、以及梭杆菌属(Fusobacterium)。
“革兰氏阳性细菌”包括球菌、非产芽孢杆菌、以及产芽孢杆菌。革兰氏阳性细菌属包括例如放线菌属(Actinomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、李斯特菌属(Listeria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、粘球菌属(Myxococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)以及链霉菌属(Streptomyces)。
本公开包括重组微生物，其包含图1、图2以及图5中所示的rGS途径的至少一种重组酶。举例来说，化能自养菌、光能自养菌、以及蓝细菌可以包含天然苹果酸硫激酶，因此，通过使表达依赖于非天然启动子来使sucC-2/sucD-2过表达在与图1、图2以及图5的其它适当的酶组合时可以产生代谢物来驱动rGS途径。另外的酶可以被重组工程化以进一步优化代谢通量，包括例如平衡ATP、NADH、NADPH以及其它辅因子利用和产生。
在另一个实施方案中，提供了一种产生重组微生物的方法，所述重组微生物包含包括rGS途径的优化的碳利用率，以将诸如丁二酸的4碳底物转化成乙酰辅酶A或由其衍生的其它代谢物，包括但不限于1-丁醇、2-戊酮、异丁醇、正己醇和/或辛醇。所述方法包括将微生物用编码选自由以下各项组成的组的多肽的一种或多种重组多核苷酸转化：苹果酸硫激酶(例如sucC-2/sucD-2)、苹果酰辅酶A裂解酶(例如mcl1)、以及异柠檬酸裂解酶(例如aceA)。
在另一个实施方案中，如先前所提到，将如上述实施方案中的任一个中所阐述的重组生物体在一定条件下培养以使酶多肽中的任一种/全部表达，然后将培养物裂解或制备无细胞制剂，所述无细胞制备具有必要的酶活性以进行图1、图2或图5中所示的途径和/或产生1-丁醇、异丁醇、正己醇、辛醇、2-戊酮以及其它产物(参见例如图12A-F)。
除了微生物之外，本公开的途径还可以被工程化到植物中以获得由4碳底物产生乙酰辅酶A的转基因植物或重组植物。
碳固定是二氧化碳被并入到有机化合物中的过程。在将阳光转化成生物燃料的过程中，植物吸收二氧化碳和水。植物和藻类中的碳固定是通过卡尔文-本森循环(Calvin-BensonCycle)实现的。卡尔文-本森循环的生产率在许多条件下是受羧化酶Rubisco的缓慢速率和底物特异性的缺乏所限制的。多条证据表明尽管Rubisco存在缺点，但是Rubisco可能已经经过天然优化并且因此它的改良潜能是非常有限的。本公开提供了一种替代途径，该替代途径能够以更高的速率支持碳固定而努力实现可持续性。
根据本公开的一个实施方案，本公开的多核苷酸表达于光合生物体(例如高等植物、藻类或蓝细菌)的细胞中。如本文所用的术语“植物”涵盖了整株植物、植物的祖代和后代以及植物部分，包括种子、枝条、茎(stem)、根(包括块茎)、以及植物的细胞、组织和器官。植物可以呈任何形式，包括悬浮培养物、胚芽、分生组织区、愈伤组织、叶、配子体、孢子体、花粉、以及小孢子。特别可用于本公开的方法中的植物包括属于绿色植物(Viridiplantee)超家族的所有植物，特别是单子叶植物和双子叶植物，包括选自包括以下各项的清单的饲料或草料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树木、或灌木：金合欢属物种(Acaciaspp.)、槭属物种(Acerspp.)、猕猴桃属物种(Actinidiaspp.)、七叶树属物种(Aesculusspp.)、南方贝壳杉(Agathisaustralis)、阔荚合欢(Albiziaamara)、三色桫椤(Alsophilatricolor)、印须芒草属物种(Andropogonspp.)、落花生属物种(Arachisspp.)、槟榔(Arecacatechu)、聚星草(Asteliafragrans)、鹰嘴紫云英(Astragaluscicer)、多小叶红苏木(Baikiaeaplurijuga)、桦属物种(Betulaspp.)、芸苔属物种(Brassicaspp.)、木榄(Bruguieragymnorrhiza)、红紫丁香(Burkeaafricana)、紫铆(Buteafrondosa)、伞形科植物(Cadabafarinosa)、朱缨花属物种(Calliandraspp.)、大叶茶(Camelliasinensis)、美人蕉(Cannaindica)、辣椒属物种(Capsicumspp.)、决明属物种(Cassiaspp.)、山珠豆(Centroemapubescens)、木瓜属物种(Chacoomelesspp.)、肉桂(Cinnamomumcassia)、小果咖啡(Coffeaarabica)、可乐豆木(Colophospermummopane)、绣球小冠花(Coronilliavaria)、栒子(Cotoneasterserotina)、山楂属物种(Crataegusspp.)、香瓜属物种(Cucumisspp.)、柏木属物种(Cupressusspp.)、银蕨(Cyatheadealbata)、榅桲(Cydoniaoblonga)、日本柳杉(Cryptomeriajaponica)、香茅属物种(Cymbopogonspp.)、银叶蕨(Cyntheadealbata)、榅桲(Cydoniaoblonga)、货贝黄檀(Dalbergiamonetaria)、大叶骨碎补(Davalliadivaricata)、山马蝗属物种(Desmodiumspp.)、粗糙蚌壳蕨(Dicksoniasquarosa)、拢双黄茅(Dibeteropogonamplectens)、迪奥豆属物种(Diocleaspp.)、镰扁豆属物种(Dolichosspp.)、豆瑞(Dorycniumrectum)、金字塔稗(Echinochloapyramidalis)、Ehraffia属物种(Ehraffiaspp.)、穇子(Eleusinecoracana)、画眉草属物种(Eragrestisspp.)、刺桐属物种(Erythrinaspp.)、桉属物种(Eucalypfusspp.)、希氏假乌木(Eucleaschimperi)、金茅(Eulaliavi/losa)、荞麦属物种(Pagopyrumspp.)、费约果(Feijoasellowlana)、草莓属物种(Fragariaspp.)、千斤拔属物种(Flemingiaspp.)、河岸藤露兜树(Freycinetiabanksli)、东亚老鹤草(Geraniumthunbergii)、银杏(GinAgobiloba)、野大豆(Glycinejavanica)、墨西哥丁香属物种(Gliricidiaspp.)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)、银桦属物种(Grevilleaspp.)、鞘籽古夷苏木(Guibourtiacoleosperma)、岩黄芪属物种(Hedysarumspp.)、牛鞭草(Hemaffhiaaltissima)、扭黄茅(Heteropogoncontoffus)、大麦(Hordeumvulgare)、红苞茅(Hyparrheniarufa)、小连翘(Hypericumerectum)、Hypeffheliadissolute、野生木蓝(Indigoincamata)、鸢尾属物种(Irisspp.)、雨伞草(Leptarrhenapyrolifolia)、胡枝子属物种(Lespedizaspp.)、莴苣属物种(Lettucaspp.)、银合欢(Leucaenaleucocephala)、单罗得草(Loudetiasimplex)、罗顿豆(Lotonusbainesli)、百脉根属物种(Lotusspp.)、阿切尔结豆(Macrotylomaaxillare)、苹果属物种(Malusspp.)、木薯(Manihotesculenta)、紫花苜蓿(Medicagosaliva)、水杉(Metasequoiaglyptostroboides)、大蕉(Musasapientum)、烟草属物种(Nicotianumspp.)、驴食豆属物种(Onobrychisspp.)、鸟足豆属物种(Ornithopusspp.)、稻属物种(Oryzaspp.)、非洲双翼豆(Peltophorumafricanum)、狼尾草属物种(Pennisetumspp.)、鳄梨(Perseagratissima)、碧冬茄属物种(Petuniaspp.)、菜豆属物种(Phaseolusspp.)、槟榔竹(Phoenixcanariensis)、新西兰剑麻(Phormiumcookianum)、石楠属物种(Photiniaspp.)、白云杉(Piceaglauca)、松属物种(Pinusspp.)、豌豆(Pisumsativam)、新西兰罗汉松(Podocarpustotara)、斑点普格纳西亚草(Pogonarthriafleckii)、糙普格纳西亚草(Pogonaffhriasquarrosa)、白杨属物种(Populusspp.)、牧豆树(Prosopiscineraria)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)、星状老虎刺(Pterolobiumstellatum)、西洋梨(Pyruscommunis)、栎属物种(Quercusspp.)、厚叶石斑木(Rhaphiolepsisumbellata)、棒花棕(Rhopalostylissapida)、纳塔尔漆树(Rhusnatalensis)、欧洲醋栗(Ribesgrossularia)、茶藨子属物种(Ribesspp.)、剌槐(Rpbiniapseudoacacia)、蔷薇属物种(Rosaspp.)、悬钩子属物种(Rubusspp.)、柳属物种(Salixspp.)、红裂稃草(Schyzachyriumsanguineum)、金松(Sciadopitysvefficillata)、北美红杉(Sequoiasempervirens)、巨杉(Sequoiadendrongiganteum)、双色高梁(Sorghumbicolor)、菠菜属物种(Spinaciaspp.)、流苏状鼠尾粟(Sporobolusfimbriatus)、Stiburusalopecuroides、矮柱花草(Stylosanthoshumilis)、葫芦茶属物种(Tadehagispp.)、落羽松(Taxodiumdistichum)、阿拉伯黄背草(Themedatriandra)、三叶草属物种(Trifoliumspp.)、小麦属物种(Triticumspp.)、加州铁杉(Tsugaheterophylla)、越桔属物种(Vacciniumspp.)、蚕豆属物种(Viciaspp.)、葡萄(Vitisvinifera)、锥穗沃森花(Watsoniapyramidata)、马蹄莲(Zantedeschiaaethiopica)、玉蜀黍(Zeamays)、苋属植物、洋蓟、芦笋、西兰花、球芽甘蓝、卷心菜、坎诺拉、胡萝卜、花椰菜、芹菜、散叶甘蓝(collardgreens)、亚麻、羽衣甘蓝、小扁豆、油菜、秋葵、洋葱、马铃薯、水稻、大豆、稻草、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜、茶、树木。或者，藻类和其它非绿色植物可以用于本公开的方法。
编码本公开的rGS途径的酶的多核苷酸的表达可以来自于组织特异性启动子、诱导型启动子或组成型启动子。组成型植物启动子的实例包括但不限于CaMV35S和CaMV19S启动子、烟草花叶病毒(TMV)启动子、FMV34S启动子、甘蔗杆状病毒(sugarcanebacilliformbadnavirus)启动子、CsVMV启动子、拟南芥ACT2/ACT8肌动蛋白启动子、拟南芥泛素UBQ1启动子、大麦叶硫堇BTH6启动子、以及水稻肌动蛋白启动子。
诱导型启动子是由特定的刺激诱导的启动子，所述刺激诸如胁迫条件，包括例如光、温度、化学品、干旱、高盐度、渗透性冲击、氧化剂条件或在病原情况下。诱导型启动子的实例包括但不限于源自于豌豆rbcS基因的光诱导型启动子、来自苜蓿rbcS基因的启动子、在干旱中具有活性的启动子DRE、MYC以及MYB；在高盐度和渗透胁迫下具有活性的启动子INT、INPS、prxEa、Hahspl7.7G4以及RD21；以及在病原胁迫下具有活性的启动子hsr203J和str246C。
可以使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔、生物射弹(基因枪)以及本领域技术人员公知的其它技术将包含rGS途径的一种或多种酶的核酸构建体引入到植物细胞中。参见例如Weissbach和Weissbach[MethodsforPlantMolecularBiology(《植物分子生物学方法》),纽约州的学术出版社(AcademicPress,NY),第VIII部分,第421-463页(1988)]。本领域公知的其它表达系统，如昆虫和哺乳动物宿主细胞系统也可以由本公开使用。
将了解的是，除了含有对于所插入的编码序列(编码多肽)的转录和翻译来说必要的元件以外，本公开的表达构建体还可以包括被工程化以优化所表达的多肽的稳定性、产生、纯化、收率或活性的序列。
本公开的酶可以与叶绿体靶向肽一起表达。叶绿体靶向序列是本领域已知的并且包括以下各项：核酮糖-1,5-双磷酸羧化酶(Rubisco)的叶绿体小亚基(deCastroSilvaFilho等(1996)PlantMol.Biol.30:769-780；Schnell等(1991)J.Biol.Chem.266(5):3335-3342)；5-(烯醇式丙酮酰)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer等(1990)J.Bioenerg.Biomemb.22(6):789-810)；色氨酸合酶(Zhao等(1995)J.Biol.Chem.270(ll):6081-6087)；质体蓝素(Lawrence等(1997)J.Biol.Chem.272(33):20357-20363)；分支酸合酶(Schmidt等(1993)J.Biol.Chem.268(36):27447-27457)；以及集光叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)(Lamppa等(1988)J.Biol.Chem.263:14996-14999)。还参见VonHeijne等(1991)PlantMol.Biol.Rep.9:104-126；Clark等(1989)J.Biol.Chem.264:17544-17550；Della-Cioppa等(1987)PlantPhysiol.84:965-968；Romer等(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421；以及Shah等(1986)Science233:478-481。
可以使用各种方法将本公开的表达载体引入到宿主细胞系统中。这些方法大体上描述于以下文献中：Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual(《分子克隆：实验室手册》),纽约州的冷泉港实验室(ColdSpringsHarborLaboratory,NewYork)(1989、1992)；Ausubel等,CurrentProtocolsinMolecularBiology(《最新分子生物学实验方法汇编》),马里兰州巴尔的摩的约翰威立出版公司(JohnWileyandSons,Baltimore,Md.)(1989)；Chang等,SomaticGeneTherapy(《体细胞基因疗法》),密歇根州安娜堡的CRC出版社(CRCPress,AnnArbor,Mich.)(1995)；Vega等,GeneTargeting(《基因靶向》),密歇根州安娜堡的CRC出版社(1995)；Vectors:ASurveyofMolecularCloningVectorsandTheirUses(《载体：分子克隆载体以及它们的用途的调查研究》),马萨诸塞州波士顿的巴特沃思公司(Butterworths,BostonMass.)(1988)；以及Gilboa等[Biotechniques4(6):504-512,1986]，并且包括例如稳定或瞬时的转染、脂质体转染、电穿孔以及用重组病毒载体进行的感染。此外，关于正负选择法，参见美国专利号5,464,764和5,487,992。
可以将植物细胞用本公开的核酸构建体稳定转化或瞬时转化。在稳定转化中，本公开的核酸分子被整合到植物基因组中并且因而，它代表稳定的和遗传的性状。在瞬时转化中，核酸分子由转化的细胞表达，但是它没有被整合到基因组中并且因而，它代表瞬时的性状。
存在将外来基因引入到单子叶植物和双子叶植物这两者中的各种方法(Potrykus,I.,Annu.Rev.Plant.Physiol.,Plant.Mol.Biol.(1991)42:205-225；Shimamoto等,Nature(1989)338:274-276)。
引起外源性DNA向植物基因组DNA中的稳定整合的主要方法包括两种主要的途径：(i)农杆菌介导的基因转移：Klee等(1987)Annu.Rev.PlantPhysiol.38:467-486；Klee和Rogers,CellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants(《植物细胞培养和体细胞遗传学》),第6卷,MolecularBiologyofPlantNuclearGenes(《植物核基因的分子生物学》),Schell,J.和Vasil,L.K.编著,加利福尼亚州圣迭戈的学术出版社(AcademicPublishers,SanDiego,Calif.)(1989)第2-25页；Gatenby,PlantBiotechnology(《植物生物技术》),Kung,S.和Arntzen,C.J.编著,马萨诸塞州波士顿的巴特沃思出版社(ButterworthPublishers,Boston,Mass.)(1989)第93-112页；以及(ii)直接DNA吸收：Paszkowski等,CellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants(《植物细胞培养和体细胞遗传学》),第6卷,MolecularBiologyofPlantNuclearGenes(《植物核基因的分子生物学》),Schell,J.和Vasil,L.K.编著,加利福尼亚州圣迭戈的学术出版社(1989)第52-68页；包括用于使DNA直接吸收到原生质体中的方法：Toriyama,K.等(1988)Bio/Technology6:1072-1074。通过短暂电击植物细胞所诱导的DNA吸收：Zhang等,PlantCellRep.(1988)7:379-384；Fromm等,Nature(1986)319:791-793。通过以下方式将DNA注射到植物细胞或植物组织中：粒子轰击：Klein等,Bio/Technology(1988)6:559-563；McCabe等,Bio/Technology(1988)6:923-926；Sanford,Physiol.Plant.(1990)79:206-209；通过使用微量吸管系统：Neuhaus等,Theor.Appl.Genet.(1987)75:30-36；Neuhaus和Spangenberg,Physiol.Plant.(1990)79:213-217；细胞培养物、胚芽或愈伤组织的玻璃纤维或碳化硅晶须转化：美国专利号5,464,765；或通过将DNA与萌发的花粉直接孵育：DeWet等,ExperimentalManipulationofOvuleTissue(《胚珠组织实验操作》),Chapman,G.P.和Mantell,S.H.以及Daniels,W.编著,伦敦朗文出版社(Longman,London),(1985)第197-209页；以及Ohta,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83:715-719。
农杆菌系统包括使用含有整合到植物基因组DNA中的限定的DNA段的质粒载体。对植物组织进行接种的方法根据植物物种和农杆菌递送系统而不同。一种广泛使用的方法是叶盘程序，所述程序可以用为引发整株植物分化提供良好来源的任何组织外植体进行。Horsch等,PlantMolecularBiologyManualA5(《植物分子生物学手册A5》),多德雷赫特的克鲁维尔学术出版社(KluwerAcademicPublishers,Dordrecht)(1988)第1-9页。一种补充方法使用农杆菌递送系统与真空渗入的组合。农杆菌系统在转基因双子叶植物的形成中是特别可行的。
存在将DNA直接转移到植物细胞中的各种方法。在电穿孔中，使原生质体短暂地暴露于强电场。在显微注射中，使用非常小的微量吸管将DNA直接机械注射到细胞中。在微粒轰击中，使DNA吸附到诸如硫酸镁晶体或钨粒的微弹上，并且使微弹物理加速进入细胞或植物组织中。
在稳定转化之后，进行植物繁殖。植物繁殖的最常见的方法是通过种子。然而，通过种子繁殖进行的再生具有以下缺陷，即由于杂合性而在作物中缺乏均匀性，这是因为种子是由植物根据由孟德尔定律(Mendelianrule)控制的遗传变异而产生。基本上，每一个种子在遗传上是不同的并且各自将生长而具有它自身特定的性状。因此，优选的是，产生转化的植物使得再生的植物具有亲本转基因植物的相同性状和特征。因此，优选的是，通过微繁殖使转化的植物再生，所述微繁殖提供了转化的植物的快速的、始终如一的繁殖。
微繁殖是一种由已经从所选择的亲本植物或栽培品种切除的单块组织培养新一代植物的方法。这种方法容许具有表达融合蛋白的优选组织的植物的大量繁殖。所产生的新一代植物在遗传上与原始植物是相同的，并且具有原始植物的所有特征。微繁殖允许在一段较短的时间内大量产生优质植物材料并且在保留原始转基因植物或转化的植物的特征时提供所选择的栽培品种的快速繁殖。克隆植物的优势在于植物繁殖的速度和所产生的植物的质量和均匀性。
微繁殖是一种多阶段程序，该程序需要在各阶段之间改变培养基或生长条件。因此，微繁殖方法包括四个基本阶段：阶段1，最初的组织培养；阶段2，组织培养物繁殖；阶段3，分化和植物形成；以及阶段4，温室培养和炼苗。在阶段1最初的组织培养期间，建立组织培养物并且确保是无污染物的。在阶段2期间，使最初的组织培养物繁殖直到产生足够数量的组织样品以达到生产目标为止。在阶段3期间，使在阶段2中生长的组织样品分裂并且长成单独的小植物。在阶段4时，将转化的小植物转移到温室中以进行炼苗，其中植物对光的耐受性逐渐增加以使它可以在天然环境中生长。
尽管稳定转化是优选的，但是对叶细胞、分生组织细胞或整株植物进行的瞬时转化也由本公开所设想。
瞬时转化可以通过上文所述的直接DNA转移法中的任一种或通过使用修饰的植物病毒进行病毒感染来实现。
已经被证实可用于转化植物宿主的病毒包括CaMV、TMV以及BV。使用植物病毒对植物进行的转化描述于美国专利号4,855,237(BGV)、EP-A67,553(TMV)、日本公开申请号63-14693(TMV)、EPA194,809(BV)、EPA278,667(BV)；以及Gluzman,Y.等,CommunicationsinMolecularBiology:ViralVectors(《分子生物学通讯：病毒载体》),纽约州的冷泉港实验室,第172-189页(1988)中。用于使外来DNA在包括植物在内的许多宿主中表达的假病毒粒子描述于WO87/06261中。
用于在植物中引入和表达非病毒外源性核酸序列的植物RNA病毒的构建由上述参考文献以及以下文献所证实：Dawson,W.O.等,Virology(1989)172:285-292；Takamatsu等,EMBOJ.(1987)6:307-311；French等,Science(1986)231:1294-1297；以及Takamatsu等,FEBSLetters(1990)269:73-76。
在病毒是DNA病毒时，可以对病毒本身进行合适的修饰。或者，可以首先将病毒克隆到细菌质粒中以易于构建具有外来DNA的所期望的病毒载体。然后可以将病毒从质粒切除。如果病毒是DNA病毒，那么可以将细菌复制起点与病毒DNA连接，然后所述病毒DNA由细菌复制。这种DNA的转录和翻译将产生衣壳化病毒DNA的外壳蛋白。如果病毒是RNA病毒，那么一般将病毒克隆成cDNA并且插入到质粒中。然后使用所述质粒进行所有的构建。然后通过转录质粒的病毒序列并且翻译病毒基因以产生衣壳化病毒RNA的一种或多种外壳蛋白而产生RNA病毒。
用于在植物中引入和表达非病毒外源性核酸序列(如本公开的构建体中所包括的那些)的植物RNA病毒的构建由上述参考文献以及美国专利号5,316,931所证实。
除了上述之外，本公开的核酸分子还可以被引入到叶绿体基因组中，从而使得能够进行叶绿体表达。
用于将外源性核酸序列引入到叶绿体的基因组中的技术是已知的。这种技术包括下列程序。首先，对植物细胞进行化学处理以将每个细胞的叶绿体数减少到约一个。然后，经由粒子轰击将外源性核酸引入到细胞中，旨在将至少一种外源性核酸分子引入到叶绿体中。外源性核酸经过选择以使其可以经由同源重组整合到叶绿体基因组中，所述同源重组容易通过叶绿体固有的酶来实现。为了这个目的，外源性核酸除了编码rGS酶的一种或多种多核苷酸之外还包括源自于叶绿体基因组的至少一个核酸段。此外，外源性核酸可以包括选择标记，所述选择标记用于通过连续的选择程序来确定叶绿体基因组的所有的或基本上所有的拷贝在这样的选择之后均将包括外源性核酸。关于这种技术的另外的细节参见美国专利号4,945,050；以及5,693,507，这些美国专利以引用的方式并入本文。多肽因此可以由叶绿体的蛋白质表达系统产生并且被整合到叶绿体的内膜中。
将了解的是，本公开中所使用的构建体类型中的任一种均可以使用每一种构建体类型中相同的或不同的选择标记共转化到相同的生物体(例如植物)中(例如可以使用一种或多种构建体，每一种具有rGS途径的一种或多种酶)。或者，可以将第一构建体类型引入到第一植物中，而可以将第二构建体类型引入到第二等基因植物中，之后，可以使由此所产生的转基因植物杂交并且针对双重转化体对后代进行选择。可以利用这样的后代的进一步自交来产生对于这两种构建体来说纯合的系。
如先前所论述，描述了在本文中有用的分子生物技术，包括使用载体、启动子以及许多其它相关的主题的一般教科书包括Berger和Kimmel,GuidetoMolecularCloningTechniques(《分子克隆技术指南》),MethodsinEnzymology(《酶学方法》),第152卷,(加利福尼亚州圣迭戈的学术出版社公司(AcademicPress,Inc.,SanDiego,Calif.))(“Berger”)；Sambrook等,MolecularCloning--ALaboratoryManual(《分子克隆——实验室手册》),第2版,第1-3卷,纽约州冷泉港的冷泉港实验室公司(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.),1989(“Sambrook”)；以及CurrentProtocolsinMolecularBiology(《最新分子生物学实验方法汇编》),F.M.Ausubel等编著,CurrentProtocols(《最新实验方法汇编》),格林出版联合公司(GreenePublishingAssociates,Inc.)与约翰威立出版公司之间的合资企业,(直到1999年补编)(“Ausubel”)，上述文献中的每一篇均以引用的方式整体并入本文。
足以指导本领域技术人员经由体外扩增方法，包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、Qβ-复制酶扩增以及其它RNA聚合酶介导的技术(例如NASBA)例如用于产生本公开的同源核酸的方案的实例参见Berger、Sambrook和Ausubel以及Mullis等,(1987)美国专利号4,683,202；Innis等编著(1990)PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(《PCR方案：方法和应用指南》)(加利福尼亚州圣迭戈的学术出版公司)(“Innis”)；Arnheim和Levinson(1990年10月1日)C&EN36-47；TheJournalOfNIHResearch(1991)3:81-94；Kwoh等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173；Guatelli等(1990)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA87:1874；Lomell等(1989)J.Clin.Chem35:1826；Landegren等(1988)Science241:1077-1080；VanBrunt(1990)Biotechnology8:291-294；Wu和Wallace(1989)Gene4:560；Barringer等(1990)Gene89:117；以及Sooknanan和Malek(1995)Biotechnology13:563-564。
用于体外克隆扩增的核酸的改进的方法描述于Wallace等的美国专利号5,426,039中。
通过PCR扩增大的核酸的改进的方法汇总于Cheng等(1994)Nature369:684-685和其中所引用的参考文献中，其中产生最多40kb的PCR扩增子。本领域技术人员将了解的是，基本上任何RNA均可以使用逆转录酶和聚合酶而转化成适用于限制性酶切消化、PCR扩增以及测序的双链DNA。参见例如Ausubel、Sambrook以及Berger(全部均同上)。
本公开因此提供了一种植物，所述植物表现出人工引入的rGS途径基因，其中所述植物表现出提高的光合作用。本公开还提供了提高植物生物质以及制造商品的方法，所述方法包括：(a)获得表现出各种rGS基因的表达或过表达的植物，其中所述植物的糖含量在与缺乏rGS途径表达的植物相比时增加；或(b)获得表现出各种rGS基因的表达或过表达的植物，其中所述植物的油含量在与缺乏rGS途径表达的植物相比时增加。
本公开进一步提供了用于改良光合途径的新型方法和组合物。此外，本公开提供了包含非天然光合途径的转基因/重组植物，所述光合途径可以由植物适应并且可以表现得优于现有的rubisco依赖性途径。本公开首次证实了人工引入的CO2固定系统可以补充sbpase突变体。sbpase是在拟南芥中完成卡尔文氏循环的一种重要的酶，没有报道在植物中存在其它同工型。本文所述的研究证实了一种替代系统可以提供高效节能的系统以在植物中固定CO2并且还有效地产生与通过Rubisco起作用的光合系统相比更高的生物质。
在下列实施例中说明本发明，所述实施例是以说明的方式提供的而不意图具限制性。
实施例
菌株构建：在本研究中所使用的所有菌株均列于表1中。使用JCL16(rrnBT14ΔlacZWJ16hsdR514ΔaraBADAH33ΔrhaBADLD78/F′[traD36proAB+lacIqZΔM15])作为野生型(WT)(Atsumi等，2008)。使用XL-1Blue(Stratagene公司)使所有质粒增殖。在酶测定之前使用BL-21DE3(英杰公司(Invitrogen))表达酶。使用来自Keio集合(Baba等，2006)的单基因敲除菌株，通过P1转导进行基因缺失。通过PCR，使用下列为缺失基因座的侧翼序列的引物验证每一处基因敲除：gltA(5′-
GTTGATGTGCGAAGGCAAATTTAAG-3′(SEQIDNO：11)+5′-
AGGCATATAAAAATCAACCCGCCAT-3′(SEQIDNO：12))，prpC(5′-
GTATTCGACAGCCGATGCCTGATG-3′(SEQIDNO：13)+5′-
CTTTGATCATTGCGGTCAGCACCT-3′(SEQIDNO：14))，mdh(5′-
TTCTTGCTTAGCCGAGCTTC-3′(SEQIDNO：15)+5′-GGGCATTAATACGCTGTCGT(SEQIDNO：16)，mqo(5′-GACTGCTGCCGTCAGGTCAATATG-3′(SEQIDNO：17)+5′-
CTCCACCCCGTAGGTTGGATAAGG-3′(SEQIDNO：18))，ppc(5′-
ACCTTTGGTGTTACTTGGGGCG-3′(SEQIDNO：19)+5′-TACCGGGATCAACCACAGCGAA-3′
(SEQIDNO：20))，aceB(5′-CTATTTCCCGCACAATGATCCGCA-3′(SEQIDNO：21)
+5′-CTTCAATACCCGCTTTCGCCTGTT-3′(SEQIDNO：22))，citE(5′-
GCGACTGAAACGCTATGCCGAA-3′(SEQIDNO：23)+5′-TTCAGTTCGCCGCTCTGTACCA-
3′(SEQIDNO：24))，icd(5′-GTTTACCCGGCTGGGTTAA-3′(SEQIDNO：25)+5′-
AGTCACGATCGTTAGCAATTG-3′(SEQIDNO：26)).
表1：所述研究中所使用的菌株和质粒。SpR：大观霉素(Spectinomycin)抗性；KmR：卡那霉素(Kanamycin)抗性；AmpR：氨苄青霉素(Ampicillin)抗性；CmR：氯霉素(Chloramphenicol)抗性；RBS：5'--‐AGGAGA--‐3'；Bs：枯草芽孢杆菌；Ec：大肠杆菌；Ct：微温绿硫细菌；Mc：荚膜甲基球菌；Rs：类球红细菌；Se：肠道沙门氏菌。★在最终的全途径菌株中所使用的质粒。
质粒
质粒构建：本研究中所使用的所有质粒均是使用等温DNA组装法组装的，如由Gibson等(2009)所述。简单地说，使用iProof聚合酶(伯乐公司(Biorad))对在每一个末端处有16-20bp重叠的质粒骨架和一个或多个插入序列进行PCR扩增。对具有预期尺寸的DNA扩增子进行凝胶纯化并且以等摩尔量混合在5μL的最终体积中。添加15μL的反应混合物[于水中的6.65％PEG-8000、133mMTris-HCl(pH7.5)、13.3mMMgCl2、13.3mMDTT、0.27mM的四种dNTP中的每一种、1.33mMNAD+、0.08U的T5核酸外切酶(Epicentre公司)、0.5U的Phusion聚合酶(NEB公司)、80U的TaqDNA连接酶(NEB公司)]，与DNA充分吹吸混合，并且在50℃孵育1小时。根据制造商的建议，将5μL的组装混合物转化到Z-感受态(Zymo研究公司(ZymoResearch))XL1-blue大肠杆菌细胞(安捷伦公司(Agilent))中，并且接种到含有适当的抗生素的LB琼脂平板上。培养至少3个独立的所得菌落，对它们的质粒进行纯化，并且通过测序加以验证。
本研究中所使用的所有质粒和它们的特征列于表1中。
生长条件：出于一般的分子生物学目的，将大肠杆菌菌株在37℃和200rpm的搅拌速率下培养在卢里亚-贝尔塔尼(LuriaBertani，LB)培养基中。对于含有质粒的菌株，将培养基补充以下列浓度的适当的抗生素：卡那霉素50μg/mL、氯霉素30μg/mL、氨苄青霉素50-100μg/mL、大观霉素100μg/mL(所有的抗生素均购自西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich))。
为了在基本培养基上进行选择，首先将细胞在LB培养基中培养到对数中期并且用0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，Gold生物技术公司(GoldBiotechnology))诱导三小时以确保所关注的蛋白质表达。然后通过以5000×g离心来收集来自1mL培养基的细胞并且用等体积的基本培养基洗涤一次。将细胞重悬在1mL的基本培养基中并且划线接种到选择性平板上。所述选择性平板含有M9基本培养基、2％葡萄糖、1mMMgSO4、0.1mMCaCl2、0.1mg/mL盐酸硫胺素、0.1mMIPTG以及适当的抗生素。如文中所指出，将平板补充以10mM天冬氨酸盐、10mM谷氨酸盐、10mM柠檬酸盐、10mM乙醛酸盐、10mM丁二酸盐或10mM苹果酸盐(所有钠盐均来自西格玛奥德里奇公司)的组合。
酶测定：异柠檬酸裂解酶(ICL)酶纯化和测定：通过用过夜培养物的1/100稀释液对补充有25mg/L大观霉素的LB培养基进行接种来使His标记的大肠杆菌AceA由质粒pSS25在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中过表达。将细胞在37℃和200rpm的搅拌速率下培养到对数中期并且使用0.1mMIPTG诱导。在相同的条件下将培养物再培养3小时，然后通过离心收集细胞。通过使用珠磨法(beadbeatermethod)(来自快而精公司(Qiagen)的TissueLyserII)将细胞在His结合缓冲液(Zymo研究公司)中裂解，然后离心以使细胞碎片沉淀。将上清液施加到His-Spin蛋白质微量制备柱(Zymo研究公司)中并且根据制造商说明书进行纯化。使用BioRad蛋白质测定试剂盒确定纯化的蛋白质洗脱液的浓度，并且通过标准SDS-PAGE和考马斯染色法(Coomassiestainingmethod)验证蛋白质的纯度。将纯化的蛋白质保持在冰上并且在当天使用。
为了测定ICL的活性，使异柠檬酸的产生与异柠檬酸脱氢酶(ICD)的活性相关联，所述异柠檬酸脱氢酶将异柠檬酸氧化和脱羧成α-酮戊二酸，同时将NADP+还原成NADPH。可以用分光光度测定法跟踪NADPH的产生。在室温在UV比色皿中进行反应并且在340nm监测。反应混合物含有50mMTris-HCl(pH7.5)、100mMNaCl、5mMMgCl2、1mM二硫苏糖醇、5mMNADP+、0.1×市售枯草芽孢杆菌ICD(西格玛奥德里奇公司)，以及如果适当的话，10mM丁二酸钠(西格玛奥德里奇公司)和10mM乙醛酸钠(西格玛奥德里奇公司)以及18.75μg/mL的纯化蛋白。
偶联的苹果酸硫激酶(MTK)和苹果酰辅酶A裂解酶(MCL)酶测定：通过用过夜培养物的1/100稀释液对补充有25mg/L大观霉素的LB培养基进行接种来使处在T7启动子控制下的推定天然MTK操纵子(参见补充方法)在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达。将细胞在37℃和200rpm的搅拌速率下培养到对数中期并且使用0.1mMIPTG诱导。在25℃将培养物再培养5小时，然后通过离心收集细胞。通过使用珠磨法(来自快而精公司的TissueLyserII)将细胞在0.1MTris-Cl(pH7.5)中裂解，然后离心以使细胞碎片沉淀。使用BioRad蛋白质测定试剂盒确定总可溶性蛋白质提取物的浓度。将总可溶性提取物保持在冰上并且在当天使用。
在偶联酶测定中使用纯化的His标记的MCL测试MTK活性(参见下文)。MTK使苹果酸和辅酶A进行ATP依赖性缩合形成苹果酰辅酶A。进而，MCL将苹果酰辅酶A切割成乙酰辅酶A和乙醛酸，后者与苯肼反应形成乙醛酸-苯腙。在324nm记录乙醛酸-苯腙的形成。将反应设置在37℃，最终体积是100μL，含有50mMTris-Cl(pH7.5)、5mMMgCl2、2mM苯肼、10mM苹果酸盐、2mMATP、0.85μg纯化的MCL(参见下文)、以及0.2μg-2μg可溶性蛋白质提取物。通过添加辅酶A达到1mM的最终浓度来开始反应，除了橙色绿屈挠菌SmtAB之外，其中使用1mM的丁二酰辅酶A。类似于苹果酸硫激酶，丁二酰辅酶A:1-苹果酸辅酶A转移酶(SmtAB)由苹果酸产生苹果酰辅酶A，但是使用丁二酰辅酶A作为辅酶A供体，而不是使用游离的辅酶A。基于乙醛酸盐标准曲线(在100μL反应缓冲液中0-10-20-30-40纳摩尔的乙醛酸盐)计算特异性酶活性。
苹果酰辅酶A裂解酶(MCL)酶纯化：通过用过夜培养物的1/100稀释液对补充有25mg/L大观霉素的LB培养基进行接种来使His标记的类球红细菌MCL由质粒pSMg59在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中过表达。将细胞在37℃和200rpm的搅拌速率下培养到对数中期并且使用0.1mMIPTG诱导。在相同的条件下将培养物再培养3小时，然后通过离心收集细胞。通过使用珠磨法(来自快而精公司的TissueLyserII)将细胞在His结合缓冲液(Zymo研究公司)中裂解，然后离心以使细胞碎片沉淀。将上清液施加到His-Spin蛋白质微量制备柱(Zymo研究公司)中并且根据制造商说明书进行纯化。使用BioRad蛋白质测定试剂盒确定纯化的蛋白质洗脱液的浓度，并且通过标准SDS-PAGE和考马斯染色法验证蛋白质的纯度。将纯化的蛋白质保持在冰上并且在当天使用。
ATP-柠檬酸裂解酶(ACL)酶纯化和测定：通过用过夜培养物的1/100稀释液对补充有50mg/L大观霉素的LB培养基进行接种来使His标记的微温绿硫细菌AclBA由质粒pXL18-4在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中过表达。将细胞在37℃和200rpm的搅拌速率下培养到对数中期并且使用0.1mMIPTG诱导。在室温将培养物以200rmp的搅拌速率再培养20小时，然后通过离心收集细胞。通过使用珠磨法(来自快而精公司的TissueLyserII)将细胞在His结合缓冲液(Zymo研究公司)中裂解，然后离心以使细胞碎片沉淀。将上清液施加到His-Spin蛋白质微量制备柱(Zymo研究公司)中并且根据制造商说明书进行纯化。使用BioRad蛋白质测定试剂盒确定纯化的蛋白质洗脱液的浓度，并且通过SDS-PAGE验证蛋白质的纯度。将纯化的蛋白质在20％甘油中保持冷冻在-80℃并且在第二天使用。
为了测定ACL的活性，使草酰乙酸的产生与苹果酸脱氢酶(MDH)的活性相关联，所述苹果酸脱氢酶将草酰乙酸还原成苹果酸，同时将NADH氧化成NAD+。可以用分光光度测定法跟踪NADH的消耗。在室温在UV比色皿中进行反应并且在340nm监测。反应混合物含有100mMTris-HCl(pH8.4)、10mMMgCl2、10mM二硫苏糖醇、0.25mMNADH、3.3U/mL市售猪心MDH(西格玛奥德里奇公司)，以及如果适当的话，20mM柠檬酸钠(西格玛奥德里奇公司)、0.44mM辅酶A(西格玛奥德里奇公司)、2.5mM腺苷三磷酸(ATP)以及1.283μg/mL纯化的蛋白质。
异柠檬酸裂解酶的可逆性：研发一种遗传选择系统来测试乙醛酸支路酶在体内的可逆性(图2)。乙醛酸支路的第一种酶ICL是由大肠杆菌基因aceA编码。基于ICL将丁二酸和乙醛酸转化成异柠檬酸的能力来测试它的可逆性，所述异柠檬酸是谷氨酸合成的前体。通常，谷氨酸是经由TCA循环的中间产物合成的。通过使柠檬酸合酶(由gltA所编码)缺失，大肠杆菌变成谷氨酸营养缺陷型。为了避免补充ΔgltA的第二位点突变，我们还使prpC缺失，该prpC编码具有较小柠檬酸合酶活性的丙酸诱导型甲基柠檬酸合酶(Maloy和Nunn,1982)。所得的谷氨酸营养缺陷型选择菌株(ΔgltAΔprpC)在下文被称为Glu-菌株(图2和表1)。在乙醛酸支路中，ICL将异柠檬酸切割成乙醛酸和丁二酸。因此，如果ICL在逆向的形成异柠檬酸的方向上具有活性，那么表达ICL的Glu-菌株预期能够在补充有乙醛酸盐和丁二酸盐的葡萄糖基本培养基上生长。如图3A中所呈现，当在培养基中供应乙醛酸盐和丁二酸盐这两者时，使用强IPTG诱导型启动子(PLlacO1)过表达EcAceA的菌株能够在不存在谷氨酸盐的情况下生长(菌株2，图3A)。当在培养基中只添加乙醛酸盐或只添加丁二酸盐时，该同一种菌株不能生长。其中AceA没有过表达的菌株用作对照(菌株1，图3A)。这种菌株不能在补充有乙醛酸盐和丁二酸盐这两者的培养基上生长。这些结果表明AceA在体内是可逆的并且能够由乙醛酸和丁二酸形成异柠檬酸。来自染色体的aceA的野生型表达水平不允许在这些条件下生长的事实最有可能是因为在缺乏诱导物乙酸盐并且含有抑制物葡萄糖的生长条件下aceA受到抑制(Cozzone,1998)。大肠杆菌AceA的可逆性还在体外得到确认(图3B)。所述酶标记有His并且经过纯化，并且在酶测定中显示出逆向(缩合)活性，其中通过市售的异柠檬酸脱氢酶使异柠檬酸的产生与NADP+还原偶联。用分光光度测定法跟踪NADPH的形成。还通过HPLC分析，通过与已知的标准品进行比较来确认异柠檬酸的产生。
苹果酸合酶的不可逆性：酶MS在乙醛酸支路中在它天然的方向上将乙醛酸乙酰化以形成苹果酸。这一反应的逆转是不利的(乙醛酸形成的ΔrG'°＝44.4kJ/mol)(Alberty,2006)。然而，如果被逆转的话，那么MS将使苹果酸转化成乙酰辅酶A和乙醛酸。我们在过表达aceA的Glu-菌株中测试这种逆向活性。在这种菌株中，由苹果酸产生的任何乙醛酸均可以充当ICL的底物以与丁二酸缩合，从而形成异柠檬酸并且挽救生长。令人遗憾的是，当在生长培养基中存在葡萄糖时，苹果酸被非常差地转运到大肠杆菌中(Davies等,1999)。
为了解决苹果酸转运问题，通过使用Δppc菌株来研究这个转运步骤的效率，所述Δppc菌株不能在葡萄糖基本培养基中生长，除非补充有TCA循环中间产物，如苹果酸。与先前的报道(Ashworth和Kornberg,1966)相一致，Δppc菌株JW3928(Baba等,2006)不能在补充有葡萄糖的基本培养基上生长，并且当添加苹果酸盐补充剂时，它的生长不佳(表2)。大肠杆菌苹果酸转运蛋白dctA的过表达对在这些条件下苹果酸的吸收没有帮助(菌株SM43，表2)。然而，并非以与大肠杆菌酶相同的方式受葡萄糖调节的枯草芽孢杆菌dctA(BsDctA)(Groeneveld等,2010)基因的过表达却允许Δppc突变体在补充有葡萄糖和苹果酸盐的M9上快速生长(菌株SM44，表2)。
表2：枯草芽孢杆菌DctA转运蛋白允许大肠杆菌Δppc突变体中的苹果酸吸收。在没有补充剂、或补充有20mM苹果酸盐或丁二酸盐的M9平板(2％葡萄糖、100μMIPTG)上培养大肠杆菌菌株JW3928、SM43以及SM44生长。--‐：不生长；+：生长不佳；+++：健康生长。平板的照片示于附图1中。
在解决了苹果酸转运问题的情况下，通过使用过表达苹果酸转运蛋白(BsDctA)和大肠杆菌MS的Glu-菌株测试MS的可逆性。在大肠杆菌中存在MS的两种同工酶，并且它们是由aceB和glcB编码的。当大肠杆菌aceB或glcB连同BsdctA和EcaceA一起过表达时，在选择性平板(于葡萄糖基本培养基中的苹果酸盐和丁二酸盐补充剂)上没有观测到生长(菌株3和4，图3A)，这表明如所预期，大肠杆菌MS酶在逆向方向上没有足够的活性以在选择时支持生长。有趣的是，在补充有乙醛酸盐和丁二酸盐的平板上，除了ICL之外还过表达MS基因的菌株的生长实际上似乎是迟缓的。这可以是MS的不可逆性的进一步的证据，这是因为这种生长迟缓可能是因为乙醛酸盐被在正向方向上起作用的MS消耗而远离ICL。
将苹果酸转化成乙醛酸和乙酰辅酶A：为了找到大肠杆菌MS的合适的替代物以将苹果酸代谢成乙醛酸和乙酰辅酶A，寻找将使这一反应与ATP的水解偶联以在所期望的方向上驱动它的酶。可以在II型甲基营养生物，如扭脱甲基杆菌的丝氨酸循环中找到这样的酶。在此，通过ATP依赖性苹果酸硫激酶(MTK；ΔrG'°＝-7.7kJ/mol)由苹果酸和辅酶A形成苹果酰辅酶A(Ablerty,2006)。然后由苹果酰辅酶A裂解酶(MCL；ΔrG'°＝14.5kJ/mol)将苹果酰辅酶A切割成乙醛酸和乙酰辅酶A(Alberty,2006；Hanson和Hanson,1996)。MCL还参与存在于橙色绿屈挠菌中的3-羟基丙酸CO2固定途径、以及(在缩合方向上)类球红细菌和其它的乙基丙二酰辅酶A途径。通过利用用于评价AceB和GlcB可逆性的相同选择来在体内测试MTK/MCL组合的活性。使所述酶连同BsDctA、EcAceA一起在Glu-菌株中表达，并且测试在含有苹果酸盐和丁二酸盐的培养基上的生长。最初，测试了被充分表征的基因扭脱甲基杆菌MtkAB和MclA(Chistoserdova和Lidstrom,1994)(Chistoserdova和Lindstrom,1997)，并且发现这些基因共同的表达没有挽救Glu-选择菌株的生长，这可能是因为在大肠杆菌中的表达问题。
因此，来自各种生物体的同源酶在大肠杆菌中被表达并且在体外被测试“逆向MS”活性以找到最具活性的变体。由于来自类球红细菌的Mcl1(RsMcl1)在大肠杆菌中活跃地表达(Erb等,2010)，因此将这种蛋白质纯化并且将它过量用于偶联测定中以测试来自各种生物体的在大肠杆菌中表达的15种推定的MtkAB操纵子的活性(图9)。在这一筛选中，由质粒pSMg45表达的来自荚膜甲基球菌的SucCD-2(Ward等,2004)(McSucCD-2)显示出最大的MTK活性(图4A)。应当指出的是，McSucCD-2已经被标注为丁二酰辅酶A合成酶，但是如在此所证实，具有MTK活性。然后在体内测试这种酶(图4B)。当在Glu-选择菌株中共同表达时，BsdctA、McsucCD-2、Rsmcl1、以及EcAceA允许在含有苹果酸盐和丁二酸盐补充剂的葡萄糖基本培养基上生长，这表明这种MTK/MCL组合具有作为逆向MS的活性(菌株6，图4B)。在只添加丁二酸盐的情况下，观测到生长(尽管更缓慢)，所述丁二酸盐可以由丁二酸脱氢酶和反丁烯二酸酶转化成苹果酸。当省去ICL、MTK或MCL时(分别是菌株5、7或8，图4B)，在选择性平板上没有观测到生长，这表明每一种酶的过表达在体内对所述途径来说都是必要的。
这些结果证实可以ATP作为代价将苹果酸转化成乙醛酸和乙酰辅酶A。因此，通过表达McSucCD-2、RsMcl1以及EcAceA，大肠杆菌中的乙醛酸支路被逆转，从而使用ATP将苹果酸和丁二酸转化成乙酰辅酶A和异柠檬酸以克服热力学障碍。
将柠檬酸转化成草酰乙酸和乙酰辅酶A：在输入两个C4化合物苹果酸和丁二酸的情况下，逆向乙醛酸支路的输出是一个乙酰辅酶A和C6化合物异柠檬酸。因此，使rGS延伸以将异柠檬酸转化回C4化合物OAA，同时释放第二个乙酰辅酶A分子。这包括逆转与TCA循环共有的两个酶步骤：容易逆转的顺乌头酸酶(Gruer和Guest,1994)以及柠檬酸合酶(CS)，所述柠檬酸合酶预期不是可逆的(逆反应的ΔrG'°＝40.3kJ/mol)(Alberty,2006)。在大肠杆菌中，CS逆反应可以通过天然酶柠檬酸裂解酶(CL)(柠檬酸→草酰乙酸+乙酸；ΔrG'°＝0.6kJ/mol)(Alberty,2006)和乙酸:辅酶A连接酶(乙酸+辅酶A+ATP→乙酰辅酶A+AMP+PPi；ΔrG'°＝2.0kJ/mol)(Alberty,2006)的协同作用来进行。替代物是使柠檬酸向草酰乙酸和乙酰辅酶A直接进行ATP依赖性转化的非天然ATP-柠檬酸裂解酶(ACL)(ΔrG'°＝2.7kJ/mol)(Alberty,2006)。这种酶存在于大部分的真核生物以及经由还原性TCA循环固定碳的古菌中(Fatland等,2002；Houston和Nimmo,1984；以及Hugler等,2007)。
为了在体内测试“逆向柠檬酸合酶”活性的这些不同的选择方案，产生天冬氨酸营养缺陷型大肠杆菌突变株(ΔgltAΔppcΔmdhΔmqoΔcitE)，在下文被称为Asp-(图5)。Asp-菌株缺失了产生天冬氨酸前体OAA的所有酶(ppc、mdh、mqo)并且还缺失了可能具有逆向柠檬酸合酶活性的基因(gltA、citE)。对于‘逆向柠檬酸合酶’测定，还使来自肠道沙门氏菌的重组柠檬酸转运蛋白CitA表达(Shimamoto等,1991)(SeCitA)以使得能够从培养基中吸收柠檬酸盐。这种菌株应当只能够在补充有柠檬酸盐的基本培养基上生长，如果它能够将培养基中所提供的柠檬酸盐转化成OAA，即天冬氨酸前体的话(菌株9，图6A)。如所预期，大肠杆菌柠檬酸合酶gltA的过表达没有恢复在含有柠檬酸盐的平板上的生长(菌株10，图6A)。此外，确定了柠檬酸裂解酶citDEF的天然表达水平不能恢复生长(菌株11，图6A：没有citE基因敲除的Asp-菌株)。这可能是因为在有氧条件下柠檬酸裂解酶操纵子受到抑制。没有使柠檬酸裂解酶操纵子连同乙酸:辅酶A连接酶一起过表达，我们测试了来自微温绿硫细菌的更直接的ATP-柠檬酸裂解酶(CtAclAB)的活性(Kim和Tabita,2006)。这一途径与涉及柠檬酸裂解酶和乙酸:辅酶A连接酶的天然大肠杆菌途径具有相同的ATP要求，但是需要更少的基因过表达。使CtAclAB在Asp-菌株中表达并且证实这种异源性酶允许在补充柠檬酸盐的培养基上生长，这提供证据表明这种酶在体内具有活性并且由柠檬酸形成必要的中间产物OAA(菌株12，图6A)。在体外在酶测定中使用从大肠杆菌纯化的His标记的蛋白质确认了CtACL的活性(图6B)。
正如苹果酸合酶逆转的情况一样，使用ATP偶联的酶使得柠檬酸合酶的最初不利的逆反应成为可能。
异柠檬酸分支点的优化：在单独地测试了所述途径的在热力学上有挑战的步骤之后，然后测试多个步骤协同的活性。首先测试CtAclAB和EcAceA的组合过表达以观测它是否允许Asp-菌株在补充有乙醛酸盐和丁二酸盐的葡萄糖基本培养基上生长。在此，预期只有在乙醛酸和丁二酸可以被缩合成异柠檬酸，并且如果异柠檬酸进而可以由顺乌头酸酶转化成柠檬酸(经由顺乌头酸)时，所述菌株才能生长。柠檬酸然后将充当ACL的底物以产生OAA并且挽救天冬氨酸营养缺陷。作为预防措施，使苹果酸合酶aceB缺失以防止损失乙醛酸而形成苹果酸。如图6C中所示(菌株15)，在这些条件下观测到极其缓慢的生长。这被假设是因为异柠檬酸被竞争相同底物的异柠檬酸脱氢酶(ICD)消耗而远离顺乌头酸酶(ACN)(参见图5)。因此，通过以下方式调整异柠檬酸分支点以有利于所述途径：i)过表达两种天然大肠杆菌顺乌头酸酶acnA和acnB中的每一种；ii)使icd基因缺失(在这种情况下，向培养基提供谷氨酸盐)；或iii)将这两种修饰组合。如由在补充有乙醛酸盐和丁二酸盐的培养基上所测试的各种菌株的生长速率所表明，通过将icd缺失和acnA过表达组合将代谢通量最好地引导到所述途径中(菌株13，图6C)。
从苹果酸和丁二酸到乙酰辅酶A和OAA的全途径的组装：已经鉴定出用于每一个步骤的活性酶并且优化了关键的分支点，将所有这些特征并入到Asp-菌株中，并且测试全途径是否可以由苹果酸和丁二酸提供OAA以支持生长。使BsdctA、McsucCD-2以及Rsmcl1连同EcaceA、EcacnA以及CtaclAB一起在具有icd和aceB基因敲除的Asp-菌株中过表达。这种菌株能够在补充有苹果酸盐和丁二酸盐的葡萄糖基本培养基上生长(菌株19，图7A-B)。缺失所述途径的关键基因(aclAB、或aceA和acnA、或mcl1；分别是菌株179、180以及181)的对照菌株不能在这些条件下生长，并且含有全途径的菌株的生长依赖于苹果酸盐和丁二酸盐的存在。这些结果证实从苹果酸和丁二酸到OAA和两个乙酰辅酶A分子的乙醛酸途径的体内完全逆转。
为了在植物中测试rGS途径，没有CO2固定或具有非常低的CO2固定的植物材料。在这种情况下，使用具有Rubisco抑制因子的植物和/或sbpase突变体。然后将rGS构建体转化到这些植物中。
仅出于实验的目的使用在卡尔文氏循环中具有受抑制的SBPase或Rubisco基因的植物来源。卡尔文氏循环是用于光合碳固定的主要途径，它在高等植物中在叶绿体基质中进行。这个循环由通过11种不同的酶催化的13个反应步骤组成。SBPase是在拟南芥中只具有一个拷贝的酶。
在从拟南芥生物资源中心(ArabidopsisBiologicalResourceCenter，ABRC)获得的SBPase基因座(AT3G55800)处使用SbpaseT-DNA插入系(SALK_130939)。与野生型幼苗相比，该功能丧失SBPase突变体是严重迟缓的并且向抽薹和开花的转变要延迟得多(Liu等,2012)。超过90％的野生型植物在生长条件下5周之后开花，相比之下，90％的sbp突变植物在超过10周之后开花。尽管生长和发育严重迟缓，但是sbp突变植物仍能在正常生长条件下开花并且产生种子。使用纯合植物和杂合植物的种子来用rGS构建体进行转化。
核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco；EC4.1.1.39)是催化光合CO2固定和光呼吸碳氧化的两个竞争反应的基质蛋白。在高等植物和绿藻中，Rubisco由通过核基因组中的RBCS多基因家族编码的八个小亚基(RBCS)和由单个RbcL基因编码的八个大亚基(RbcL)构成。在拟南芥中，已经鉴定出四个RBCS成员，即RBCS1A(At1g67090)、RBCS1B(At5g38430)、RBCS2B(At5g38420)、以及RBCS3B(At5g38410)。从拟南芥生物资源中心(ABRC)获得这4种基因的T-DNA插入系的种子。对这些RBCS基因的T-DNA插入突变体进行筛选，并且分离RBCS1A和RBCS3B的纯合突变系。通过正反交产生这些基因的双重突变体并且与WT相比，这些植物的营养生长和开花延迟。
使用另一种方法来抑制内源性碳固定途径(CBB循环)，这是通过以可诱导方式破坏CBB循环来实现的。还可以将这种条件CBB突变系用为功能性rGS循环所需的所有基因转化。在这种模型中，然后将在所得的初级转化体中诱导CBB破坏。以平衡方式表达所有外来基因的转基因系预期在这种CBB破坏中存活更长时间。因此在大的转化体群体中将容易对它们进行鉴定，并且选用于进一步表征。
没有除草剂靶向CBB循环。因此，为了破坏CBB循环，使用人工微小RNA(amiR)策略来使CBB基因沉默。多种amiR被设计成特异性地使核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(RbcS)基因家族沉默。在每种情况下，WebMicro-RNADesignerWMD3([http://]wmd3.weigelworld.org/)预测了所测试的许多合适的amiR。这些amiR的表达是处在雌二醇诱导型启动子的控制之下的。使每种amiR的初级转化体(T0)生长至成熟，并且采集T1种子。由每一种T1的种子，使12株幼苗生长至成熟并且采集种子以进行分离分析。针对由雌二醇处理所触发的amiR表达和CBB基因敲除效率对一些进行测试。由amiR触发的成功的CBB破坏能够显示出不同的表型，如开花缺陷，从而导致生长停滞、萎黄等。基于这些结果，选择5种amiR系，这些系可以用于用rGS途径进行转化。
使用如上文所述并且示于下表3中的来自各种来源的11种基因形成rGS构建体：表3：
pBR6包含顺乌头酸酶、NADP-苹果酸脱氢酶、反丁烯二酸酶以及反丁烯二酸还原酶并且所有其它基因被引入到pDS31中。将这些转化到农杆菌(LBA4404)中并且使用浸花法转化到WT、SBPase(杂合/纯合)以及Rubico抑制系(双重突变体)中。在Basta平板(1/2MS培养基)上选择阳性转化体，随后针对DS-Red标记进行筛选。使所有所选择的系生长以采集种子，随后在T1代中针对表型差异进行筛选。
使植物在4平方英寸的花盆中在SunGro-Mix#4上生长并且在控制环境室(美国路易斯安娜州的珀西瓦尔科技公司(PercivalScientific,lA,USA))中以120至140flmol·m2·s1的光子在21℃下14小时的光亮以及在19℃下10小时的黑暗下培育。
基因分型和RT-PCR研究：使用C-TAB法或N-AMPPCR试剂盒(西格玛公司(Sigma))从所有的转基因系、WT以及突变系的11天大的幼苗中分离基因组DNA。使用RNeasy小型试剂盒(加利福尼亚州瓦伦西亚的快而精公司(Qiagen,Valencia,CA))，根据制造商的说明书从所有的转基因系的11天大的幼苗中分离总RNA。使用Nanodrop分光光度计ND-100(特拉华州威灵顿的NanoDropTechnologies公司(NanoDropTechnologies,Willington,DE))定量RNA并且评价纯度。
对于定量两步RT-PCR，使用QiagencDNA合成试剂盒(德国希尔登的快而精公司(Qiagen,Hilden,Germany))将1μg的总RNA逆转录成第一链cDNA，并且随后使用那些cDNA作为模板以用基因特异性引物进行qPCR。植物特异性EF4A2(Atlg54270)基因用作组成型基因表达的对照。
已经描述了本发明的某些实施方案。应当了解的是，可以作出各种改动而不脱离本发明的精神和范围。其它实施方案也落入以下权利要求书的范围内。化能自养菌、光能自养菌、蓝细菌依靠非天然启动子而过表达FPK、XPK。

Claims (66)

1.一种重组微生物，所述重组微生物包含用于由四碳底物合成乙酰辅酶A和异柠檬酸的代谢途径，所述代谢途径使用包含具有苹果酸硫激酶活性、苹果酰辅酶A裂解酶活性和/或异柠檬酸裂解酶活性的一种或多种多肽的途径。
2.如权利要求1所述的重组微生物，其中所述微生物是原核生物或真核生物。
3.如权利要求2所述的重组微生物，其中所述微生物是酵母。
4.如权利要求2所述的重组微生物，其中所述微生物是原核生物。
5.如权利要求4所述的重组微生物，其中所述微生物源自于大肠杆菌(E.coli)微生物。
6.如权利要求5所述的重组微生物，其中所述大肠杆菌被工程化以表达苹果酸硫激酶。
7.如前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述苹果酸硫激酶是从荚膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus)克隆的。
8.如前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述苹果酸硫激酶包含来自荚膜甲基球菌的sucC-2和sucD-2的异二聚体。
9.如前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述苹果酸硫激酶包含与SEQIDNO:2和4具有至少40％至100％同一性的序列并且将苹果酸转化成苹果酰辅酶A。
10.如前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述重组微生物被工程化以表达苹果酰辅酶A裂解酶。
11.如前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述苹果酰辅酶A裂解酶是从类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)克隆的。
12.如权利要求11所述的重组微生物，其中所述苹果酰辅酶A裂解酶包含来自类球红细菌的mcl1。
13.如前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述苹果酰辅酶A裂解酶包含与SEQIDNO:8具有至少40％至100％同一性的序列并且将苹果酰辅酶A转化成乙醛酸。
14.如前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述重组微生物被工程化以表达或过表达异柠檬酸裂解酶。
15.如权利要求14所述的重组微生物，其中所述异柠檬酸裂解酶是从大肠杆菌克隆的。
16.如权利要求15所述的重组微生物，其中所述异柠檬酸裂解酶包含来自大肠杆菌的aceA。
17.如前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述异柠檬酸裂解酶包含与SEQIDNO:10具有至少40％至100％同一性的序列并且将乙醛酸和丁二酸转化成异柠檬酸。
18.如前述权利要求中任一项所述的重组微生物，所述重组微生物进一步包含表达或过表达苹果酸脱氢酶。
19.如前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述微生物被工程化以异源表达下列酶中的一种或多种：
(a)苹果酸硫激酶；
(b)苹果酰辅酶A裂解酶；以及
(c)异柠檬酸裂解酶。
20.如权利要求19所述的重组微生物，其中所述微生物被进一步工程化以表达或过表达苹果酸脱氢酶。
21.如前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述微生物被进一步工程化以表达或过表达顺乌头酸酶。
22.如前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述微生物被进一步工程化以表达或过表达ATP柠檬酸裂解酶。
23.如前述权利要求中任一项所述的重组微生物，所述重组微生物进一步包含选自由atoB、hbd、crt、ter以及adhE2组成的组的一种或多种基因，并且其中所述微生物产生1-丁醇。
24.如前述权利要求中任一项所述的重组微生物，所述重组微生物进一步包含将乙酰辅酶A转化成乙醇、脂肪酸或类异戊二烯的一种或多种酶。
25.如前述权利要求中任一项所述的重组微生物，所述重组微生物进一步包含CO2固定途径。
26.如权利要求23或24所述的重组微生物，其中所述微生物进一步包含pta。
27.如前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述微生物进一步包含选自由以下各项组成的组的一处或多处基因敲除：Δicd、ΔgltA、ΔcitDEF、Δmdh/mqo、Δppc、ΔadhE、Δack、前述任一个的同源物、以及其任何组合。
29.一种无细胞系统，所述无细胞系统用于将4碳底物转化成异柠檬酸和两个乙酰辅酶A，所述无细胞系统包含ATP和辅酶A以及：
(i)将苹果酸转化成苹果酰辅酶A的酶；
(ii)将苹果酰辅酶A转化成乙醛酸和乙酰辅酶A的酶；
(iii)将异柠檬酸转化成柠檬酸的酶；以及
(iv)将柠檬酸转化成草酰乙酸的酶。
30.如权利要求29所述的无细胞系统，其中(i)-(iv)中的每一种是从不同的微生物通过使所述微生物表达并且破坏所述生物体或从所述生物体中分离所述酶而获得的。
31.如权利要求30所述的无细胞系统，其中所述不同的微生物被重组工程化以表达(i)-(iv)的酶。
32.一种用于产生1-丁醇的重组微生物，其中所述微生物包含：
(i)将苹果酸转化成苹果酰辅酶A的酶；
(ii)将苹果酰辅酶A转化成乙醛酸和乙酰辅酶A的酶；
(iii)将异柠檬酸转化成柠檬酸的酶；
(iv)将柠檬酸转化成草酰乙酸的酶；
(v)将乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A的酶，以及(a)将乙酰乙酰辅酶A转化成(R)-3-羟基丁酰辅酶A或(S)-3-羟基丁酰辅酶A以及将(R)-3-羟基丁酰辅酶A或(S)-3-羟基丁酰辅酶A转化成巴豆酰辅酶A的至少一种酶；
(vi)将巴豆酰辅酶A转化成丁酰辅酶A的酶；以及
(vii)将丁酰辅酶A转化成丁醛以及将丁醛转化成1-丁醇的酶。
33.如权利要求32所述的重组微生物，其中所述微生物包含选自由以下各项组成的组的表达谱：
(a)Mtk、Mcl、aceA(或icl)、acnAB、Acl、AtoB、Hbd、Crt、Ter、BldH、以及YqhD；
(b)Mtk、Mcl、aceA(或icl)、acnAB、Acl、AtoB、Hbd、Crt、Ter、以及AdhE2；
(c)Mtk、Mcl、aceA(或icl)、acnAB、Acl、AtoB、Hbd、Crt、ccr、BldH、以及YqhD；以及
(d)Mtk、Mcl、aceA(或icl)、acnAB、Acl、AtoB、Hbd、Crt、ccr、以及AdhE2。
34.一种重组植物，所述重组植物被工程化以表达具有选自由以下各项组成的组的活性的一种或多种多肽：苹果酸硫激酶活性、苹果酰辅酶A裂解酶活性、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶活性以及反丁烯二酸还原酶活性并且其中所述重组植物与野生型植物或亲本植物相比产生更多的乙酰辅酶A。
35.如权利要求34所述的重组植物，其中所述植物与野生型植物或亲本植物相比表现出增加的生物质。
36.如权利要求34所述的重组植物，其中所述植物与野生型植物或亲本植物相比表现出提高的CO2利用率。
37.如权利要求34所述的重组植物，其中所述植物与野生型植物或亲本植物相比表现出减少的光呼吸或不表现出光呼吸。
38.如权利要求34所述的重组植物，其中所述植物与野生型植物或亲本植物相比表现出提高的光合效率。
39.如权利要求34所述的重组植物，其中所述植物与亲本植物或野生型植物相比表现出提高的营养生物质。
40.如权利要求34所述的重组植物，其中所述植物与亲本植物或野生型植物相比表现出增加的种子产量。
41.如权利要求34所述的重组植物，其中所述植物与亲本植物或野生型植物相比表现出提高的收获指数。
42.如权利要求34或35所述的重组植物，其中所述植物具有突变的sbpase基因。
43.如权利要求34或35所述的重组植物，其中所述植物包含降低的RuBisco表达或活性或缺乏RuBisco的活性。
44.如权利要求34或35所述的重组植物，其中所述植物是用于油、生物燃料、化学品、动物饲料、谷物或草料的作物植物。
45.如权利要求34、35或44所述的重组植物，其中所述植物是拟南芥(Arabidopsis)、坎诺拉或亚麻荠作物植物。
46.如权利要求34、35或44所述的重组植物，其中所述植物是单子叶植物。
47.如权利要求34、35或44所述的重组植物，其中所述植物是双子叶植物。
48.如权利要求34、35、44或45至47所述的重组植物，其中所述重组植物与野生型植物或亲本植物相比包含升高的乙酰辅酶A通量。
49.如权利要求34、35、44或45至48所述的重组植物，其中所述重组植物与野生型植物或亲本植物相比包含升高的油含量或脂肪酸含量。
50.如权利要求34至49中任一项所述的重组植物，其中所述植物表达或过表达选自由以下各项组成的组的酶：顺乌头酸酶、NADP-苹果酸脱氢酶、反丁烯二酸酶、反丁烯二酸还原酶、ATP-柠檬酸裂解酶、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、苹果酸硫激酶、苹果酰辅酶A裂解酶、异柠檬酸裂解酶、丙酮酸羧化酶以及其任何组合。
51.如权利要求50所述的重组植物，其中所述植物包含选自由以下各项组成的组的基因型：acn、mdh、fumc、frd、acl、nifJ、mtkA、mtkB、mcl、icl、pyc以及其任何组合的基因。
52.一种植物部分，所述植物部分是从如权利要求34、35、44或45至51所述的重组植物获得的。
53.如权利要求52所述的植物部分，其中所述植物部分是原生质体、细胞、分生组织、根、雌蕊、花粉囊、花、种子、胚芽、秆或叶柄。
54.一种产品，所述产品是由如权利要求34、35、44、或45至51所述的重组植物生产的。
55.一种产品，所述产品是由如权利要求52或53所述的植物部分生产的。
56.一种用于提高植物中的生物质或油产量的方法，所述方法包括：向植物、植物部分和/或植物细胞中引入编码具有以下各项的酶活性的多肽的一种或多种异源性多核苷酸：顺乌头酸酶、NADP-苹果酸脱氢酶、反丁烯二酸酶、反丁烯二酸还原酶、ATP-柠檬酸裂解酶、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、苹果酸硫激酶、苹果酰辅酶A裂解酶、异柠檬酸裂解酶、以及丙酮酸羧化酶，以产生稳定转化的表达所述一种或多种异源性多核苷酸的植物、植物部分、和/或植物细胞。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述一种或多种异源性多核苷酸被引入到所述植物、植物部分和/或植物细胞的核和/或叶绿体中。
58.如权利要求56所述的方法，其中所述多肽中的一种或多种与使所述多肽靶向所述叶绿体的氨基酸序列可操作地连接。
59.一种稳定转化的植物、植物部分或植物细胞，所述植物、植物部分或植物细胞是通过如权利要求56所述的方法产生的。
60.一种稳定转化的植物、植物部分或植物细胞，所述植物、植物部分或植物细胞，其包含编码具有以下各项的酶活性的多肽的一种或多种异源性多核苷酸：顺乌头酸酶、NADP-苹果酸脱氢酶、反丁烯二酸酶、反丁烯二酸还原酶、ATP-柠檬酸裂解酶、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、苹果酸硫激酶、苹果酰辅酶A裂解酶、异柠檬酸裂解酶、以及丙酮酸羧化酶。
61.如权利要求60所述的稳定转化的植物的种子，其中所述种子在它的基因组中包含所述编码具有以下各项的酶活性的多肽的一种或多种异源性多核苷酸：顺乌头酸酶、NADP-苹果酸脱氢酶、反丁烯二酸酶、反丁烯二酸还原酶、ATP-柠檬酸裂解酶、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、苹果酸硫激酶、苹果酰辅酶A裂解酶、异柠檬酸裂解酶、以及丙酮酸羧化酶。
62.一种产品，所述产品是由如权利要求59所述的稳定转化的植物、植物部分或植物细胞生产的。
63.一种产品，所述产品是由如权利要求60所述的稳定转化的植物、植物部分或植物细胞生产的。
64.一种产品，所述产品是由如权利要求61所述的稳定转化的种子生产的。
65.如权利要求62所述的产品，其中所述产品是食品、饮料、动物饲料、纤维、油、化学品、脂肪酸、类异戊二烯、药物和/或生物燃料。
66.如权利要求63所述的产品，其中所述产品是食品、饮料、动物饲料、纤维、油、化学品、脂肪酸、类异戊二烯、药物和/或生物燃料。
67.如权利要求64所述的产品，其中所述产品是食品、饮料、动物饲料、纤维、油、化学品、脂肪酸、类异戊二烯、药物和/或生物燃料。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109576284A (zh) * 2018-12-21 2019-04-05 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一个多功能的myb转录因子基因及其用途
CN110004102A (zh) * 2019-04-23 2019-07-12 南京工业大学 一种利用马来酸全细胞催化合成l-天冬氨酸的菌株与方法
CN113710813A (zh) * 2019-02-15 2021-11-26 布拉斯科公司 通过逆向乙醛酸支路生产乙醇酸和甘氨酸的微生物和方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016164810A1 (en) 2015-04-08 2016-10-13 Metabolix, Inc. Plants with enhanced yield and methods of construction
EP3864136A1 (en) * 2018-10-09 2021-08-18 Novozymes A/S Modified filamentous fungal host cell
CN113122489B (zh) * 2020-01-15 2022-06-14 中国科学院微生物研究所 一种产乙醇酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用
WO2023023092A2 (en) * 2021-08-16 2023-02-23 Lygos, Inc. Recombinant host cells and methods for the production of glycolic acid

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009046929A2 (de) * 2007-10-02 2009-04-16 Insilico Biotechnology Ag Biotechnologische fixierung von kohlenstoffdioxid
WO2013018734A1 (ja) * 2011-07-29 2013-02-07 三井化学株式会社 二酸化炭素固定経路を導入した微生物

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6815580B1 (en) * 1999-05-13 2004-11-09 Monsanto Technology Llc Expression of the Chlorella sorokiniana sedoheptulose 1,7-bisphosphatase in transgenic plants
KR20030011780A (ko) * 2000-03-01 2003-02-11 리서치 앤드 디벨롭먼트 인스티튜트 인코포레이티드 종자 수확량, 바이오매스 및 수확지수가 증가된 형질전환식물
US20080293101A1 (en) * 2006-07-27 2008-11-27 Peters Matthew W Engineered microorganisms for increasing product yield in biotransformations, related methods and systems
WO2009036095A1 (en) * 2007-09-10 2009-03-19 Joule Biotechnologies, Inc. Engineered light-harvesting organisms
US7858350B2 (en) * 2008-09-10 2010-12-28 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of 1,4-butanediol
US9410131B2 (en) * 2010-02-11 2016-08-09 Yeda Research And Development Co. Ltd. Enzymatic systems for carbon fixation and methods of generating same
US8349587B2 (en) * 2011-10-31 2013-01-08 Ginkgo Bioworks, Inc. Methods and systems for chemoautotrophic production of organic compounds

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009046929A2 (de) * 2007-10-02 2009-04-16 Insilico Biotechnology Ag Biotechnologische fixierung von kohlenstoffdioxid
WO2013018734A1 (ja) * 2011-07-29 2013-02-07 三井化学株式会社 二酸化炭素固定経路を導入した微生物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SAMUEL E.MAINGUET: "A reverse glyoxylate shunt to build a non-native route from C4 to C2 in Escherichia coli", 《METABOLIC ENGINEERING》 *
无: "MCAL_RHOSK", 《UNIPROTKB》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109576284A (zh) * 2018-12-21 2019-04-05 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一个多功能的myb转录因子基因及其用途
CN109576284B (zh) * 2018-12-21 2021-09-17 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一个多功能的myb转录因子基因及其用途
CN113710813A (zh) * 2019-02-15 2021-11-26 布拉斯科公司 通过逆向乙醛酸支路生产乙醇酸和甘氨酸的微生物和方法
CN110004102A (zh) * 2019-04-23 2019-07-12 南京工业大学 一种利用马来酸全细胞催化合成l-天冬氨酸的菌株与方法

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Publication number Publication date
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