CN101748069B

CN101748069B - 一种重组蓝藻

Info

Publication number: CN101748069B
Application number: CN200810239558XA
Authority: CN
Inventors: 周杰; 解鹃; 高成华; 张延平; 李寅
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2008-12-12
Filing date: 2008-12-12
Publication date: 2012-08-08
Anticipated expiration: 2028-12-12
Also published as: CN101748069A

Abstract

本发明公开了一种重组蓝藻。该重组蓝藻，是通过包括如下步骤的方法得到的重组蓝藻：向色球藻科蓝藻中导入如下1)或2)中所述的丁醇合成相关基因：1)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因：电子转移黄素蛋白A亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶；2)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因：电子转移黄素蛋白B亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶。本发明实现了利用蓝藻将地球上取之不尽的太阳能和温室气体二氧化碳转化为能源产品丁醇，避免了能源再生过程中对粮食等其它有机物的浪费，同时又有利于环境保护。因此，利用本发明重组蓝藻来生产丁醇是实现可再生清洁能源持续、健康发展的理想途径之一。

Description

一种重组蓝藻

技术领域

本发明涉及一种重组蓝藻。

背景技术

全球面临的能源问题、环境问题向人们提出了发展可再生清洁能源的要求，而粮食短缺问题又要求可再生清洁能源的发展要实现不与人争粮、不与作物争地、不与人和作物争淡水。

丁醇(butanol)是一种重要的化工原料，主要用于制造增塑剂、溶剂、萃取剂等，是一种高附加值化学品，全球年需求量超过140万吨。此外，丁醇还是一种极具潜力的新型生物燃料，具有如下优点：其热值、辛烷值与汽油相当，含氧量与汽油中常用的甲基叔丁基醚相近；其不腐蚀管道，便于管道输送；其蒸汽压低，安全性高，能与汽油以任意比混合。

丁醇可由发酵和石油化工合成法生产，由于石油危机，丁醇发酵生产成为研究热点。发酵生产主要是通过丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)发酵粮食生产丁醇。从70年代起三十几年的研究，阐明了丙酮丁醇梭菌的丁醇代谢途径，使丁醇发酵生产取得了很大进展。但丁醇发酵生产存在发酵底物成本高、产物丁醇中混杂有丙酮、丙酮丁醇梭菌严格厌氧及丁醇对细胞有毒害等缺点。因此，科学家们在改进发酵生产丁醇的同时也在探索用非厌氧菌生物合成丁醇。美国和日本的科学家先后将丙酮丁醇梭菌的丁醇合成途径导入大肠杆菌中，并得到有丁醇产生的菌株。这种方法虽然解决了梭菌发酵生产丁醇时产物中混有丙酮和产丁醇梭菌的严格厌氧不利于操作的问题，但大肠杆菌仍为异养菌，其原料成本依然很高，没有解决发展生物能源与粮食问题的冲突。

蓝藻(blue-green algae)又称蓝细菌(cyanobacteria)，是可以进行放氧光合作用的原核生物。蓝藻能够利用二氧化碳和太阳能快速繁殖，而且其广泛分布在淡水、海水甚至是污水中，是生物合成能源产品的理想宿主。作为原核生物，蓝藻细胞结构简单、遗传背景与大肠杆菌相似，易于基因操作。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种产丁醇的重组蓝藻。

本发明所提供的重组蓝藻，是通过包括如下步骤的方法得到的重组蓝藻：向蓝藻中导入如下1)、2)或3)中所述的丁醇合成相关基因：

1)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因：电子转移黄素蛋白A亚基、烯酰水合酶(又称烯酰辅酶A水合酶)、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶；

2)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因：电子转移黄素蛋白B亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶；

3)所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因：电子转移黄素蛋白A亚基、电子转移黄素蛋白B亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶。

所述丁醇合成相关基因还可包括如下酶的编码基因：3-羟丁酰辅酶A脱氢酶和/或乙酰辅酶A乙酰转移酶(又称硫解酶)和/或丁醇脱氢酶。

所述方法还可包括灭活所述蓝藻中的至少一个聚-β羟基丁酸酯合成相关基因的步骤。

所述灭活的方法可为用至少一个的所述丁醇合成相关基因替换至少一个的所述聚-β羟基丁酸酯合成相关基因。

所述聚-β羟基丁酸酯合成相关基因具体可为聚-β羟基丁酸酯合成酶的编码基因；所述灭活的方法具体可为用所述乙醇脱氢酶的编码基因替换所述聚-β羟基丁酸酯合成酶的编码基因。

所述灭活的方法可以是通过同源重组实现的。

本发明方法中导入的丁醇合成相关基因可以自行通过复制型重组质粒来进行表达(即不包括灭活所述色球藻科蓝藻中的至少一个聚-β羟基丁酸酯合成相关基因的步骤的情况)，也可以整合到染色体上进行表达(即包括灭活所述色球藻科蓝藻中的至少一个聚-β羟基丁酸酯合成相关基因的步骤情况)，或者二者同时进行。

所述各酶可以是如下氨基酸序列的蛋白质：

所述烯酰水合酶为如下1)或2)所述的蛋白质：

1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有烯酰水合酶功能的由1)衍生的蛋白质；

所述丁酰辅酶A脱氢酶为如下a)或b)所述的蛋白质：

a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有丁酰辅酶A脱氢酶功能的由a)衍生的蛋白质；

所述电子转移黄素蛋白B亚基为如I或II所述的蛋白质：

I由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

II将序列表中序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有电子转移黄素蛋白B亚基功能的由I衍生的蛋白质；

所述电子转移黄素蛋白A亚基为如下i或ii所述的蛋白质：

i由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

ii将序列表中序列6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有电子转移黄素蛋白A亚基功能的由i衍生的蛋白质；

所述3-羟丁酰辅酶A脱氢酶为如下①或②所述的蛋白质：

①由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

②将序列表中序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有3-羟丁酰辅酶A脱氢酶功能的由①衍生的蛋白质；

所述丁醇脱氢酶为如下A或B所述的蛋白质：

A.由序列表中序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

B.将序列表中序列8的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有丁醇脱氢酶功能的由A衍生的蛋白质；

所述乙醇脱氢酶为如下A)或B)所述的蛋白质：

A)由序列表中序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

B)将序列表中序列9的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有乙醇脱氢酶功能的由A)衍生的蛋白质；

所述乙酰辅酶A乙酰转移酶(又称硫解酶)为如下(1)或(2)所述的蛋白质：

(1)由序列表中序列10所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列10的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有乙酰辅酶A乙酰转移酶功能的由(1)衍生的蛋白质。

所述导入的各酶的核苷酸序列可以如下：

所述烯酰水合酶的编码基因为如下1)、2)或3)所述的基因：

1)其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1-786位核苷酸的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列有90％以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子；

所述丁酰辅酶A脱氢酶的编码基因为如下a)、b)或c)所述的基因：

a)其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第800-1939位核苷酸的DNA分子；

b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

c)与a)限定的DNA序列有90％以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子；

所述电子转移黄素蛋白B亚基的编码基因为如I、II或III所述的基因：

I其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1958-2737位核苷酸的DNA分子；

II在严格条件下与I限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

III与I限定的DNA序列有90％以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子；

所述电子转移黄素蛋白A亚基的编码基因为如下i、ii或iii所述的基因：

i其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第2756-3766位核苷酸的DNA分子；

所述3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的编码基因为如下①、②或③所述的基因：

①核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第3871-4719位核苷酸的DNA分子；

②在严格条件下与①限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

③与①限定的DNA序列有90％以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子；

所述乙醇脱氢酶的编码基因为如下A、B或C所述的基因：

A.其核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第610-3186位核苷酸的DNA分子；

B.在严格条件下与A限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

C.与A限定的DNA序列有90％以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子；

所述丁醇脱氢酶的编码基因为如下(1)、(2)或(3)所述的基因：

(1)其核苷酸序列为序列表中序列11所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

(3)与(1)限定的DNA序列有90％以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子；

所述乙酰辅酶A乙酰转移酶的编码基因为如下(1)、(2)或(3)所述的基因：

(1)其核苷酸序列为序列表中序列12所示的DNA分子；

本发明中所用的出发菌可以蓝藻门中的任一蓝藻，具体可以是色球藻科蓝藻，具体可如色球藻科蓝藻为淡水蓝藻聚球藻6803(Synechocystis sp.PCC 6803)和海水蓝藻聚球藻7002(Synechococcus sp.PCC 7002)。

本发明中得到的重组蓝藻具体为蓝藻集胞藻(Synechocystis sp.)SMB-100CGMCC No.2795和聚球藻(Synechococcus sp.)SMB-101 CGMCC No.2794。

蓝藻集胞藻(Synechocystis sp.)SMB-100已于2008年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.2795。

聚球藻(Synechococcus sp.)SMB-101已于2008年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.2794。

本发明利用了蓝藻可以进行光合自养的特性、可以在海水和污水中生长的特性及易于进行基因操作的优点。

本发明对蓝藻代谢途径进行改造和重建，在蓝藻中建立丁醇合成途径，使其具有产丁醇的能力。这样构建的重组蓝藻根据其自身的光合自养的特点来大量繁殖，从而产生更多的能源产品丁醇。本发明中使用蓝藻自身的诱导启动子，在控制丁醇合成途径的同时又避免了丁醇对蓝藻的毒害作用。

本发明实现了利用蓝藻将地球上取之不尽的太阳能和温室气体二氧化碳转化为能源产品丁醇，避免了能源再生过程中对粮食等其它有机物的浪费，同时又有利于环境保护。因此，利用本发明重组蓝藻来生产丁醇是实现可再生清洁能源持续、健康发展的理想途径之一。

附图说明

图1为重组蓝藻SMB-100的鉴定。

图2为标准品中丁醇的色谱图。

图3为重组蓝藻SMB-100培养液中丁醇的色谱图。

图4为重组蓝藻SMB-101的鉴定。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从生物公司购买。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

本发明的总体构思如下：

一、通过代谢工程改造，在蓝藻中建立丁醇合成途径：

1、从丙酮丁醇梭菌中克隆丁醇合成途径中所需酶的编码基因：烯酰水合酶(crt)、丁酰辅酶A脱氢酶(bcd)、电子转移黄素蛋白B亚基(etfB)、电子转移黄素蛋白A亚基(etfA)、3-羟丁酰辅酶A脱氢酶(hbd)和乙醇脱氢酶(adhe)。其中前五个基因crt、bcd、etfB、etfB和hbd为一个操作子，将其命名为命名为crt操纵子。

2、在蓝藻中诱导表达crt操纵子：构建蓝藻表达载体pAM-crt，使crt操纵子在蓝藻内源铜诱导启动子的启动下，在蓝藻中诱导表达。

3、在蓝藻中表达乙醇脱氢酶基因(adhe)：通过同源重组，将adhe基因整合在蓝藻基因组DNA上，并使其表达。

二、工程蓝藻的鉴定及丁醇的诱导合成与检测：

1、基因水平鉴定上述丁醇合成途径所需酶的编码基因已成功转入蓝藻中；

2、通过诱导激活工程藻中建立的丁醇合成途径，使工程藻产丁醇；通过液相色谱检测工程蓝藻中有丁醇产生。

下述实施例中，出发菌分别为色球藻科集胞藻属淡水蓝藻集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC 6803)(Zhang S，Spann KW，et al.Identification oftwo genes，sll0804 and slr1306，as putative components of theCO2-concentrating mechanism in the cyanobacterium Synechocystis sp.strainPCC 6803.J Bacteriol.2008 190：8234-7；)(中国科学院微生物研究所)和色球藻科聚球藻属海水蓝藻聚球藻7002(Synechococcus sp.PCC 7002)；(Jin Z，Heinnickel M，et al.Biogenesis of iron-sulfur clusters in photosystem I：holo-NfuA from the cyanobacterium Synechococcus sp.PCC 7002 rapidly andefficiently transfers[4Fe-4S]clusters to apo-PsaC in vitro.J Biol Chem.2008，283：28426-35)(中国科学院微生物研究所)。

丙酮丁醇梭菌为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824(US2007020740(A1))；蓝藻表达载体pAM2770(Wu X，Li DW，et al.The Anabaenasp.strain PCC 7120 asr1734 gene encodes a negative regulator of heterocystDevelopment.Molecul Microbiol.2007，64：782-794.)(中国科学院微生物研究所)；质粒pRL271(Wei TF，Ramasubramanian TS，et al.Anabaena sp.strain PCC7120 ntcA Gene required for growth on nitrate and heterocyst development.JBacteriol.1994，176：4473-4482.)。(中国科学院微生物研究所)。

下述实施例中Synechocystis sp.PCC 6803及其工程菌转化、筛选及培养时所用培养基为BG-11培养基，基因工程菌株筛选时添加10μg/ml的卡那霉素和10μg/ml的氯霉素。

下述实施例中Synechococcus sp.PCC 7002及其工程菌转化、筛选及培养时所用培养基为Medium 957培养基，基因工程菌株筛选时添加10μg/ml的卡那霉素和10μg/ml的氯霉素。

BG-11培养基组成：每升培养基中含有NaNO₃ 1.5g，K₂HPO₄ 0.04g，MgSO₄·7H₂O0.075g，CaCl₂·2H₂O 0.036g，柠檬酸0.006g，柠檬酸铁铵0.006g，EDTA(disodiumsalt)0.001g，Na₂CO₃ 0.02g，Trace metal mix A5 1.0ml，琼脂10.0g，蒸馏水1.0L，pH 7.1±0.3。

Medium 957培养基组成：每升培养基中含有蒸馏水250.0ml，海水750.0ml，MgSO₄·7H₂O 0.04g，CaCl₂·2H₂O 0.02g，NaNO₃ 0.75g，K₂HPO₄·3H₂O 0.02g，柠檬酸3.0mg，柠檬酸铁铵3.0mg，EDTA(disodium potassium salt)乙二胺四乙酸0.5mg，Na₂CO₃ 0.02g，Trace metal mix A51.0ml，琼脂10.0g，pH 8.5±0.3。

Trace metal mix A5组成：每升中含有H₃BO₃ 2.86g，MnCl₂·4H₂O 1.81g，ZnSO₄·7H₂O 0.222g，NaMoO₄·2H₂O 0.39g，CuSO₄·5H₂O 0.079g，Co(NO₃)₂·6H₂O49.4mg，蒸馏水1.0L。

实施例1、色球藻科集胞藻属(Synechocystis)淡水蓝藻集胞藻的重组构建

本实施例中使用的出发蓝藻为淡水蓝藻集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC6803)。

一、向出发菌中导入丁醇合成相关基因

本实验中的丁醇合成相关基因由crt基因、bcd基因、etfB基因、etfA基因和hbd基因组成，组成一个crt操纵子，各基因均来自梭菌。

1、crt操纵子的扩增：

提取丙酮丁醇梭菌基因组DNA；

根据丙酮丁醇梭菌基因组中crt操纵子DNA序列和蓝藻表达载体pAM2770上的酶切位点设计引物如下：

crtF：ATTC GAGCTC AATGGAACTAAACAATGTCATCCT(下划线部分为SacI酶切位点)；

crtR：CG GGATCC ATGGGGATTCTTGTAAACTTATT(下划线部分为BamHI酶切位点)。

以丙酮丁醇梭菌基因组DNA为模板、以crtF和crtR为引物，进行PCR扩增；对扩增产物进行测序，得到的基因的序列如序列表中序列1所示，表明扩增产物为有crt基因、bcd基因、etfB基因、etfA基因和hbd基因的crt操纵子，序列正确，其中自序列1的5’末端第1-786位核苷酸为crt基因的序列，第800-1939位核苷酸为bcd基因的序列，第1958-2737核苷酸为etfB基因的序列，第2756-3766位核苷酸为etfA基因的序列，第3871-4719位核苷酸为hbd基因的序列。

2、重组蓝藻表达载体pAM-crt的构建：

为避免丁醇对蓝藻生长的毒害作用，使用蓝藻内源启动子铜诱导启动子petE在蓝藻中诱导表达crt操纵子。

用限制性内切酶SacI和BamHI酶切上述crt操纵子；用限制性内切酶SacI和BamHI酶切蓝藻表达载体pAM2770，回收大片段；将两酶切产物连接，连接产物转化至大肠杆菌中，通过50μg/ml卡那霉素筛选，得到重组质粒。重组质粒序列分析结果表明，crt操纵子正确插入到pAM2770载体上铜诱导启动子petE下游SacI和BamHI位点，并且插入的序列正确，将正确的阳性重组蓝藻表达载体命名为pAM-crt。

3、pAM-crt对蓝藻Synechocystis sp.PCC 6803的转化及筛选：

转化方法：具体步骤为收集处于对数生长期的蓝藻细胞，用培养基BG-11洗涤细胞后，将质粒pAM-crt加入到蓝藻培养液中混匀，光照下静止培养5小时；

筛选：在含有卡那霉素的固体BG-11培养基平板上筛选重组子，卡那霉素筛选浓度为10μg/ml；

将得到的阳性重组蓝藻命名为PCC 6803/pAM-crt。

4、空载体pAM2770对蓝藻Synechocystis sp.PCC 6803的转化及筛选：

转化方法：具体步骤为收集处于对数生长期的蓝藻细胞，用培养基BG-11洗涤细胞后，将质粒pAM2770加入到蓝藻培养液中混匀，光照下静止培养5小时。

筛选：在含有卡那霉素的固体BG-11培养基平板上筛选重组子，卡那霉素筛选浓度为10μg/ml。；

将得到的含空载体的重组蓝藻命名为PCC 6803/pAM2770。

二、用丙酮丁醇梭菌丁醇合成途径中adhe基因替换蓝藻Synechocystis sp.PCC 6803中PHB合成酶基因

由于蓝藻中存在聚羟基丁酸(PHB)次级代谢途径，PHB合成与丁醇合成有共同的前体，而PHB合成酶的敲除不影响蓝藻生长，因此，用丁醇合成途径中最后一个酶乙醇脱氢酶基因(adhe)来取代蓝藻基因组中的PHB合成酶基因(phb)，构建整合表达载体pUC-up-adhe-Cm-down，通过同源重组，用adhe和氯霉素抗性基因(Cm)取代蓝藻PHB合成酶基因。

1、蓝藻同源重组整合表达载体pUC-up-adhe-Cm-down的构建：

adhe基因的获得：以丙酮丁醇梭菌的基因组DNA为模板，用下述引物(adheF/adheR)进行PCR扩增，PCR产物测序，得到adhe基因，其核苷酸序列如序列表中序列2中第610-3186位核苷酸所示。

up为蓝藻基因组DNA中phb编码区上游的600bp DNA片段，通过以下方法获得：以淡水蓝藻集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC 6803)的基因组DNA为模板，用下述引物进行PCR扩增，PCR产物测序，得到up序列，其核苷酸序列如序列表中序列2中第1-609位核苷酸所示。

down为蓝藻基因组DNA中phb编码区下游的600bp DNA片段，通过以下方法获得：以淡水蓝藻集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC 6803)的基因组DNA为模板，用下述引物(downF/downR)进行PCR扩增，PCR产物测序，得到down序列，其核苷酸序列如序列表中序列2中第4402-4996位核苷酸所示。

Cm序列的获得：以质粒pRL271为模板，用下述引物(CmF/CmR)进行PCR扩增，PCR产物测序，得到Cm序列，其核苷酸序列如序列表中序列2中第3352-4401位核苷酸所示。

up-adhe的获得：首先PCR分别扩增得到up和adhe，然后再把两片段混在一起作模板，用upF/adheR引物对进行第二轮PCR扩增，得到up-adhe；

Cm-down的获得：首先PCR分别扩增得到Cm和down，然后再把两片段混在一起作模板，用CmF/downR引物对进行第二轮PCR扩增，得到Cm-down；；

pUC-up-adhe-Cm-down的获得：用限制性内切酶XbaI酶切Cm-down，用限制性内切酶XbaI酶切pUC-18载体，连接得到重组载体pUC-18/Cm-down；用限制性内切酶BamHI酶切up-adhe，用限制性内切酶BamHI酶切pUC-18/Cm-down，连接得到重组载体pUC-up-adhe-Cm-down。

阳性质粒的转化及筛选：用pUC-up-adhe-Cm-down转化大肠杆菌，经50μg/ml氨苄霉素和30μg/ml氯霉素筛选阳性克隆。

阳性质粒的验证：将筛选得到的阳性质粒进行测序，表明插入的up-adhe-Cm-down序列如序列表中序列2所示，得到载体pUC-up-adhe-Cm-down正确；

扩增各片段及融合PCR所需引物如下：

upF：5’-CGCGGATCCCAGATTCGGTCTTCCCCCAGGCG(BamHI)

upR：5’-CTTTTTGATTTGTAACTTTCATGGTCAAAATCCACCTTACTACTGGC(up-adhe融合所需嵌合引物)

adheF：5’-ATGAAAGTTACAAATCAAAAAGA

adheR：5’-CGCGGATCCAAAGAATTGTGGAGTAAAGGATA(BamHI)

CmF：5’-GCTCTAGAGGTTGATAATGAACTGTGCTGAT(XbaI)

CmR：5’-GTTGCCCTAATGTATTCCAGCAAATCGAATTTCTGCCATTCATCCG

(Cm-down融合所需嵌合引物)

downF：5’-TTGCTGGAATACATTAGGGCAAC

downR：5’-GCTCTAGAGATATCGAAGCGGACAACGGCAT(XbaI)

2、将pUC-up-adhe-Cm-down转化至实验一中的重组蓝藻PCC 6803/pAM-crt中：

转化方法：具体步骤为收集处于对数生长期的重组蓝藻PCC 6803/pAM-crt细胞，用培养基BG-11洗涤细胞后，将质粒pUC-up-adhe-Cm-down加入到细胞液中混匀，光照下静止培养5小时。

筛选：在含有氯霉素的固体BG-11培养基平板上筛选重组子，氯霉素筛选浓度为10μg/ml；将筛选得到的重组蓝藻命名为SMB-100。

同时向蓝藻PCC 6803/pAM2770中转入空载体pUC-18，将得到的重组蓝藻命名为PCC 6803/pAM2770/pUC，作为对照；同时向蓝藻PCC 6803中转入空载体pUC18，作为对照，将得到的重组蓝藻命名为PCC 6803/pUC。

三、重组蓝藻SMB-100的验证及目标产物丁醇的检测

(1)基因水平鉴定：

分别提取蓝藻SMB-100、PCC 6803/pAM2770、PCC 6803/pUC和PCC 6803/pAM2770/pUC的总DNA；再分别以crtF、crtR和phb700F、phb700R(蓝藻PHB合成酶基因的上下游700bp处设计的引物)为引物，进行PCR扩增。结果如图1A所示，在SMB-100中用引物crtF、crtR扩增得到4.7kb的DNA片段，大小与crt操纵子一致；在对照组中用引物crtF、crtR没有扩增到条带，表明上述丁醇合成途径所需酶的编码基因crt操纵子已成功转入蓝藻SMB-100中。结果如图1B所示，在SMB-100中，用引物phb700F、phb700R扩增得到5.3kb的DNA片段，大小与up-adhe-Cm-down一致；在对照组中用引物phb700F、phb700R扩增到3.4kb片段，该片段为PHB合成酶基因(2kb)及其上下游700bp，这表明adhe基因已成功转入蓝藻SMB-100中，并且adhe基因已通过同源重组成功取代PHB合成酶基因。(图1中，A为crt操纵子导入重组蓝藻SMB-100的鉴定，泳道1：DNA Maker λDNA/HindIII，泳道2：SMB-100，泳道3：对照组PCC 6803/pAM2770，泳道4：对照组PCC 6803/pUC、泳道5：对照组PCC 6803/pAM2770/pUC；B为adhe基因整合到SMB-100基因组的鉴定，泳道1：DNA MakerλDNA/HindIII，泳道2：SMB-100，泳道3：对照组PCC6803/pAM2770，泳道4：对照组PCC 6803/pUC，泳道5：对照组PCC6803/pAM2770/pUC)。phb700F：5’-TACAACATTTTTCTGTAGGC-3’，phb700R：5’-ATGTCGCCTATCAACTGTTGA-3’。

(2)重组蓝藻SMB-100生产丁醇性能的检测：

将重组蓝藻SMB-100接种于不含铜的BG-11培养基中，在30℃、60μmol m^-2s^-1光照、振荡的条件下培养至对数生长后期，使其细胞密度达到OD₇₃₀＝1.5；向培养液中加入2μM CuSO₄使铜诱导启动子petE启动adhe基因和crt操纵子的表达，进而诱导丁醇合成；在铜诱导48小时后，取培养液进行液相色谱检测。

液相色谱检测方法为：样品前处理：取培养液12000rpm离心1min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤；色谱条件：Agilent 1200液相色谱仪，示差检测器；BioRadAminex HPX-87H有机酸柱(300*7.8mm)，柱温15℃；上样量10μl；流动相为0.05mM H₂SO₄，流速0.5ml/min。

丁醇标准品购自Sigma公司(目录号：4C006217)；在如上色谱条件下标准品中丁醇的保留时间为40.9分钟，丁醇标准品的检测图谱如图2所示(A表示丁醇)。

重组蓝藻SMB-100培养液的上清的检测图谱如图3所示(A表示丁醇)。

实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，工程藻SMB-100生产丁醇的能力为0.27g/L培养液。

实施例2、色球藻科聚球藻属海水蓝藻聚球藻7002的重组构建

本实施例中使用的出发蓝藻为海水蓝藻聚球藻7002(Synechococcus sp.PCC7002)。

一、向出发菌中导入丁醇合成相关基因

导入基因的序列及导入方法均与实施例1中一所述一致。

转入空载体pAM2770的重组蓝藻命名为PCC 7002/pAM2770。

二、用梭菌丁醇合成途径中adhe基因替换蓝藻Synechocystis sp.PCC 6803中PHB合成酶基因

方法均与实施例1中二所述一致。

既导入空载体pAM2770又导入空载体pUC18的蓝藻命名为PCC7002/pAM2770/pUC，作为对照；向蓝藻PCC 7002中转入空载体pUC18的蓝藻命名为PCC 7002/pUC。

将得到的含有adhe基因和crt操纵子的重组蓝藻命名为SMB-101。

三、蓝藻SMB-101的验证及目标产物丁醇的检测

(1)基因水平鉴定：

鉴定方法与实施例1中三所述一致。

结果如图4A所示，在SMB-101中用引物crtF、crtR扩增得到4.7kb的DNA片段，大小与crt操纵子一致；在对照组中用引物crtF、crtR没有扩增到条带，表明上述丁醇合成途径所需酶的编码基因crt操纵子已成功转入蓝藻SMB-101中。结果如图4B所示，在SMB-101中，用引物phb700F、phb700R扩增得到5.3kb的DNA片段，大小与up-adhe-Cm-down一致；在对照组中用引物phb700F、phb700R扩增到3.4kb片段，该片段为PHB合成酶基因(2kb)及其上下游700bp这表明adhe基因已成功转入蓝藻SMB-101中，并且adhe基因已通过同源重组成功取代PHB合成酶基因。(图4中，A为crt操纵子导入重组蓝藻SMB-101的鉴定，1：DNA MakerλDNA/HindIII；2：SMB-101；3：对照组PCC 7002/pAM2770，4：对照组PCC 7002/pUC，5：对照组PCC 7002/pAM2770/pUC；B为adhe基因整合到SMB-101基因组的鉴定，1：DNA MakerλDNA/HindIII；2：SMB-101；3：对照组PCC 7002/pAM2770，4：对照组PCC 7002/pUC，5：对照组PCC 7002/pAM2770/pUC)。phb700F：5’-TACAACATTTTTCTGTAGGC-3’，phb700R：5’-ATGTCGCCTATCAACTGTTGA-3’。

(2)重组蓝藻SMB-101生产丁醇性能的检测：

将重组蓝藻SMB-101接种于不含铜的Medium 957培养基中，在30℃、60μmolm^-2s^-1光照、振荡的条件下培养至对数生长后期，使其细胞密度达到OD₇₃₀＝1.5；向培养液中加入2μM CuSO₄使铜诱导启动子petE启动adhe基因和crt操纵子的表达，进而诱导丁醇合成；在铜诱导48小时后，取培养液进行液相色谱检测。

色谱检测方法及条件同实施例1中三一致。

实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，工程藻SMB-101生产丁醇的能力为0.22g/L培养液。

序列表

<210>1

<211>4736

<212>DNA

<213>梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

<400>1

atggaactaa acaatgtcat ccttgaaaag gaaggtaaag ttgctgtagt taccattaac 60

agacctaaag cattaaatgc gttaaatagt gatacactaa aagaaatgga ttatgttata 120

ggtgaaattg aaaatgatag cgaagtactt gcagtaattt taactggagc aggagaaaaa 180

tcatttgtag caggagcaga tatttctgag atgaaggaaa tgaataccat tgaaggtaga 240

aaattcggga tacttggaaa taaagtgttt agaagattag aacttcttga aaagcctgta 300

atagcagctg ttaatggttt tgctttagga ggcggatgcg aaatagctat gtcttgtgat 360

ataagaatag cttcaagcaa cgcaagattt ggtcaaccag aagtaggtct cggaataaca 420

cctggttttg gtggtacaca aagactttca agattagttg gaatgggcat ggcaaagcag 480

cttatattta ctgcacaaaa tataaaggca gatgaagcat taagaatcgg acttgtaaat 540

aaggtagtag aacctagtga attaatgaat acagcaaaag aaattgcaaa caaaattgtg 600

agcaatgctc cagtagctgt taagttaagc aaacaggcta ttaatagagg aatgcagtgt 660

gatattgata ctgctttagc atttgaatca gaagcatttg gagaatgctt ttcaacagag 720

gatcaaaagg atgcaatgac agctttcata gagaaaagaa aaattgaagg cttcaaaaat 780

agataggagg taagtttata tggattttaa tttaacaaga gaacaagaat tagtaagaca 840

gatggttaga gaatttgctg aaaatgaagt taaacctata gcagcagaaa ttgatgaaac 900

agaaagattt ccaatggaaa atgtaaagaa aatgggtcag tatggtatga tgggaattcc 960

attttcaaaa gagtatggtg gcgcaggtgg agatgtatta tcttatataa tcgccgttga 1020

ggaattatca aaggtttgcg gtactacagg agttattctt tcagcacata catcactttg 1080

tgcttcatta ataaatgaac atggtacaga agaacaaaaa caaaaatatt tagtaccttt 1140

agctaaaggt gaaaaaatag gtgcttatgg attgactgag ccaaatgcag gaacagattc 1200

tggagcacaa caaacagtag ctgtacttga aggagatcat tatgtaatta atggttcaaa 1260

aatattcata actaatggag gagttgcaga tacttttgtt atatttgcaa tgactgacag 1320

aactaaagga acaaaaggta tatcagcatt tataatagaa aaaggcttca aaggtttctc 1380

tattggtaaa gttgaacaaa agcttggaat aagagcttca tcaacaactg aacttgtatt 1440

tgaagatatg atagtaccag tagaaaacat gattggtaaa gaaggaaaag gcttccctat 1500

agcaatgaaa actcttgatg gaggaagaat tggtatagca gctcaagctt taggtatagc 1560

tgaaggtgct ttcaacgaag caagagctta catgaaggag agaaaacaat ttggaagaag 1620

ccttgacaaa ttccaaggtc ttgcatggat gatggcagat atggatgtag ctatagaatc 1680

agctagatat ttagtatata aagcagcata tcttaaacaa gcaggacttc catacacagt 1740

tgatgctgca agagctaagc ttcatgctgc aaatgtagca atggatgtaa caactaaggc 1800

agtacaatta tttggtggat acggatatac aaaagattat ccagttgaaa gaatgatgag 1860

agatgctaag ataactgaaa tatatgaagg aacttcagaa gttcagaaat tagttatttc 1920

aggaaaaatt tttagataat ttaaggaggt taagaggatg aatatagttg tttgtttaaa 1980

acaagttcca gatacagcgg aagttagaat agatccagtt aagggaacac ttataagaga 2040

aggagttcca tcaataataa atccagatga taaaaacgca cttgaggaag ctttagtatt 2100

aaaagataat tatggtgcac atgtaacagt tataagtatg ggacctccac aagctaaaaa 2160

tgctttagta gaagctttgg ctatgggtgc tgatgaagct gtacttttaa cagatagagc 2220

atttggagga gcagatacac ttgcgacttc acatacaatt gcagcaggaa ttaagaagct 2280

aaaatatgat atagtttttg ctggaaggca ggctatagat ggagatacag ctcaggttgg 2340

accagaaata gctgagcatc ttggaatacc tcaagtaact tatgttgaga aagttgaagt 2400

tgatggagat actttaaaga ttagaaaagc ttgggaagat ggatatgaag ttgttgaagt 2460

taagacacca gttcttttaa cagcaattaa agaattaaat gttccaagat atatgagtgt 2520

agaaaaaata ttcggagcat ttgataaaga agtaaaaatg tggactgccg atgatataga 2580

tgtagataag gctaatttag gtcttaaagg ttcaccaact aaagttaaga agtcatcaac 2640

taaagaagtt aaaggacagg gagaagttat tgataagcct gttaaggaag cagctgcata 2700

tgttgtctca aaattaaaag aagaacacta tatttaagtt aggagggatt tttcaatgaa 2760

taaagcagat tacaagggcg tatgggtgtt tgctgaacaa agagacggag aattacaaaa 2820

ggtatcattg gaattattag gtaaaggtaa ggaaatggct gagaaattag gcgttgaatt 2880

aacagctgtt ttacttggac ataatactga aaaaatgtca aaggatttat tatctcatgg 2940

agcagataag gttttagcag cagataatga acttttagca catttttcaa cagatggata 3000

tgctaaagtt atatgtgatt tagttaatga aagaaagcca gaaatattat tcataggagc 3060

tactttcata ggaagagatt taggaccaag aatagcagca agactttcta ctggtttaac 3120

tgctgattgt acatcacttg acatagatgt agaaaataga gatttattgg ctacaagacc 3180

agcgtttggt ggaaatttga tagctacaat agtttgttca gaccacagac cacaaatggc 3240

tacagtaaga cctggtgtgt ttgaaaaatt acctgttaat gatgcaaatg tttctgatga 3300

taaaatagaa aaagttgcaa ttaaattaac agcatcagac ataagaacaa aagtttcaaa 3360

agttgttaag cttgctaaag atattgcaga tatcggagaa gctaaggtat tagttgctgg 3420

tggtagagga gttggaagca aagaaaactt tgaaaaactt gaagagttag caagtttact 3480

tggtggaaca atagccgctt caagagcagc aatagaaaaa gaatgggttg ataaggacct 3540

tcaagtaggt caaactggta aaactgtaag accaactctt tatattgcat gtggtatatc 3600

aggagctatc cagcatttag caggtatgca agattcagat tacataattg ctataaataa 3660

agatgtagaa gccccaataa tgaaggtagc agatttggct atagttggtg atgtaaataa 3720

agttgtacca gaattaatag ctcaagttaa agctgctaat aattaagata aataaaaaga 3780

attatttaaa gcttattatg ccaaaatact tatatagtat tttggtgtaa atgcattgat 3840

agtttcttta aatttaggga ggtctgttta atgaaaaagg tatgtgttat aggtgcaggt 3900

actatgggtt caggaattgc tcaggcattt gcagctaaag gatttgaagt agtattaaga 3960

gatattaaag atgaatttgt tgatagagga ttagatttta tcaataaaaa tctttctaaa 4020

ttagttaaaa aaggaaagat agaagaagct actaaagttg aaatcttaac tagaatttcc 4080

ggaacagttg accttaatat ggcagctgat tgcgatttag ttatagaagc agctgttgaa 4140

agaatggata ttaaaaagca gatttttgct gacttagaca atatatgcaa gccagaaaca 4200

attcttgcat caaatacatc atcactttca ataacagaag tggcatcagc aactaaaaga 4260

cctgataagg ttataggtat gcatttcttt aatccagctc ctgttatgaa gcttgtagag 4320

gtaataagag gaatagctac atcacaagaa acttttgatg cagttaaaga gacatctata 4380

gcaataggaa aagatcctgt agaagtagca gaagcaccag gatttgttgt aaatagaata 4440

ttaataccaa tgattaatga agcagttggt atattagcag aaggaatagc ttcagtagaa 4500

gacatagata aagctatgaa acttggagct aatcacccaa tgggaccatt agaattaggt 4560

gattttatag gtcttgatat atgtcttgct ataatggatg ttttatactc agaaactgga 4620

gattctaagt atagaccaca tacattactt aagaagtatg taagagcagg atggcttgga 4680

agaaaatcag gaaaaggttt ctacgattat tcaaaataag tttacaagaa tcccca 4736

<210>2

<211>4996

<212>DNA

<220>

<223>

<400>2

cagattcggt cttcccccag gcgatcgcca aggaaaaatt atttttctga cccgctaccg 60

tggcgacaat ggtggccagg ttgatactcc tcaggttggt taacagccta tccaaaactt 120

gctagagtgt tcattggcca aaaatcccat taattctttt attattaccg ctttgccatg 180

gttaacacct acaccgccga aatccaacac cagggtcaga cctataccat ctccgttccc 240

gaggataaaa cggtgctcca agcggcggat gatgagggga tacaactacc tacttcctgt 300

ggcgctgggg tttgcactac ctgtgcggcg ttaatcaccg aaggcacagc ggagcaggct 360

gacggcatgg gagtttcagc ggaactacag gctgagggat atgctctact ttgtgtagcc 420

tatccccgct cagatttgaa aattatcacc gaaaaagaag acgaagttta tcagcggcag 480

ttcggcggcc aaggttagat tcggctggaa ttctcccttc ccatgacaaa tcttccagag 540

caacacttgc caccccaaaa agctgagcca taattcaggt agcggccagt agtaaggtgg 600

attttgacca tgaaagttac aaatcaaaaa gaactaaaac aaaagctaaa tgaattgaga 660

gaagcgcaaa agaagtttgc aacctatact caagagcaag ttgataaaat ttttaaacaa 720

tgtgccatag ccgcagctaa agaaagaata aacttagcta aattagcagt agaagaaaca 780

ggaataggtc ttgtagaaga taaaattata aaaaatcatt ttgcagcaga atatatatac 840

aataaatata aaaatgaaaa aacttgtggc ataatagacc atgacgattc tttaggcata 900

acaaaggttg ctgaaccaat tggaattgtt gcagccatag ttcctactac taatccaact 960

tccacagcaa ttttcaaatc attaatttct ttaaaaacaa gaaacgcaat attcttttca 1020

ccacatccac gtgcaaaaaa atctacaatt gctgcagcaa aattaatttt agatgcagct 1080

gttaaagcag gagcacctaa aaatataata ggctggatag atgagccatc aatagaactt 1140

tctcaagatt tgatgagtga agctgatata atattagcaa caggaggtcc ttcaatggtt 1200

aaagcggcct attcatctgg aaaacctgca attggtgttg gagcaggaaa tacaccagca 1260

ataatagatg agagtgcaga tatagatatg gcagtaagct ccataatttt atcaaagact 1320

tatgacaatg gagtaatatg cgcttctgaa caatcaatat tagttatgaa ttcaatatac 1380

gaaaaagtta aagaggaatt tgtaaaacga ggatcatata tactcaatca aaatgaaata 1440

gctaaaataa aagaaactat gtttaaaaat ggagctatta atgctgacat agttggaaaa 1500

tctgcttata taattgctaa aatggcagga attgaagttc ctcaaactac aaagatactt 1560

ataggcgaag tacaatctgt tgaaaaaagc gagctgttct cacatgaaaa actatcacca 1620

gtacttgcaa tgtataaagt taaggatttt gatgaagctc taaaaaaggc acaaaggcta 1680

atagaattag gtggaagtgg acacacgtca tctttatata tagattcaca aaacaataag 1740

gataaagtta aagaatttgg attagcaatg aaaacttcaa ggacatttat taacatgcct 1800

tcttcacagg gagcaagcgg agatttatac aattttgcga tagcaccatc atttactctt 1860

ggatgcggca cttggggagg aaactctgta tcgcaaaatg tagagcctaa acatttatta 1920

aatattaaaa gtgttgctga aagaagggaa aatatgcttt ggtttaaagt gccacaaaaa 1980

atatatttta aatatggatg tcttagattt gcattaaaag aattaaaaga tatgaataag 2040

aaaagagcct ttatagtaac agataaagat ctttttaaac ttggatatgt taataaaata 2100

acaaaggtac tagatgagat agatattaaa tacagtatat ttacagatat taaatctgat 2160

ccaactattg attcagtaaa aaaaggtgct aaagaaatgc ttaactttga acctgatact 2220

ataatctcta ttggtggtgg atcgccaatg gatgcagcaa aggttatgca cttgttatat 2280

gaatatccag aagcagaaat tgaaaatcta gctataaact ttatggatat aagaaagaga 2340

atatgcaatt tccctaaatt aggtacaaag gcgatttcag tagctattcc tacaactgct 2400

ggtaccggtt cagaggcaac accttttgca gttataacta atgatgaaac aggaatgaaa 2460

taccctttaa cttcttatga attgacccca aacatggcaa taatagatac tgaattaatg 2520

ttaaatatgc ctagaaaatt aacagcagca actggaatag atgcattagt tcatgctata 2580

gaagcatatg tttcggttat ggctacggat tatactgatg aattagcctt aagagcaata 2640

aaaatgatat ttaaatattt gcctagagcc tataaaaatg ggactaacga cattgaagca 2700

agagaaaaaa tggcacatgc ctctaatatt gcggggatgg catttgcaaa tgctttctta 2760

ggtgtatgcc attcaatggc tcataaactt ggggcaatgc atcacgttcc acatggaatt 2820

gcttgtgctg tattaataga agaagttatt aaatataacg ctacagactg tccaacaaag 2880

caaacagcat tccctcaata taaatctcct aatgctaaga gaaaatatgc tgaaattgca 2940

gagtatttga atttaaaggg tactagcgat accgaaaagg taacagcctt aatagaagct 3000

atttcaaagt taaagataga tttgagtatt ccacaaaata taagtgccgc tggaataaat 3060

aaaaaagatt tttataatac gctagataaa atgtcagagc ttgcttttga tgaccaatgt 3120

acaacagcta atcctaggta tccacttata agtgaactta aggatatcta tataaaatca 3180

ttttaaaaaa taaagaatgt aaaatagtct ttgcttcatt atattagctt catgaagcac 3240

atagactatt ttacatttta ctcttgtttt ttatctttca agtggttgct tgtacgaatc 3300

tgtaccatct ttaatattaa ttaccttgta tcctttactc cacaattctt tgttgataat 3360

gaactgtgct gattacaaaa atactaaaaa tgcccatatt ttttcctcct tataaaatta 3420

gtataattat agcacgcgaa ttcatcgaat aaatacctgt gacggaagat cacttcgcag 3480

aataaataaa tcctggtgtc cctgttgata ccgggaagcc ctgggccaac ttttggcgaa 3540

aatgagacgt tgatcggcac gtaagaggtt ccaactttca ccataatgaa ataagatcac 3600

taccgggcgt attttttgag ttatcgagat tttcaggagc taaggaagct aaaatggaga 3660

aaaaaatcac tggatatacc accgttgata tatcccaatg gcatcgtaaa gaacattttg 3720

aggcatttca gtcagttgct caatgtacct ataaccagac cgttcagctg gatattacgg 3780

cctttttaaa gaccgtaaag aaaaataagc acaagtttta tccggccttt attcacattc 3840

ttgcccgcct gatgaatgct catccggaat tccgtatggc aatgaaagac ggtgagctgg 3900

tgatatggga tagtgttcac ccttgttaca ccgttttcca tgagcaaact gaaacgtttt 3960

catcgctctg gagtgaatac cacgacgatt tccggcagtt tctacacata tattcgcaag 4020

atgtggcgtg ttacggtgaa aacctggcct atttccctaa agggtttatt gagaatatgt 4080

ttttcgtctc agccaatccc tgggtgagtt tcaccagttt tgatttaaac gtggccaata 4140

tggacaactt cttcgccccc gttttcacca tgggcaaata ttatacgcaa ggcgacaagg 4200

tgctgatgcc gctggcgatt caggttcatc atgccgtttg tgatggcttc catgtcggca 4260

gaatgcttaa tgaattacaa cagtactgcg atgagtggca gggcggggcg taattttttt 4320

aaggcagtta ttggtgccct taaacgcctg gtgctacgcc tgaataagtg ataataagcg 4380

gatgaatggc agaaattcga tttgctggaa tacattaggg caacactcag gactcatcta 4440

gtgctttaac tgatacatcc accgcttgta cgtcaatagt tccaggggga gtggggcggg 4500

taaattgtcc attgctcact tccaactctt ccccgcaact ggggcatcgg catggctgac 4560

cgtcaaaacc agtgaagtga tactgacaaa cgggacactc cccatccacc aattttctct 4620

tcagccacca gcggaatacc aaaaagccca ccgttggtgc cagaaacaat agcaaaatca 4680

acagagcaat gccattgaca acccatttca gaccaatggc actgaggagc atggccacgg 4740

caaggacagt caagccacag cccaggcctg attggttgac ggtaacaaat ttgggggaaa 4800

agttgttcac agatggctcc taccaacagc attaccgctg ggatcactat tttccatcct 4860

agtccattag ctccgcagtt ggaataccaa ggtatcctcc cctgggctaa aggttttgaa 4920

caggtcgcac accatgccta tcccattaaa atcacgttgt caatcacatg gataatgccg 4980

ttgtccgctt cgatat 4996

<210>3

<211>261

<212>PRT

<213>梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

<400>3

Met Glu Leu Asn Asn Val Ile Leu Glu Lys Glu Gly Lys Val Ala Val

1 5 10 15

Val Thr Ile Asn Arg Pro Lys Ala Leu Asn Ala Leu Asn Ser Asp Thr

20 25 30

Leu Lys Glu Met Asp Tyr Val Ile Gly Glu Ile Glu Asn Asp Ser Glu

35 40 45

Val Leu Ala Val Ile Leu Thr Gly Ala Gly Glu Lys Ser Phe Val Ala

50 55 60

Gly Ala Asp Ile Ser Glu Met Lys Glu Met Asn Thr Ile Glu Gly Arg

65 70 75 80

Lys Phe Gly Ile Leu Gly Asn Lys Val Phe Arg Arg Leu Glu Leu Leu

85 90 95

Glu Lys Pro Val Ile Ala Ala Val Asn Gly Phe Ala Leu Gly Gly Gly

100 105 110

Cys Glu Ile Ala Met Ser Cys Asp Ile Arg Ile Ala Ser Ser Asn Ala

115 120 125

Arg Phe Gly Gln Pro Glu Val Gly Leu Gly Ile Thr Pro Gly Phe Gly

130 135 140

Gly Thr Gln Arg Leu Ser Arg Leu Val Gly Met Gly Met Ala Lys Gln

145 150 155 160

Leu Ile Phe Thr Ala Gln Asn Ile Lys Ala Asp Glu Ala Leu Arg Ile

165 170 175

Gly Leu Val Asn Lys Val Val Glu Pro Ser Glu Leu Met Asn Thr Ala

180 185 190

Lys Glu Ile Ala Asn Lys Ile Val Ser Asn Ala Pro Val Ala Val Lys

195 200 205

Leu Ser Lys Gln Ala Ile Asn Arg Gly Met Gln Cys Asp Ile Asp Thr

210 215 220

Ala Leu Ala Phe Glu Ser Glu Ala Phe Gly Glu Cys Phe Ser Thr Glu

225 230 235 240

Asp Gln Lys Asp Ala Met Thr Ala Phe Ile Glu Lys Arg Lys Ile Glu

245 250 255

Gly Phe Lys Asn Arg

260

<210>4

<211>378

<212>PRT

<213>梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

<400>4

Met Asp Phe Asn Leu Thr Arg Glu Gln Glu Leu Val Arg Gln Met Val

1 5 10 15

Arg Glu Phe Ala Glu Asn Glu Val Lys Pro Ile Ala Ala Glu Ile Asp

20 25 30

Glu Thr Glu Arg Phe Pro Met Glu Asn Val Lys Lys Met Gly Gln Tyr

35 40 45

Gly Met Met Gly Ile Pro Phe Ser Lys Glu Tyr Gly Gly Ala Gly Gly

50 55 60

Asp Val Leu Ser Tyr Ile Ile Ala Val Glu Glu Leu Ser Lys Val Cys

65 70 75 80

Gly Thr Thr Gly Val Ile Leu Ser Ala His Thr Ser Leu Cys Ala Ser

85 90 95

Leu Ile Asn Glu His Gly Thr Glu Glu Gln Lys Gln Lys Tyr Leu Val

100 105 110

Pro Leu Ala Lys Gly Glu Lys Ile Gly Ala Tyr Gly Leu Thr Glu Pro

115 120 125

Asn Ala Gly Thr Asp Ser Gly Ala Gln Gln Thr Val Ala Val Leu Glu

130 135 140

Gly Asp His Tyr Val Ile Asn Gly Ser Lys Ile Phe Ile Thr Asn Gly

145 150 155 160

Gly Val Ala Asp Thr Phe Val Ile Phe Ala Met Thr Asp Arg Thr Lys

165 170 175

Gly Thr Lys Gly Ile Ser Ala Phe Ile Ile Glu Lys Gly Phe Lys Gly

180 185 190

Phe Ser Ile Gly Lys Val Glu Gln Lys Leu Gly Ile Arg Ala Ser Ser

195 200 205

Thr Thr Glu Leu Val Phe Glu Asp Met Ile Val Pro Val Glu Asn Met

210 215 220

Ile Gly Lys Glu Gly Lys Gly Phe Pro Ile Ala Met Lys Thr Leu Asp

225 230 235 240

Gly Gly Arg Ile Gly Ile Ala Ala Gln Ala Leu Gly Ile Ala Glu Gly

245 250 255

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Arg Ser Leu Asp Lys Phe Gln Gly Leu Ala Trp Met Met Ala Asp Met

275 280 285

Asp Val Ala Ile Glu Ser Ala Arg Tyr Leu Val Tyr Lys Ala Ala Tyr

290 295 300

Leu Lys Gln Ala Gly Leu Pro Tyr Thr Val Asp Ala Ala Arg Ala Lys

305 310 315 320

Leu His Ala Ala Asn Val Ala Met Asp Val Thr Thr Lys Ala Val Gln

325 330 335

Leu Phe Gly Gly Tyr Gly Tyr Thr Lys Asp Tyr Pro Val Glu Arg Met

340 345 350

Met Arg Asp Ala Lys Ile Thr Glu Ile Tyr Glu Gly Thr Ser Glu Val

355 360 365

Gln Lys Leu Val Ile Ser Gly Lys Ile Phe

370 375

<210>5

<211>259

<212>PRT

<213>梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

<400>5

Met Asn Ile Val Val Cys Leu Lys Gln Val Pro Asp Thr Ala Glu Val

1 5 10 15

Arg Ile Asp Pro Val Lys Gly Thr Leu Ile Arg Glu Gly Val Pro Ser

20 25 30

Ile Ile Asn Pro Asp Asp Lys Asn Ala Leu Glu Glu Ala Leu Val Leu

35 40 45

Lys Asp Asn Tyr Gly Ala His Val Thr Val Ile Ser Met Gly Pro Pro

50 55 60

Gln Ala Lys Asn Ala Leu Val Glu Ala Leu Ala Met Gly Ala Asp Glu

65 70 75 80

Ala Val Leu Leu Thr Asp Arg Ala Phe Gly Gly Ala Asp Thr Leu Ala

85 90 95

Thr Ser His Thr Ile Ala Ala Gly Ile Lys Lys Leu Lys Tyr Asp Ile

100 105 110

Val Phe Ala Gly Arg Gln Ala Ile Asp Gly Asp Thr Ala Gln Val Gly

115 120 125

Pro Glu Ile Ala Glu His Leu Gly Ile Pro Gln Val Thr Tyr Val Glu

130 135 140

Lys Val Glu Val Asp Gly Asp Thr Leu Lys Ile Arg Lys Ala Trp Glu

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Asp Gly Tyr Glu Val Val Glu Val Lys Thr Pro Val Leu Leu Thr Ala

165 170 175

Ile Lys Glu Leu Asn Val Pro Arg Tyr Met Ser Val Glu Lys Ile Phe

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Gly Ala Phe Asp Lys Glu Val Lys Met Trp Thr Ala Asp Asp Ile Asp

195 200 205

Val Asp Lys Ala Asn Leu Gly Leu Lys Gly Ser Pro Thr Lys Val Lys

210 215 220

Lys Ser Ser Thr Lys Glu Val Lys Gly Gln Gly Glu Val Ile Asp Lys

225 230 235 240

Pro Val Lys Glu Ala Ala Ala Tyr Val Val Ser Lys Leu Lys Glu Glu

245 250 255

His Tyr Ile

<210>6

<211>336

<212>PRT

<213>梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

<400>6

Met Asn Lys Ala Asp Tyr Lys Gly Val Trp Val Phe Ala Glu Gln Arg

1 5 10 15

Asp Gly Glu Leu Gln Lys Val Ser Leu Glu Leu Leu Gly Lys Gly Lys

20 25 30

Glu Met Ala Glu Lys Leu Gly Val Glu Leu Thr Ala Val Leu Leu Gly

35 40 45

His Asn Thr Glu Lys Met Ser Lys Asp Leu Leu Ser His Gly Ala Asp

50 55 60

Lys Val Leu Ala Ala Asp Asn Glu Leu Leu Ala His Phe Ser Thr Asp

65 70 75 80

Gly Tyr Ala Lys Val Ile Cys Asp Leu Val Asn Glu Arg Lys Pro Glu

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Ile Leu Phe Ile Gly Ala Thr Phe Ile Gly Arg Asp Leu Gly Pro Arg

100 105 110

Ile Ala Ala Arg Leu Ser Thr Gly Leu Thr Ala Asp Cys Thr Ser Leu

115 120 125

Asp Ile Asp Val Glu Asn Arg Asp Leu Leu Ala Thr Arg Pro Ala Phe

130 135 140

Gly Gly Asn Leu Ile Ala Thr Ile Val Cys Ser Asp His Arg Pro Gln

145 150 155 160

Met Ala Thr Val Arg Pro Gly Val Phe Glu Lys Leu Pro Val Asn Asp

165 170 175

Ala Asn Val Ser Asp Asp Lys Ile Glu Lys Val Ala Ile Lys Leu Thr

180 185 190

Ala Ser Asp Ile Arg Thr Lys Val Ser Lys Val Val Lys Leu Ala Lys

195 200 205

Asp Ile Ala Asp Ile Gly Glu Ala Lys Val Leu Val Ala Gly Gly Arg

210 215 220

Gly Val Gly Ser Lys Glu Asn Phe Glu Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Thr Ile Ala Ala Ser Arg Ala Ala Ile Glu Lys Glu

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Trp Val Asp Lys Asp Leu Gln Val Gly Gln Thr Gly Lys Thr Val Arg

260 265 270

Pro Thr Leu Tyr Ile Ala Cys Gly Ile Ser Gly Ala Ile Gln His Leu

275 280 285

Ala Gly Met Gln Asp Ser Asp Tyr Ile Ile Ala Ile Asn Lys Asp Val

290 295 300

Glu Ala Pro Ile Met Lys Val Ala Asp Leu Ala Ile Val Gly Asp Val

305 310 315 320

Asn Lys Val Val Pro Glu Leu Ile Ala Gln Val Lys Ala Ala Asn Asn

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<210>7

<211>282

<212>PRT

<213>梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

<400>7

Met Lys Lys Val Cys Val Ile Gly Ala Gly Thr Met Gly Ser Gly Ile

1 5 10 15

Ala Gln Ala Phe Ala Ala Lys Gly Phe Glu Val Val Leu Arg Asp Ile

20 25 30

Lys Asp Glu Phe Val Asp Arg Gly Leu Asp Phe Ile Asn Lys Asn Leu

35 40 45

Ser Lys Leu Val Lys Lys Gly Lys Ile Glu Glu Ala Thr Lys Val Glu

50 55 60

Ile Leu Thr Arg Ile Ser Gly Thr Val Asp Leu Asn Met Ala Ala Asp

65 70 75 80

Cys Asp Leu Val Ile Glu Ala Ala Val Glu Arg Met Asp Ile Lys Lys

85 90 95

Gln Ile Phe Ala Asp Leu Asp Asn Ile Cys Lys Pro Glu Thr Ile Leu

100 105 110

Ala Ser Asn Thr Ser Ser Leu Ser Ile Thr Glu Val Ala Ser Ala Thr

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130 135 140

Val Met Lys Leu Val Glu Val Ile Arg Gly Ile Ala Thr Ser Gln Glu

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Thr Phe Asp Ala Val Lys Glu Thr Ser Ile Ala Ile Gly Lys Asp Pro

165 170 175

Val Glu Val Ala Glu Ala Pro Gly Phe Val Val Asn Arg Ile Leu Ile

180 185 190

Pro Met Ile Asn Glu Ala Val Gly Ile Leu Ala Glu Gly Ile Ala Ser

195 200 205

Val Glu Asp Ile Asp Lys Ala Met Lys Leu Gly Ala Asn His Pro Met

210 215 220

Gly Pro Leu Glu Leu Gly Asp Phe Ile Gly Leu Asp Ile Cys Leu Ala

225 230 235 240

Ile Met Asp Val Leu Tyr Ser Glu Thr Gly Asp Ser Lys Tyr Arg Pro

245 250 255

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260 265 270

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275 280

<210>8

<211>390

<212>PRT

<213>梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

<400>8

Met Val Asp Phe Glu Tyr Ser Ile Pro Thr Arg Ile Phe Phe Gly Lys

1 5 10 15

Asp Lys Ile Asn Val Leu Gly Arg Glu Leu Lys Lys Tyr Gly Ser Lys

20 25 30

Val Leu Ile Val Tyr Gly Gly Gly Ser Ile Lys Arg Asn Gly Ile Tyr

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Asp Lys Ala Val Ser Ile Leu Glu Lys Asn Ser Ile Lys Phe Tyr Glu

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Arg Ala Asn Leu Met Trp Ala Ser Ser Leu Ala Ile Asn Gly Leu Leu

245 250 255

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260 265 270

Leu Ser Ala Tyr Tyr Asp Ile Thr His Gly Val Gly Leu Ala Ile Leu

275 280 285

Thr Pro Asn Trp Met Glu Tyr Ile Leu Asn Asn Asp Thr Val Tyr Lys

290 295 300

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<210>9

<211>858

<212>PRT

<213>梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

<400>9

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35 40 45

Leu Ala Lys Leu Ala Val Glu Glu Thr Gly Ile Gly Leu Val Glu Asp

50 55 60

Lys Ile Ile Lys Asn His Phe Ala Ala Glu Tyr Ile Tyr Asn Lys Tyr

65 70 75 80

Lys Asn Glu Lys Thr Cys Gly Ile Ile Asp His Asp Asp Ser Leu Gly

85 90 95

Ile Thr Lys Val Ala Glu Pro Ile Gly Ile Val Ala Ala Ile Val Pro

100 105 110

Thr Thr Asn Pro Thr Ser Thr Ala Ile Phe Lys Ser Leu Ile Ser Leu

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145 150 155 160

Gly Ala Pro Lys Asn Ile Ile Gly Trp Ile Asp Glu Pro Ser Ile Glu

165 170 175

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180 185 190

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Gly Val Gly Ala Gly Asn Thr Pro Ala Ile Ile Asp Glu Ser Ala Asp

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Gly Val Ile Cys Ala Ser Glu Gln Ser Ile Leu Val Met Asn Ser Ile

245 250 255

Tyr Glu Lys Val Lys Glu Glu Phe Val Lys Arg Gly Ser Tyr Ile Leu

260 265 270

Asn Gln Asn Glu Ile Ala Lys Ile Lys Glu Thr Met Phe Lys Asn Gly

275 280 285

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290 295 300

Met Ala Gly Ile Glu Val Pro Gln Thr Thr Lys Ile Leu Ile Gly Glu

305 310 315 320

Val Gln Ser Val Glu Lys Ser Glu Leu Phe Ser His Glu Lys Leu Ser

325 330 335

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340 345 350

Lys Ala Gln Arg Leu Ile Glu Leu Gly Gly Ser Gly His Thr Ser Ser

355 360 365

Leu Tyr Ile Asp Ser Gln Asn Asn Lys Asp Lys Val Lys Glu Phe Gly

370 375 380

Leu Ala Met Lys Thr Ser Arg Thr Phe Ile Asn Met Pro Ser Ser Gln

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Gly Ala Ser Gly Asp Leu Tyr Asn Phe Ala Ile Ala Pro Ser Phe Thr

405 410 415

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565 570 575

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580 585 590

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610 615 620

Leu Thr Pro Asn Met Ala Ile Ile Asp Thr Glu Leu Met Leu Asn Met

625 630 635 640

Pro Arg Lys Leu Thr Ala Ala Thr Gly Ile Asp Ala Leu Val His Ala

645 650 655

Ile Glu Ala Tyr Val Ser Val Met Ala Thr Asp Tyr Thr Asp Glu Leu

660 665 670

Ala Leu Arg Ala Ile Lys Met Ile Phe Lys Tyr Leu Pro Arg Ala Tyr

675 680 685

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Ser Asn Ile Ala Gly Met Ala Phe Ala Asn Ala Phe Leu Gly Val Cys

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<210>10

<211>392

<212>PRT

<213>梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

<400>10

Met Lys Glu Val Val Ile Ala Ser Ala Val Arg Thr Ala Ile Gly Ser

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Tyr Gly Lys Ser Leu Lys Asp Val Pro Ala Val Asp Leu Gly Ala Thr

20 25 30

Ala Ile Lys Glu Ala Val Lys Lys Ala Gly Ile Lys Pro Glu Asp Val

35 40 45

Asn Glu Val Ile Leu Gly Asn Val Leu Gln Ala Gly Leu Gly Gln Asn

50 55 60

Pro Ala Arg Gln Ala Ser Phe Lys Ala Gly Leu Pro Val Glu Ile Pro

65 70 75 80

Ala Met Thr Ile Asn Lys Val Cys Gly Ser Gly Leu Arg Thr Val Ser

85 90 95

Leu Ala Ala Gln Ile Ile Lys Ala Gly Asp Ala Asp Val Ile Ile Ala

100 105 110

Gly Gly Met Glu Asn Met Ser Arg Ala Pro Tyr Leu Ala Asn Asn Ala

115 120 125

Arg Trp Gly Tyr Arg Met Gly Asn Ala Lys Phe Val Asp Glu Met Ile

130 135 140

Thr Asp Gly Leu Trp Asp Ala Phe Asn Asp Tyr His Met Gly Ile Thr

145 150 155 160

Ala Glu Asn Ile Ala Glu Arg Trp Asn Ile Ser Arg Glu Glu Gln Asp

165 170 175

Glu Phe Ala Leu Ala Ser Gln Lys Lys Ala Glu Glu Ala Ile Lys Ser

180 185 190

Gly Gln Phe Lys Asp Glu Ile Val Pro Val Val Ile Lys Gly Arg Lys

195 200 205

Gly Glu Thr Val Val Asp Thr Asp Glu His Pro Arg Phe Gly Ser Thr

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Ile Glu Gly Leu Ala Lys Leu Lys Pro Ala Phe Lys Lys Asp Gly Thr

225 230 235 240

Val Thr Ala Gly Asn Ala Ser Gly Leu Asn Asp Cys Ala Ala Val Leu

245 250 255

Val Ile Met Ser Ala Glu Lys Ala Lys Glu Leu Gly Val Lys Pro Leu

260 265 270

Ala Lys Ile Val Ser Tyr Gly Ser Ala Gly Val Asp Pro Ala Ile Met

275 280 285

Gly Tyr Gly Pro Phe Tyr Ala Thr Lys Ala Ala Ile Glu Lys Ala Gly

290 295 300

Trp Thr Val Asp Glu Leu Asp Leu Ile Glu Ser Asn Glu Ala Phe Ala

305 310 315 320

Ala Gln Ser Leu Ala Val Ala Lys Asp Leu Lys Phe Asp Met Asn Lys

325 330 335

Val Asn Val Asn Gly Gly Ala Ile Ala Leu Gly His Pro Ile Gly Ala

340 345 350

Ser Gly Ala Arg Ile Leu Val Thr Leu Val His Ala Met Gln Lys Arg

355 360 365

Asp Ala Lys Lys Gly Leu Ala Thr Leu Cys Ile Gly Gly Gly Gln Gly

370 375 380

Thr Ala Ile Leu Leu Glu Lys Cys

385 390

<210>11

<211>1173

<212>DNA

<213>梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

<400>11

gtggttgatt tcgaatattc aataccaact agaatttttt tcggtaaaga taagataaat 60

gtacttggaa gagagcttaa aaaatatggt tctaaagtgc ttatagttta tggtggagga 120

agtataaaga gaaatggaat atatgataaa gctgtaagta tacttgaaaa aaacagtatt 180

aaattttatg aacttgcagg agtagagcca aatccaagag taactacagt tgaaaaagga 240

gttaaaatat gtagagaaaa tggagttgaa gtagtactag ctataggtgg aggaagtgca 300

atagattgcg caaaggttat agcagcagca tgtgaatatg atggaaatcc atgggatatt 360

gtgttagatg gctcaaaaat aaaaagggtg cttcctatag ctagtatatt aaccattgct 420

gcaacaggat cagaaatgga tacgtgggca gtaataaata atatggatac aaacgaaaaa 480

ctaattgcgg cacatccaga tatggctcct aagttttcta tattagatcc aacgtatacg 540

tataccgtac ctaccaatca aacagcagca ggaacagctg atattatgag tcatatattt 600

gaggtgtatt ttagtaatac aaaaacagca tatttgcagg atagaatggc agaagcgtta 660

ttaagaactt gtattaaata tggaggaata gctcttgaga agccggatga ttatgaggca 720

agagccaatc taatgtgggc ttcaagtctt gcgataaatg gacttttaac atatggtaaa 780

gacactaatt ggagtgtaca cttaatggaa catgaattaa gtgcttatta cgacataaca 840

cacggcgtag ggcttgcaat tttaacacct aattggatgg agtatatttt aaataatgat 900

acagtgtaca agtttgttga atatggtgta aatgtttggg gaatagacaa agaaaaaaat 960

cactatgaca tagcacatca agcaatacaa aaaacaagag attactttgt aaatgtacta 1020

ggtttaccat ctagactgag agatgttgga attgaagaag aaaaattgga cataatggca 1080

aaggaatcag taaagcttac aggaggaacc ataggaaacc taagaccagt aaacgcctcc 1140

gaagtcctac aaatattcaa aaaatctgtg taa 1173

<210>12

<211>1179

<212>DNA

<213>梭菌属丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

<400>12

atgaaagaag ttgtaatagc tagtgcagta agaacagcga ttggatctta tggaaagtct 60

cttaaggatg taccagcagt agatttagga gctacagcta taaaggaagc agttaaaaaa 120

gcaggaataa aaccagagga tgttaatgaa gtcattttag gaaatgttct tcaagcaggt 180

ttaggacaga atccagcaag acaggcatct tttaaagcag gattaccagt tgaaattcca 240

gctatgacta ttaataaggt ttgtggttca ggacttagaa cagttagctt agcagcacaa 300

attataaaag caggagatgc tgacgtaata atagcaggtg gtatggaaaa tatgtctaga 360

gctccttact tagcgaataa cgctagatgg ggatatagaa tgggaaacgc taaatttgtt 420

gatgaaatga tcactgacgg attgtgggat gcatttaatg attaccacat gggaataaca 480

gcagaaaaca tagctgagag atggaacatt tcaagagaag aacaagatga gtttgctctt 540

gcatcacaaa aaaaagctga agaagctata aaatcaggtc aatttaaaga tgaaatagtt 600

cctgtagtaa ttaaaggcag aaagggagaa actgtagttg atacagatga gcaccctaga 660

tttggatcaa ctatagaagg acttgcaaaa ttaaaacctg ccttcaaaaa agatggaaca 720

gttacagctg gtaatgcatc aggattaaat gactgtgcag cagtacttgt aatcatgagt 780

gcagaaaaag ctaaagagct tggagtaaaa ccacttgcta agatagtttc ttatggttca 840

gcaggagttg acccagcaat aatgggatat ggacctttct atgcaacaaa agcagctatt 900

gaaaaagcag gttggacagt tgatgaatta gatttaatag aatcaaatga agcttttgca 960

gctcaaagtt tagcagtagc aaaagattta aaatttgata tgaataaagt aaatgtaaat 1020

ggaggagcta ttgcccttgg tcatccaatt ggagcatcag gtgcaagaat actcgttact 1080

cttgtacacg caatgcaaaa aagagatgca aaaaaaggct tagcaacttt atgtataggt 1140

ggcggacaag gaacagcaat attgctagaa aagtgctag 1179

Claims

1.一种重组蓝藻，是通过包括如下步骤的方法得到的重组蓝藻：向蓝藻中导入丁醇合成相关基因；所述丁醇合成相关基因包括如下酶的编码基因：

电子转移黄素蛋白A亚基、电子转移黄素蛋白B亚基、烯酰水合酶、丁酰辅酶A脱氢酶、乙醇脱氢酶和3-羟丁酰辅酶A脱氢酶；

所述烯酰水合酶为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述丁酰辅酶A脱氢酶为由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述电子转移黄素蛋白B亚基为由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述电子转移黄素蛋白A亚基为由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述3-羟丁酰辅酶A脱氢酶为由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述乙醇脱氢酶为由序列表中序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述蓝藻为淡水蓝藻集胞藻(Synechocystis sp.)PCC 6803或海水蓝藻聚球藻(Synechococcus sp.)PCC 7002。

2.根据权利要求1所述的重组蓝藻，其特征在于：所述方法包括灭活所述蓝藻中的至少一个聚-β羟基丁酸酯合成相关基因的步骤。

3.根据权利要求2所述的重组蓝藻，其特征在于：所述灭活的方法为用至少一个的所述丁醇合成相关基因替换至少一个的所述聚-β羟基丁酸酯合成相关基因。

4.根据权利要求3所述的重组蓝藻，其特征在于：所述聚-β羟基丁酸酯合成相关基因为聚-β羟基丁酸酯合成酶的编码基因；所述灭活的方法为用所述乙醇脱氢酶的编码基因替换所述聚-β羟基丁酸酯合成酶的编码基因。

5.根据权利要求4所述的重组蓝藻，其特征在于：所述灭活的方法是通过同源重组实现的。

6.根据权利要求1-5中任一所述的重组蓝藻，其特征在于：

所述烯酰水合酶的编码基因为：其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1-786位核苷酸的DNA分子；

所述丁酰辅酶A脱氢酶的编码基因为：其核苷酸序列为序列表中序列1自5’ 末端第800-1939位核苷酸的DNA分子；

所述电子转移黄素蛋白B亚基的编码基因为：其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1958-2737位核苷酸的DNA分子；

所述电子转移黄素蛋白A亚基的编码基因为：其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第2756-3766位核苷酸的DNA分子；

所述3-羟丁酰辅酶A脱氢酶的编码基因为：核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第3871-4719位核苷酸的DNA分子；

所述乙醇脱氢酶的编码基因为：其核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第610-3186位核苷酸的DNA分子。

7.根据权利要求6所述的重组蓝藻，其特征在于：所述重组蓝藻为蓝藻集胞藻SMB-100 CGMCC No.2795.和聚球藻SMB-101 CGMCC No.2794。