CN103703122A - 导入了二氧化碳的固定途径的微生物 - Google Patents

导入了二氧化碳的固定途径的微生物 Download PDF

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Abstract

本发明要解决的问题在于提供利用二氧化碳高效地生成乙酰CoA的乙酰CoA生产微生物及使用其的物质生产方法。本发明的乙酰CoA生产微生物具有乙酰CoA生产循环，所述乙酰CoA生产微生物是通过赋予选自苹果酸硫激酶、苹果酰CoA裂解酶、乙醛酸醛连接酶、2－羟基－3－氧代丙酸还原酶、及羟基丙酮酸还原酶中的至少一种酶活性而得到的。

Description

导入了二氧化碳的固定途径的微生物
技术领域
本发明涉及乙酰CoA生产微生物及使用其的物质生产方法。
背景技术
乙酰CoA是微生物的代谢途径中的极其重要的中间体之一。各种代谢产物经由乙酰CoA被生产。作为这样的经由乙酰CoA被生成的物质的例子，例如已知L－谷氨酸、L－谷氨酰胺、L－脯氨酸、L－精氨酸、L－亮氨酸、L－异亮氨酸等氨基酸类；乙酸、丙酸、丁酸、己酸、柠檬酸、3－羟基丁酸、3－羟基异丁酸、3－氨基异丁酸、2－羟基异丁酸、甲基丙烯酸及聚－3－羟基丁酸等有机酸类；异丙醇、乙醇、丁醇等醇类；其他如丙酮、聚谷氨酸等。
在多数微生物的情况下，乙酰CoA以葡萄糖等糖为碳源进行生产。糖首先经过埃姆登·迈耶霍夫途径（Embden－Meyerhof pathway）、恩特纳·杜多罗夫途径（Entner－Doudoroff pathway）、戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathway）等被称为糖酵解系统的代谢途径而被转化为丙酮酸。然后，在丙酮酸脱羧酶、丙酮酸－甲酸裂解酶等的作用下，被转化为乙酰CoA。此时，二氧化碳、甲酸作为副产物而被生产，损失一部分来自糖的碳。因此，为了将二氧化碳再固定来增加乙酰CoA的产量，进行了一些研究。
已知一些在微生物的体内固定二氧化碳而作为碳源的途径（Appl.Environ.Microbiol.77（6），1925－1936（2011））。具体而言，可举出卡尔文·本森循环（Calvin－Benson cycle）、还原性TCA循环（reductive TCA cycle）、Wood－Ljungdahl途径（Wood－Ljungdahl pathway）、3－羟基丙酸循环（3－hydroxypropionate cycle）、4－羟基丁酸循环（4－hydroxybutyrate cycle）等。卡尔文·本森循环是存在于植物、光养细菌的包括约12种酶的CO2固定途径，通过核酮糖－1，5－双磷酸羧化酶（RubisCO）固定CO2，最终生产甘油醛3－磷酸。还原性TCA循环是在以绿硫细菌（green sulfur bacteria）为代表的厌氧菌、微需氧菌中可见的循环，包括11种酶，特征在于以铁氧还原蛋白（ferredoxin）为辅酶的CO2固定酶（乙酰CoA羧化酶、2－酮戊二酸合酶（2－oxoglutarate synthase）），通过与通常的TCA循环方向相反的反应，由CO2生产丙酮酸。Wood－Ljungdahl途径是在乙酸产生菌等厌氧性微生物中可见的途径，包括9种酶，通过甲酸脱氢酶、CO脱氢酶等将CO2、辅酶上的甲酸还原，最终转化为乙酰CoA。3－羟基丙酸循环是在绿屈挠菌属（Chloroflexus）菌等中可见的循环，包括13种酶，通过乙酰CoA（丙酰CoA）羧化酶的作用将CO2固定，经由丙二酸单酰CoA等，生产乙酰CoA。4－羟基丁酸循环是存在于古细菌等中的途径，通过丙酮酸合酶、乙酰CoA（丙酰CoA）羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的反应而将CO2固定，经由4－羟基丁酰CoA等，生产乙酰CoA。
另一方面，作为构想，也报道了一些将固定二氧化碳的途径导入到生产有用化合物的微生物中来生产有用物质的尝试。例如国际公开第2009/094485号小册子、国际公开第2010/071697号小册子中，公开了使用导入了与乙酸菌的Wood－Ljungdahl途径类似的途径的微生物由二氧化碳生产乙酰CoA的提案。另外，作为固定CO2而生产有用化合物的例子，国际公开第2009/046929号小册子中，公开了使用导入了氢化酶和四氢叶酸裂解酶（tetrahydrofolate lyase）的微生物由二氧化碳生产乳酸的尝试。另外，国际公开第2011/099006号小册子中，提出了经由向乙酰CoA上的二氧化碳固定反应、丙二酸单酰CoA的还原反应而固定CO2的循环。德国专利申请公开第102007059248号说明书中，提出了利用与4－羟基丁酸循环类似的途径进行的乙酰CoA的生产。
发明内容
然而，从固定CO2而生产来自乙酰CoA的有用化学品这样的观点考虑，公知的二氧化碳固定循环不能说效率一定高。例如，卡尔文·本森循环作为自然界的二氧化碳固定循环最为有名，但担负二氧化碳固定的RubisCO的反应速度慢，而且还可见氧化分解这样的副反应，不能说是效率高的酶（Journal of Bioscience and Bioengineering94（6）497－505，2002）。另外，Wood－Ljungdahl途径、国际公开第2009/094485号小册子、国际公开第2010/071697号小册子、国际公开第2009/046929号小册子等中记载的途径中，包括将CO2还原为CO、甲酸的途径，但这样的还原反应在通常的条件下是困难的，而且，催化这样强还原反应的酶只在还原性的环境下起作用的情况很多，不容易导入到绝对厌氧性的微生物以外的微生物中。在还原性TCA循环中，在中途的由丙酮酸合酶、2－酮戊二酸合酶进行的还原反应中，需要以铁氧还原蛋白作为电子受体的强还原力，不易进行反应。另外，4－羟基丁酸循环、3－羟基丙酸循环、国际公开第2011/099006号小册子、国际公开第2009/046929号小册子等中记载的途径等中，利用琥珀酰CoA的还原、丙二酸单酰CoA的还原这样的羧酸或其（硫代）酯的还原反应，但这样的反应作为酶反应通常是困难的，认为作为发酵途径期望尽可能地避免（Atsumi等.，Nature，451，（3），86－89，2008；Yim等.，Nat.Chem.Biol.，7，445－452，2011）。4－羟基丁酸循环经由4－羟基丁酰CoA的脱水、3－羟基丙酸的脱水这样的脱水反应，但存在这样的反应在水中经常与逆反应（水和）进行竞争这样的问题。另外，在4－羟基丁酸循环、3－羟基丙酸循环、还原性TCA循环中，在丙二酸单酰CoA合成酶、丙酮酸合酶的作用下，生产出的乙酰CoA在循环内被转化为其他物质，因而从乙酰CoA的生产的观点考虑，不能说一定是有效率的。
进而，当将这样的循环导入到微生物中而尝试进行某些物质生产时，需要考虑构成循环的酶的数目、应重新赋予的酶活性的数目。即，构筑循环的酶、赋予的酶的数目越多，除了控制越发变难以外，对微生物的负担也越发增加。例如，如果要将Wood－Ljungdahl途径导入至大肠杆菌，则至少需要导入9种基因，除了构筑物质生产的途径之外，进一步进行这样程度的导入基因并控制，可以说在现实中是极其困难的操作。通过赋予数目少的酶来构筑由数目少的酶构成的循环不仅在构筑循环方面有利，而且在组合物质生产途径方面也是有利的，这是显然的。
因此，对于固定CO2并转化为乙酰CoA，如下方面可以说是理想的：A.构成途径的各酶的活性足够高，B.循环中不含消耗乙酰CoA的酶，C.新赋予的酶的数目少，循环简单。然而，在迄今为止报道的由CO2生产乙酰CoA的循环中，还不存在满足全部的A～C的条件的循环，均缺乏可操作性。其证据是，在现存的二氧化碳固定循环的提案中，迄今完全没有实际将酶活性赋予工业上利用的微生物从而将CO2转化为乙酰CoA及来自乙酰CoA的物质而用于发酵的例子。
本发明提供为了利用二氧化碳高效地生成乙酰CoA有用的微生物、及使用该微生物制造乙酰CoA及来自乙酰CoA的有用的代谢产物的方法。
本发明如下所述。
[1]乙酰CoA生产微生物，具有乙酰CoA生产循环，所述乙酰CoA生产微生物是通过如下方式得到的：向不具有下述（a）、（b）、（c）、（d）及（e）中任一种的微生物中，不赋予（a）、（b）、（c）及（d）中任一种，或即使赋予也不发挥其功能，赋予选自苹果酸硫激酶（malate thiokinase）、苹果酰CoA裂解酶（malyl－CoA lyase）、乙醛酸醛连接酶（glyoxylate carboligase）、2－羟基－3－氧代丙酸还原酶（2－hydroxy－3－oxopropionate reductase）及羟基丙酮酸还原酶（hydroxypyruvate reductase）中的至少一种酶活性；
（a）具有由丙二酸单酰CoA（malonyl－CoA）向丙二酸半醛（malonate semialdehyde）或3－羟基丙酸（3－hydroxypropionate）的酶反应的二氧化碳固定循环，
（b）具有由乙酰CoA和CO2向丙酮酸的酶反应的二氧化碳固定循环，
（c）具有由巴豆酰CoA（crotonyl CoA）和CO2向乙基丙二酸单酰CoA（ethylmalonyl－CoA）或戊烯二酸单酰CoA（glutaconylCoA）的酶反应的二氧化碳固定循环，
（d）具有由CO2向甲酸的酶反应的二氧化碳固定循环，
（e）选自苹果酸硫激酶和苹果酰CoA裂解酶中的至少一种。
[2][1]所述的乙酰CoA生产微生物，具有如下的乙酰CoA生产循环：磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸经由草酰乙酸、进而通过苹果酸硫激酶、苹果酰CoA裂解酶、乙醛酸醛连接酶而得到的2－羟基－3－氧代丙酸进一步经由2－磷酸甘油酸再次转化为磷酸烯醇式丙酮酸。
[3][1]或[2]所述的乙酰CoA生产微生物，具有乙酰CoA生产循环，所述乙酰CoA生产循环包括如下酶：
（f）选自丙酮酸激酶及丙酮酸羧化酶、或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、或磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶中的至少一种，
（g）苹果酸脱氢酶，
（h）苹果酸硫激酶，
（i）苹果酰CoA裂解酶，
（j）乙醛酸醛连接酶，
（k）选自2－羟基－3－氧代丙酸还原酶、或羟基丙酮酸异构酶及羟基丙酮酸还原酶中的至少一种，
（l）选自甘油酸2－激酶、或磷酸甘油酸变位酶及甘油酸3－激酶中的至少一种，
（m）烯醇化酶。
[4][1]～[3]中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的微生物或属于棒状细菌（coryneform bacteria）的微生物。
[5][1]～[4]中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为属于肠杆菌科的微生物，为埃希氏菌属（Escherichia）细菌或泛菌属（Pantoea）细菌；或属于棒状细菌的微生物，为棒状杆菌属（Corynebacterium）细菌。
[6][1]～[5]中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为埃希氏菌属细菌，埃希氏菌属细菌具有的乳酸脱氢酶的活性被失活或降低。
[7][1]～[6]中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为埃希氏菌属细菌，埃希氏菌属细菌具有的选自异柠檬酸裂解酶（isocitrate lyase）及苹果酸合酶（malate synthase）中的至少一种酶的活性被失活或降低。
[8][1]～[7]中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为埃希氏菌属细菌，埃希氏菌属细菌中硫解酶（thiolase）活性、CoA转移酶（CoA transferase）活性及乙酰乙酸脱羧酶（acetoacetatedecarboxylase）活性被赋予或强化。
[9][1]～[8]中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为埃希氏菌属细菌，埃希氏菌属细菌中硫解酶活性、CoA转移酶活性、乙酰乙酸脱羧酶活性及异丙醇脱氢酶活性被赋予或强化。
[10][1]～[5]中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为泛菌属细菌，泛菌属细菌具有的富马酸水合酶（fumarate hydratase）A及富马酸水合酶C的活性被失活或降低。
[11][1]～[5]及[10]中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为泛菌属细菌，泛菌属细菌具有的苹果酸合酶的活性被失活或降低。
[12][1]～[11]中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其特征在于，使用如下的苹果酸硫激酶，所述苹果酸硫激酶中，对应于来自扭脱甲基杆菌（Methylobacterium extorquens）的mtkB的第144位的氨基酸的氨基酸为异亮氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酰胺或脯氨酸，及/或，第244位的氨基酸为谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、赖氨酸或精氨酸。
[13]乙酰CoA生产方法，包括如下步骤：使用[1]～[12]中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，由碳源材料生产乙酰CoA。
[14]丙酮生产方法，包括如下步骤：使用[9]或[12]所述的乙酰CoA生产微生物，由碳源材料生产丙酮。
[15]异丙醇生产方法，包括如下步骤：使用[9]或[12]所述的乙酰CoA生产微生物，由碳源材料生产异丙醇。
[16]谷氨酸生产方法，包括如下步骤：使用[5]、[10]、[11]或[12]所述的乙酰CoA生产微生物，由碳源材料生产谷氨酸。
通过本发明，可提供为了高效地将二氧化碳转化为乙酰CoA而有用的微生物及使用该微生物制造乙酰CoA及有用的代谢产物的方法。
附图说明
[图1]为说明本发明涉及的二氧化碳的固定途径的概要的途径图。
[图2A]为表示各种mtkB的序列同源性的图。
[图2B]为表示各种mtkB的序列同源性的图。
[图3A]为表示各种mtkA的序列同源性的图。
[图3B]为表示各种mtkA的序列同源性的图。
[图4]为表示实施例41涉及的向用各种泛菌属细菌生产出的谷氨酸的13C导入图的图。
[图5]为表示实施例50涉及的向用各种棒状杆菌属细菌生产出的谷氨酸的13C导入图的图。
具体实施方式
本发明涉及的乙酰CoA生产微生物具有乙酰CoA生产循环，所述乙酰CoA生产微生物是通过如下方式得到的：向不具有下述（a）、（b）、（c）、（d）及（e）中任一种的微生物中，不赋予（a）、（b）、（c）及（d）中任一种，或即使赋予也不发挥其功能，赋予选自苹果酸硫激酶、苹果酰CoA裂解酶、乙醛酸醛连接酶、2－羟基－3－氧代丙酸还原酶及羟基丙酮酸还原酶中的至少一种酶活性。
（a）具有由丙二酸单酰CoA向丙二酸半醛或3－羟基丙酸的酶反应的二氧化碳固定循环。
（b）具有由乙酰CoA和CO2向丙酮酸的酶反应的二氧化碳固定循环。
（c）具有由巴豆酰CoA和CO2向乙基丙二酸单酰CoA或戊烯二酸单酰CoA的酶反应的二氧化碳固定循环。
（d）具有由CO2向甲酸的酶反应的二氧化碳固定循环。
（e）选自苹果酸硫激酶和苹果酰CoA裂解酶中的至少一种。
通过本发明，可提供具有乙酰CoA生产循环的乙酰CoA生产微生物，对于所述乙酰CoA生产微生物，通过赋予规定的酶活性，而将在糖代谢中产生的CO2、从外部供给的CO2固定化，构筑二氧化碳的固定循环，且能够高效地将CO2转化为乙酰CoA。
即，本发明是这样完成的：为了将CO2转化为乙酰CoA而进行了各种研究，结果发现：如上所述，向不具有下述（a）、（b）、（c）、（d）及（e）中任一种的微生物中，不赋予（a）、（b）、（c）及（d）中任一种，或即使赋予也不发挥其功能，赋予选自苹果酸硫激酶、苹果酰CoA裂解酶、乙醛酸醛连接酶、2－羟基－3－氧代丙酸还原酶及羟基丙酮酸还原酶中的至少一种酶活性，由此，可将CO2转化为乙酰CoA。
（a）具有由丙二酸单酰CoA向丙二酸半醛或3－羟基丙酸的酶反应的二氧化碳固定循环，
（b）具有由乙酰CoA和CO2向丙酮酸的酶反应的二氧化碳固定循环，
（c）具有由巴豆酰CoA和CO2向乙基丙二酸单酰CoA或戊烯二酸单酰CoA的酶反应的二氧化碳固定循环，
（d）具有由CO2向甲酸的酶反应的二氧化碳固定循环，
（e）选自苹果酸硫激酶和苹果酰CoA裂解酶中的至少一种。
另外，通过利用该将CO2转化为乙酰CoA的乙酰CoA生产微生物，而且对该微生物进一步赋予规定的酶活性，由此可高效地进行如下物质的生产：乙酰CoA和来自乙酰CoA的有用的代谢产物，例如，异丙醇、乙醇、丙酮、柠檬酸、衣康酸、乙酸、丁酸、（聚－）3－羟基丁酸、3－羟基异丁酸、3－氨基异丁酸、2－羟基异丁酸、甲基丙烯酸、（聚）谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸等。
本发明提出了将CO2固定并转化为乙酰CoA的最简单且实用的乙酰CoA生产循环（图1）。
图1所记载的乙酰CoA生产循环表示本发明中的乙酰CoA生产循环的优选方案之一（以下，有时称为“图1的循环”。）。
包括选自磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、和丙酮酸羧化酶及丙酮酸激酶中的至少一种；苹果酸脱氢酶；苹果酸硫激酶；苹果酰CoA裂解酶；乙醛酸醛连接酶；选自羟基丙酮酸异构酶、羟基丙酮酸还原酶及2－羟基－3－氧代丙酸还原酶中的至少一种；选自甘油酸2－激酶、磷酸甘油酸变位酶及甘油酸3－激酶中的至少一种；和烯醇化酶这样的8～10种酶，（磷酸烯醇式）丙酮酸羧化酶负责二氧化碳固定。该（磷酸烯醇式）丙酮酸羧化酶属于二氧化碳固定酶中活性高的种类。例如，植物等的光合作用中利用的RubisCO的比活性已知为3U～20U/mg左右的活性（J.Biol.Chem.274（8）5078－82（1999），Anal.Biochem.153（1）97－101（1986）），与此相对，（磷酸烯醇式）丙酮酸羧化酶中，报道了在大肠杆菌中为30U/mg、甚至高达100～150U/mg（J.Biol.Chem.247，5785－5792（1972）；Biosci.Biotechnol.Biochem.59，140－142（1995）；Biochim Biophys Acta.1475（3）：191－206（2000））。另外，对于合成苹果酰CoA的苹果酸硫激酶（mtk），在此次的研究中，发现了与目前为止已知的酶（J.Biol.Chem.248（21）7295－303（1973））相比，活性更高的苹果酸硫激酶。进而，构成图1的循环的酶数为8～10种，与公知的乙酰CoA生产循环相比最简单，并且应赋予微生物的酶数为少量即可。而且，在图1的循环中，不含消耗乙酰CoA的酶。因此，图1的循环可以说是用于将CO2固定并转化为乙酰CoA的理想的循环。
进而，作为图1的循环的优点，也可举出如下优点：由于循环与糖酵解系统独立，因此可以与各种途径的糖酵解系统自由地组合。例如，戊糖磷酸途径的NADPH的生产量高，所以常用于物质生产（日本特表2007－510411号公报），但与本循环独立，可以容易地组合。
图1的循环的苹果酸脱氢酶（mdh）、2－羟基－3－氧代丙酸还原酶（glxR）或羟基丙酮酸还原酶（ycdW）分别消耗NADH（或NADPH）作为还原力。另外，苹果酸硫激酶（mtk）、甘油酸3－激酶（glxK）、甘油酸2－激酶（garK）、丙酮酸羧化酶（pyc）消耗ATP。丙酮酸激酶（pyk）生产丙酮酸。
作为图1的循环的收支，当以磷酸烯醇式丙酮酸为起始物质时，为“磷酸烯醇式丙酮酸＋2CoA＋CO2＋3NAD（P）H＋3ATP→2乙酰CoA＋3NAD（P）＋＋3ADP”。
另外，当以丙酮酸为起始物质时，变为“丙酮酸＋2CoA＋CO2＋3NAD（P）H＋4ATP→2乙酰CoA＋3NAD（P）＋＋4ADP”。
即，图1的循环中，固定CO2并转化为乙酰CoA时，需要供给磷酸烯醇式丙酮酸（或丙酮酸）、NAD（P）H、ATP。
在以乙酰CoA为中间体的发酵途径中，发酵中消耗氧的途径的收支式记载于表1。假定在这些发酵中产生如下那样的现象：在发酵途径上生成NADH等还原型辅酶，其在氧的作用下恢复为氧化型。因此，如果能利用图1的循环代替氧而消耗生成的还原型辅酶，则可期待能将发酵中生成的还原力在乙酰CoA生产循环中有效利用，能固定CO2而转化为产物。
需要说明的是，此处的还原型辅酶是NADH、NADPH、FADH2、FMNH2、还原型醌辅酶这样的参与氧化还原的辅酶，而且其是指为还原状态的辅酶，优选是指NADH或NADPH，更优选是指NADH。另一方面，氧化型辅酶是还原型辅酶的氧化型，例如是指NAD＋、NADP＋、FAD、FMN、氧化型醌辅酶，优选是指NAD＋或NADP＋，更优选是指NAD＋。
[表1]
另外，如表1所示，在氧存在于发酵式的左边的发酵中，常常需要大量的氧，因此，有时要求大量的通气、强烈的搅拌，导致设备费、电费的增加。因此，如果导入图1的循环，则通过消耗剩余的还原力，而可缓和过量的通气搅拌，可期待能降低发酵生产的费用。
为了补充本发明的循环的还原力，也可通过加入可生产还原力的物质，或从外部赋予能量，从而赋予还原力。例如，也可考虑将还原度高的物质（例如，氢、亚硫酸盐、醇类、石蜡等）作为底物利用、通过电气培养直接供给还原能、通过生物的光化学反应供给还原力等这样的手段。需要说明的是，如果能从外部补给还原力，则即使不是如表1所示产生还原型辅酶的发酵的情况，也可驱动提出的二氧化碳固定途径。
以下，对本发明进行说明。
本发明中的“二氧化碳（CO2）的固定”是指，将在糖代谢中产生的CO2、从外部供给的CO2转化为有机化合物。CO2也可以是HCO3 －。另外，本说明书中，有时将“二氧化碳（CO2）的固定”称为“二氧化碳固定”。
本说明书中，词语“工序”不仅是指独立的工序，即使是在不能明确地与其他工序区别的情况下，只要能实现该工序所期待的目的，则也包含在本术语中。另外，本说明书中，使用“～”表示的数值范围表示包含“～”前后所记载的数值分别作为最小值及最大值的范围。
在本发明中，当言及组合物中的各成分的量时，当组合物中存在多种属于各成分的物质时，只要没有特别说明，是指组合物中存在的该多种物质的总量。
本发明中的“失活”是指，通过现有的所有测定系统测定出的酶（只要没有特别说明，本说明书中“酶”也包括单独不表现酶活性的“因子”）的活性为如下状态：将失活前的在微生物中的活性作为100时，其为1/10以下。
本发明中的酶活性的“降低”是指如下状态：通过编码该酶的基因的基因重组技术，与进行这些处理之前的状态相比，该酶的活性显著降低。
本发明中的“活性”的“强化”广泛是指，强化前的在微生物中的各种酶活性在强化后提高。
作为强化的方法，只要微生物具有的各种酶的活性提高即可，没有特别限制，可举出利用由细胞外导入的酶基因的强化、利用细胞内的酶基因的表达增强的强化以及它们的组合。
作为利用由细胞外导入的酶基因的强化，具体而言，可举出：利用基因重组技术将编码活性高于来自宿主的酶的酶的基因从宿主微生物的细胞外导入至细胞内，从而追加导入的酶基因带来的酶活性、或将该酶活性与宿主本来具有的酶活性置换；进而使来自宿主的酶基因或来自细胞外的酶基因的数目增加至2以上；以及它们的组合。
作为利用微生物内的酶基因的表达增强的强化，具体而言，可举出：将增强酶基因的表达的碱基序列从宿主微生物的微生物外导入至微生物内；将宿主微生物在基因组上具有的酶基因的启动子取代为其他的启动子从而强化酶基因的表达；以及它们的组合。
本发明中的“活性”的“赋予”广泛是指，对于未发现对象酶基因的微生物，从外部导入酶基因，从而赋予作为对象的酶的活性。作为赋予的方法，只要能向微生物赋予作为对象的酶的活性即可，没有特别限制，可举出：利用具有酶基因的质粒的转化，酶基因向基因组的导入，以及它们的组合。
作为“活性”的“强化”或“赋予”中使用的启动子，只要是能表达基因的启动子即可，没有特别限制，可使用组成型启动子或诱导型启动子。
当判断该微生物是否具有作为对象的酶基因时，例如可举出参照登陆于KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes；http：//www.genome.jp/kegg/）、NCBI（National Center for Biotechnology Information；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）的各菌株的基因信息。需要说明的是，本发明中，仅使用登陆于KEGG或NCBI的各菌株的基因信息。
本发明中的酶活性的赋予例如可通过将编码酶的基因利用基因重组技术从宿主细菌的细胞外导入至细胞内来进行。此时，导入的酶基因相对于宿主细胞为同种或不同种均可。
从细胞外向细胞内导入基因时必要的基因组DNA的制备、DNA的切断及连接、转化、PCR（Polymerase Chain Reaction）、用作引物的寡核苷酸的设计、合成等的方法可利用本领域技术人员熟知的通常的方法来进行。这些方法记载于Sambrook，J.，等.，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition”，Cold Spring Harbor Laboratory出版，（1989）等。
本发明中的“利用基因重组技术”等词语，只要是通过其他的DNA向原本的基因的碱基序列的插入、或基因某部分的取代、缺失或它们的组合而发生碱基序列上的改变，就全部包含在内，例如可以是发生突变结果得到的改变。
本发明中因子或酶的活性被失活的微生物是指，利用从细胞外至细胞内的某种方法、而使原本的活性受到破坏的微生物。这些微生物例如可通过将编码该蛋白质或酶的基因破坏（基因破坏）来制成。
作为本发明中的基因破坏，可举出：为了使得不发挥某基因的功能，而向该基因的碱基序列中引入变异，插入其他DNA，及使基因的某部分缺失。基因破坏的结果，例如该基因变得不能转录为mRNA，结构基因变得不能被翻译。或者，由于被转录出的mRNA不完全，因而被翻译出的结构蛋白质的氨基酸序列中发生变异或缺失，变得不能发挥本来的功能。
对于基因破坏株的制作，只要能得到该酶或蛋白质不表达的破坏株，任何方法均可使用。关于基因破坏的方法，报道了多种方法（自然育种、诱变剂添加、紫外线照射、放射线照射、随机突变、转座子、位点特异性的破坏），但从仅能破坏某特定基因这样的方面考虑，优选利用同源重组进行的基因破坏。利用同源重组进行的方法记载于J.Bacteriol.，161，1219－1221（1985）、J.Bacteriol.，177，1511－1519（1995）、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，97，6640－6645（2000），本领域技术人员能够通过这些方法及其应用容易地实施。
本发明中“宿主”是指，被从微生物外导入一种以上的基因、结果成为能发挥本发明的效果的状态的该微生物。
需要说明的是，本发明中的“宿主”是指，无论本来是否具有从碳源材料生产乙酰CoA的能力、可通过使用某种手段从而具有从碳源材料生产乙酰CoA的能力的微生物。
本发明中的“宿主”可以具有有用的代谢产物的生产途径。本发明中的“有用的代谢产物”是指，以醇、氨基酸、有机酸、萜烯类为代表的在微生物的代谢途径中的主要的代谢产物的总称。无论本来是否具有生产有用的代谢产物的能力，只要是可通过使用某种手段从而具有生产有用的代谢产物的能力的微生物即可。
本发明中的“来自乙酰CoA的有用的代谢产物”是指，在代谢途径上经由乙酰CoA而生产的有用的代谢产物的总称。醇中例如可举出异丙醇、乙醇、丁醇等。氨基酸中例如表示L－谷氨酸、L－谷氨酸、L－精氨酸、L－鸟氨酸、L－瓜氨酸、L－亮氨酸、L－脯氨酸等。有机酸中例如可举出3－羟基丁酸、聚－3－羟基丁酸、聚谷氨酸、3－羟基异丁酸、3－氨基异丁酸、2－羟基异丁酸、甲基丙烯酸、柠檬酸、乙酸、丙酸、丁酸、己酸、甲羟戊酸等。萜烯类中可举出异戊二烯、角鲨烯、甾族化合物、类胡萝卜素等。在这些之外，例如可举出丙酮等。无论本来是否具有生产来自乙酰CoA的有用的代谢产物的能力，只要是可通过使用某种手段从而具有生产来自乙酰CoA的有用的代谢产物的能力的微生物即可。
本发明涉及的“乙酰CoA的生产”是指，在代谢途径上将某种物质转化为乙酰CoA。乙酰CoA是代谢中间体，在代谢途径上被迅速地转化为各种物质，因此，表观的乙酰CoA量不一定增加，但可通过在来自乙酰CoA的物质中检测来自CO2的标签、或来自乙酰CoA的物质的相对于糖的收率等上升等来间接地把握效果。参与转化的要素为多种（辅酶量、底物量、由反馈抑制等导致的代谢变化等），因此，乙酰CoA的生产量不一定与所有的来自乙酰CoA物质的量成比例，但如果在强化从乙酰CoA向特定物质的生产途径、或其原本就强的情况（例如，下述异丙醇生产微生物、谷氨酸生产微生物的情况）下，乙酰CoA以后的转化效率不易受到外在要素的影响，因此，将该物质的生产效率视为乙酰CoA生产效率的指标。
本发明涉及的乙酰CoA生产微生物具有乙酰CoA生产循环，所述乙酰CoA生产微生物是通过如下方式得到的：向不具有下述（a）、（b）、（c）、（d）及（e）中任一种的微生物中，不赋予（a）、（b）、（c）及（d）中任一种，或即使赋予也不发挥其功能，赋予选自苹果酸硫激酶、苹果酰CoA裂解酶、乙醛酸醛连接酶、2－羟基－3－氧代丙酸还原酶及羟基丙酮酸还原酶中的至少一种酶活性。
（a）具有由丙二酸单酰CoA向丙二酸半醛或3－羟基丙酸的酶反应的二氧化碳固定循环，
（b）具有由乙酰CoA和CO2向丙酮酸的酶反应的二氧化碳固定循环，
（c）具有由巴豆酰CoA和CO2向乙基丙二酸单酰CoA或戊烯二酸单酰CoA的酶反应的二氧化碳固定循环，
（d）具有由CO2向甲酸的酶反应的二氧化碳固定循环，
（e）选自苹果酸硫激酶和苹果酰CoA裂解酶中的至少一种。
从乙酰CoA生产效率的观点考虑，就乙酰CoA生产微生物而言，优选被赋予苹果酸硫激酶及苹果酰CoA裂解酶的酶活性，更优选被赋予苹果酸硫激酶、苹果酰CoA裂解酶及乙醛酸醛连接酶的酶活性，进一步优选被赋予苹果酸硫激酶、苹果酰CoA裂解酶、乙醛酸醛连接酶、2－羟基－3－氧代丙酸还原酶及/或羟基丙酮酸还原酶的酶活性。
此处，本发明中的“（原本）不具有”是指宿主微生物在自然界中本来不具有。
本说明书中的“具有从丙二酸单酰CoA向丙二酸半醛或3－羟基丙酸的酶反应的二氧化碳固定循环”是指，下述（1）～（7）的循环。
（1）国际公开第2011/099006号小册子的图1所示的乙酰CoA经由丙二酸单酰CoA、3－羟基丙酸、丙酰CoA、苹果酸、苹果酰CoA而再次转化为乙酰CoA的循环
（2）国际公开第2011/099006号小册子的图4A所示的乙酰CoA经由丙二酸单酰CoA、丙二酸半醛、β－丙氨酸、苹果酸、苹果酰CoA而再次转化为乙酰CoA的循环
（3）国际公开第2011/099006号小册子的图4B、16或18所示的乙酰CoA经由丙二酸单酰CoA、羟基丙酸、（R）－乳酸或（S）－乳酸、苹果酸、苹果酰CoA而再次转化为乙酰CoA的循环
（4）国际公开第2011/099006号小册子的图8所示的乙酰CoA经由丙二酸单酰CoA、丙二酸半醛或羟基丙酸、丙酮酸、苹果酸、苹果酰CoA而再次转化为乙酰CoA的循环
（5）国际公开第2011/099006号小册子的图9A、9B或9C所示的乙酰CoA经由丙二酸单酰CoA、羟基丙酸、2－酮戊二酸、苹果酸、苹果酰CoA而再次转化为乙酰CoA的循环
（6）国际公开第2011/099006号小册子的图9D或9F所示的乙酰CoA经由丙二酸单酰CoA、羟基丙酸、甲基丙二酸单酰CoA、苹果酸、苹果酰CoA而再次转化为乙酰CoA的循环
（7）国际公开第2011/099006号小册子的图17所示的乙酰CoA经由丙二酸单酰CoA、丙二酸半醛或羟基丙酸、甲基丙二酸单酰CoA、丙酮酸、草酰乙酸、苹果酸、苹果酰CoA而再次转化为乙酰CoA的循环
上述（1）～（7）的二氧化碳固定循环共同具有从丙二酸单酰CoA向丙二酸半醛或3－羟基丙酸的酶反应。丙二酸半醛脱氢酶或丙二酸单酰CoA还原酶催化这些反应（国际公开第2011/099006号小册子）。这样的琥珀酰CoA的还原、丙二酸单酰CoA的还原这样的羧酸或其（硫代）酯的还原反应作为酶反应通常是困难的，认为作为发酵途径优选尽可能避免（Atsumi等.，Nature，451，（3），86－89，2008；Yim等.，Nat.Chem.Biol.，7，445－452，2011）。
本说明书中的“具有从乙酰CoA和CO2向丙酮酸的酶反应的二氧化碳固定循环”是指下述（8）～（10）的循环。
（8）国际公开第2011/099006号小册子的图1所示的乙酰CoA经由丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸、草酰乙酸、苹果酸、苹果酰CoA而再次转化为乙酰CoA的循环
（9）国际公开第2011/099006号小册子的图7C、7D或7E所示的乙酰CoA经由丙酮酸、苹果酸、苹果酰CoA而再次转化为乙酰CoA的循环
（10）国际公开第2011/099006号小册子的图9M所示的乙酰CoA经由丙酮酸、2－酮戊二酸、苹果酸、苹果酰CoA而再次转化为乙酰CoA的循环
上述（8）～（10）的二氧化碳固定循环共同具有从乙酰CoA和CO2至丙酮酸的酶反应。催化该反应的是丙酮酸合酶（国际公开第2011/099006号小册子）。利用丙酮酸合酶的丙酮酸的合成反应需要介由铁氧还原蛋白的强还原力，不仅反应慢，而且对氧弱，因此如果不是在极端厌氧条件下，则反应不进行。
本说明书中的“具有从巴豆酰CoA和CO2向乙基丙二酸单酰CoA或戊烯二酸单酰CoA的酶反应的二氧化碳固定循环”是指，国际公开第2011/099006号小册子的图9H或9J所示的乙酰CoA经由巴豆酰CoA、乙基丙二酸单酰CoA或戊烯二酸单酰CoA、草酰乙酸、苹果酸、苹果酰CoA而再次转化为乙酰CoA的循环。
催化上述的从巴豆酰CoA和CO2向乙基丙二酸单酰CoA或戊烯二酸单酰CoA的转化的是巴豆酰CoA羧化酶－还原酶或甲基巴豆酰CoA羧化酶。巴豆酰CoA羧化酶－还原酶相对于碳酸盐的Km高（14mM；PNAS104（25）10631－10636、（2007）），不能期待在低浓度范围产生活性。另外，作为底物的巴豆酰CoA通过脱水反应从3－羟基丁酰CoA被生产出来，但这样的酶在水中环境下时，通常逆反应水合反应占优势，因此，不能期待充分的反应速度。另外，甲基巴豆酰CoA羧化酶也存在如下这样的问题：已报道的比活性也不是特别高（0.2－0.6U/mg；Arch Biochem Biophys.310（1）64－75（1994）），而且与上述相同，在作为底物的巴豆酰CoA的生产中，不能期待充分的速度。
本说明书中的“具有从CO2向甲酸的酶反应的二氧化碳固定循环”是指，国际公开第2009/046929号小册子的图5、6、13或14所示的循环，即具有从CO2经由甲酸、丝氨酸的途径，草酰乙酸经由苹果酸、苹果酰CoA、甘油酸而再次转化为草酰乙酸的循环。
上述的从CO2向甲酸的酶反应需要强还原力，不仅反应缓慢，而且对氧弱，因此如果不是在极端的厌氧条件下，则反应不进行。
本说明书中，对于二氧化碳固定循环“即使赋予也不使其发挥功能（不发挥其功能）”是指，对于未发现对象酶基因的微生物，虽然从外部导入具有活性的酶基因，赋予作为对象的酶的活性，但二氧化碳固定循环不发挥功能。“二氧化碳固定循环不发挥功能”可通过如下内容来间接地把握：利用使用了被标签过的CO2的试验，在循环中的代谢产物或来自这些代谢产物的物质中，未检测到来自CO2的标签；或未发现循环中的来自代谢产物的物质的相对于糖的收率等上升等。
上述乙酰CoA生产微生物中构筑的乙酰CoA生产循环是包括苹果酸硫激酶、苹果酰CoA裂解酶、羟基丙酮酸还原酶、乙醛酸醛连接酶或2－羟基－3－氧代丙酸还原酶的途径。将这样的乙酰CoA生产循环的一个例子示于图1。另外，上述乙酰CoA生产循环不具有消耗乙酰CoA的酶，例如乙酰CoA羧化酶、丙酮酸合酶。
图1所示的乙酰CoA生产循环中，二氧化碳首先在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ppc）、丙酮酸羧化酶（pyc）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（pck）等的作用下，与磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸结合，被转化为草酰乙酸。草酰乙酸在苹果酸脱氢酶（mdh）的作用下被转化为苹果酸。苹果酸在苹果酸硫激酶（mtk）的作用下被转化为苹果酰CoA（苹果酸CoA）。苹果酰CoA（苹果酸CoA）在苹果酰CoA裂解酶（Mcl）的作用下被转化为乙酰CoA和乙醛酸。乙醛酸在乙醛酸醛连接酶（gcl）的作用下被转化为2－羟基－3－氧代丙酸。3－羟基－2－氧代丙酸在2－羟基－3－氧代丙酸还原酶（glxR）的作用下被转化为甘油酸、或在羟基丙酮酸异构酶（hyi）的作用下被转化为羟基丙酮酸、然后在羟基丙酮酸还原酶（ycdW）的作用下被转化为甘油酸。甘油酸在甘油酸3－激酶（glxK）的作用下被转化为3－磷酸甘油酸、或在甘油酸2－激酶（garK）的作用下被转化为2－磷酸甘油酸。3－磷酸甘油酸在磷酸甘油酸变位酶（gpm）的作用下被转化为2－磷酸甘油酸。2－磷酸甘油酸在烯醇化酶（eno）的作用下被转化为磷酸烯醇式丙酮酸。循环中包含丙酮酸羧化酶时，在丙酮酸激酶（pyk）的作用下，磷酸烯醇式丙酮酸被转化为丙酮酸。
被赋予至上述乙酰CoA生产微生物的酶活性只要在赋予后功能性地构筑上述乙酰CoA生产循环即可，可根据宿主微生物，在本说明书中记载的范围内适当选择。
在由于不具有一部分图1的循环上的酶、因而在图1的任一途径上未形成封闭的循环的微生物中，需要赋予不足的酶。埃希氏菌属细菌中，例如大肠杆菌由于不具有苹果酸硫激酶及苹果酰CoA裂解酶，所以至少赋予该两种酶即可。
另外，泛菌属细菌、例如菠萝泛菌（Pantoea ananatis）由于不具有苹果酸硫激酶、及苹果酰CoA裂解酶、及乙醛酸醛连接酶，因而至少赋予苹果酸硫激酶、苹果酰CoA裂解酶、乙醛酸醛连接酶即可。
另外，棒状细菌中，例如谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）由于不具有苹果酸硫激酶、苹果酰CoA裂解酶、乙醛酸醛连接酶、2－羟基－3－氧代丙酸还原酶、及羟基丙酮酸还原酶，因而至少赋予苹果酸硫激酶、和苹果酰CoA裂解酶、和乙醛酸醛连接酶、和2－羟基－3－氧代丙酸还原酶及/或羟基丙酮酸还原酶即可。
上述消耗乙酰CoA的酶是指，本发明的循环中利用的除了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和丙酮酸羧化酶以外的、以乙酰CoA为底物转化为其他物质的酶。例如，可举出被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号6.4.1.2、将乙酰CoA转化为丙二酸单酰CoA的乙酰CoA羧化酶，被分类为酶编号1.2.7.1、将乙酰CoA转化为丙酮酸的丙酮酸合酶。
上述包含消耗乙酰CoA的酶的循环是指，利用消耗乙酰CoA的酶，乙酰CoA经由循环再次返回至乙酰CoA这样的封闭循环。需要说明的是，在利用消耗乙酰CoA的酶而转化出的物质不返回至乙酰CoA而被转化为其他产物的情况（例如，在异丙醇生产途径中，被转化为异丙醇作为最终产物的情况），不是封闭循环，所以不包括在“包含消耗乙酰CoA的酶的循环”之内。
上述封闭循环是指，从循环上的任意的物质开始，经由循环而被转化为其他物质，最终被转化为与最初相同的物质的途径。
上述苹果酸硫激酶，是被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号6.2.1.9、使苹果酸与CoA结合、转化为苹果酰CoA的酶的总称。反应时消耗1分子的ATP，生成1分子的ADP和磷酸。本酶由400个氨基酸左右的大亚基（large subunit）和300个氨基酸小亚基构成。通常以大亚基、小亚基这样的顺序存在于基因上。本专利中，为了方便，将大亚基称为mtkB，将小亚基称为mtkA。作为本酶的比活性，例如报道了精制酶中2.5U/mg这样的例子（Anal Biochem.227（2），363－367（1995））。
本酶是主要在甲烷等C1碳源的同化途径（J.Bacteriol.176（23），7398－7404（1994））、3－羟基丙酸途径（Arch.Microbiol.，151、252－256（1989））中可见的酶，可见在基因组上的附近存在苹果酰CoA裂解酶这样的特征，只要是这样的酶，即可优选使用。以精制酶评价活性的例子已知来自扭脱甲基杆菌的苹果酸硫激酶，但实际的对序列与活性的对比少，同时评价活性与序列的例子，只有唯一的来自扭脱甲基杆菌AM1株的酶（Genbank登录号AAA62654及AAA62655）（J.Bacteriol.176（23），7398－7404（1994））。该文献中，将基因克隆，将其导入至相同的扭脱甲基杆菌，评价活性。可是，即使我们实际合成该序列进行评价，但并未观察到活性。因此，对AAA62655的序列与本发明中重新取得的来自扭脱甲基杆菌的苹果酸硫激酶序列（序列号126）进行比较时，AAA62655的羧酸末端大幅（36个氨基酸）缺失，即使与其他的苹果酸硫激酶的序列（例如图3）比较，也异常短，因此认为记载了错误的非活性型的序列。
因此，实际地克隆苹果酸硫激酶，由不同种微生物使其表达，将活性与序列对应而报道的例子，本发明事实上是首次。
苹果酸硫激酶例如可举出来自扭脱甲基杆菌（Methylobacteriumextorquens）等甲基杆菌属（Methylobacterium）（序列号70及71）、来自嗜甲基生丝微菌（Hyphomicrobium methylovolum）、脱氮生丝微菌（Hyphomicrobium denitrificans）等生丝微菌属（Hyphomicrobium）、来自根瘤菌属的种（Rhizobium sp）NGR234等根瘤菌属（Rhizobium）、来自致病乙酸细菌（Granulibacter bethesdensis）等乙酸细菌属（Granulibacter）（序列号107及108）、来自欧洲亚硝化单胞菌（Nitrosomonas europaea）等亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）、来自荚膜甲基球菌（Methylococcus capsulatus）等甲基球菌属（Methylococcus）、来自γ－变形菌界（Gammaproteobacteria）的苹果酸硫激酶。
从经由乙酰CoA的有用物质的生产效率的观点考虑，尤其可优选例举来自生丝微菌属的氨基酸序列（序列号73及74、110及111）、来自根瘤菌属的氨基酸序列（序列号75及76）、来自亚硝化单胞菌属的氨基酸序列（序列号113及114）、来自甲基球菌属的氨基酸序列（序列号116、117）、及来自γ－变形菌界的氨基酸序列（例如序列号118、119）。
来自生丝微菌属的苹果酸硫激酶（序列号73、74及110及111）、来自根瘤菌属的苹果酸硫激酶（序列号75及76）及来自亚硝化单胞菌属的苹果酸硫激酶（序列号113及114）具有65%～80%的同源性。另外，来自甲基球菌属的苹果酸硫激酶（序列号116、117）与来自γ－变形菌界的苹果酸硫激酶（例如序列号118、119）具有70%～80%的同源性。
对于本发明中公开的来自生丝微菌属的苹果酸硫激酶、来自根瘤菌属的苹果酸硫激酶、来自亚硝化单胞菌属的苹果酸硫激酶、来自甲基球菌属的苹果酸硫激酶、来自γ－变形菌界的苹果酸硫激酶，在各氨基酸序列中，具有70%以上的同源性，并且具有苹果酸硫激酶活性的苹果酸硫激酶可合适地用于本发明的乙酰CoA及来自乙酰CoA的有用的产物的生产。
将实施例所示的苹果酸硫激酶的比对（alignment）结果示于图2A及图2B（MtkB：mtk的大亚基）（以下，将图2A及图2B合称为“图2”。）及图3A及图3B（MtkA：mtk的小亚基）（以下，将图3A及图3B合称为“图3”。）。如图2及图3所示可知，苹果酸硫激酶整体地保持同源性高的共有序列，以相同的氨基酸或类似的氨基酸被保存。
将来自扭脱甲基杆菌（图2及图3中标记为Me）、酶活性高的根瘤菌属的种（图2及图3中标记为Rh）、嗜甲基生丝微菌（图2及图3中标记为Hme）、脱氮生丝微菌（图2及图3中标记为Hd）、欧洲亚硝化单胞菌（图2及图3中标记为Ne）、荚膜甲基球菌（图2及图3中标记为Mc）及γ－变形菌界的苹果酸硫激酶（图2及图3中标记为gam）分类为以下所示的从第一群组至第四群组的四个群组，在图2及图3中用“.＋＃＊”四种符号表示各群组。
第一群组是对扭脱甲基杆菌、与酶活性高的根瘤菌属的种、嗜甲基生丝微菌、脱氮生丝微菌、欧洲亚硝化单胞菌、荚膜甲基球菌及γ－变形菌（Gammaproteobacteria）进行比较时，具有不同序列的部位，在图2及图3中用符号“.”表示。将序列的位置按照扭脱甲基杆菌的氨基酸的序列号记载。
MtkB（图2）中，可举出第18位的组氨酸、脯氨酸或赖氨酸、第21位的精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或丙氨酸、第26位的酪氨酸或组氨酸、第29位的谷氨酸、丙氨酸或精氨酸、第34位的精氨酸或缬氨酸、第36位的精氨酸、丝氨酸或谷氨酸、第42位的精氨酸、苏氨酸、缬氨酸或甘氨酸、第44位的缬氨酸、第66位的天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸或亮氨酸、第67位的组氨酸、赖氨酸或谷氨酸、第74位的天冬氨酸或谷氨酸、第75位的丝氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸或谷氨酸、第80位的苏氨酸、赖氨酸或组氨酸、第84位的组氨酸或脯氨酸、第89位的谷氨酰胺、丙氨酸、甘氨酸或赖氨酸、第92位的亮氨酸或缬氨酸、第100位的谷氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺、第102位的甲硫氨酸、苏氨酸、丝氨酸或缬氨酸、第103位的天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、组氨酸或丝氨酸、第104位的异亮氨酸或脯氨酸、第105位的丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸或谷氨酰胺、第112位的苯丙氨酸或亮氨酸、第121位的异亮氨酸、第122位的甲硫氨酸、缬氨酸或苏氨酸、第127位的丝氨酸或丙氨酸、第128位的丝氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸、第139位的丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸或精氨酸、第144位的异亮氨酸、第146位的精氨酸或赖氨酸、第166位的甘氨酸或丙氨酸、第170位的天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸、第171位的天冬酰胺、脯氨酸、天冬氨酸或甘氨酸、第173位的异亮氨酸或亮氨酸、第175位的甘氨酸、天冬酰胺、脯氨酸或丙氨酸、第176位的精氨酸、赖氨酸、组氨酸或谷氨酰胺、第183位的甘氨酸、丙氨酸或精氨酸、第184位的半胱氨酸或异亮氨酸、第191位的酪氨酸、亮氨酸或赖氨酸、第193位的丙氨酸、第206位的精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或丝氨酸、第207位的甘氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或脯氨酸、第208位的天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丝氨酸或赖氨酸、第231位的谷氨酸、第233位的精氨酸、第235位的赖氨酸、天冬酰胺或亮氨酸、第238位的谷氨酸或异亮氨酸、第243位的苏氨酸、异亮氨酸或缬氨酸、第244位的酪氨酸、丙氨酸或谷氨酸、第249位的甘氨酸、第256位的天冬氨酸、第258位的天冬酰胺或天冬氨酸、第278位的异亮氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸、第300位的赖氨酸或天冬酰胺、第307位的苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺、第336位的亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸或酪氨酸、第340位的甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺或精氨酸、第358位的精氨酸或亮氨酸、第375位的丙氨酸或天冬氨酸、第379位的天冬氨酸、赖氨酸、谷氨酸或丙氨酸、第385位的色氨酸、丙氨酸、精氨酸或缬氨酸。
MtkA（图3）中，可举出第16位的苯丙氨酸、第19位的赖氨酸、精氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺、第20位的异亮氨酸或组氨酸、第30位的精氨酸或天冬氨酸、第46位的谷氨酰胺、苏氨酸或丝氨酸、第47位的丙氨酸、丝氨酸、赖氨酸或精氨酸、第49位的亮氨酸或脯氨酸、第51位的甲硫氨酸、精氨酸或亮氨酸、第67位的天冬氨酸或谷氨酸、第68位的丙氨酸或缬氨酸、第71位的缬氨酸或异亮氨酸、第74位的脯氨酸、第90位的异亮氨酸、第93位的半胱氨酸、丙氨酸或异亮氨酸、第94位的缬氨酸、第119位的天冬氨酸、丙氨酸或丝氨酸、第121位的甲硫氨酸、丝氨酸或半胱氨酸、第124位的异亮氨酸、苏氨酸或亮氨酸、第137位的丙氨酸或半胱氨酸、第151位的精氨酸、缬氨酸或天冬酰胺、第155位的缬氨酸、第171位的丙氨酸、精氨酸或赖氨酸、第193位的赖氨酸、精氨酸或缬氨酸、第195位的甲硫氨酸、缬氨酸或异亮氨酸、第197位的谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或赖氨酸、第223位的丙氨酸或甘氨酸、第224位的亮氨酸或精氨酸、第226位的丙氨酸、第230位的甲硫氨酸、第259位的苯丙氨酸、丙氨酸或谷氨酸、第267位的缬氨酸或甲硫氨酸、第271位的谷氨酸或赖氨酸、第273位的丙氨酸、半胱氨酸或亮氨酸、第280位的苏氨酸或天冬酰胺、第282位的丝氨酸或丙氨酸、第294位的丙氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸或谷氨酸、第295位的甲硫氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、亮氨酸或组氨酸。
从酶活性的观点考虑，更优选具有一个以上上述氨基酸序列的苹果酸硫激酶。
第二群组为所有的根瘤菌属的种、嗜甲基生丝微菌、脱氮生丝微菌、欧洲亚硝化单胞菌、荚膜甲基球菌及γ－变形菌的特征性的共有序列，在图2及图3中用符号“＋”表示。将特征性的共有序列的位置按照嗜甲基生丝微菌的氨基酸的序列号记载。
可举出MtkB（图2）的第43位的缬氨酸、第120位的异亮氨酸、第143位的异亮氨酸、第192位的丙氨酸、第230位的谷氨酸、第232位的精氨酸、第248位的甘氨酸及第255位的天冬氨酸。
MtkA（图3）中，可举出第16位的苯丙氨酸、第74位的脯氨酸、第90位的异亮氨酸、第94位的缬氨酸、第155位的缬氨酸、第226位的丙氨酸及第230位的甲硫氨酸。
可以向这些特征性的共有序列、及保存于全体的共有序列以外的无同源性的部分，引入变异。从酶活性的观点考虑，进一步优选具有这些氨基酸序列的苹果酸硫激酶。
第三群组为根瘤菌属的种、嗜甲基生丝微菌、脱氮生丝微菌及欧洲亚硝化单胞菌中特征性的共有序列，在图2及图3中用符号“＃”表示。将特征性的共有序列的位置按照嗜甲基生丝微菌的氨基酸的序列号记载。
可举出MtkB（图2）的第29位的谷氨酸、第34位的精氨酸、第68位的异亮氨酸、第83位的组氨酸、第91位的亮氨酸、第95位的亮氨酸、第103位的异亮氨酸、第111位的苯丙氨酸、第141位的天冬氨酸、第182位的甘氨酸、第183位的半胱氨酸、第252位的缬氨酸、第299位的赖氨酸、第345位的缬氨酸、第354位的谷氨酸、第357位的精氨酸及第374位的丙氨酸。
MtkA（图3）中，可举出第20位的异亮氨酸、第68位的丙氨酸、第93位的半胱氨酸、第121位的甲硫氨酸、第123位的亮氨酸、第137位的丙氨酸、第224位的亮氨酸、第236位的丙氨酸、第237位的酪氨酸、第238位的异亮氨酸、第261位的谷氨酸、第267位的缬氨酸、第270位的亮氨酸、第271位的赖氨酸、第275位的缬氨酸、第277位的异亮氨酸、第280位的苏氨酸及第282位的丝氨酸。
可以向这些特征性的共有序列、及保存于全体的共有序列以外的无同源性的部分，引入变异。从酶活性的观点考虑，进一步优选具有这些氨基酸序列的苹果酸硫激酶。
第四群组为荚膜甲基球菌及γ－变形菌中特征性的共有序列，图2及图3中用符号“＊”表示。将特征性的共有序列的位置按照荚膜甲基球菌的氨基酸的序列号记载。
可举出MtkB（图2）的第2位的天冬酰胺、第15位的酪氨酸、第18位的脯氨酸、第26位的酪氨酸、第28位的天冬氨酸、第34位的缬氨酸、第36位的谷氨酸、第38位的异亮氨酸、第53位的甘氨酸、第60位的缬氨酸、第6364位的丙氨酸、第65位的丝氨酸、第67位的谷氨酸、第74位的天冬氨酸、第76位的甲硫氨酸、第114位的异亮氨酸、第119位的谷氨酰胺、第122位的苏氨酸、第128位的谷氨酸、第132位的谷氨酸、第136位的缬氨酸、第143位的赖氨酸、第145位的缬氨酸、第147位的谷氨酸、第153位的异亮氨酸、第160位的半胱氨酸、第162位的赖氨酸、第163位的缬氨酸、第166位的丙氨酸、第167位的异亮氨酸、第173位的亮氨酸、第174位的甲硫氨酸、第176位的谷氨酰胺、第179位的精氨酸、第180位的亮氨酸、第181位的甲硫氨酸、第184位的异亮氨酸、第194位的亮氨酸、第195位的谷氨酰胺、第203位的异亮氨酸、第204位的缬氨酸、第205位的甘氨酸、第211位的亮氨酸、第218位的苯丙氨酸、第219位的天冬酰胺、第237位的亮氨酸、第239位的谷氨酸、第240位的谷氨酸、第245位的缬氨酸、第246位的谷氨酸、第249位的甘氨酸、第253位的天冬酰胺、第256位的丙氨酸、第277位的丙氨酸、第281位的组氨酸、第298位的谷氨酸、第299位的赖氨酸、第302位的天冬酰胺、第304位的半胱氨酸、第306位的异亮氨酸、第330位的异亮氨酸、第334位的亮氨酸、第336位的谷氨酰胺、第340位的丝氨酸、第341位的亮氨酸、第370位的苯丙氨酸、第375位的天冬酰胺、第377位的天冬氨酸、第378位的天冬氨酸、第381位的丙氨酸及第386位的异亮氨酸。
MtkA（图3）中，可举出第4位的苯丙氨酸、第5位的缬氨酸、第6位的天冬酰胺、第8位的组氨酸、第9位的丝氨酸、第11位的缬氨酸、第12位的异亮氨酸、第20位的组氨酸、第28位的丙氨酸、第30位的精氨酸、第33位的苏氨酸、第56位的亮氨酸、第60位的天冬氨酸、第72位的天冬氨酸、第73位的缬氨酸、第91位的异亮氨酸、第96位的精氨酸、第97位的缬氨酸、第102位的丙氨酸、第107位的缬氨酸、第111位的异亮氨酸、第114位的谷氨酰胺、第117位的精氨酸、第119位的甘氨酸、第121位的天冬氨酸、第129位的苏氨酸、第130位的脯氨酸、第134位的苏氨酸、第137位的谷氨酸、第138位的半胱氨酸、第139位的赖氨酸、第140位的缬氨酸、第163位的天冬酰胺、第168位的谷氨酸、第175位的亮氨酸、第191位的苏氨酸、第192位的天冬氨酸、第194位的缬氨酸、第195位的苏氨酸、第196位的缬氨酸、第199位的丙氨酸、第210位的缬氨酸、第221位的缬氨酸、第222位的丙氨酸、第224位的丙氨酸、第225位的精氨酸、第227位的丙氨酸、第260位的谷氨酸、第263位的苏氨酸、第266位的丙氨酸、第268位的甲硫氨酸、第269位的天冬氨酸、第270位的丙氨酸、第272位的谷氨酸、第274位的亮氨酸、第277位的酪氨酸、第280位的精氨酸、第281位的天冬酰胺、第283位的丙氨酸、第285位的异亮氨酸、第290位的亮氨酸、第291位的精氨酸、第292位的丙氨酸、第295位的谷氨酸。
可以向这些特征性的共有序列、及保存于全体的共有序列以外的无同源性的部分，引入变异。
从酶活性的观点考虑，最优选具有这些氨基酸序列的苹果酸硫激酶。
作为上述苹果酸硫激酶的基因（mtk），可利用具有由上述各来源生物得到的编码苹果酸硫激酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。
作为优选的DNA，可例举具有来自扭脱甲基杆菌等甲基杆菌属（序列号110及111）、来自嗜甲基生丝微菌、脱氮生丝微菌等生丝微菌属、来自根瘤菌属的种NGR234等根瘤菌属、来自致病乙酸细菌等乙酸细菌属、来自欧洲亚硝化单胞菌等亚硝化单胞菌属、来自荚膜甲基球菌等甲基球菌属、来自γ－变形菌界的基因的碱基序列的DNA。
从乙酰CoA的生产效率的观点考虑，可优选例举具有来自生丝微菌属（序列号61及62、序列号86及87）、来自根瘤菌属（例如序列号63）、来自乙酸细菌属（序列号81及82）、来自亚硝化单胞菌属（序列号91及92）、来自甲基球菌属（序列号96及97）、来自γ－变形菌界的基因的碱基序列（序列号102及103）的DNA。
可特别优选例举来自生丝微菌属基因的碱基序列（序列号63及64、序列号86及87）、及将密码子最优化过的来自根瘤菌属的基因的碱基序列（例如序列号63）、来自亚硝化单胞菌属的基因的碱基序列（序列号91及92）、来自甲基球菌属的基因的碱基序列（序列号96及97）、来自γ－变形菌界的基因的碱基序列（序列号102及103）。
上述苹果酰CoA裂解酶是被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号4.1.3.24、从苹果酰CoA生成乙醛酸和乙酰CoA的酶。例如，可举出来自扭脱甲基杆菌等甲基杆菌属、来自嗜甲基生丝微菌、脱氮生丝微菌等生丝微菌属、来自橙色绿屈挠菌（Chloroflexus aurantiacus）等绿屈挠菌属、来自欧洲亚硝化单胞菌等亚硝化单胞菌属、来自荚膜甲基球菌等甲基球菌属的苹果酰CoA裂解酶。
从乙酰CoA的生产效率的观点考虑，特别是可优选例举来自甲基杆菌属的氨基酸序列（序列号69）、来自生丝微菌属的氨基酸序列（序列号72及109）、来自亚硝化单胞菌属的氨基酸序列（序列号112）、来自甲基球菌属的氨基酸序列（序列号115）。
作为苹果酰CoA裂解酶的比活性，例如，在扭脱甲基杆菌中，作为精制酶，有28.1U/mg这样的报道（Biochem.J.139，399－405，（1974））。
作为上述苹果酰CoA裂解酶的基因（mcl），可利用具有由上述各来源生物得到的编码苹果酰CoA裂解酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。
作为优选的DNA，可例举具有来自扭脱甲基杆菌等甲基杆菌属、来自嗜甲基生丝微菌、脱氮生丝微菌等生丝微菌属、来自橙色绿屈挠菌等绿屈挠菌属的基因的碱基序列的DNA。从乙酰CoA的生产效率的观点考虑，特别是可优选例举具有来自甲基杆菌属的基因、及来自生丝微菌属的基因的碱基序列的DNA。
作为特别优选的来自甲基杆菌属的基因的碱基序列的一例，可举出来自扭脱甲基杆菌基因的碱基序列（序列号66）；作为来自生丝微菌属的基因的碱基序列的一例，可举出来自嗜甲基生丝微菌的基因的碱基序列（序列号60）、来自脱氮生丝微菌基因的碱基序列（序列号85）；作为来自亚硝化单胞菌属的基因的碱基序列的一例，可举出来自欧洲亚硝化单胞菌基因的碱基序列（序列号90）；作为来自甲基球菌属的基因的碱基序列的一例，可举出来自荚膜甲基球菌基因的碱基序列（序列号95）。
上述乙酰CoA羧化酶是被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号6.4.1.2、从乙酰CoA和CO2转化为丙二酸单酰CoA的酶的总称。
上述丙二酸半醛脱氢酶是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号1.2.1.18、从丙二酸单酰CoA转化为丙二酸半醛的酶的总称。
上述丙二酸单酰CoA还原酶是指，将丙二酸单酰CoA转化为丙二酸半醛或3－羟基丙酸的酶的总称。
上述巴豆酰CoA羧化酶－还原酶是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号1.3.1.85、将巴豆酰CoA转化为乙基丙二酸单酰CoA的酶的总称。
上述甲基巴豆酰CoA羧化酶是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号6.4.1.4、将巴豆酰CoA转化为戊烯二酸单酰CoA的酶的总称。
上述丙酮酸合酶是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号1.2.7.1、将乙酰CoA转化为丙酮酸的酶的总称。
关于上述乙酰CoA生产微生物，进一步优选选自乳酸脱氢酶、苹果酸合酶、及富马酸水合酶中的至少一种酶的活性被失活或降低。由此，可更高效地生产乙酰CoA。
在可成为活性的失活或降低的对象的乳酸脱氢酶、苹果酸合酶、及富马酸水合酶各酶中，苹果酸合酶是将乙酰CoA和乙醛酸转化为苹果酸的反应，是利用苹果酸硫激酶及苹果酰CoA裂解酶的反应的逆反应，由于乙酰CoA和乙醛酸返回至苹果酸的反应被抑制或降低，所以致使乙酰CoA的收率提高，故优选。
另外，在可成为活性的失活或降低的对象的乳酸脱氢酶、苹果酸合酶、及富马酸水合酶各酶中，从乙酰CoA的生产效率的观点考虑，优选使富马酸水合酶失活。由此，可防止苹果酸向以富马酸为代表的其他物质转化而量减少，致使乙酰CoA的收率提高。
上述乳酸脱氢酶（ldhA）是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号1.1.1.28、将丙酮酸转化为乳酸，或进行其逆转化的酶的总称。
上述异柠檬酸裂解酶（aceA）是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号4.1.3.1、将异柠檬酸转化为琥珀酸和乙醛酸的酶的总称。
上述苹果酸合酶（aceB及glcB）是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号2.3.3.9、将乙酰CoA和乙醛酸转化为苹果酸和CoA的酶的总称。苹果酸合酶根据微生物的不同，也存在在基因组中具有多个异构体（isomer）的情况。很多大肠杆菌具有aceB及glcB这两种名称的基因，因此，本专利中记载这两者。需要说明的是，菠萝泛菌及谷氨酸棒杆菌中，相当于aceB或glcB的基因存在一种，本专利中为了方便而统一记载为aceB。
上述富马酸水合酶（fum）是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号4.2.1.2、将苹果酸转化为富马酸的酶的总称。富马酸水合酶根据微生物的不同，也存在在基因组中具有多个异构体的情况。例如，大肠杆菌具有fumA，fumB，fumC这三种富马酸水合酶。菠萝泛菌具有fumA，fumC。谷氨酸棒杆菌具有fumC。
上述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号4.1.1.31、将磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳转化为草酰乙酸和磷酸的酶的总称。例如，可举出来自谷氨酸棒杆菌等棒状杆菌属细菌、大肠杆菌（Escherichia coli）等埃希氏菌属细菌、菠萝泛菌等泛菌属细菌、嗜甲基生丝微菌（Hyphomicrobium methylovorum）等生丝微菌属细菌、Starkeya novella（Starkeya novella）等Starkeya属细菌、红假单胞菌属的种（Rhodopseudomonas sp.）等红假单胞菌属（Rhodopseudomonas）细菌、天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）等链霉菌属（Streptomyces）细菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。
作为上述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因（ppc），可利用具有由上述各来源生物得到的编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可例举具有来自谷氨酸棒杆菌等棒状杆菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌、菠萝泛菌等泛菌属细菌、嗜甲基生丝微菌（Hyphomicrobium methylovorum）等生丝微菌属细菌、Starkeya novella（Starkeya novella）等Starkeya属细菌、红假单胞菌属的种（Rhodopseudomonas sp.）等红假单胞菌属细菌、天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）等链霉菌属细菌的基因的碱基序列的DNA。
上述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号4.1.1.32、酶编号4.1.1.38、酶编号4.1.1.49、将磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳转化为草酰乙酸的酶的总称。此时，分别地，酶编号4.1.1.32伴随将GDP转化为GTP的反应，酶编号4.1.1.38伴随将磷酸转化为焦磷酸的反应，酶编号4.1.1.49伴有将ADP转化为ATP的反应。例如，可举出来自琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）等放线杆菌属（succinogenes）细菌、耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）等分枝杆菌属（smegmatis）细菌、布氏锥虫（Trypanosoma brucei）等锥虫属（Trypanosoma）细菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶。
作为上述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的基因（pck），可利用具有由上述各来源生物得到的编码磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可举出来自琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）等放线杆菌属、耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）等分枝杆菌属细菌、布氏锥虫（Trypanosoma brucei）等锥虫属细菌的DNA。
上述丙酮酸羧化酶是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号6.4.1.1、将丙酮酸和二氧化碳转化为草酰乙酸的酶的总称。反应时消耗ATP，生成ADP和磷酸。例如，可举出来自谷氨酸棒杆菌等棒状杆菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌、菠萝泛菌等泛菌属细菌、耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）等分枝杆菌属细菌的丙酮酸羧化酶。
作为上述丙酮酸羧化酶的基因（pyc），可利用具有由上述各来源生物得到的编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可例举具有来自谷氨酸棒杆菌等棒状杆菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌、菠萝泛菌等泛菌属细菌、耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）等分枝杆菌属细菌的基因的碱基序列的DNA。
上述苹果酸脱氢酶是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号1.1.1.37、使用NADH作为辅酶、从草酰乙酸生成苹果酸的酶的总称。例如，可举出来自谷氨酸棒杆菌等棒状杆菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌的苹果酸脱氢酶。
作为上述苹果酸脱氢酶的基因（mdh），可利用具有由上述各来源生物得到的编码苹果酸脱氢酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可例举具有来自谷氨酸棒杆菌等棒状杆菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌、菠萝泛菌等泛菌属细菌的基因的碱基序列的DNA。
上述乙醛酸醛连接酶是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号4.1.1.47、将2分子的乙醛酸转化为1分子的2－羟基－3－氧代丙酸的酶的总称。反应时伴随1分子的二氧化碳的脱二氧化碳。例如，可举出来自谷氨酸棒杆菌等棒状杆菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌、红球菌jostii（Rhodococcus jostii）等红球菌属（Rhodococcus）细菌的乙醛酸醛连接酶。
作为上述乙醛酸醛连接酶的基因（gcl），可利用具有由上述各来源生物得到的编码乙醛酸醛连接酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可例举具有来自红球菌jostii等红球菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌的基因的碱基序列的DNA。
上述2－羟基－3－氧代丙酸还原酶是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号1.1.1.60、使用NADH作为辅酶、将2－羟基－3－氧代丙酸转化为甘油酸的酶的总称。例如，可举出来自谷氨酸棒杆菌等棒状杆菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌的2－羟基－3－氧代丙酸还原酶。
作为上述2－羟基－3－氧代丙酸还原酶的基因（glxR），可利用具有由上述各来源生物得到的编码2－羟基－3－氧代丙酸还原酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可例举具有来自大肠杆菌等埃希氏菌属细菌的基因的碱基序列的DNA。
上述羟基丙酮酸异构酶是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号5.3.1.22、将2－羟基－3－氧代丙酸异构化为羟基丙酮酸的酶的总称。例如，可举出来自谷氨酸棒杆菌等棒状杆菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌、菠萝泛菌等泛菌属细菌的羟基丙酮酸异构酶。
作为上述羟基丙酮酸异构酶的基因（hyi），可利用具有由上述各来源生物得到的编码羟基丙酮酸异构酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可例举具有来自谷氨酸棒杆菌等棒状杆菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌、菠萝泛菌等泛菌属细菌的基因的碱基序列的DNA。
上述羟基丙酮酸还原酶是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号1.1.1.81、使用NADH或NADPH作为辅酶、将羟基丙酮酸转化为甘油酸的酶的总称。
例如，可举出来自大肠杆菌等埃希氏菌属细菌、及菠萝泛菌等泛菌属细菌的羟基丙酮酸还原酶。
作为上述羟基丙酮酸还原酶的基因（ycdW），可利用具有由上述各来源生物得到的编码羟基丙酮酸还原酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可例举具有来自大肠杆菌等埃希氏菌属细菌、及菠萝泛菌等泛菌属细菌的基因的碱基序列的DNA。
上述甘油酸3－激酶是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号2.7.1.31、将甘油酸转化为3－磷酸甘油酸的酶的总称。消耗1分子的ATP、生成1分子的ADP和磷酸。例如，可举出来自谷氨酸棒杆菌等棒状杆菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌的甘油酸3－激酶。
作为本发明中的甘油酸3－激酶的基因（glxK），可利用具有由上述各来源生物得到的编码甘油酸3－激酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可例举具有来自谷氨酸棒杆菌等棒状杆菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌、菠萝泛菌等泛菌属细菌的基因的碱基序列的DNA。
上述甘油酸2－激酶是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号2.7.1.165、将甘油酸转化为2－磷酸甘油酸的酶的总称。消耗1分子的ATP、生成1分子的ADP和磷酸。例如，可举出来自谷氨酸棒杆菌等棒状杆菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌的甘油酸2－激酶。
作为本发明中的甘油酸2－激酶的基因（garK），可利用具有由上述各来源生物得到的编码甘油酸2－激酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可例举具有来自谷氨酸棒杆菌等棒状杆菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌、菠萝泛菌等泛菌属细菌的基因的碱基序列的DNA。
上述磷酸甘油酸变位酶是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号5.4.2.1、将3－磷酸甘油酸转化为2－磷酸甘油酸的酶的总称。例如，可举出来自谷氨酸棒杆菌等棒状杆菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌、菠萝泛菌等泛菌属细菌的磷酸甘油酸变位酶。
作为上述磷酸甘油酸变位酶的基因（gpm），可利用具有由上述各来源生物得到的编码磷酸甘油酸变位酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可例举具有来自谷氨酸棒杆菌等棒状杆菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌、菠萝泛菌等泛菌属细菌的基因的碱基序列的DNA。
上述烯醇化酶是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号4.2.1.11、将2－磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸的酶的总称。例如，可举出来自谷氨酸棒杆菌等棒状杆菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌、菠萝泛菌等泛菌属细菌的烯醇化酶。
作为上述烯醇化酶的基因（eno），可利用具有由上述各来源生物得到的编码烯醇化酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可例举具有来自谷氨酸棒杆菌等棒状杆菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌、菠萝泛菌等泛菌属细菌的基因的碱基序列的DNA。
上述丙酮酸激酶是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号2.7.1.40、从磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成丙酮酸和ATP的酶的总称。例如，可举出来自谷氨酸棒杆菌等棒状杆菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌、来自菠萝泛菌等泛菌属细菌的丙酮酸激酶。
作为上述丙酮酸激酶的基因（pyk），可利用具有由上述各来源生物得到的编码丙酮酸激酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可例举具有来自谷氨酸棒杆菌等棒状杆菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌、菠萝泛菌等泛菌属细菌的基因的碱基序列的DNA。
上述乙酰CoA生产微生物，除了具有将乙酰CoA转化为有用的代谢产物的途径之外，还可以具有以乙酰CoA为原料的生产其他代谢产物的途径，或者，还可以强化与生产该其他代谢产物的途径相关的酶活性。由此，可由碳源材料及二氧化碳生成来自乙酰CoA的有用的代谢产物，并且可提高来自乙酰CoA的有用的代谢产物的生产率。
本发明中使用的微生物只要是不具有下述（a）、（b）、（c）、（d）及（e）中任一种的微生物即可，没有特别限制。
（a）具有由丙二酸单酰CoA向丙二酸半醛或3－羟基丙酸的酶反应的二氧化碳固定循环，
（b）具有由乙酰CoA和CO2向丙酮酸的酶反应的二氧化碳固定循环，
（c）具有由巴豆酰CoA和CO2向乙基丙二酸单酰CoA或戊烯二酸单酰CoA的酶反应的二氧化碳固定循环，
（d）具有由CO2向甲酸的酶反应的二氧化碳固定循环，
（e）选自苹果酸硫激酶和苹果酰CoA裂解酶中的至少一种。
例如，可举出属于肠杆菌科的微生物或属于棒状细菌的微生物。具体而言，可举出埃希氏菌属细菌、泛菌属细菌等属于肠杆菌科的微生物、棒状杆菌属细菌、短杆菌属（Brevibacterium）细菌等属于棒状细菌的微生物、丝状菌、放线菌等。
作为属于肠杆菌科的微生物，可举出属于肠杆菌属（Enterobacter）、欧文氏菌属（Erwinia）、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、泛菌属、普罗维登斯菌属（Providencia）、沙门氏菌属（Salmonella）、沙雷氏菌属（Serratia）、志贺氏菌属（Shigella）、摩根氏菌属（Morganella）、欧文氏菌属（Erwinia）等的菌。其中，从可有效率地生产有用的代谢产物这样的观点考虑，优选属于埃希氏菌属或泛菌属的微生物。
作为棒状杆菌属细菌，可举出例如谷氨酸棒杆菌等。
作为埃希氏菌属细菌，没有特别限定，例如可举出大肠杆菌。作为大肠杆菌，具体而言，可举出来自原型（prototype）的野生株K12株的大肠杆菌W3110（ATCC27325）、大肠杆菌MG1655（ATCC47076）等。
埃希氏菌属细菌及泛菌属细菌均属于肠杆菌科，亲缘性非常高（J.Gen.Appl.Microbiol.43（6）355－361（1997）、International Journal of Systematic Bacteriology，p1061－1067（1997））。
近年来，属于肠杆菌属（Enterobacter）的菌中，存在被再分类为成团泛菌（Pantoea agglomerans）或分散泛菌（Pantoea dispersa）等的细菌（International Journal of Systematic Bacteriology，July39（3）337－345（1989））。
另外，属于欧文氏菌属的菌中，存在被再分类为菠萝泛菌（Pantoea ananas）、斯氏泛菌（Pantoea stewartii）的细菌（International Journal of Systematic Bacteriology，43（1），162－173（1993））。
作为肠杆菌属细菌，可举出成团肠杆菌（Enterobacter agglomerans）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）等。具体而言，可使用欧洲专利申请公开952221号说明书中例举的菌株。作为肠杆菌属的代表株，可举出成团肠杆菌ATCC12287株。
作为泛菌属细菌的代表菌株，可举出菠萝泛菌（Pantoea ananatis）、斯氏泛菌（Pantoea stewartii）、成团泛菌、柠檬泛菌（Pantoea citrea）。具体而言，可举出下述的菌株。
·菠萝泛菌AJ13355株（FERM BP－6614）（欧洲专利申请公开0952221号说明书）
·菠萝泛菌AJ13356株（FERM BP－6615）（欧洲专利申请公开0952221号说明书）
需要说明的是，虽然这些菌株在欧洲专利申请公开0952221号说明书中作为成团肠杆菌记载，但如上所述，利用16S rRNA的碱基序列分析等，现在被再分类为菠萝泛菌。
本发明的棒状细菌是指，属于Bergeys Manual of Determinative Bacteriology，8，599（1974）中定义的、棒状杆菌属（Corynebacterium）、短杆菌属（Brevibacterium）、或微杆菌属（Microbacterium）的微生物等。
另外，还可举出虽然以往被分类为短杆菌属、但随后被再分类为棒状杆菌属的微生物（Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255（1991））、及属于作为亲缘菌的短杆菌属的微生物。以下列举出棒状细菌的例子。
例如，可举出嗜乙酰乙酸棒杆菌（Corynebacterium acetoacidophilum）、醋谷棒杆菌（corynebacterium acetoglutamicum）、解烷棒杆菌（Corynebacterium alkanolyticum）、美棒杆菌（Corynebacterium callunae）、谷氨酸棒杆菌、百合棒杆菌（Corynebacterium lilium）、栖糖蜜棒杆菌（Corynebacterium melassecola）、热产氨棒杆菌（Corynebacterium thermoaminogenes）、力士棒杆菌（Corynebacteriumherculis）、叉开短杆菌（Brevibacterium divaricatum）、黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）、短杆菌immariophilum（Brevibacteriumimmariophilum）、乳发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum）、玫瑰色短杆菌（Brevibacterium roseum）、解糖短杆菌（Brevibacterium saccharolyticum）、生硫短杆菌（Brevibacterium thiogenitalis）、产氨棒杆菌（Corynebacterium ammoniagenes）、白短杆菌（Brevibacterium album）、蜡状短杆菌（Brevibacterium cerinum）、嗜氨微杆菌（Microbacterium ammoniaphilum）。
特别是，包含以下的菌株。
包含嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870、醋谷棒杆菌ATCC15806、解烷棒杆菌ATCC21511、美棒杆菌ATCC15991、谷氨酸棒杆菌ATCC13020、13032、13060、百合棒杆菌ATCC15990、栖糖蜜棒杆菌ATCC17965、热产氨棒杆菌AJ12340（FERM BP－1539）、力士棒杆菌ATCC13868、叉开短杆菌ATCC14020、黄色短杆菌ATCC13826、ATCC14067、AJ12418（FERM BP－2205）、短杆菌immariophilum ATCC14068、乳发酵短杆菌（谷氨酸棒杆菌）ATCC13869、玫瑰色短杆菌ATCC13825、解糖短杆菌ATCC14066、生硫短杆菌ATCC19240、产氨短杆菌ATCC6871、ATCC6872、白短杆菌ATCC15111、蜡状短杆菌ATCC15112及嗜氨微杆菌ATCC15354。
当微生物为埃希氏菌属细菌时，可举出向埃希氏菌属细菌赋予或强化了硫解酶活性、CoA转移酶活性及乙酰乙酸脱羧酶活性而得到的乙酰CoA生产微生物作为本发明中的乙酰CoA生产微生物的优选的一个方案。
另外，当微生物为埃希氏菌属细菌时，也可举出向埃希氏菌属细菌赋予或强化了硫解酶活性、CoA转移酶活性、乙酰乙酸脱羧酶活性及异丙醇脱氢酶活性而得到的乙酰CoA生产微生物作为本发明中的乙酰CoA生产微生物的优选的一个方案。
上述硫解酶是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号2.3.1.9、催化从乙酰CoA生成乙酰乙酰CoA的反应的酶的总称。
作为这样的硫解酶，例如，可举出来自丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）、拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）等梭状芽孢杆菌属（Clostridium）细菌、大肠杆菌（Escherichia coli）等埃希氏菌属细菌、盐杆菌属的种（Halobacterium sp.）细菌、生枝动胶菌（Zoogloea ramigera）等动胶菌属（Zoogloea）细菌、根瘤菌属的种（Rhizobium sp.）细菌、大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）等慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）细菌、热带念珠菌（Candida tropicalis）等念珠菌属（Candida）细菌、新月柄杆菌（Caulobacter crescentus）等柄杆菌属细菌、山丘链霉菌（Streptomyces collinus）等链霉菌属（Streptomyces）细菌、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）等肠球菌属（Enterococcus）细菌的硫解酶。
作为上述硫解酶的基因，可利用具有由上述各来源生物得到的编码硫解酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可例举具有来自丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌等梭状芽孢杆菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌、盐杆菌属的种的细菌、生枝动胶菌等动胶菌属细菌、根瘤菌属的种的细菌、大豆慢生根瘤菌等慢生根瘤菌属细菌、热带念珠菌等念珠菌属细菌、新月柄杆菌等柄杆菌属细菌、山丘链霉菌等链霉菌属细菌、粪肠球菌等肠球菌属细菌的基因的碱基序列的DNA。作为更优选的DNA，可举出来自梭状芽孢杆菌属细菌、及埃希氏菌属细菌等原核生物的DNA，特别优选为具有来自丙酮丁醇梭菌或大肠杆菌的基因的碱基序列的DNA。
上述乙酰乙酸脱羧酶是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号4.1.1.4、催化从乙酰乙酸生成丙酮的反应的酶的总称。
作为这样的乙酰乙酸脱羧酶，例如，可举出来自丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）、拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）等梭状芽孢杆菌属细菌、多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）等芽孢杆菌属（Bacillus）细菌的乙酰乙酸脱羧酶。
作为上述乙酰乙酸脱羧酶的基因，可利用具有由上述各来源生物得到的编码乙酰乙酸脱羧酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可举出来自梭状芽孢杆菌属细菌的DNA，及来自芽孢杆菌属细菌的DNA，例如可例举具有来自丙酮丁醇梭菌、多粘芽孢杆菌的基因的碱基序列的DNA。特别优选为具有来自丙酮丁醇梭菌的基因的碱基序列的DNA。
作为上述乙酰乙酸脱羧酶的基因，可利用具有由上述各来源生物得到的编码乙酰乙酸脱羧酶的基因的碱基序列的DNA。作为优选的DNA，可举出来自梭状芽孢杆菌属细菌的DNA、及来自芽孢杆菌属细菌的DNA，例如可例举具有来自丙酮丁醇梭菌、多粘芽孢杆菌的基因的碱基序列的DNA。特别优选为具有来自丙酮丁醇梭菌的基因的碱基序列的DNA。
上述异丙醇脱氢酶是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号1.1.1.80、催化从丙酮生成异丙醇的反应的酶的总称。
作为这样的异丙醇脱氢酶，例如，可举出来自拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）等梭状芽孢杆菌属细菌的异丙醇脱氢酶。
作为上述异丙醇脱氢酶的基因，可利用具有由上述各来源生物得到的编码异丙醇脱氢酶的基因的碱基序列的DNA。作为优选的DNA，可举出来自梭状芽孢杆菌属细菌的DNA，例如为具有来自拜氏梭菌的基因的碱基序列的DNA。
上述CoA转移酶是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号2.8.3.8、催化从乙酰乙酰CoA生成乙酰乙酸的反应的酶的总称。
作为这样的CoA转移酶，例如，可举出来自丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）、拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）等梭状芽孢杆菌属细菌、肠道罗斯氏菌（Roseburia intestinalis）等罗斯氏菌属（Roseburia）细菌、普拉梭菌（Faecalibacterium prausnitzii）等Faecalibacterium属细菌、粪球菌（Coprococcus）属细菌、布氏锥虫（Trypanosoma brucei）等锥虫、大肠杆菌（Escherichia coli：大肠杆菌）等埃希氏菌属细菌的CoA转移酶。
作为上述CoA转移酶的基因，可利用具有由上述各来源生物得到的编码CoA转移酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可例举具有来自丙酮丁醇梭菌等梭状芽孢杆菌属细菌、肠道罗斯氏菌等罗斯氏菌属细菌、普拉梭菌等Faecalibacterium属细菌、粪球菌属细菌、布氏锥虫等锥虫、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌的基因的碱基序列的DNA。作为更优选的DNA，可举出来自梭状芽孢杆菌属细菌及埃希氏菌属细菌的DNA，特别优选为具有来自丙酮丁醇梭菌及大肠杆菌的基因的碱基序列的DNA。
从酶活性的观点考虑，优选上述四种酶分别来自选自梭状芽孢杆菌属细菌、芽孢杆菌属细菌及埃希氏菌属细菌中的至少一种，其中，进一步优选乙酰乙酸脱羧酶及异丙醇脱氢酶来自梭状芽孢杆菌属细菌、CoA转移酶活性及硫解酶活性来自埃希氏菌属细菌的情况。
其中，从酶活性的观点考虑，优选上述四种酶分别来自丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌或大肠杆菌中的任一种，更优选乙酰乙酸脱羧酶是来自丙酮丁醇梭菌的酶、CoA转移酶及硫解酶分别是来自丙酮丁醇梭菌或大肠杆菌的酶、异丙醇脱氢酶是来自拜氏梭菌的酶，从酶活性的观点考虑，特别优选上述四种酶中乙酰乙酸脱羧酶活性来自丙酮丁醇梭菌、上述异丙醇脱氢酶活性来自拜氏梭菌、CoA转移酶活性及硫解酶活性来自大肠杆菌。
来自大肠杆菌的CoA转移酶基因（atoD及atoA）和硫解酶基因（atoB）以atoD、atoA、atoB的顺序在大肠杆菌基因组上形成操纵子（Journal of Baceteriology Vol.169pp42－52Lauren Sallus Jenkins等），因此，通过改变atoD的启动子，可同时控制CoA转移酶基因和硫解酶基因的表达。
由此，CoA转移酶活性及硫解酶活性通过宿主大肠杆菌的基因组基因得到时，从获得充分的异丙醇生产能力的观点考虑，优选通过将负责两种酶基因的表达的启动子取代为其他启动子等，而增强两种酶基因的表达。作为用于增强CoA转移酶活性及硫解酶活性的表达的启动子，可举出前述的来自大肠杆菌的GAPDH启动子等。
作为以乙酰CoA为原料生产其他的代谢产物的乙酰CoA生产微生物，例如，可举出以具有异丙醇生产系统的大肠杆菌（以下，称为“异丙醇生产大肠杆菌”。）为宿主、将上述各酶活性赋予或强化、或失活或降低而得到的微生物等。
作为上述异丙醇生产大肠杆菌，只要可导入及改变赋予异丙醇生产能力的各基因即可，可以是任一大肠杆菌。
更优选可以是预先赋予了异丙醇生产能力的大肠杆菌，由此，可更高效地生产异丙醇。
作为这样的异丙醇生产大肠杆菌，可举出例如国际公开第2009/008377号小册子中记载的赋予了乙酰乙酸脱羧酶活性、异丙醇脱氢酶活性、CoA转移酶活性及硫解酶活性、能从来自植物的原料生成异丙醇的异丙醇生成大肠杆菌等。此外，也可举出国际公开第2009/094485号小册子、国际公开第2009/094485号小册子、国际公开第2009/046929号小册子、国际公开第2009/046929号小册子中记载的微生物作为异丙醇生产大肠杆菌的例子。
上述异丙醇生产大肠杆菌是具备异丙醇生产途径的大肠杆菌，是指具有利用基因重组技术导入的异丙醇生产能力的大肠杆菌。这样的异丙醇生产系统只要是使作为对象的大肠杆菌生产异丙醇的系统即可，可以是任意系统。
本发明中的异丙醇生产大肠杆菌优选被从细胞外赋予乙酰乙酸脱羧酶活性、异丙醇脱氢酶活性、CoA转移酶活性及前述的硫解酶活性这四种酶活性。
本发明中，作为具备异丙醇生产系统的异丙醇生产大肠杆菌的例子，可例举WO2009/008377号中记载的pIPA/B株或pIaaa/B株。另外，该大肠杆菌中包含如下株：在参与异丙醇的生产的酶中，CoA转移酶活性和硫解酶活性的强化通过将该大肠杆菌的基因组上的各基因的表达强化来进行，异丙醇脱氢酶活性和乙酰乙酸脱羧酶活性的强化通过用质粒强化各基因的表达来进行（本说明书中，有时称为pIa/B：：atoDAB株）。
进而，本发明的异丙醇生产大肠杆菌可以是如下的异丙醇生产大肠杆菌：转录抑制因子GntR的活性被失活，并且具备异丙醇生产系统、和维持或强化伴随该GntR的活性的失活的异丙醇生产能力的酶活性图案（pattern）的辅酶群。由此，能进一步提高异丙醇生产能力。
本发明中的“辅酶群”是指，影响上述异丙醇生产能力的一种或两种以上的酶。另外，辅酶群的各酶活性被失活、活化或强化，本发明中的“辅酶群的酶活性图案”是指，能维持或增加仅通过将GntR的活性失活而得到的提高了的异丙醇生产量的各酶的酶活性图案，包含一种或两种以上的酶的组合。
作为辅酶群的酶活性图案，可优选举出以下的图案：
（1）葡萄糖－6－磷酸异构酶（Pgi）活性、葡萄糖－6－磷酸－1－脱氢酶（Zwf）活性及磷酸葡糖酸脱氢酶（Gnd）活性的野生型的维持、
（2）葡萄糖－6－磷酸异构酶（Pgi）活性的失活、和葡萄糖－6－磷酸－1－脱氢酶（Zwf）活性的强化、
（3）葡萄糖－6－磷酸异构酶（Pgi）活性的失活、葡萄糖－6－磷酸－1－脱氢酶（Zwf）活性的强化、和磷酸葡糖酸脱氢酶（Gnd）活性的失活。
其中，从异丙醇生产能力的观点考虑，更优选上述（3）的辅酶群的酶活性图案。
需要说明的是，上述辅酶群及其酶活性图案不受它们的限制，只要是包含GntR的活性的失活、可增加异丙醇生产大肠杆菌中的异丙醇生产量的辅酶群及其酶活性图案，均包含在本发明中。另外，辅酶群不一定需要由多种酶构成，也可以由一种酶构成。
上述GntR是指，对参与经由恩特纳·杜多罗夫途径的葡萄糖酸代谢的操纵子进行负调控的转录因子。是指抑制负责葡萄糖酸的吸收和代谢的两种基因群（GntI和GntII）的作用的GntR转录抑制因子的总称。
上述葡萄糖－6－磷酸异构酶（Pgi）是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号5.3.1.9、催化从D－葡萄糖－6－磷酸生成D－果糖－6－磷酸的反应的酶的总称。
上述葡萄糖－6－磷酸－1－脱氢酶（Zwf）是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号1.1.1.49、催化从D－葡萄糖－6－磷酸生成D－葡萄糖酸－1，5－内酯－6－磷酸的反应的酶的总称。
作为这样的酶，例如，可举出来自嗜放射异常球菌（Deinococcus radiophilus）等异常球菌属（Deinococcus）菌、黑曲霉（Aspergillus niger）、棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）等曲霉属（Aspergillus）菌、汉式醋杆菌（Acetobacter hansenii）等醋酸杆菌属（Acetobacter）菌、海栖热袍菌（Thermotoga maritima）等栖热袍菌属（Thermotoga）菌、新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）等隐球菌属（Cryptococcus）菌、盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）等网柄菌属（Dictyostelium）菌、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、绿脓假单胞菌（Pseudomonas aeruginos）等假单胞菌属（Pseudomonas）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等酵母菌属（Saccharomyces）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）等芽孢杆菌属（Bacillus）菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌的酶。
作为上述葡萄糖－6－磷酸－1－脱氢酶（Zwf）的基因，可利用具有由上述各来源生物得到的编码硫解酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的DNA，可例举具有来自嗜放射异常球菌（Deinococcus radiophilus）等异常球菌属菌、黑曲霉（Aspergillus niger）、棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）等曲霉属菌、汉式醋杆菌（Acetobacter hansenii）等醋酸杆菌属菌、海栖热袍菌（Thermotoga maritima）等栖热袍菌属菌、新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）等隐球菌属菌、盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）等网柄菌属菌、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、绿脓假单胞菌（Pseudomonas aeruginos等假单胞菌属、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等酵母菌属、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）等芽孢杆菌属菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌的基因的碱基序列的DNA。作为更优选的DNA，可举出来自异常球菌属菌、曲霉属菌、醋酸杆菌属菌、栖热袍菌属菌、假单胞菌属、芽孢杆菌属菌、埃希氏菌属细菌等原核生物的DNA，特别优选为具有来自埃希氏菌属的基因的碱基序列的DNA。
上述磷酸葡糖酸脱氢酶（Gnd）是指，被分类为依据国际生物化学联合会（I.U.B.）酶委员会报道的酶编号1.1.1.44、催化从6－磷酸－D－葡萄糖酸生成D－核酮糖－5－磷酸和CO2的反应的酶的总称。
本发明中的这些酶的活性可以从细胞外向细胞内导入，或者，通过将宿主细菌在基因组上具有的酶基因的启动子活性强化或取代为其他启动子而使酶基因强表达。
本发明中强化了酶的活性的大肠杆菌是指，通过某种方法将该酶活性强化过的大肠杆菌。这些大肠杆菌例如可使用如下方法制成：使用与上述相同的基因重组技术使用质粒将编码该酶及蛋白质的基因从细胞外导入至细胞内，或通过将宿主大肠杆菌在基因组上具有的酶基因的启动子活性强化或取代为其他启动子从而使酶基因强表达，或它们的组合等。
可应用于上述异丙醇生产大肠杆菌的基因的启动子，只要是能控制上述任一基因的表达的启动子即可，可以是平常在微生物内发挥功能的强力的启动子，且即使在葡萄糖的存在下也不易受到表达抑制的启动子。具体而言，可例举甘油醛3－磷酸脱氢酶（以下有时称为GAPDH）的启动子、丝氨酸羟基甲基转移酶的启动子。
上述异丙醇生产大肠杆菌中的启动子是指，与具有sigma因子的RNA聚合酶结合、开始转录的部位。例如，来自大肠杆菌的GAPDH启动子，在GenBank登录号X02662的碱基序列信息中，被记载于碱基编号397～440。
上述异丙醇生产大肠杆菌中，乳酸脱氢酶（LdhA）可以被破坏。由此，即使在氧供给受到限制的培养条件下，乳酸的生产也受到抑制，因此可高效地生产异丙醇。氧供给受到限制的培养条件是指，在仅使用空气作为气体的情况下，通常为0.02vvm～2.0vvm（vvm：通气容量〔mL〕/液容量〔mL〕/时间〔分钟〕）、转数200～600rpm。
上述乳酸脱氢酶（LdhA）是指，从丙酮酸和NADH生成D－乳酸和NAD的酶。
需要说明的是，就上述乙酰CoA生产微生物而言，在生产丙酮的情况下，在异丙醇生产系统中，可以仅具有硫解酶活性、CoA转移酶活性及乙酰乙酸脱羧酶活性。即，当使用上述乙酰CoA生产微生物生产丙酮时，也可以使用不具有异丙醇脱氢酶活性的微生物。
作为以乙酰CoA为原料的生产其他代谢产物的途径的其他例子，可举出从乙酰CoA生产谷氨酸的途径。例如，可举出以具有高效地生产谷氨酸的途径的微生物（以下，有时称为“谷氨酸生产微生物”。）为宿主、将上述的各酶活性赋予或强化、或失活或降低而得到的微生物作为具有上述生产其他的代谢产物的途径的微生物、或将与该生产其他的代谢产物的途径有关的酶活性强化后的微生物的优选的一个例子。
作为谷氨酸生产微生物，可举出具有生产L－氨基酸的能力的已述的微生物。
作为谷氨酸生产微生物的具体例，可举出埃希氏菌属细菌、泛菌属细菌等肠杆菌科属菌、谷氨酸棒杆菌等棒状细菌等，但本发明的微生物不受这些例子的限制。
作为上述谷氨酸生产菌，只要是可导入及改变赋予谷氨酸生产能力的各基因的微生物即可，可以是任一微生物。可更优选为预先赋予了谷氨酸生产能力的泛菌属细菌或棒状细菌，由此，可更高效地生产谷氨酸。
向微生物赋予谷氨酸生产能力的方法，例如包括：进行改变使得编码参与L－谷氨酸生物合成的酶的基因的表达增强及/或过表达。作为L－谷氨酸生物合成酶的例子，可举出谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶、柠檬酸合酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇式丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛－3－磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、果糖－2－磷酸醛缩酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖磷酸异构酶等。这些酶中，优选增大柠檬酸合酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、及谷氨酸脱氢酶中一种或多种的活性，更优选增强上述全部三种酶的活性。
作为这样的谷氨酸生产菌，可举出例如日本特开2005－278643号公报中记载的谷氨酸生产菌等。
作为L－谷氨酸生产菌，可使用具有在酸性条件下培养时，在液体培养基中蓄积超过L－谷氨酸的饱和浓度的量的L－谷氨酸的能力（以下，有时称为酸性条件下的L－谷氨酸蓄积能力）的微生物。例如，通过利用欧洲公开公报1078989号记载的方法、而获得在低pH环境下对L－谷氨酸的耐性提高的菌株，由此，可赋予蓄积超过饱和浓度的量的L－谷氨酸的能力。
作为本来具有酸性条件下的L－谷氨酸蓄积能力的微生物，具体而言，可举出菠萝泛菌AJ13356株（FERM BP－6615）及AJ13601株（FERM BP－7207）（以上均参见欧洲专利申请公开0952221号说明书）等。菠萝泛菌AJ13356于平成10年（1998年）2月19日以保藏编号FERM P－16645被保藏于日本通产省工业技术院生命工学工业技术研究所（现名称为独立行政法人产品评价技术基础机构专利生物保藏中心（IPOD，NITE），地址：邮政编码305－8566，日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6），于平成11年（1999年）1月11日移交给基于布达佩斯条约的国际保藏，赋予保藏编号FERM BP－6615。需要说明的是，该株在被分离出时被鉴定为成团肠杆菌（Enterobacter agglomerans），作为成团肠杆菌AJ13355而被保藏，但近年来，通过16S rRNA的碱基序列分析等，被再分类为菠萝泛菌（Pantoea ananatis）（参见后述实施例）。另外，由后述的AJ13355诱导出的菌株AJ13356、及AJ13601也同样地作为成团肠杆菌被保藏于上述保藏机构，但在本说明书中记述为菠萝泛菌。AJ13601于1999年8月18日以保藏编号FERM P－17156被保藏于日本经济产业省工业技术院生命工学工业技术研究所（现名称为独立行政法人产品评价技术基础机构专利生物保藏中心（IPOD，NITE）），于2000年7月6日移交给基于布达佩斯条约的国际保藏，赋予保藏编号FERMBP－7207。
作为赋予或增强L－谷氨酸生产能力的其他方法，也可举出赋予对有机酸类似物、呼吸抑制剂等的耐性的方法、赋予对细胞壁合成抑制剂的敏感性的方法。例如，可举出赋予一氟乙酸耐性的方法（日本特开昭50－113209号公报）、赋予腺嘌呤耐性或胸腺嘧啶耐性的方法（日本特开昭57－065198号公报）、使脲酶弱化的方法（日本特开昭52－038088号公报）、赋予丙二酸耐性的方法（日本特开昭52－038088号公报）、赋予对苯并吡喃酮或萘醌类的耐性的方法（日本特开昭56－1889号公报）、赋予HOQNO耐性的方法（日本特开昭56－140895号公报）、赋予α－酮丙二酸（α－ketomalonicacid）耐性的方法（日本特开昭57－2689号公报）、赋予胍耐性的方法（日本特开昭56－35981号公报）、赋予对青霉素的敏感性的方法（日本特开平4－88994号公报）等。
作为这样的耐性菌的具体例，可举出下述那样的菌株。
·黄色短杆菌AJ3949（FERMBP－2632；参见日本特开昭50－113209号公报）
·谷氨酸棒杆菌AJ11628（FERM P－5736；参见日本特开昭57－065198号公报）
·黄色短杆菌AJ11355（FERM P－5007；参见日本特开昭56－1889号公报）
·谷氨酸棒杆菌AJ11368（FERM P－5020；参见日本特开昭56－1889号公报）
·黄色短杆菌AJ11217（FERM P－4318；参见日本特开昭57－2689号公报）
·谷氨酸棒杆菌AJ11218（FERM P－4319；参见日本特开昭57－2689号公报）
·黄色短杆菌AJ11564（FERM P－5472；参见日本特开昭56－140895公报）
黄色短杆菌AJ11439（FERM P－5136；参见日本特开昭56－35981号公报）
·谷氨酸棒杆菌H7684（FERM BP－3004；参见日本特开平04－88994号公报）
·乳发酵短杆菌AJ11426（FERM P－5123；参见日本特开平56－048890号公报）
·谷氨酸棒杆菌AJ11440（FERM P－5137；参见日本特开平56－048890号公报）
·乳发酵短杆菌AJ11796（FERM P－6402；参见日本特开平58－158192号公报）
作为具有L－谷氨酰胺生产能力的微生物而优选的例子，为强化了谷氨酸脱氢酶活性的菌、强化了谷氨酰胺合成酶（glnA）活性的菌、破坏了谷氨酰胺酶基因的菌（欧洲专利申请公开1229121号、1424398号说明书）。谷氨酰胺合成酶的活性增强也可通过谷氨酰胺腺苷酰基转移酶（glutamine adenylyl transferase）（glnE）的破坏、PII控制蛋白（glnB）的破坏实现。另外，还可例举属于埃希氏菌属、具有谷氨酰胺合成酶的397位的酪氨酸残基被其他的氨基酸残基取代而得到的变异型谷氨酰胺合成酶的菌株作为优选的L－谷氨酰胺生产菌（美国专利申请公开第2003－0148474号说明书）。
作为赋予或增强L－谷氨酰胺生产能力的其他方法，可举出赋予6－重氮－5－氧代－正亮氨酸耐性的方法（日本特开平3－232497号公报）、赋予嘌呤类似物耐性及甲硫氨酸亚砜（methionine sulfoxide）耐性的方法（日本特开昭61－202694号公报）、赋予α－酮马来酸（α－ketomaleic acid）耐性的方法（日本特开昭56－151495号公报）等。作为具有L－谷氨酰胺生产能力的棒状细菌的具体例，可举出以下的微生物。
·黄色短杆菌AJ11573（FERM P－5492；日本特开昭56－161495号公报）
·黄色短杆菌AJ11576（FERM BP－10381；日本特开昭56－161495号公报）
·黄色短杆菌AJ12212（FERM P－8123；日本特开昭61－202694号公报）
作为生产脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、聚谷氨酸的微生物而优选的例子，记载于日本特开2010－41920号公报。另外，作为生产乙酸、（聚）3－羟基丁酸、衣康酸、柠檬酸、丁酸的微生物，记载于发酵手册（共立出版）。
作为制造4－氨基丁酸的微生物，例如，可举出如日本特开2011－167097号公报那样，向谷氨酸生产微生物中导入了谷氨酸脱羧酶的微生物。
作为制造4－羟基丁酸的微生物，例如，可举出如日本特开2009－171960号公报那样，向谷氨酸生产微生物中导入了谷氨酸脱羧酶、氨基转移酶、醛脱氢酶的微生物。
作为制造3－羟基异丁酸的微生物，例如，可举出导入了国际公开第2009/135074号小册子、国际公开第2008/145737号小册子记载的途径的微生物。
作为制造2－羟基异丁酸的微生物，例如，可举出导入了国际公开第2009/135074号小册子、国际公开第2009/156214号小册子记载的途径的微生物。
作为制造3－氨基异丁酸、甲基丙烯酸的微生物，例如，可举出导入了国际公开第2009/135074号小册子记载的途径的微生物。
本发明中的微生物是通过赋予至少苹果酸硫激酶和苹果酰CoA裂解酶两方、而构筑了上述图1的乙酰CoA生产途径的微生物。因此，原本具有苹果酸硫激酶和苹果酰CoA裂解酶的微生物被排除在本发明的乙酰CoA生产微生物之外。
作为原本具有Mtk和mcl的微生物，例如，可举出扭脱甲基杆菌（methylobacterium extorquens）这样的甲烷同化菌。对于这些微生物来说，适于甲烷同化菌的载体系统（vector system）、甲烷同化菌的基因组基因的改变技术不发达，与大肠杆菌、棒状杆菌等工业微生物相比，基因操作困难。另外，这些微生物增殖慢的情况多，不适于有用的代谢产物的生产。
本发明涉及的乙酰CoA、丙酮、异丙醇或谷氨酸的生产方法包括：使用上述乙酰CoA生产微生物，从碳源材料生产作为目标产物的乙酰CoA、丙酮、异丙醇或谷氨酸。即，上述乙酰CoA生产方法包括：使上述乙酰CoA生产微生物与碳源材料接触来进行培养的工序（以下称为培养工序）、和回收通过接触而得到的目标产物（乙酰CoA、丙酮、异丙醇或谷氨酸）的工序（以下称为回收工序）。
通过上述乙酰CoA生产方法，使上述乙酰CoA生产微生物与碳源材料接触来进行培养，因此，可一边利用上述乙酰CoA生产微生物将碳源材料同化、固定二氧化碳，一边高效地生产目标产物。
作为上述碳源材料，只要是含有微生物可同化的碳源的材料即可，没有特别限制，但优选为来自植物的原料。
作为上述来自植物的原料，是指根、茎、干、枝、叶、花、种子等器官、包含它们的植物体、及上述植物器官的分解产物，进而，在从植物体、植物器官、及它们的分解产物得到的碳源中，可在培养微生物时作为碳源利用的物质也包含在来自植物的原料中。
这样的来自植物的原料中包含的碳源中，通常可举出淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖等糖类、及大量含有这些成分的草木质分解产物、纤维素水解物等、及它们的组合，进而，来自植物油的甘油或脂肪酸也可包含在本发明中的碳源中。
作为上述来自植物的原料的例子，可以优选举出谷物等农作物，玉米、米、小麦、大豆、甘蔗、甜菜、棉花等、及它们的组合，作为上述原料的使用形态，为未加工品、榨汁、粉碎物等，没有特别限定。另外，也可以为仅是上述碳源的形态。
就培养工序中的乙酰CoA生产微生物与来自植物的原料的接触而言，通常通过在含有来自植物的原料的培养基中培养乙酰CoA生产微生物来进行。
上述来自植物的原料与乙酰CoA生产微生物的接触密度根据乙酰CoA生产微生物的活性的不同而不同，但作为培养基中的来自植物的原料的浓度，以葡萄糖换算，通常可使初始的糖浓度相对于混合物的总质量为20质量%以下，从乙酰CoA生产微生物的耐糖性的观点考虑，可优选使初始的糖浓度为15质量%以下。其他各成分以通常向微生物的培养基中添加的量添加即可，没有特别限制。
另外，作为培养基中的乙酰CoA生产微生物的含量，根据微生物的种类及活性的不同而不同，但通常使在培养开始时投入的前培养的菌液（OD660nm＝4～8）的量相对于培养液为0.1质量%至30质量%，从培养条件控制的观点考虑，可优选使其为1质量%～10质量%。
作为乙酰CoA生产微生物的培养中使用的培养基，只要是含有碳源、氮源、无机离子、及为了使微生物生产目标产物而需要的无机微量元素、核酸、维生素类等的通常使用的培养基，就没有特别限制。
对上述培养工序中的培养条件没有特别限制，例如，在需氧条件下，可一边将pH和温度适当地控制在pH4～9、优选pH6～8、温度20℃～50℃、优选25℃～42℃的范围内一边进行培养。
向上述混合物中通气体的通气量没有特别限制，当仅使用空气作为气体时，通常为0.02vvm～2.0vvm（vvm：通气容量〔mL〕/液容量〔mL〕/时间〔分钟〕）、50～600rpm，从抑制对大肠杆菌的物理损伤的观点考虑，优选在0.1vvm～2.0vvm下进行，更优选为0.1vvm～1.0vvm。
可使培养工序从培养开始持续至混合物中的碳原材料被消耗、或至乙酰CoA生产微生物的活性消失。培养工序的期间根据混合物中的乙酰CoA生产微生物的数目及活性、以及碳源材料的量的不同而不同，但通常为1小时以上、优选为4小时以上即可。另一方面，通过进行碳源材料或乙酰CoA生产微生物的再投入，可使培养期间无限制地持续，但从处理效率的观点考虑，通常为5天以下，优选为72小时以下。其他条件直接适用通常的培养中使用的条件即可。
作为回收培养液中蓄积的目标产物的方法，没有特别限制，例如可采用如下方法：在通过离心分离等从培养液中除去菌体后，在根据目标产物的种类而确定的条件下，用蒸馏或膜分离等通常的分离方法将目标产物分离。
需要说明的是，本发明涉及的乙酰CoA生产方法中，在上述培养工序之前，也可包括前培养工序，所述前培养工序用于使使用的乙酰CoA生产微生物为适当的菌数或/及适度的活性状态。前培养工序只要是在根据乙酰CoA生产微生物的种类而确定的通常使用的培养条件下所进行的培养即可。
作为上述丙酮生产方法中使用的乙酰CoA生产微生物，从丙酮的生产效率的观点考虑，优选具有前述的硫解酶活性、CoA转移酶活性及乙酰乙酸脱羧酶活性的乙酰CoA生产微生物作为乙酰CoA生产微生物优选的一个方案。
作为上述异丙醇生产方法中使用的乙酰CoA生产微生物，从异丙醇的生产效率的观点考虑，优选具有前述的硫解酶活性、CoA转移酶活性、乙酰乙酸脱羧酶活性及异丙醇脱氢酶活性的乙酰CoA生产微生物作为乙酰CoA生产微生物的优选的一个方案。
需要说明的是，在上述异丙醇生产方法或丙酮生产方法的情况下，优选包括：一边向含有上述乙酰CoA生产微生物及碳源材料的混合物中供给气体、一边培养该乙酰CoA生产微生物的培养工序；和从混合物中分离并回收通过上述培养而生成的异丙醇或丙酮的目标产物回收工序。
通过该异丙醇生产方法或丙酮生产方法，一边向混合物中供给气体一边培养乙酰CoA生产微生物（通气培养）。通过该通气培养，生产出的异丙醇或丙酮被释放到混合物中，并且从混合物中蒸发，其结果，可容易地从混合物中分离生成的异丙醇或丙酮。另外，由于生成的异丙醇或丙酮连续地从混合物中分离，所以可抑制混合物中的异丙醇或丙酮的浓度上升。由此，不需要特别考虑上述乙酰CoA生产微生物相对于异丙醇或丙酮的耐性。
需要说明的是，本方法中的混合物，只要是以通常用于作为宿主的微生物的培养的基本培养基为主体即可。关于培养条件可直接适用上述事项。
在上述目标产物回收工序中，回收在培养工序中生成的、从混合物中分离出的异丙醇或丙酮。作为该回收方法，只要可以收集通过通常培养从混合物中蒸发出的气体状或飞沫状的异丙醇或丙酮即可。作为这样的方法，可以举出收纳到通常使用的密闭容器等收集构件中等，其中，从可以只将异丙醇或丙酮高纯度地回收的观点考虑，优选为包括将用于捕集异丙醇或丙酮的捕集液与从混合物中分离出的异丙醇或丙酮接触的步骤的方法。
本异丙醇生产方法或丙酮生产方法中，可以以将异丙醇或丙酮溶解在捕集液或混合物中的方式进行回收。作为这样的回收方法，可举出例如国际公开2009/008377号小册子中记载的方法等。回收的异丙醇或丙酮可使用HPLC等通常的检测手段进行确认。可根据需要对回收的异丙醇进行进一步精制。作为这样的精制方法，可举出蒸馏等。
当回收的异丙醇或丙酮为水溶液的状态时，本异丙醇生产方法或丙酮生产方法除了包括回收工序之外还可进一步包括脱水工序。异丙醇或丙酮的脱水可通过常规方法进行。
作为能够适用于能以溶解在捕集液或混合物中的方式回收的异丙醇或丙酮的生产方法的装置，例如，可举出国际公开2009/008377号小册子的图1所示的生产装置。
在该生产装置中，在容纳有含有使用的微生物和来自植物的原料的培养基的培养槽上，连接有用于从装置外部注入气体的注入管，能够向培养基通气。
另外，在培养槽上通过连接管连接有捕获槽，所述捕获槽容纳有作为捕集液的捕获液。此时，移动至捕获槽的气体或液体与捕获液接触而发生起泡。
由此，在培养槽中通过通气培养而生成的异丙醇或丙酮由于通气而蒸发，容易从培养基中分离，并且在捕获槽中被捕获液捕集。其结果，能够以进一步被精制的形态连续且简便地生产异丙醇或丙酮。
本发明涉及的谷氨酸生产方法包括：使用上述乙酰CoA生产微生物，从碳源材料生产作为目标产物的谷氨酸。即，上述谷氨酸生产方法包括：使上述乙酰CoA生产微生物与碳源材料接触来进行培养的工序（以下称为培养工序）、和回收通过接触而得到的目标产物（谷氨酸）的工序（以下称为回收工序）。
通过上述谷氨酸生产方法，使上述乙酰CoA生产微生物与碳源材料接触来进行培养，因此，可一边利用上述乙酰CoA生产微生物将碳源材料同化、固定二氧化碳，一边高效地生产目标产物。
培养中使用的培养基，可使用含有碳源、氮源、无机盐类、其他根据需要的氨基酸、维生素等有机微量营养素的通常的培养基。合成培养基或天然培养基均可使用。培养基中使用的碳源及氮源只要是培养的菌株可利用的碳源及氮源即可，可以使用任意种类。
作为碳源材料，可使用葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物、糖蜜等糖类，此外，乙酸、柠檬酸等有机酸、乙醇等醇类也可单独使用或与其他碳源并用。
作为氮源，可使用氨、硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、乙酸铵等铵盐或硝酸盐等。
作为有机微量营养素，可使用氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸、以及含有这些物质的胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白分解物等，在使用生长繁殖中要求氨基酸等的营养突变体（auxotrophic mutant，日语：栄養要求性変異株）的情况下，优选补充添加所要求的营养素。
作为无机盐类，可使用磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等。
对于培养，优选控制为发酵温度20～45℃、pH3～9的条件、进行通气培养。需要说明的是，pH调节可使用无机或有机的酸性或碱性物质、以及氨气等。通过在上述条件下进行优选10小时～120小时左右的培养，而在培养液中或菌体内蓄积L－氨基酸。
另外，目标L－氨基酸为L－谷氨酸时，也可使用已调节为使L－谷氨酸析出那样的条件的液体培养基进行培养，使得一边在培养基中析出L－谷氨酸，一边生成、蓄积L－谷氨酸。作为使L－谷氨酸析出的条件，可举出例如pH5.0～4.0、优选pH4.5～4.0、进一步优选pH4.3～4.0、特别优选pH4.0。需要说明的是，为了同时实现酸性条件下的生长繁殖得到提高、及有效率地析出L－谷氨酸，期望pH优选为5.0～4.0、更优选为4.5～4.0、进一步优选为4.3～4.0。需要说明的是，上述pH下的培养可以是培养的整个期间，也可以是一部分期间。
对于从培养结束后的培养液中采集L－氨基酸的方法，通过公知的回收方法进行即可。例如，可以在从培养液中除去菌体后通过进行浓缩结晶的方法或离子交换色谱法等进行采集。在使L－谷氨酸在培养基中析出那样的条件下进行培养时，在培养液中析出的L－谷氨酸可通过离心分离或过滤等进行采集。此时，也可以在使溶解在培养基中的L－谷氨酸结晶后，一并进行分离。
作为生产脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、乙酸、（聚）3－羟基丁酸、衣康酸、柠檬酸、丁酸、聚谷氨酸的方法，例如，可举出发酵手册（共立出版）中记载的方法。
作为制造4－氨基丁酸的方法，例如，可举出如日本特开2011－167097那样、利用向谷氨酸生产微生物中导入了谷氨酸脱羧酶而得到的微生物而进行的生产方法。
作为制造4－羟基丁酸的微生物，例如，可举出如日本特开2009－171960号公报那样、利用向谷氨酸生产微生物中导入谷氨酸脱羧酶、氨基转移酶、醛脱氢酶而得到的微生物而进行的生产方法。
作为制造3－羟基异丁酸的方法，例如，可举出导入了国际公开第2009/135074号小册子、国际公开第2008/145737号小册子中记载的途径的微生物。
作为制造2－羟基异丁酸的方法，例如，可举出导入了国际公开第2009/135074号小册子、国际公开第2009/156214号小册子中记载的途径的微生物。
作为制造3－氨基异丁酸、甲基丙烯酸的方法，例如，可举出导入了国际公开第2009/135074号小册子中记载的途径的微生物。
[实施例]
以下，通过实施例来详细地说明本发明。然而，本发明不受它们的任何限制。
[实施例1]
＜大肠杆菌B株atoD基因组强化株的制作＞
大肠杆菌MG1655株的基因组DNA的全碱基序列是公知的（GenBank登录号U00096），也报道了编码大肠杆菌MG1655株的CoA转移酶α亚基的基因（以下有时简称为atoD）的碱基序列。即atoD记载于GenBank登录号U00096所记载的大肠杆菌MG1655株基因组序列的2321469～2322131。
作为为了使上述的基因表达而需要的启动子的碱基序列，可使用记载于GenBank登录号X02662的碱基序列信息中397－440的来自大肠杆菌的甘油醛3－磷酸脱氢酶（以下有时称为GAPDH）的启动子序列。为了获得GAPDH启动子，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板，使用CGCTCAATTGCAATGATTGACACGATTCCG（序列号1）、及ACAGAATTCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG（序列号2）的引物，利用PCR法进行扩增，用限制性酶MfeI及EcoRI消化得到的DNA片段，从而得到约100bp的编码GAPDH启动子的DNA片段。将得到的DNA片段与用限制性酶EcoRI消化质粒pUC19（GenBank登录号X02514）进而用碱性磷酸酶处理而得到的物质混合，用连接酶连接，然后转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞（competent cell）（东洋纺织株式会社DNA－903），得到了在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。对于得到的菌落中的10个，分别在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，回收质粒，选出在用限制性酶EcoRI及KpnI消化时GAPDH启动子未被切除的质粒，进而确认DNA序列，将GAPDH启动子被正确地插入的质粒作为pUCgapP。用限制性酶EcoRI及KpnI消化得到的pUCgapP。
进而，为了获得atoD，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板，使用CGAATTCGCTGGTGGAACATATGAAAACAAAATTGATGACATTACAAGAC（序列号3）、及GCGGTACCTTATTTGCTCTCCTGTGAAACG（序列号4）的引物，利用PCR法进行扩增，用限制性酶EcoRI及KpnI消化得到的DNA片段，从而得到约690bp的atoD片段。将该DNA片段与之前用限制性酶EcoRI及KpnI消化过的pUCgapP混合，用连接酶连接，然后转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞（东洋纺织株式会社DNA－903），得到了在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。从得到的菌体中回收质粒，确认atoD被正确插入，将该质粒命名为pGAPatoD。
需要说明的是，大肠杆菌MG1655株可从美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection）获得。
如上所述，也报道了大肠杆菌MG1655株的基因组DNA中的atoD的碱基序列。使用基于大肠杆菌MG1655株的atoD的5’附近区域的基因信息而制成的、GCTCTAGATGCTGAAATCCACTAGTCTTGTC（序列号5）和TACTGCAGCGTTCCAGCACCTTATCAACC（序列号6）的引物，将大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板进行PCR，由此扩增了约1.1kbp的DNA片段。
另外，使用基于大肠杆菌MG1655株的GAPDH启动子的序列信息而制成的GGTCTAGAGCAATGATTGACACGATTCCG（序列号7）和基于大肠杆菌MG1655株的atoD的序列信息而制成的序列号4的引物，将之前制成的表达载体pGAPatoD作为模板进行PCR，得到了包括GAPDH启动子和atoD的约790bp的DNA片段。
将如上所述得到的片段分别用限制性酶PstI和XbaI、XbaI和KpnI消化，将该片段与用PstI和KpnI消化温度敏感性质粒pTH18cs1（GenBank登录号AB019610）〔Hashimoto－Gotoh，T.，Gene，241，185－191（2000）〕而得到的片段混合，用连接酶连接，然后转化至DH5α株，得到了在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中在30℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒。将该质粒转化至大肠杆菌B株（ATCC11303），在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种于含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。将得到的培养菌体涂布于含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上，在42℃下培养而得到菌落。将得到的菌落在不含抗生素的LB液体培养基中在30℃下进行2小时培养，涂布于不含抗生素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。
从出现的菌落中随机选出100个菌落，分别使它们在不含抗生素的LB琼脂板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖，选出氯霉素敏感性的克隆。进而，通过PCR从上述克隆的染色体DNA扩增含有GAPDH启动子和atoD的约790bp片段，选择atoD启动子区域被GAPDH启动子取代的株，将满足以上条件的克隆命名为大肠杆菌B株atoD基因组强化株（以下有时简称为B：：atoDAB株）。
需要说明的是，大肠杆菌B株（ATCC11303）可由作为细胞·微生物·基因库的美国典型培养物保藏中心获得。
[实施例2]
＜大肠杆菌B株atoD基因组强化、pgi基因缺失株的制作＞
大肠杆菌MG1655的基因组DNA的全碱基序列是公知的（GenBank登录号U00096），也报道了编码大肠杆菌的磷酸葡萄糖异构酶（以下有时称为pgi）的基因的碱基序列（GenBank登录号X15196）。为了克隆编码pgi的基因（1，650bp）的碱基序列附近区域，合成CAGGAATTCGCTATATCTGGCTCTGCACG（序列号8）、CAGTCTAGAGCAATACTCTTCTGATTTTGAG（序列号9）、CAGTCTAGATCATCGTCGATATGTAGGCC（序列号10）及GACCTGCAGATCATCCGTCAGCTGTACGC（序列号11）所示的四种寡核苷酸引物。分别地，序列号8的引物在5’末端侧具有EcoRI识别位点，序列号9及10的引物在5’末端侧具有XbaI识别位点，序列号11的引物在5’末端侧具有PstI识别位点。
制备大肠杆菌MG1655株（ATCC700926）的基因组DNA，将得到的基因组DNA作为模板，使用序列号8和序列号9的引物对进行PCR，由此扩增了约1.0kb的DNA片段（以下有时称为pgi－L片段）。另外，使用序列号10和序列号11的引物对进行PCR，由此扩增了约1.0kb的DNA片段（以下有时称为pgi－R片段）。用琼脂糖电泳分离、回收上述DNA片段，分别地，用EcoRI及XbaI消化pgi－L片段，用XbaI及PstI消化pgi－R片段。将该两种消化片段、与温度敏感性质粒pTH18cs1（GenBank登录号AB019610）的EcoRI及PstI消化物混合，用T4DNA连接酶进行反应后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞（东洋纺织公司制），得到了在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下生长繁殖的转化体。从得到的转化体中回收质粒，确认了编码pgi的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的两个片段被正确插入至pTH18cs1。用XbaI消化得到的质粒后，利用T4DNA聚合酶进行平滑末端化处理。使用T4DNA连接酶连接本DNA片段、与对用EcoRI消化pUC4K质粒（GenBank登录号X06404）（Pharmacia）从而得到的卡那霉素耐性基因进一步利用T4DNA聚合酶进行了平滑末端化处理的DNA片段。然后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到了在含有10μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上在30℃下生长繁殖的转化体。从得到的转化体中回收质粒，确认了卡那霉素耐性基因被正确插入于编码pgi的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段之间，将其作为pTH18cs1－pgi。
需要说明的是，大肠杆菌MG1655株可由美国典型培养物保藏中心获得。
将制成的pTH18cs1－pgi转化至实施例1中制成的B：：atoDAB，在含有10μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上在30℃下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种于含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。接着，将一部分该培养液涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。将得到的菌落在含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中在30℃下培养24小时，进而涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。
从出现的菌落中随机选出100个菌落，分别使它们在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂板、和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖，选出仅在含有卡那霉素的LB琼脂板上生长繁殖的氯霉素敏感性的克隆。进而，利用PCR由上述目标克隆的染色体DNA进行扩增，选出由于pgi基因被取代为卡那霉素耐性基因而可得到约3.3kbp片段的扩增的株，将得到的株命名为大肠杆菌B株atoD基因组强化、pgi基因缺失株（以下有时简称为B：：atoDAB△pgi株）。
需要说明的是，大肠杆菌MG1655株及大肠杆菌B株可由美国典型培养物保藏中心获得。
[实施例3]
＜大肠杆菌B株atoD基因组强化、pgi基因缺失、gntR基因缺失株的制作＞
大肠杆菌B株的基因组DNA的全碱基序列是公知的（GenBank登录号（accession No.）CP000819），编码GntR的碱基序列记载于GenBank登录号CP000819所记载的大肠杆菌B株基因组序列的3509184～3510179。为了克隆编码GntR的碱基序列（gntR）的附近区域，合成GGAATTCGGGTCAATTTTCACCCTCTATC（序列号12）、GTGGGCCGTCCTGAAGGTACAAAAGAGATAGATTCTC（序列号13）、CTCTTTTGTACCTTCAGGACGGCCCACAAATTTGAAG（序列号14）、GGAATTCCCAGCCCCGCAAGGCCGATGGC（序列号15）所示的四种寡核苷酸引物。序列号12及13的引物分别在5’末端侧具有EcoRI识别位点。
制备大肠杆菌B株的基因组DNA（GenBank登录号CP000819），将得到的基因组DNA作为模板，使用序列号12和序列号13的引物对进行PCR，由此扩增了约1.0kb的DNA片段（以下有时称为gntR－L片段）。另外，使用序列号14和序列号15的引物对进行PCR，由此扩增了约1.0kb的DNA片段（以下有时称为gntR－R片段）。用琼脂糖电泳分离、回收上述DNA片段，将gntR－L和gntR－R片段作为模板、使用序列号12和序列号15的引物对进行PCR，由此扩增了约2.0kb的DNA片段（以下有时称为gntR－LR片段）。用琼脂糖电泳分离、回收该gntR－LR片段，用EcoRI消化，将其与温度敏感性质粒pTH18cs1（GenBank登录号AB019610）的EcoRI消化物混合，用T4DNA连接酶进行反应后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞（东洋纺织公司制），得到了在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下生长繁殖的转化体。从得到的转化体中回收质粒，确认了gntLR片段被正确地插入至pTH18cs1，将该质粒作为pTH18cs1－gntR。
将如上所述得到的质粒pTH18cs1－gntR转化至实施例2中制成的大肠杆菌B：：atoDAB△pgi株，在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种于含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。接着，将一部分该培养液涂布于含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。将得到的菌落在LB液体培养基中在30℃下培养24小时，进而涂布于LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。
从出现的菌落中随机选出100个菌落，分别使它们在LB琼脂板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖，选出氯霉素敏感性的克隆。进而，利用PCR由上述目标克隆的染色体DNA进行扩增，选出由于gntR基因缺失可得到约2.0kbp片段的扩增的株，将得到的株命名为B株atoD基因组强化、pgi基因缺失、gntR基因缺失株（以下有时简称为B：：atoDAB△pgi△gntR株）。
[实施例4]
＜大肠杆菌B株atoD基因组强化、pgi基因缺失、gntR基因缺失、gnd基因缺失株的制作＞
为了克隆编码磷酸葡糖酸脱氢酶的基因（gnd）的碱基序列附近区域，合成了CGCCATATGAATGGCGCGGCGGGGCCGGTGG（序列号16）、TGGAGCTCTGTTTACTCCTGTCAGGGGG（序列号17）、TGGAGCTCTCTGATTTAATCAACAATAAAATTG（序列号18）、CGGGATCCACCACCATAACCAAACGACGG（序列号19）所示的四种寡核苷酸引物。序列号16的引物在5’末端侧具有NdeI识别位点，序列号17及序列号18的引物在5’末端侧具有SacI识别位点。另外，序列号19的引物在5’末端侧具有BamHI识别位点。
制备大肠杆菌B株的基因组DNA（GenBank登录号CP000819），使用序列号16和序列号17的引物对进行PCR，由此扩增了约1.0kb的DNA片段（以下有时称为gnd－L片段）。另外，使用序列号18和序列号19的引物对进行PCR，由此扩增了约1.0kb的DNA片段（以下有时称为gnd－R片段）。用琼脂糖电泳分离、回收上述DNA片段，用NdeI及SacI消化gnd－L片段，用SacI及BamHI消化gnd－R片段。将该两种消化片段、与温度敏感性质粒pTH18cs1（GenBank登录号AB019610）的NdeI及BamHI消化物混合，用T4DNA连接酶进行反应后，转化至s感受态细胞（东洋纺织公司制），得到了在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下生长繁殖的转化体。从得到的转化体中回收质粒，确认了编码gnd的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的两种片段被正确地插入至pTH18cs1，将其作为pTH18cs1－gnd。
将如上所述得到的质粒pTH18cs1－gnd转化至实施例3中制成的大肠杆菌B：：atoDAB△pgi△gntR株，在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种于含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。接着，将一部分该培养液涂布于含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。将得到的菌落在LB液体培养基中在30℃下培养24小时，进而涂布于LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。
从出现的菌落中随机选出100个菌落，分别使它们在LB琼脂板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖，选出氯霉素敏感性的克隆。进而，利用PCR由上述目标克隆的染色体DNA进行扩增，选出由于gnd基因缺失而可得到约2.0kbp片段的扩增的株，将得到的株命名为大肠杆菌B株atoD基因组强化、pgi基因缺失、gntR基因缺失、gnd基因缺失株、B：：atoDAB△pgi△gntR△gnd株。
[实施例5]
＜大肠杆菌B株atoD基因组强化、pgi基因缺失、gntR基因缺失、gnd基因缺失、ldhA基因缺失株的制作＞
为了克隆编码D－乳酸脱氢酶（以下有时简称为ldhA）的基因（990bp）的碱基序列附近区域，合成了GGAATTCGACCATCGCTTACGGTCAATTG（序列号20）、GAGCGGCAAGAAAGACTTTCTCCAGTGATGTTG（序列号21）、GGAGAAAGTCTTTCTTGCCGCTCCCCTGCAAC（序列号22）、GGAATTCTTTAGCAAATGGCTTTCTTC（序列号23）所示的四种寡核苷酸引物。序列号20及23的引物分别在5’末端侧具有EcoRI识别位点。
制备大肠杆菌B株的基因组DNA（登录号CP000819），将得到的基因组DNA作为模板，使用序列号20和序列号21的引物对进行PCR，由此扩增了约1.0kb的DNA片段（以下有时称为ldhA－L片段）。另外，使用序列号22和序列号23的引物对进行PCR，由此扩增了约1.0kb的DNA片段（以下有时称为ldhA－R片段）。用琼脂糖电泳分离、回收上述DNA片段，将ldhA－L和ldhA－R片段作为模板、使用序列号20和序列号23的引物对进行PCR，由此扩增了约2.0kb的DNA片段（以下有时称为ldhA－LR片段）。用琼脂糖电泳分离、回收该ldhA－LR片段，用EcoRI消化，将其与温度敏感性质粒pTH18cs1（GenBank登录号AB019610）的EcoRI消化物混合，用T4DNA连接酶进行反应后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞（东洋纺织公司制），得到了在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下生长繁殖的转化体。从得到的转化体中回收质粒，确认了ldhA－LR片段被正确地插入至pTH18cs1，将该质粒作为pTH18cs1－ldhA。
将如上所述得到的质粒pTH18cs1－ldhA转化至实施例4中制成的大肠杆菌B株B：：atoDAB△pgi△gntR△gnd，在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种于含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。接着，将一部分该培养液涂布于含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。将得到的菌落在LB液体培养基中在30℃下培养24小时，进而涂布于LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。
从出现的菌落中随机选出100个菌落，分别使它们在LB琼脂板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖，选出氯霉素敏感性的克隆。进而，利用PCR由上述目标克隆的染色体DNA进行扩增，选出由于ldhA基因缺失而可得到约2.0kbp片段的扩增的株，将得到的株命名为atoD基因组强化、pgi基因缺失、gntR基因缺失、gnd基因缺失、ldhA基因缺失株（以下有时简称为B：：atoDAB△pgi△gntR△gnd△ldhA）株）。
[实施例6]
＜atoD基因组强化、pgi基因缺失、gntR基因缺失、gnd基因缺失、ldhA基因缺失、aceBA基因缺失株的制作＞
为了克隆编码异柠檬酸裂解酶及苹果酸合酶（以下有时简称为aceBA）的基因（2936bp）的碱基序列附近区域，合成了GGAATTCATTCAGCTGTTGCGCATCGATTC（序列号24）、CGGTTGTTGTTGCCGTGCAGCTCCTCGTCATGGATC（序列号25）、GGAGCTGCACGGCAACAACAACCGTTGCTGACTG（序列号26）、GGAATTCCAGGCAGGTATCAATAAATAAC（序列号27）所示的四种寡核苷酸引物。序列号24及27的引物分别在5’末端侧具有EcoRI识别位点。
制备大肠杆菌B株的基因组DNA（登录号CP000819），将得到的基因组DNA作为模板，使用序列号24和序列号25的引物对进行PCR，由此扩增了约1.0kb的DNA片段（以下有时称为aceBA－L片段）。另外，使用序列号26和序列号27的引物对进行PCR，由此扩增了约1.0kb的DNA片段（以下有时称为aceBA－R片段）。用琼脂糖电泳分离、回收上述DNA片段，将aceBA－L和aceBA－R片段作为模板、使用序列号24和序列号27的引物对进行PCR，由此扩增了约2.0kb的DNA片段（以下有时称为aceBA－LR片段）。用琼脂糖电泳分离、回收该aceBA－LR片段，用EcoRI消化，将其与温度敏感性质粒pTH18cs1（GenBank登录号AB019610）的EcoRI消化物混合，用T4DNA连接酶进行反应后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞（东洋纺织公司制），得到了在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下生长繁殖的转化体。从得到的转化体中回收质粒，确认了aceBA－LR片段被正确地插入至pTH18cs1，将该质粒作为pTH18cs1－aceBA。
将如上所述得到的质粒pTH18cs1－aceBA转化至实施例5中制成的大肠杆菌B株B：：atoDAB△pgi△gntR△gnd△ldhA，在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种于含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。接着，将一部分该培养液涂布于含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。将得到的菌落在LB液体培养基中在30℃下培养24小时，进而涂布于LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。
从出现的菌落中随机选出100个菌落，分别使它们在LB琼脂板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖，选出氯霉素敏感性的克隆。进而，利用PCR由上述目标克隆的染色体DNA进行扩增，选出由于aceBA基因缺失而可得到约2.0kbp片段的扩增的株，将得到的株命名为B株atoD基因组强化、pgi基因缺失、gntR基因缺失、gnd基因缺失、ldhA基因缺失、aceBA基因缺失株（以下有时简称为B：：atoDAB△pgi△gntR△gnd△ldhA△aceBA）株）。
[实施例7]
＜atoD基因组强化、pgi基因缺失、gntR基因缺失、gnd基因缺失、ldhA基因缺失、aceBA基因缺失、glcB基因缺失株的制作＞
为了克隆编码苹果酸合酶G（以下有时简称为glcB）的基因（723bp）的碱基序列附近区域，合成了GGAATTCCAGGAGAAAGGGCTGGCACGGG（序列号28）、CTTTTTTGACGCTATGTTTATCTCCTCGTTTTCGC（序列号29）、GAGATAAACATAGCGTCAAAAAAGCCCCGGC（序列号30）、GGAATTCCGTCCATCATTGCTACCAGCC（序列号31）所示的四种寡核苷酸引物。序列号28及31的引物分别在5’末端侧具有EcoRI识别位点。
制备大肠杆菌B株的基因组DNA（登录号CP000819），将得到的基因组DNA作为模板，使用序列号28和序列号29的引物对进行PCR，由此扩增了约1.0kb的DNA片段（以下有时称为glcB－L片段）。另外，使用序列号30和序列号31的引物对进行PCR，由此扩增了约1.0kb的DNA片段（以下有时称为glcB－R片段）。用琼脂糖电泳分离、回收上述DNA片段，将glcB－L和glcB－R片段作为模板、使用序列号28和序列号31的引物对进行PCR，由此扩增了约2.0kb的DNA片段（以下有时称为glcB－LR片段）。用琼脂糖电泳分离、回收该glcB－LR片段，用EcoRI消化，将其与温度敏感性质粒pTH18cs1（GenBank登录号AB019610）的EcoRI消化物混合，用T4DNA连接酶进行反应后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞（东洋纺织公司制），得到了在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下生长繁殖的转化体。从得到的转化体中回收质粒，确认了glcB－LR片段被正确地插入至pTH18cs1，将该质粒作为pTH18cs1－glcB。
将如上所述得到的质粒pTH18cs1－gclB转化至实施例6中制成的大肠杆菌B株B：：atoDAB△pgi△gntR△gnd△ldhA△aceBA株，在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种于含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。接着，将一部分该培养液涂布于含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。将得到的菌落在LB液体培养基中在30℃下培养24小时，进而涂布于LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。
从出现的菌落中随机选出100个菌落，分别使它们在LB琼脂板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖，选出氯霉素敏感性的克隆。进而，利用PCR由上述目标克隆的染色体DNA进行扩增，选出由于aceBA基因缺失而可得到约2.0kbp片段的扩增的株，将得到的株命名为B株atoD基因组强化、pgi基因缺失、gntR基因缺失、gnd基因缺失、ldhA基因缺失、aceBA基因缺失、glcB基因缺失株（以下有时简称为B：：atoDAB△pgi△gntR△gnd△ldhA△aceBA△glcB）株）。
[实施例8]
＜atoD基因组强化、pgi基因缺失、gntR基因缺失、gnd基因缺失、ldhA基因缺失、aceBA基因缺失、glcB基因缺失、fumAC基因缺失株的制作＞
为了克隆编码富马酸水合酶A及富马酸水合酶C（以下有时简称为fumAC）的基因（3193bp）的碱基序列附近区域，合成了CGCCATATGATCGCCAGCGCGCGGGATTTTTC（序列号32）、CGAGCTCTGTTCTCTCACTTACTGCCTGG（序列号33）、ATGAGCTCTCTGCAACATACAGGTGCAG（序列号34）、CGGGATCCACTACGCGCACGATGGTCAAG（序列号35）所示的四种寡核苷酸引物。序列号32的引物在5’末端侧具有NdeI识别位点。序列号33及34的引物分别在5’末端侧具有SacI识别位点。序列号35的引物在5’末端侧具有BamHI识别位点。
制备大肠杆菌B株的基因组DNA（登录号CP000819），将得到的基因组DNA作为模板，使用序列号32和序列号33的引物对进行PCR，由此扩增了约1.0kb的DNA片段（以下有时称为fumA－L片段）。另外，使用序列号34和序列号35的引物对进行PCR，由此扩增了约1.0kb的DNA片段（以下有时称为fumC－R片段）。用琼脂糖电泳分离、回收上述DNA片段，用NdeI，SacI处理fumA－L片段，用SacI，BamHI处理fumC－R片段。将这些片段与温度敏感性质粒pTH18cs1（GenBank登录号AB019610）的NdeI，BamHI消化物混合，用T4DNA连接酶进行反应后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞（东洋纺织公司制），得到了在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下生长繁殖的转化体。从得到的转化体中回收质粒，确认了fumA、fumC片段被正确地插入至pTH18cs1，将该质粒作为pTH18cs1－fumAC。
将如上所述得到的质粒pTH18cs1－fumAC转化至实施例7中制成的大肠杆菌B株B：：atoDAB△pgi△gntR△gnd△ldhA△aceBA△glcB株，在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种于含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。接着，将一部分该培养液涂布于含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。将得到的菌落在LB液体培养基中在30℃下培养24小时，进而涂布于LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。
从出现的菌落中随机选出100个菌落，分别使它们在LB琼脂板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖，选出氯霉素敏感性的克隆。进而，利用PCR由上述目标克隆的染色体DNA进行扩增，选出由于fumAC基因缺失而可得到约2.0kbp片段的扩增的株，将得到的株命名为B株atoD基因组强化、pgi基因缺失、gntR基因缺失、gnd基因缺失、ldhA基因缺失、aceBA基因缺失、glcB基因缺失、fumAC基因缺失株（以下有时简称为B：：atoDAB△pgi△gntR△gnd△ldhA△aceBA△glcB△fumAC）株）。
[实施例9]
＜质粒pIaz的制作＞
梭状芽孢杆菌属细菌的乙酰乙酸脱羧酶记载于GenBank登录号M55392，异丙醇脱氢酶记载于GenBank登录号AF157307。
作为为了使上述的基因群表达而需要的启动子的碱基序列，可使用记载于GenBank登录号X02662的碱基序列信息中397－440的来自大肠杆菌的甘油醛3－磷酸脱氢酶（以下有时称为GAPDH）的启动子序列。
为了获得GAPDH启动子，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板，由CGAGCTACATATGCAATGATTGACACGATTCCG（序列号36）、及CGCGCGCATGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG（序列号37），利用PCR法进行扩增，用限制性酶NdeI、SphI消化得到的DNA片段，从而得到约110bp的相当于GAPDH启动子的DNA片段。将得到的DNA片段与通过用限制性酶NdeI及SphI消化质粒pBR322（GenBank登录号J01749）而得到的片段混合，用连接酶连接，然后转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞（东洋纺织株式会社DNA－903），得到了在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒pBRgapP。
为了获得异丙醇脱氢酶基因，使用拜氏梭菌NRRL B－593的基因组DNA作为模板，由AATATGCATGCTGGTGGAACATATGAAAGGTTTTGCAATGCTAGG（序列号38）、及ACGCGTCGAC TTATAATATAACTACTGCTTTAATTAAGTC（序列号39），利用PCR法进行扩增，用限制性酶SphI、SalI消化得到的DNA片段，从而得到约1.1kbp的异丙醇脱氢酶片段。将得到的DNA片段与通过用限制性酶SphI及SalI消化质粒pUC119而得到的片段混合，用连接酶连接，然后转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞，得到了在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒，确认IPAdh被正确插入，将该质粒命名为pUC－I。
将通过用限制性酶SphI及EcoRI消化质粒pUC－I而得到的含有IPAdh的片段、与通过用限制性酶SphI及EcoRI消化质粒pBRgapP而得到的片段混合，用连接酶连接，然后转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞，得到了在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒，确认IPAdh被正确插入，将该质粒命名为pGAP－I。
为了获得乙酰乙酸脱羧酶基因，使用丙酮丁醇梭菌ATCC824的基因组DNA作为模板，由ACGCGTCGACGCTGGTGGAACATATGTTAAAGGATGAAGTAATTAAACAAATTAGC（序列号40）、及GCTCTAGAGGTACCTTACTTAAGATAATCATATATAACTTCAGC（序列号41），利用PCR法进行扩增，通过用限制性酶SalI、XbaI消化得到的DNA片段从而得到约700bp的乙酰乙酸脱羧酶片段。将得到的DNA片段与通过用限制性酶SalI及XbaI消化之前制成的质粒pGAP－I而得到的片段混合，用连接酶连接，然后转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞，得到了在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒，确认adc被正确插入，将该质粒命名为pIa。
为了获得葡萄糖6磷酸－1－脱氢酶基因（zwf），使用大肠杆菌B株的基因组DNA（GenBank登录号CP000819）作为模板，使用GCTCTAGACGGAGAAAGTCTTATGGCGGTAACGCAAACAGCCCAGG（序列号42）、及CGGGATCCCGGAGAAAGTCTTATGAAGCAAACAGTTTATATCGCC（序列号43），利用PCR法进行扩增，用限制性酶BamHI、XbaI消化得到的DNA片段从而得到约1500bp的葡萄糖6磷酸1－脱氢酶片段。将得到的DNA片段与通过用限制性酶XbaI及BamHI消化之前制成的质粒pIa而得到的片段混合，用连接酶连接，然后转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞，得到了在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，将得到的质粒作为pIaz。
[实施例10]
＜质粒pMWGKC的制作＞
使用pBRgapP作为模板，由CCGCTCGAGCATATGCTGTCGCAATGATTGACACG（序列号44）、及GCTATTCCATATGCAGGGTTATTGTCTCATGAGC（序列号45），利用PCR法进行扩增，通过用T4多核苷酸激酶（Polynucleotide Kinase）（Takara）将得到的DNA片段磷酸化，得到了含有GAPDH启动子的DNA片段。另外，用限制性酶AatII及NdeI处理质粒pMW119（GenBank登录号AB005476），用KOD plus DNA聚合酶（Takara）将得到的DNA片段末端平滑化，从而得到包含pMW119的复制起点的DNA片段。将含有GAPDH启动子的DNA片段与含有pMW119的复制起点的DNA片段混合，用连接酶连接，然后转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞，得到了在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒pMWG。
为了获得氯霉素耐性基因，使用pTH18cs1（GenBank登录号AB019610）作为模板，由TCGGCACGTAAGAGGTTCC（序列号46）及CGGGTCGAATTTGCTTTCG（序列号47），利用PCR法进行扩增，通过用T4多核苷酸激酶（Takara）将得到的DNA片段磷酸化，得到了含有氯霉素耐性基因的DNA片段。然后，使用pMWG作为模板，由CTAGATCTGACAGTAAGACGGGTAAGCC（序列号48）、及CTAGATCTCAGGGTTATTGTCTCATGAGC（序列号49），利用PCR法进行扩增，与含有氯霉素耐性基因的DNA片段混合，用连接酶连接，然后转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞，得到了在含有25μg/mL氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有25μg/mL氯霉素的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，将得到的质粒作为pMWGC。
使用pMWGC基因作为模板，由CCGCTCGAGCATATGCTGTCGCAATGATTGACACG（序列号50）、及GCTATTCCATATGCAGGGTTATTGTCTCATGAGC（序列号51），利用PCR法进行扩增，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞，得到了在含有25μg/mL氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有25μg/mL氯霉素的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒pMWGKC。
[实施例11]
＜来自扭脱甲基杆菌IAM12632的苹果酸硫激酶表达质粒的构筑＞
从东京大学分子细胞生物学研究所IAM培养物保藏中心（Culture Collection）购入扭脱甲基杆菌（Methylobacterium extorquens）IAM12632。用NBRC的培养基编号352培养IAM12632，使用DNeasy Blood＆Tissue试剂盒（株式会社QIAGEN）得到染色体DNA。
使用扭脱甲基杆菌IAM12632的染色体DNA作为模板，以AAAAGGCGGAATTCACAAAAAGGATAAAACAATGGACGTTCACGAGTACCAAGCC（序列号52）及CATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGCGAGGTTCTTTTTCCGGACTC（序列号53）为引物实施PCR，用NdeI和XbaI切断扩增DNA，得到了苹果酸硫激酶的片段。另外，将扭脱甲基杆菌的染色体DNA作为模板，以GGATCCTCTAGACTGGTGGAATATATGAGCTTCACCCTGATCCAGCAG（序列号54）及GGCATGCAAGCTTTTACTTTCCGCCCATCGCGTC（序列号55）为引物实施PCR，用XbaI和HindIII切断扩增DNA，得到了苹果酰CoA裂解酶的片段。将扭脱甲基杆菌的苹果酸硫激酶和苹果酰CoA裂解酶的片段与用NdeI和HindIII切断的pMWGKC连接。将得到的质粒命名为pMWGKC＿mtk（Mex）＿mcl。
pMWGKC＿mtk（Mex）＿mcl包含来自扭脱甲基杆菌的mcl的基因序列（序列号66）、mtkA的基因序列（序列号67）及mtkB的基因序列（序列号68）。另外，来自扭脱甲基杆菌的mcl的氨基酸序列、mtkA的氨基酸序列及mtkB的氨基酸序列分别如序列号69、序列号70及序列号71所示。
[实施例12]
＜来自嗜甲基生丝微菌NBRC14180的苹果酸硫激酶表达质粒的构筑＞
从NBRC（独立行政法人产品评价技术基础机构生物技术本部生物遗传资源部门）购入嗜甲基生丝微菌（Hyphomicrobium methylovolum）NBRC14180。用NBRC的培养基编号233培养NBRC14180，使用DNeasy Blood＆Tissue试剂盒（株式会社QIAGEN）得到染色体DNA。
以NBRC14180的丝氨酸－乙醛酸氨基转移酶（GenBank登录号D13739）的N末端的DNA序列为参考制作引物（序列号56）。
基于脱氮生丝微菌（Hyphomicrobium denitrificans）的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/300021538？from＝3218417＆to＝3221272＆report＝gbwithparts）的氨基酸序列，使用NCIBM（美国立生物工学信息中心）的同源性检索工具比较同源性。（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp＆BLAST＿PROGRAMS＝blastp＆PAGE＿TYPE＝BlastSearch＆SHOW＿DEFAULTS＝on＆LINK＿LOC＝blasthome）
以同源性高的氨基酸序列为参考制作引物（序列号57）。
使用上述得到的序列号56和序列号57的引物，以上述的染色体DNA为模板实施PCR。将扩增片段连接于用SmaI消化pUC19而得到的DNA，由来自嗜甲基生丝微菌NBRC14180的丝氨酸－乙醛酸氨基转移酶基因克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的一部分。确认克隆的序列，进而制作引物（序列号58及59）。
将嗜甲基生丝微菌NBRC14180的染色体DNA作为模板，使用上述得到的序列号60及61的引物实施PCR，用EcoRI和XbaI切断扩增的DNA，得到包含生丝微菌属的mcl及mtk基因的DNA片段。然后，用EcoRI和XbaI切断上述质粒pMWGKC＿mtk（Mex）＿mcl，回收含有mcl的约4.3kb的片段，与含有生丝微菌属的mcl及mtk基因的DNA片段连接。将得到的质粒命名为pMWGKC＿mcl（Hme）＿mtk（Hme）＿mcl。
pMWGKC＿mcl（Hme）＿mtk（Hme）＿mcl包含来自嗜甲基生丝微菌的mcl的基因序列（序列号60）、mtkA的基因（序列号61）及mtkB的基因（序列号62）。另外，来自嗜甲基生丝微菌的mcl的氨基酸序列、mtkA的氨基酸及mtkB的氨基酸分别如序列号72、序列号73及序列号74所示。
[实施例13]
＜来自根瘤菌属的种NGR234的苹果酸硫激酶表达质粒的构筑＞
基于根瘤菌属的种（Rhizobium sp）NGR234的苹果酸硫激酶·β亚基（GenBank登录号ACP26381）和琥珀酰CoA合成酶·α亚基（GenBank登录号ACP26382）的氨基酸序列信息，将苹果酸硫激酶的基因全合成（序列号63）。用NdeI和XbaI切断得到的基因，与同样地用限制性酶切断后的pMWGKC连接。将得到的质粒命名为pMWGKC＿mtk（Rhi）。另外，将扭脱甲基杆菌的染色体DNA作为模板，使用序列号64及序列号65的引物实施PCR，将扩增DNA用XbaI和HindIII切断并将末端平滑化，然后与将pMWGKC＿mtk（Rhi）用XbaI切断并进行了平滑化的基因连接。将以相同方向导入了mtk和mcl的基因而得到的质粒命名为pMWGKC＿mtk（Rhi）＿mcl。来自根瘤菌属的种的mtkA的氨基酸、及mtkB的氨基酸分别如序列号75、及序列号76所示。
[实施例14]
＜导入了苹果酸硫激酶及苹果酰CoA裂解酶的异丙醇生产株的制作＞
向实施例8中制成的大肠杆菌B株（atoDAB，△pgi＿gntR＿gnd＿ldhA＿aceBA＿glcB＿fumAC）的感受态细胞转化实施例9中制成的质粒pIaz、和mtk及mcl的各表达质粒，涂抹在含有25mg/L的氯霉素、100mg/L的氨苄西林的LB琼脂培养基上，将进行了生长繁殖的株分别命名如下（参见表2）。
需要说明的是，表2记载的株编号是指向大肠杆菌B株（atoDAB，△pgi＿gntR＿gnd＿ldhA＿aceBA＿glcB＿fumAC）导入了pIaz和表2记载的质粒的株。
[表2]
Figure BDA0000461771840000791
[实施例15]
＜13C标签化CO2向异丙醇的导入验证＞
在500ml的带挡板三角烧瓶中配制100ml的LB液体培养基，利用高压釜进行121℃、且为20分钟的灭菌。向该培养基中添加氨苄西林和氯霉素使得氨苄西林终浓度为50μg/ml、氯霉素为34μg/ml，然后接种1铂环的表2的二氧化碳固定途径导入株，在30℃、且为130rpm下培养约20小时。利用离心分离（5000G×15分钟）从培养液中仅分离菌体，接着，将该菌体再悬浮于10ml的生理盐水中，分别得到菌体悬浮液。
在100mL的三角烧瓶中，准备含有100mM的用13C标记过的碳酸氢钠、50g/L的葡萄糖、34μg/ml的氯霉素、50μg/ml的氨苄西林的30mL的M9最小培养基。接种3mL上述菌体悬浮液，用硅胶塞密封，在30℃、100rpm下培养24小时。对于得到的培养液，使用设置有亲水性PTFE膜滤器（ADVANTEC公司、H050A047A、孔径0.5μM、直径47mm）的减压过滤用过滤器架（ADVANTEC公司、KGS－47）进行减压过滤，分离为培养上清液和菌体。
立即将附着有菌体的膜滤器浸入到冷却至－20℃的1.6mL的甲醇（LC/MS级）中并进行搅拌，然后在－20℃下放置1小时。1小时后，加入冷却至－20℃的1.6mL的氯仿（HPLC级）和冷却至4℃的0.64mL的纯水，用涡流（vortex）搅拌30秒。然后，在4℃下进行离心并回收上清液，得到菌体的甲醇提取液。用LC－MS/MS分析该菌体的甲醇提取液，测定了菌体中的乙酰CoA的分子量分布。结果示于表3。需要说明的是，对于乙酰CoA的分子量分布，将质谱峰（mass spectral peak）的分子量：808、809及810的比例分别作为M＋0、M＋1及M＋2来进行换算。
另一方面，利用蒸馏使醇类及丙酮高浓度化并从上述培养上清液中提取出醇类及丙酮，用作分子量分布的测定原料。用GC－MS分析培养上清液中的异丙醇及乙醇的分子量分布。结果示于表4及5。需要说明的是，对于异丙醇（IPA）的分子量分布（表4），将质谱峰的分子量：117、118及119的比例分别作为M＋0、M＋1及M＋2进行换算。对于乙醇（EtOH）的分子量分布（表5），将质谱峰的分子量：103、104及105的比例分别作为M＋0、M＋1及M＋2进行换算。
[表3]
样品名 M+0 M+1 M+2
MT－1 0.80 0.14 0.06
MT－2 0.76 0.18 0.06
对照 0.81 0.13 0.06
[表4]
样品名 M+0 M+1 M+2
MT－1 0.87±0.01 0.10±0.01 0.03±0.00
MT－2 0.84±0.00 0.12±0.00 0.04±0.00
市售IPA 0.87±0.00 0.10±0.00 0.04±0.00
[表5]
样品名 M+0 M+1 M+2
MT－1 0.87±0.00 0.09±0.00 0.04±0.00
MT－2 0.85±0.01 0.11±0.01 0.04±0.00
市售EtOH 0.88±0.00 0.09±0.00 0.03±0.00
如表3所示，在MT－1株、及MT－2株中，与对照株比较，未导入13C的乙酰CoA（M＋0）的比例低，导入了1原子的13C的乙酰CoA（M＋1）的比例高。尤其是，MT－2株的M＋1的比例高。因此可知，在MT－1株、及MT－2株中，向乙酰CoA导入了来自经13C标签化过的碳酸的碳，而且MT－2株的效果更显著。
进而，对于MT－2株，与市售异丙醇、乙醇相比，未导入13C的异丙醇、乙醇（M＋0）的比例低，导入了1原子的13C的异丙醇、乙醇（M＋1）的比例高（表4、表5）。因此可知，MT－2株中，对于异丙醇、乙醇，也导入了来自经13C标签化的碳酸的碳。
[实施例16]
＜以苹果酸为底物的乙醛酸生产活性测定＞
在含有25μg/ml氯霉素、100μg/ml的氨苄西林的2mL的LB培养基中培养上述的mtk及mcl表达株。粗酶液的提取使用如下所示的方法进行。利用离心分离回收对数增殖期的菌体，用200mMMOPS‐K缓冲液（pH7.7）洗涤，然后溶解在该缓冲液中，进行超声波破碎。将离心上清液（12，000rpm、2min）作为粗酶提取液。
粗酶液的蛋白质浓度如下求出：将粗酶液及用于制成标准曲线的浓度已知的BSA分别与Quick Start Bradford Dye Reagent（BioRad公司）反应而显色后，用UV酶标仪（UV plate reader）（Molecular Divices，spectra max190）测定OD595nm，由标准曲线求出蛋白浓度。
溶液中的酶活性按照以下步骤求出。将MOPS－K缓冲液pH7.7，3.5mM苯肼，10mM MgCl2，3mM ATP，0.3mM CoA，10质量%粗酶液在微孔上混合，在室温下孵育30分钟，然后用UV酶标仪测定OD324mM的经时变化作为背景，然后添加（S）－L－苹果酸钠溶液pH7.5使得最终浓度变为5mM，测定OD324mM的经时变化。作为标准曲线，将乙醛酸添加至上述的缓冲液中，在室温下放置5分钟，测定OD324mM，制成乙醛酸的标准曲线。对于酶活性的值，从上述的（S）－L－苹果酸钠添加后的OD324mM的斜率减去背景的斜率，由乙醛酸的标准曲线换算为乙醛酸的消耗速度。然后，将乙醛酸的消耗速度除以蛋白浓度，从而求出每单位蛋白的酶活性（表6）。
如表6所示，针对MT－1～MT－3中任一种，确认了酶活性。其中，可知即使将MT－2株及MT－3株与MT－1株比较，酶活性也高。与此相对，在对照中，未确认到酶活性。
[表6]
样品名 活性（nmol/min/mg蛋白）
MT－1 2±0
MT－2 29±0
MT－3 23±0
对照 0±0
[实施例17]
＜苹果酸硫激酶及苹果酰CoA裂解酶导入株的活菌数及质粒保持率＞
在100mL的三角烧瓶中，准备含有50g/L的葡萄糖及30μg/ml的氯霉素、100μg/ml的氨苄西林的30mL的M9最小培养基及LB培养基。将上述的mtk及mcl表达株接种于M9最小培养基或LB培养基，用硅胶塞密封，在30℃、100rpm下培养24小时。用水稀释培养液，涂布100μL于不含抗生素的LB板，测定总活菌数。另外，将稀释过的培养液涂布于含有30μg/ml的氯霉素的LB板上，测定保持具有mtk（smt））及mcl的质粒的菌数。
如表7所示可知，MT－2及MT－3与MT－1株相比，培养液中的总活菌数的比例高，增殖良好。另外，具有mtk、mcl的质粒稳定保持在MT－1～3株各株中。
[表7]
Figure BDA0000461771840000841
[实施例18]
＜来自致病乙酸细菌BAA－1260的苹果酸硫激酶表达质粒的构筑＞
由ATCC购入致病乙酸细菌的基因组DNA（Granulibacter bethesdensis）BAA－1260D－5。
将致病乙酸细菌的基因组DNA作为模板，以CCCTGAGGAGGGTCCAAGAGATGGACGTCCATGAGTACCA（序列号77）及GCTCTAGATCAGGCTGCCTGACGCCCA（序列号78）为引物实施PCR，得到乙酸细菌属（Granulibacter）的mtk片段。另外，将实施例12中制成的pMWGKC＿mcl（Hme）＿mtk（Hme）＿mcl作为模板，以GGAATTCACAAAAAGGATAAAA（序列号79）及TGGTACTCATGGACGTCCATCTCTTGGACCCTCCTCAGGG（序列号80）为引物实施PCR，得到生丝微菌属（Hyphomicrobium）的mcl片段。将得到的乙酸细菌属的mtk片段和生丝微菌属的mcl片段作为模板，以序列号79及序列号78为引物实施PCR，得到含有生丝微菌属的mcl及乙酸细菌属的mtk片段基因的DNA片段。将用EcoRI和XbaI切断而得到的片段与用EcoRI和XbaI切断实施例10中制成的质粒pMWGKC而得到的质粒连接。将得到的质粒命名为pMWGKC＿mcl（Hme）＿mtk（Gb）。
pMWGKC＿mcl（Hme）＿mtk（Gb）含有来自致病乙酸细菌的mtkA的基因（序列号81）、及mtkB的基因（序列号82）。另外，来自致病乙酸细菌的mtkA的氨基酸序列、及mtkB的氨基酸序列分别如序列号107、及序列号108所示。
[实施例19]
＜来自脱氮生丝微菌（Hyphomicrobium denitrificans）DSM1869的苹果酸硫激酶表达质粒的构筑＞
从DSMZ（德国微生物菌种保藏中心，德国（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Germany））购入脱氮生丝微菌（Hyphomicrobium denitrificans）DSM1869。用DSM的培养基编号803培养DSM1869，使用DNeasy Blood＆Tissue试剂盒（株式会社QIAGEN）得到染色体DNA。
将脱氮生丝微菌的基因组DNA作为模板，以ACCAGGGAATTCACAAAAAGGATAAAACAATGAGCTATACCCTCTACCCAACCGTAAGC（序列号83）及GCCCACTCTAGATCAGGCAACTTTTTTCTGCTTGCCGAGAACC（序列号84）为引物实施PCR，得到生丝微菌属的mcl－mtk片段。将用EcoRI和XbaI切断而得到的片段、与用EcoRI和XbaI切断实施例12中制成的质粒pMWGKC＿mcl（Hme）＿mtk（Hme）＿mcl而得到的质粒连接。将得到的质粒命名为pMWGKC＿mcl（Hde）＿mtk（Hde）＿mcl。
pMWGKC＿mcl（Hde）＿mtk（Hde）＿mcl含有来自脱氮生丝微菌的mcl的基因序列（序列号85）、mtkA的基因（序列号86）、及mtkB的基因（序列号87）。另外，来自脱氮生丝微菌的mcl的氨基酸序列、mtkA的氨基酸序列、及mtkB的氨基酸序列分别如序列号109、序列号110、及序列号111所示。
[实施例20]
＜来自欧洲亚硝化单胞菌NBRC14298的苹果酸硫激酶表达质粒的构筑＞
从NBRC（生物资源中心（Biological Resource Center），NITE）购入欧洲亚硝化单胞菌（Nitrosomonas europaea）NBRC14298。用NBRC的培养基编号829培养NBRC14298，使用DNeasy Blood＆Tissue试剂盒（株式会社QIAGEN）得到染色体DNA。
将欧洲亚硝化单胞菌的基因组DNA作为模板，以GCGGGGGAATTCACAAAAAGGATAAAACAATGAGTCATACCCTGTATGAACCAAAACACC（序列号88）及CAGGCGTCTAGATTAGAGTCCGGCCAGAACTTTTGCGACG（序列号89）为引物实施PCR，得到欧洲亚硝化单胞菌的mtk片段。将用EcoRI和XbaI切断而得到的片段与用EcoRI和XbaI切断实施例12中制成的质粒pMWGKC＿mcl（Hme）＿mtk（Hme）＿mcl而得到的质粒连接。将得到的质粒命名为pMWGKC＿mcl（Ne）＿mtk（Ne）＿mcl。
pMWGKC＿mcl（Ne）＿mtk（Ne）＿mcl含有来自欧洲亚硝化单胞菌的mcl的基因序列（序列号90）、mtkA的基因（序列号91）、及mtkB的基因（序列号92）。另外，来自欧洲亚硝化单胞菌的mcl的氨基酸序列、mtkA的氨基酸序列、及mtkB的氨基酸序列分别如序列号112、序列号113、及序列号114所示。
[实施例21]
＜来自荚膜甲基球菌ATCC33009的苹果酸硫激酶表达质粒的构筑＞
从ATCC购入荚膜甲基球菌的基因组DNA（Methylococcus capsulatus）ATCC33009D－5。
将荚膜甲基球菌的基因组DNA作为模板，以GGAATTCCATATGGCTGTTAAAAATCGTCTAC（序列号93）及GCTCTAGATCAGAATCTGATTCCGTGTTC（序列号94）为引物实施PCR，得到甲基球菌属（Methylococcus）的mcl－mtk片段。将用NdeI和XbaI切断而得到的片段与用NdeI和XbaI切断实施例10中制成的质粒pMWGKC或pMWGC而得到的质粒连接。将得到的质粒命名为pMWGKC＿mcl（Mc）＿mtk（Mc）或pMWGC＿mcl（Mc）＿mtk（Mc）。
pMWGKC＿mcl（Mc）＿mtk（Mc）或pMWGC＿mcl（Mc）＿mtk（Mc）含有来自荚膜甲基球菌的mcl的基因序列（序列号95）、mtkA的基因序列（序列号96）、及mtkB的基因序列（序列号97）。另外，来自荚膜甲基球菌的mcl的氨基酸序列、mtkA的氨基酸序列、及mtkB的氨基酸序列分别如序列号115、序列号116、及序列号117所示。
[实施例22]
＜来自未培养（uncultured）γ－变形菌GenBank：AP011641.1的苹果酸硫激酶表达质粒的构筑＞
为了获得来自未培养γ－变形菌的mtk，基于GenBank：AP011641.1的氨基酸序列设计来自γ－变形菌的mtk，利用DNA合成来制作以下的DNA片段（序列号98）。
将制成的DNA片段作为模板，以GTTGAACGAGGAGATCGTCCATGAACATTCACGAATATCA（序列号99）及GCTCTAGATTAGCCAGAAACTGCAGATCC（序列号100）为引物实施PCR，得到γ－变形菌的mtk片段。另外，将实施例21中制成的pMWGKC＿mcl（Mc）＿mtk（Mc）或pMWGC＿mcl（Mc）＿mtk（Mc）作为模板，以序列号93及TGATATTCGTGAATGTTCATGGACGATCTCCTCGTTCAAC（序列号101）为引物实施PCR，得到甲基球菌属（Methylococcus）的mcl片段。将得到的γ－变形菌的mtk片段和甲基球菌属的mcl片段作为模板，以序列号93及序列号100为引物实施PCR，得到含有甲基球菌属的mcl及γ－变形菌的mtk片段基因的DNA片段。将用NdeI和XbaI切断而得到的片段与用NdeI和XbaI切断实施例10中制成的质粒pMWGKC而得到的质粒连接。将得到的质粒命名为pMWGKC＿mcl（Mc）＿mtk（gamma）。
pMWGKC＿mcl（Mc）＿mtk（gamma）含有来自未培养γ－变形菌的mtkA的基因（序列号102）、及mtkB的基因（序列号103）。另外，来自未培养γ－变形菌的mtkA的氨基酸序列、及mtkB的氨基酸序列分别如序列号118、及序列号119所示。
[实施例23]
＜导入了苹果酸激酶及苹果酰CoA裂解酶的异丙醇生产atoD基因组强化、pgi基因缺失、gntR基因缺失、gnd基因缺失、ldhA基因缺失、fumAC基因缺失、aceBA基因缺失、glcB基因缺失株的制作＞
向实施例8中制成的大肠杆菌B株（atoDAB，△pgi＿gntR＿gnd＿ldhA＿aceBA＿glcB＿fumAC）的感受态细胞转化实施例18～22中制成的质粒pIaz、和mtk及mcl的各表达质粒，涂抹于含有25mg/L的氯霉素、100mg/L的氨苄西林的LB琼脂培养基上，将生长繁殖的株分别命名如下（参见表8）。
需要说明的是，表8记载的株编号是指向大肠杆菌B株（atoDAB，△pgi＿gntR＿gnd＿ldhA＿aceBA＿glcB＿fumAC）导入了pIaz和表2记载的质粒的株。
[表8]
Figure BDA0000461771840000891
[实施例24]
＜将苹果酸作为底物的乙醛酸生产活性测定＞
通过与实施例16同样的方法，求出每单位蛋白的酶活性（表9）。
如表9所示，针对MT－4～MT－8中任一种，确认了酶活性，即使与MT－1株比较，酶活性也高。其中，MT－5株、MT－6株、MT－7株及MT－8株的活性在实施例16中示出的MT－2及MT－3株的活性以上。与此相对，对照中未确认到酶活性。
[表9]
样品名 活性（nmol/min/mg蛋白）
MT－4 7.5±0
MT－5 34.0±0
MT－6 54.0±0
MT－7 68.3±0
MT－8 43.4±0
MT－1 2±0
MT－2 29±0
MT－3 23±0
对照 0±0
[实施例25]
＜atoD基因组强化、aceB基因缺失株的制作＞
为了克隆编码苹果酸合酶（以下有时简称为aceB）的基因（1602bp）的碱基序列附近区域，合成了GGAATTCATTCAGCTGTTGCGCATCGATTC（序列号24）、GTTATGTGGTGGTCGTGCAGCTCCTCGTCATGG（序列号104）、GAGCTGCACGACCACCACATAACTATGGAG（序列号105）、GGAATTCCAGTTGAACGACGGCGAGCAG（序列号106）所示的四种寡核苷酸引物。序列号及的引物分别在5’末端侧具有EcoRI识别位点。
制备大肠杆菌B株的基因组DNA（登录号CP000819），将得到的基因组DNA作为模板，使用序列号24和序列号106的引物对进行PCR，由此扩增了约1.0kb的DNA片段（以下有时称为aceB－L片段）。另外，使用序列号105和序列号106的引物对进行PCR，由此扩增了约1.0kb的DNA片段（以下有时称为aceB－R片段）。用琼脂糖电泳分离、回收上述DNA片段，以aceB－L和aceB－R片段为模板，使用序列号24和序列号108的引物对进行PCR，由此扩增了约2.0kb的DNA片段（以下有时称为aceB－LR片段）。用琼脂糖电泳分离、回收该aceB－LR片段，用EcoRI消化，与温度敏感性质粒pTH18cs1（GenBank登录号AB019610）的EcoRI消化物混合，用T4DNA连接酶进行反应，然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞（东洋纺织公司制），得到了在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下生长繁殖的转化体。从得到的转化体中回收质粒，确认aceB－LR片段被正确插入至pTH18cs1，将该质粒作为pTH18cs1－aceB。
将如上所述得到的质粒pTH18cs1－aceB转化至实施例1中制成的大肠杆菌B株、B：：atoDAB，在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种于含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。接着，将一部分该培养液涂布于含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。将得到的菌落在LB液体培养基中在30℃下培养24小时，进而，涂布在LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。
从出现的菌落中随机选出100个菌落，分别使它们在LB琼脂板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖，选出氯霉素敏感性的克隆。进而，利用PCR由上述目标克隆的染色体DNA进行扩增，选出由于aceB基因缺失而可得到约2.0kbp片段的扩增的株，将得到的株命名为B株atoD基因组强化、aceB基因缺失株（以下有时简称为B：：atoDAB△aceB）株）。
[实施例26]
＜atoD基因组强化、aceB基因缺失、glcB基因缺失株的制作＞
将实施例7中制成的质粒pTH18cs1－gclB转化至实施例25中制成的大肠杆菌B株、B：：atoDAB△aceB株，在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种于含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。接着，将一部分该培养液涂布于含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。将得到的菌落在LB液体培养基中在30℃下培养24小时，进而涂布于LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。
从出现的菌落中随机选出100个菌落，分别使它们在LB琼脂板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖，选出氯霉素敏感性的克隆。进而，利用PCR由上述目标克隆的染色体DNA进行扩增，选出由于aceBA基因缺失而可得到约2.0kbp片段的扩增的株，将得到的株命名为B株atoD基因组强化、aceB基因缺失、glcB基因缺失株（以下有时简称为B：：atoDAB△aceB△glcB）株）。
[实施例27]
＜atoD基因组强化、ldhA基因缺失株的制作＞
将实施例5中制成的质粒pTH18cs1－ldhA转化至实施例1中制成的大肠杆菌B株、B：：atoDAB，在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种于含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。接着，将一部分该培养液涂布于含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。将得到的菌落在LB液体培养基中在30℃下培养24小时，进而涂布于LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。
从出现的菌落中随机选出100个菌落，分别使它们在LB琼脂板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖，选出氯霉素敏感性的克隆。进而，利用PCR由上述目标克隆的染色体DNA进行扩增，选出由于ldhA基因缺失而可得到约2.0kbp片段的扩增的株，将得到的株命名为atoD基因组强化、ldhA基因缺失株（以下有时简称为B：：atoDAB△ldhA）株）。
[实施例28]
＜pBRgapP、pMWGC＿mcl（Mc）＿mtk（Mc）/B株、pBRgapP、pMWGC/B株的制作＞
向大肠杆菌B株的感受态细胞转化实施例2中制成的质粒pBRgapP、和实施例21中制成的质粒pMWGC＿mcl（Mc）＿mtk（Mc）、或pMWGC，涂抹于含有25mg/L的氯霉素、100mg/L的氨苄西林的LB琼脂培养基上，得到生长繁殖的株。
[实施例29]
＜pIa、pMWGC＿mcl（Mc）＿mtk（Mc）/B：：atoDAB株、pIa、pMWGC/B：：atoDAB株的制作＞
向实施例1中制成的大肠杆菌B株（B：：atoDAB）的感受态细胞转化实施例9中制成的质粒pIa、和实施例21中制成的质粒pMWGC＿mcl（Mc）＿mtk（Mc）、或pMWGC，涂抹于含有25mg/L的氯霉素、100mg/L的氨苄西林的LB琼脂培养基上，得到生长繁殖的株。
[实施例30]
＜pIa、pMWGC＿mcl（Mc）＿mtk（Mc）/B：：atoDAB△aceB株、pIa、pMWGC/B：：atoDAB△aceB株的制作＞
向实施例25中制成的大肠杆菌B株（B：：atoDAB△aceB）的感受态细胞转化实施例9中制成的质粒pIa、和实施例21中制成的质粒pMWGC＿mcl（Mc）＿mtk（Mc）、或pMWGC，涂抹于含有25mg/L的氯霉素、100mg/L的氨苄西林的LB琼脂培养基上，得到生长繁殖的株。
[实施例31]
＜pIa、pMWGC＿mcl（Mc）＿mtk（Mc）/B：：atoDAB△aceB△glcB株、pIa、pMWGC/B：：atoDAB△aceB△glcB株的制作＞
向实施例26中制成的大肠杆菌B株（B：：atoDAB△aceB△glcB）的感受态细胞转化实施例9中制成的质粒pIa、和实施例21中制成的质粒pMWGC＿mcl（Mc）＿mtk（Mc）、或pMWGC，涂抹于含有25mg/L的氯霉素、100mg/L的氨苄西林的LB琼脂培养基上，得到生长繁殖的株。
[实施例32]
＜pIa、pMWGC＿mcl（Mc）＿mtk（Mc）/B：：atoDAB△ldhA株、pIa、pMWGC/B：：atoDAB△ldhA株的制作＞
向实施例27中制成的大肠杆菌B株（B：：atoDAB△ldhA）的感受态细胞转化实施例9中制成的质粒pIa、和实施例21中制成的质粒pMWGC＿mcl（Mc）＿mtk（Mc）、或pMWGC，涂抹于含有25mg/L的氯霉素、100mg/L的氨苄西林的LB琼脂培养基上，得到生长繁殖的株。
[实施例33]
＜异丙醇的生产＞
本实施例中，使用WO2009/008377号小册子图1所示的生产装置进行异丙醇的生产。培养槽使用容量3升的玻璃制培养槽，以每1槽9L的量向捕获槽中注入作为捕获液的水（捕获水），将2台连接来使用。
用于异丙醇生产评价的株的一览表如表10所示。
Figure BDA0000461771840000941
作为前培养，向装入有含有25mg/L的氯霉素、100mg/L的氨苄西林的LB液体培养基（LB Broth），米勒（Miller）培养液（Difco244620）50mL的500mL容量三角烧瓶中接种各评价株，在培养温度30℃、120rpm下进行搅拌培养，培养一夜。将45mL前培养液移至装入有900g如下所示的组成的培养基的3L容量的培养槽（ABLE公司制培养装置BMS－PI）中，进行培养。培养在大气压下、通气量0.45L/min、搅拌速度490rpm、培养温度30℃、pH7.0（用NH3水溶液调节）的条件下进行。在从培养开始直至8小时后的期间，以20g/L/小时的流速添加50wt/wt%的葡萄糖水溶液。然后，以20g/L/小时的流速适当添加50wt/wt%的葡萄糖水溶液，使得葡萄糖尽量不在培养槽内残留。从培养开始直至30小时，对菌体培养液采样数次，利用离心操作除去菌体，然后利用HPLC根据常规方法测定得到的培养上清液中及捕获水中的异丙醇、丙酮及主要的副产物的蓄积量。需要说明的是，测定值为培养后的培养液与2台捕获槽中的合计值。结果示于表11，副产物示于表12。
＜培养基组成＞
玉米浆（corn steep liquor）（日本食品化工制）：50g/L
Fe2SO4·7H2O：0.1g/L
K2HPO4：2g/L
KH2PO4：2g/L
MgSO4·7H2O：2g/L
（NH4）2SO4：2g/L
ADEKANOL LG126（旭电化工业）0.1g/L
（余量：水）
[表11]
Figure BDA0000461771840000961
Figure BDA0000461771840000971
评价结果为：对照株（vec/atoDAB）的异丙醇生产量为33.2g/30h，mtk导入株（mtk＿mcl/atoDAB）的生产量为34.6g/30h。丙酮的生产量在对照株（vec/atoDAB）中为6.0g/30h，在mtk导入株（mtk＿mcl/atoDAB）中为8.8g/30h。由此可知，导入了mtk＋mcl的菌株的异丙醇、丙酮的生产量提高。另外，30h时的异丙醇的相对于糖的收率在对照株（vec/atoDAB）中显示为15.8%，在mtk＋mcl导入株（mtk＿mcl/atoDAB）中显示为16.5%，异丙醇和丙酮的相对于糖的收率在对照株（vec/atoDAB）中显示为18.6%，在mtk＋mcl导入株（mtk＿mcl/atoDAB）中显示为20.7%。由此可知，通过导入mtk＋mcl的途径，糖向异丙醇、丙酮的转化效率提高。
在atoDAB△ldhA中也同样显示了：与atoDAB同样，导入了mtk＋mcl的株的异丙醇、丙酮的生产量、相对于糖的收率均提高。在atoDAB△ldhA、atoDAB△aceB、atoDAB△aceB△glcB中，与各株的对照株（vec）相比，导入了mtk＋mcl的株的相对于糖的收率提高，因此认为，通过mtk＋mcl，乙酰CoA、来自乙酰CoA的有用物质有效率地增加。
表12中示出了副产物。对30h时的对照株（vec/B）与mtk＋mcl导入株（mtk＿mcl/B）株进行比较可知，乙醇、丙酮酸、琥珀酸的量减少，mtk＋mcl导入株的副产物的总量也出乎意料地相对于对照株而减少。在atoDAB、atoDAB△aceB、atoDAB△aceB△glcB、atoDAB△ldhA中也同样显示了：导入了mtk＋mcl的株的乙醇、丙酮酸、琥珀酸、副产物的总量相对于对照株而减少。由此可知，无论有无atoDAB，均可见由mtk＋mcl带来的同样的效果。
在atoDAB△aceB及atoDAB△aceB△glcB中，IPA及IPA与丙酮的相对于糖的收率与atoDAB株相比大致为同等水平，与vec、mtk导入株一样，副产物的总量减少，尤其是在mtk＋mcl导入株中，乳酸、琥珀酸的蓄积出乎意料地显著减少。从培养液中回收异丙醇、丙酮时，如果副产物少，则精制负担能格外减轻，因此，在工业上期望atoDAB△aceB及atoDAB△aceB△glcB。
在atoDAB△ldhA中也同样显示了：与atoDAB同样，导入了mtk＋mcl的株的异丙醇、丙酮的生产量、相对于糖的收率均提高。另外，在上述所有株中，与对照株（vec）相比，导入了mtk＋mcl的株中，相对于糖的收率均提高，因此认为乙酰CoA、来自乙酰CoA的有用物质有效率地增加。
atoDAB△ldhA中，副产物的总量减少，同时在mtk＋mcl导入株中，丙酮酸的蓄积显著减少。进而，在导入了mtk＋mcl的atoDAB△ldhA中，异丙醇、丙酮的相对于糖的收率提高，因此显示了：从葡萄糖和mtk＋mcl的途径两方高效地流向异丙醇、丙酮。在atoDAB△ldhA中，与上述atoDAB△aceB及atoDAB△aceB△glcB同样，除了副产物减少以外，在mtk＋mcl导入株中，异丙醇、丙酮的相对于糖的收率高。可知从在回收异丙醇、丙酮时的精制负担减轻和收率提高这两方面考虑，在工业上生产异丙醇、丙酮方面，优选ldhA破坏。
在B株中，未导入异丙醇、丙酮的生产途径。由于乙酸显著增加，因此认为：乙酰CoA主要流向乙酸方向。另外，预测在mtk＋mcl导入株（mtk＿mcl/B）中，增加的乙酰CoA流向乙酸和乙醇。由此可知，在B株中，也由于mtk＋mcl的效果，乙酰CoA增加。
[实施例34]
＜质粒pGAPS的构筑＞
为了获得壮观霉素（spectinomycin）耐性基因，使用质粒pIC156（Steinmetz等，Gene，1994，142（1）：79－83）作为模板，由CCGCGGTACCGTATAATAAAGAATAATTATTAATCTGTAGACAAATTGTGAAAGG（序列号120）及CTTTTGTTTATAAGTGGGTAAACCGTGAATATCGTGTTCTTTTCAC（序列号121），利用PCR法进行扩增，通过用T4多核苷酸激酶（Toyobo）将得到的DNA片段磷酸化，得到了含有壮观霉素耐性基因的DNA片段。然后，用PvuI处理质粒pGAP，用Toyobo blunting high将DNA片段平滑化，与前述的含有壮观霉素耐性基因的DNA片段连接，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞，得到了在含有120μg/mL壮观霉素的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有120μg/mL壮观霉素的LB液体培养基中培养一夜，将得到的质粒命名为pGAPS。
[实施例35]
＜质粒pGAPS＿gcl的制作＞
由大肠杆菌MG1655株，使用DNeasy Blood＆Tissue试剂盒（株式会社QIAGEN）得到染色体DNA。
以含有乙醛酸醛连接酶（gcl，NCBI－GI：945394）的操纵子为参考，制作AAGAACTCTAGAACAAAAAGGATAAAACAATGGCAAAAATGAGAGCCGTTGACGCGGCAATG（序列号122）及GACCAGCTGCAGTCAGGCCAGTTTATGGTTAGCCATTAATTCCAGC（序列号123）两种引物。
另外，制作ACACAACTGCAGACAAAAAGGATAAAACAATGAAGATTGTCATTGCGCCAGACTCTTTTAAAGAGAGCT（序列号124）及GCCCCCAAGCTTTCAGTTTTTAATTCCCTGACCTATTTTAATGGCGCAGG（序列号125）两种引物。
使用上述得到的序列号122和序列号123的引物，将大肠杆菌MG1655株的染色体DNA作为模板实施PCR，得到约3kb的扩增DNA。然后，使用上述得到的124和序列号125的引物，将大肠杆菌MG1655株的染色体DNA作为模板实施PCR，得到约1.1kb的扩增DNA。将扩增DNA分别用PstI切断、连接。将该连接DNA作为模板，使用AAGAACTCTAGAACAAAAAGGATAAAACAATGGCAAAAATGAGAGCCGTTGACGCGGCAATG（序列号126）及GCCCCCAAGCTTTCAGTTTTTAATTCCCTGACCTATTTTAATGGCGCAGG（序列号127）作为引物进行PCR，得到扩增DNA。用XbaI和HindIII切断该扩增DNA，与同样地用限制性酶切断后的质粒pGAPS连接。转化大肠杆菌DH5α，用含有壮观霉素的LB琼脂板培养，从得到的转化体中回收质粒。
用限制性酶ClaI及HindIII切断该质粒，回收含有pGAPS和gcl的基因的、约4kb的DNA片段。对于DNA片段，在将末端平滑化后，使其进行自身连接（self－ligation），然后转化大肠杆菌DH5α，用含有120μg/mL壮观霉素的LB琼脂板培养，将生长繁殖的菌用含有120μg/mL壮观霉素的LB液体培养基培养，得到转化体。从得到的转化体中回收质粒，得到质粒pGAPS＿gcl。
[实施例36]
＜质粒菠萝泛菌PA株的获得＞
从菠萝泛菌AJ13601（专利保藏菌株BP－7207）中取出质粒RSFCPG。质粒RSFCPG是具有催化L－谷氨酸的生物合成反应的酶的四环素耐性的质粒，所述催化L－谷氨酸的生物合成反应的酶是谷氨酸脱氢酶、柠檬酸合酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（日本特开2001―333769号公报）。使用RSFCPG，利用CaCl2法（Molecular Cloning，第三版，Cold Spring Harbor出版，2001）转化菠萝泛菌AJ417（专利保藏菌株BP－8646），用含有10μL/mL的四环素的LB培养基培养，获得菠萝泛菌AJ417/RSFCPG（以后有时简称为PA株）。
[实施例37]
＜菠萝泛菌aceB基因缺失株的制作＞
菠萝泛菌AJ13355（专利保藏菌株BP－6614）的基因组DNA的全碱基序列是公知的（GenBank登录号AP012032），也报道了编码菠萝泛菌的苹果酸合酶（以下有时称为PAaceB）的基因的碱基序列（GenBank登录号NC＿017531）。为了克隆编码aceB的基因（1，599bp）的碱基序列附近区域，合成了GACTCTAGAGGATCCCCGGGATGACAGACTCGGTTATCAACAGTGAATTACTTTTCAG（序列号128）、GACGGGACGGCGGCTTTGTTGGCTTCCGCGTTATGAAAAAAGTAGAGAGC（序列号129）、TTGAGACACAACGTGGCTTTCCCAGCAAGGACAGCGCGCGCAATGAATG（序列号130）、ATGACCATGATTACGAATTCTCAGGGAAGCAGGCGGTAGCCTGGCAGAGTCAG（序列号131）所示的四种寡核苷酸引物。
另外，为了克隆卡那霉素耐性基因，合成了TTTTTCATAACGCGGAAGCCAACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGC（序列号132）、CGCGCGCTGTCCTTGCTGGGAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGC（序列号133）所示的两种寡核苷酸引物。
制备菠萝泛菌AJ417株的基因组DNA，将得到的基因组DNA作为模板，使用序列号128和序列号129的引物对进行PCR，由此扩增了含有aceB基因附近的序列的DNA片段（以下有时称为PAaceB－L片段）。另外，使用序列号130和序列号131的引物对进行PCR，由此扩增了含有aceB基因附近的序列的DNA片段（以下有时称为PAaceB－R片段）。另外，对于具有卡那霉素耐性基因的质粒pUC4K，使用序列号132和序列号133的引物对进行PCR，由此扩增了含有卡那霉素耐性基因的DNA片段（以下有时称为KanR片段）。另外，用EcoRI和XmaI处理质粒pUC18，制作pUC18片段。回收这些PAaceB－L片段、PAaceB－R片段、KanR片段、pUC18片段，混合各片段，使用In－fusion HD cloning试剂盒（Invitrogen）处理，转化大肠杆菌DH5α（NEB5α；New England Biolabs）感受态细胞，用含有30μL/mL的卡那霉素的LB板培养。从得到的转化体中回收质粒，通过DNA测序确认了在pUC18载体中构筑了aceB前方部分序列＿卡那霉素耐性基因＿aceB后方部分序列这样的序列。将该质粒作为模板，使用GCCGCCGAATTCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACC（序列号134）及ATGACCATGATTACGAATTCTCAGGGAAGCAGGCGGTAGCCTGGCAGAGTCAG（序列号135）进行PCR，进行精制，用EcoRI切断扩增产物，利用DNA连接酶（Takara）使其进行自身连接，由此得到不具有复制起点的质粒。使用该质粒转化菠萝泛菌AJ417株，用含有30μL/mL的卡那霉素的LB板培养。针对得到的菌落，通过基因组PCR和DNA测序确认了aceB基因正确地缺失。使用RSFCPG利用CaCl2法转化获得的株，用含有10μL/mL的四环素的LB培养基培养，命名为菠萝泛菌AJ417株aceB基因缺失株（有时简称为PA△aceB株）。
[实施例38]
＜菠萝泛菌fumA基因缺失株的制作＞
制备枯草芽孢杆菌枯草亚种168株（Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168）（ATCC23857）的基因组DNA，将得到的基因组DNA作为模板，使用AGTCTAGAGATCCTTTTTAACCCATCAC（序列号136）、及AGTCTAGAAGTCGATAAACAGCAATATT（序列号137）的引物，利用PCR法进行扩增，用限制性酶XhoI消化得到的DNA片段，从而得到约2.0kbp的含有sacB基因的DNA片段。将得到的DNA片段和用限制性酶XhoI消化质粒pHSG298（Takara）进而用碱性磷酸酶处理过的DNA片段混合，用连接酶连接，然后转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞（东洋纺织株式会社DNA－903），得到了在含有25μg/mL卡那霉素的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。从得到的菌体中回收质粒，得到了向pHSG298中插入了含有sacB基因的DNA片段的质粒pHSG－sacB。
菠萝泛菌AJ13355原来具有的质粒pEA320的全碱基序列是公知的（NCBI参考序列（NCBI Reference Sequence）NC＿017533.1），也报道了编码富马酸水合酶I类（class I）（以下有时称为fumA）的基因的碱基序列。为了克隆编码fumA的基因（1，647bp）的碱基序列附近区域，合成了GCAACGTTGGCTCTCATCT（序列号138）、CGGGATCCAAACACGCGGCGGAAAACA（序列号139）、CGGGATCCGTTAACGCAGGCTGAC（序列号140）及GCTGCTGGCGTACTGGTTC（序列号141）所示的四种寡核苷酸引物。
制备菠萝泛菌AJ417株的基因组DNA，将得到的基因组DNA作为模板，使用序列号138和序列号139的引物对进行PCR，由此扩增了约0.7kb的DNA片段（以下有时称为fumA－L片段）。另外，使用序列号140和序列号141的引物对进行PCR，由此扩增了约0.9kb的DNA片段（以下有时称为fumA－R片段）。
用琼脂糖电泳分离、回收上述DNA片段，分别将fumA－L片段及fumA－R片段用BamHI消化，用连接酶连接，然后利用T4多核苷酸激酶进行5’末端磷酸化处理。将本DNA片段与用BamHI消化上述pHSG－sacB、利用T4DNA聚合酶进行平滑末端化处理后、进而经碱性磷酸酶处理而得到的DNA片段混合，用连接酶连接，然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞（东洋纺织公司制），得到了在含有25μg/mL卡那霉素的LB琼脂板上在30℃下生长繁殖的转化体。从得到的转化体中回收质粒，确认了编码fumA的基因的5’上游附近片段和3’附近片段的两种片段被正确地插入至pHSG－sacB。将得到的质粒命名为psacB－PAfumA。
psacB－PAfumA是能在菠萝泛菌内复制的质粒。因此，为了得到不具有复制起点、不能在菠萝泛菌内复制的fumA基因缺失用质粒，而以psacB－PAfumA为模板，利用使用了CTTTACACTTTATGCTTCC（序列号142）及在5’末端侧具有SacI识别位点的TTGAGCTCGAGAGGTCTGCCTCGTGA（序列号143）的引物对的PCR扩增了约5kbp的DNA片段。用SacI消化该DNA片段，使用连接酶连接，从而得到了质粒pPAfumA。得到的pPAfumA含有fumA－L片段、fumA－R片段、sacB基因、及卡那霉素耐性基因，不具有复制起点。利用电穿孔（electroporation）法，使用pPAfumA转化菠萝泛菌AJ417，将其涂布于含有40μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基上。将上述的培养基中得到的单交叉株（single－crossover clone）用LB培养基进行一夜液体培养，将培养液涂覆于含有10%（W/V）蔗糖的LB琼脂培养基。
接着，从上述的培养基中得到的克隆中选择显示卡那霉素敏感性及含蔗糖培养基生长繁殖性的克隆。进而，利用使用了序列号138和序列号141的引物对的PCR由上述克隆的染色体DNA进行扩增，选出由于fumA基因缺失而可得到约1.5kbp片段的扩增的株，将得到的株命名为菠萝泛菌AJ417株fumA基因缺失株（以下有时简称为PA△fumA株）。
[实施例39]
＜菠萝泛菌fumA基因缺失、fumC基因缺失株的制作＞
为了克隆编码富马酸水合酶II类（class II）（以下有时称为fumC）的基因（1，398bp）的碱基序列附近区域，合成了TCGCCATGATGCTGCTGTG（序列号144）、CGGGATCCGACTTAGCGTCATCGGTTG（序列号145）、CGGGATCCGATGAAGATTGCTAACGACG（序列号146）及TGATGCCGACAATATTACGC（序列号147）所示的四种寡核苷酸引物。
制备菠萝泛菌AJ417株的基因组DNA，将得到的基因组DNA作为模板，使用序列号144和序列号145的引物对进行PCR，由此扩增了约0.8kb的DNA片段（以下有时称为fumC－L片段）。另外，使用序列号146和序列号147的引物对进行PCR，由此扩增了约0.7kb的DNA片段（以下有时称为fumC－R片段）。
用琼脂糖电泳分离、回收上述DNA片段，分别将fumC－L片段及fumC－R片段用BamHI消化，用连接酶连接，然后利用T4多核苷酸激酶进行5’末端磷酸化处理。将本DNA片段与用BamHI消化实施例38中制成的pHSG－sacB、利用T4DNA聚合酶进行平滑末端化处理后、进而用碱性磷酸酶处理而得到的DNA片段混合，用连接酶连接，然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞（东洋纺织公司制），得到了在含有25μg/mL卡那霉素的LB琼脂板上在30℃下生长繁殖的转化体。从得到的转化体中回收质粒，确认了编码fumC的基因的5’上游附近片段和3’附近片段的两种片段被正确地插入至pHSG－sacB。将得到的质粒命名为psacB－PAfumC。
除了将质粒psacB－PAfumA改变为psacB－PAfumC以外，用与实施例38同样的方法，得到了不具有复制起点、不能在菠萝泛菌内复制的fumC基因缺失用质粒pPAfumC。进而，除了使实施例38中使用的质粒pPAfumA为pPAfumC、使用于转化的菠萝泛菌AJ417株为PA△fumA株以外，用与实施例38同样的方法，选择显示卡那霉素敏感性及含蔗糖的培养基生长繁殖性的克隆。进而，利用使用了序列号138和序列号141的引物对的PCR从上述克隆的染色体DNA进行扩增，选出由于fumC基因缺失而可得到约1.5kbp片段的扩增的株。使用RSFCPG用CaCl2法转化获得的株，用含有10μL/mL的四环素的LB培养基进行培养，命名为菠萝泛菌fumA基因缺失、fumC基因缺失株（以下有时简称PA△fumAC株）。
[实施例40]
＜菠萝泛菌评价株的构筑＞
使用实施例36、37、及39中制成的菠萝泛菌PA株、PA△aceB株、PA△fumAC株，用CaCl2法或电穿孔法转化实施例34的pGAPS、实施例35的pGAPS＿gcl、实施例10的pMWGKC、及实施例21的pMWGKC＿mcl（Mc）＿mtk（Mc）。将各株涂布于含有30μg/mL氯霉素、120μg/mL壮观霉素、15μg/mL四环素的LB琼脂培养基上，将生长繁殖的株作为评价株。将这些株总结于表13。
Figure BDA0000461771840001071
[实施例41]
＜基于泛菌株的13C标签化CO2向谷氨酸的导入验证＞
将作为对象的泛菌株在含有30μg/mL氯霉素、120μg/mL壮观霉素、15μg/mL四环素的LB培养基中在220rpm、30℃的条件下进行前培养。利用离心分离（5000rpm、5分钟）从前培养液中回收菌体。然后，准备含有20g/L葡萄糖、30μg/mL氯霉素、120μg/mL壮观霉素、15μg/mL四环素的2mL的泛菌用最小培养基（17g/LNa2HPO4·12H2O、3g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、1g/L NH4Cl、10mM MgSO4、10μM CaCl2、50mg/L L－赖氨酸、50mg/L L－甲硫氨酸、pH6.0），添加前培养菌体并将OD调节为1～5的范围内。盖严后，在30℃、220rpm下培养1天。对培养液进行定期采样，离心分离（12，000rpm、3分钟）而除去菌体，用亲水性PTFE膜滤器（MILLIPORE公司、MSGVN2B50）过滤上清液，制成培养样品。将用作培养样品的株总结于表13。
在测定培养样品的谷氨酸中的13C含量时，对于适当量的样品，利用冷冻干燥或减压干燥等将其干燥后，加入500μL的MTBSTFA＋1%TBDMSCl（Sigma·Aldrich公司制、375934）及500μL的干DMF，在80℃下加热2小时，离心分离（14，000rpm、5分钟），利用GC－MS（Agilent7890A及5975c）分析上清液。测定预想为衍生物化过的谷氨酸脱落一处叔丁基而得到的结构的、分子量432、433、434的质谱峰的面积。需要说明的是，认为分子量432是所有原子由丰度最高的同位素构成的结构，分子量433及434是进一步含有1个及2个的中子的结构。将分子量为432、433、434的峰分别作为[M＋0]、[M＋1]及[M＋2]，将[M＋1]/[M＋0]的值作为x轴，将[M＋2]/[M＋0]的值作为y轴，将分析结果示于图4。
在通常的谷氨酸发酵中，来自NaH13CO3的13C经过草酰乙酸、仅导入至谷氨酸的1位或5位的碳中的某一方，因此，成为记载的基线上的值。需要说明的是，基线通过以下式子求出。
x＝（x0－x0×α＋α）/（1－α）
y＝（y0－y0×α＋x0×α）/（1－α）
α表示谷氨酸中的来自CO2的碳（1位或5位）的13C同位素的比例｛≈13C/（13C＋12C）｝。x及y表示基线上的任意点的坐标。假定谷氨酸中的、来自CO2的碳（谷氨酸的1位或5位的某一方碳）的同位素比中的12C的比例为100%，其他原子等于天然的同位素比，x0、y0是此时的x及y的值（即，α＝0时的x及y的值），分别设定为0.358527、0.16822084314。求解上式，结果基线如下式所示。
y＝x0·x＋y0－x0 2
本来的谷氨酸生产途径中，来自NaH13CO3的13C通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ppc）、丙酮酸羧化酶（pyc）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（pck）这样的二氧化碳固定酶而被固定，经由草酰乙酸，仅导入至谷氨酸的1位或5位的碳的任意一方。此处，根据ppc引入的12CO2和13CO2的比例，[M＋1]、[M＋2]的值发生变化，导入的部位有一处时，通常为基线上的值。另一方面，在假定的二氧化碳固定途径发挥功能时，13C经由草酰乙酸和乙酰CoA两方，因此，产生同时导入至谷氨酸的碳的1位和5位的可能性，其结果是，[M＋2]的值相对上升，应当成为与基线相比为上部的值。
根据图4，在PA/mtk＿mcl＿gcl株、PA△aceB/mtk＿mcl＿gcl株、PA△fumAC/mtk＿mcl＿gcl株中，显示明显是与基线相比为上部的值。即，认为固定的CO2经由乙酰CoA、被导入至谷氨酸。另一方面，对照株（PA/vec）中，在基线上绘点，未见经由乙酰CoA的13C导入。另外，即使是仅mtk＋mcl的导入株（PA/mtk＿mcl），也未见经由乙酰CoA的13C导入。菠萝泛菌不具有gcl，因此，认为仅赋予mtk和mcl时，没有乙醛酸的去处，反应不进行。因此，如图1所示，通过不仅导入mtk和mcl，而且连接gcl以后的途径，显示了CO2被转化至乙酰CoA。
[实施例42]
＜利用泛菌株进行的谷氨酸生产＞
测定实施例41的培养液中的、谷氨酸量及副产物的量。对于培养样品中的谷氨酸的定量，使用装载有NN－814（昭和电工公司）柱的HPLC（Waters公司2695）和UV/Vis检测器（Waters公司2489）。对于滤液中的葡萄糖、及其他产物的定量，使用装载有ULTRON PS－80H（信和化工公司）柱的HPLC（Waters公司2695）和RI检测器（Waters公司2414）。将结果示于表14及15。
[表14]
株表示名 相对于糖的收率（24h） 13C导入确认
PA/vec 9% －
PA/mtk_mcl 10% －
PA/mtk_mcl/gcl 11% +
PAΔaceB/mtk_mcl/gcl 16% +
PAΔfumAC/mtk_mcl/gcl 16% +
[表15]
赋予了mtk＋mcl＋gcl的株（PA/mtk＿mcl/gcl），与对照株（PA/vec）或赋予了mtk＋mcl的株（PA/mtk＿mcl）相比，显示高的相对于糖的收率。另外，破坏aceB基因、fumAC基因时，相对于糖的收率进一步提高（PA△aceB/mtk＿mcl/gcl、PA△fumAC/mtk＿mcl/gcl）。
关于副产物量，对mtk＋mcl＋gcl导入株（PA/mtk＿mcl/gcl）株和对照株（PA/vec）比较时，出乎意料地得知，琥珀酸和2，3－丁二醇（2，3－BDO）的量减少，副产物的总量也减少。进而，对破坏了aceB基因的株（PA△aceB/mtk＿mcl/gcl）与破坏前（PA/mtk＿mcl/gcl）进行比较时，出乎意料地得知，琥珀酸及乙酸减少，副产物总量也大幅减少。fumAC基因破坏株（PA△fumAC/mtk＿mcl/gcl）中，与破坏前（PA/mtk＿mcl/gcl）相比，琥珀酸量大幅减少，但乙酸量增加，副产物总量也减少。从培养液中回收谷氨酸时，副产物的量少时，精制负荷能格外地减轻，因此在工业利用时的有用性很大。
需要说明的是，对于上述的副产物降低效果，在不具有RSFCPG的PA株中也可见同样的效果。
[实施例43]
＜质粒pCASET的制作＞
以pHSG298（Takara）为模板，使用CGCCTCGAGTGACTCATACCAGGCCTG（序列号148）、及CGCCTCGAGGCAACACCTTCTTCACGAG（序列号149）的引物，利用PCR法进行扩增，用限制性酶XhoI消化得到的DNA片段，用连接酶连接，然后转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞（东洋纺织株式会社DNA－903），得到了在含有25μg/mL卡那霉素的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。从得到的菌体中回收质粒，将向pHSG298中插入了XhoI的识别序列的质粒命名为pHSG298－XhoI。
为了获得tac启动子，以pKK223－3（Pharmacia）为模板，使用ATCATCCAGCTGTCAGGCAGCCATCGGAAG（序列号150）、及ATCCCCGGGAATTCTGTT（序列号151）的引物，利用PCR法进行扩增，用限制性酶PvuII及SmaI消化得到的DNA片段，从而得到约0.2kbp的编码tac启动子的DNA片段。将得到的DNA片段与用限制性酶PvuII消化质粒pHSG298－XhoI、进而用碱性磷酸酶处理而得到的约2.4kbp的DNA片段混合，用连接酶连接，然后转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞（东洋纺织株式会社DNA－903），得到了在含有25μg/mL卡那霉素的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。从得到的菌体中回收质粒，pHSG298－XhoI的lac启动子被取代为tac启动子，得到tac启动子的方向与原来的lac启动子方向相同的质粒pHSGT1。
为了在得到的pHSGT1的tac启动子的下游连接pHSG298的多克隆位点，而用限制性酶EcoRI及ClaI消化pHSG298从而得到含有pHSG298的多克隆位点的约1.0kbp的DNA片段。将得到的DNA片段与用限制性酶EcoRI及ClaI消化质粒pHSGT1进而用碱性磷酸酶处理而得到的约1.7kbp的DNA片段混合，用连接酶连接，然后转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞（东洋纺织株式会社DNA－903），得到了在含有25μg/mL卡那霉素的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。从得到的菌体中回收质粒，得到了在tac启动子的下游连接有pHSG298的多克隆位点的质粒pHSGT2。
利用DNA合成，制作下述DNA序列（序列号152），所述DNA序列包含由乳酪棒状杆菌（Corynebacterium casei）JCM12072分离的pCASE1（Appl Microbiol Biotechnol（2009）81：1107－1115）的复制起点、repA及repB。序列如下所示。
CGCCTCGAGCACTGGAAGGGTTCTTCAGGGGAACCCCCGGAAACCGGGGAAACATCTGACTTGGTTAAATGTCGTATTATGAACACGCCGAGGAATGAAAACCGACCGTGCACGCTCGTGTGAGAAAGTCAGCTACATGAGACCAACTACCCGCCCTGAGGGACGCTTTGAGCAGCTGTGGCTGCCGCTGTGGCCATTGGCAAGCGATGACCTCCGTGAGGGCATTTACCGCACCTCACGGAAGAACGCGCTGGATAAGCGCTACGTCGAAGCCAATCCCGACGCGCTCTCTAACCTCCTGGTCGTTGACATCGACCAGGAGGACGCGCTTTTGCGCTCTTTGTGGGACAGGGAGGACTGGAGACCTAACGCGGTGGTTGAAAACCCCTTAAACGGGCACGCACACGCTGTCTGGGCGCTCGCGGAGCCATTTACCCGCACCGAATACGCCAAACGCAAGCCTTTGGCCTATGCCGCGGCTGTCACCGAAGGCCTACGGCGCTCTGTCGATGGCGATAGCGGATACTCCGGGCTGATCACCAAAAACCCCGAGCACACTGCATGGGATAGTCACTGGATCACCGATAAGCTGTATACGCTCGATGAGCTGCGCTTTTGGCTCGAAGAAACCGGCTTTATGCCGCCTGCGTCCTGGAGGAAAACGCGGCGGTTCTCGCCAGTTGGTCTAGGTCGTAATTGCGCACTCTTTGAAAGCGCACGTACGTGGGCATATCGGGAGGTCAGAAAGCATTTTGGAGACGCTGACGGCCTAGGCCGCGCAATCCAAACCACCGCGCAAGCACTTAACCAAGAGCTGTTTGATGAACCACTACCTGTGGCCGAAGTTGACTGTATTGCCAGGTCAATCCATAAATGGATCATCACCAAGTCACGCATGTGGACAGACGGCGCCGCCGTCTACGACGCCACATTCACCGCAATGCAATCCGCACGCGGGAAGAAAGGCTGGCAACGAAGCGCTGAGGTGCGTCGTGAGGCTGGACATACTCTTTGGAGGAACATTGGCTAAGGTTTATGCACGTTATCCACGCAACGGAAAAACAGCCCGCGAGCTGGCAGAACGTGCCGGTATGTCGGTGAGAACAGCTCAACGATGGACTTCCGAACCGCGTGAAGTGTTCATTAAACGTGCCAACGAGAAGCGTGCTCGCGTCCAGGAGCTGCGCGCCAAAGGTCTGTCCATGCGCGCTATCGCGGCAGAGATTGGTTGCTCGGTGGGCACGGTTCACCGCTACGTCAAAGAAGTTGAAGAGAAGAAAACCGCGTAAATCCAGCGGTTTAGTCACCCTCGGCGTGTTCAAAGTCCATCGTAACCAAGTCAGCTCGAGGCG
将用限制性酶XhoI消化制成的DNA片段从而得到的DNA片段与用限制性酶XhoI消化质粒pHSGT2、进而用碱性磷酸酶处理而得到的DNA片段混合，用连接酶连接，然后转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)，得到了在含有25μg/mL卡那霉素的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。从得到的菌体中回收质粒，将于pHSGT2的XhoI识别位点插入有含有pCASE1的复制起点、repA及repB的DNA片段的质粒命名为pCASET。在回收的pCASET中，来自pCASE1的repA的方向与tac启动子方向相反。
[实施例44]
<质粒pCASEL的构筑>
将用限制性酶XhoI消化实施例43中合成的、含有pCASE1的复制起点、repA及repB的DNA片段(序列号152)从而得到的DNA片段、与用限制性酶XhoI消化实施例43中制成的质粒pHSG298-XhoI、进而用碱性磷酸酶处理而得到的DNA片段混合，用连接酶连接，然后转化至大肠杆菌DH5α，得到了在含有25μg/mL卡那霉素的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。从得到的菌体中回收质粒，将于pHSG298-XhoI的XhoI识别位点插入有含有pCASE1的复制起点、repA及repB的DNA片段的质粒命名为pCASEL。在回收的pCASEL中，来自pCASE1的repA的方向与来自pHSG298的lac启动子方向相反。
[实施例45]
＜来自荚膜甲基球菌（Methylococcus capsulatus）的mtk及mcl表达质粒的构筑＞
将pMWGKC＿mcl（Mc）＿mtk（Mc）作为模板，使用GGAATTCACAAAAAGGATAAAACAATGGCTGTCAAGAACCGTCTAC（序列号153）及CGAATTCTCAGAATCTGATTCCGTGTTCCTG（序列号154）的引物对实施PCR，得到了含有甲基球菌属的mcl－mtk的DNA片段。序列号153及154的引物在5’末端侧具有EcoRI识别位点。用EcoRI切断该DNA片段及质粒pCASET，将两者连接。利用DNA测序，确认mcl－mtk片段以适于利用质粒的启动子进行的表达的方向插入，将该质粒命名为pCASET＿mcl（Mc）＿mtk（Mc）及pCASEL＿mcl（Mc）＿mtk（Mc）。
[实施例46]
＜来自致病乙酸细菌、欧洲亚硝化单胞菌、嗜甲基生丝微菌的mtk表达质粒的构筑＞
分别使用pMWGKC＿mcl（Hme）＿mtk（Gb）、pMWGKC＿mcl（Hme）＿mtk（Hme）＿mcl、pMWGKC＿mcl（Ne）＿mtk（Ne），转化dam－/dcm－Competent E.coli（New England Biolabs公司），用含有30μg/mL氯霉素的LB培养基使其增殖，然后回收质粒，用限制性酶EcoRI及XbaI切断，回收含有mtk和mcl的约3kb的DNA片段。然后，用限制性酶EcoRI及XbaI切断质粒pCASEL，与含有mtk和mcl的DNA片段连接，制成用于在棒状杆菌中使mtk及mcl表达的载体pCASEL＿mcl（Hme）＿mtk（Gb）、pCASEL＿mcl（Hme）＿mtk（Hme）、pCASEL＿mcl（Ne）＿mtk（Ne）。分别具有致病乙酸细菌、欧洲亚硝化单胞菌、嗜甲基生丝微菌的mtk。
将目前为止制成的棒状杆菌用质粒总结于表16。
[表16]
Figure BDA0000461771840001161
[实施例47]
＜棒状杆菌中的mtk的活性测定＞
使用实施例45及实施例46中制成的质粒，用电穿孔法转化谷氨酸棒杆菌ATCC13012株，将其涂布于含有15μg/mg的卡那霉素的LB琼脂培养基，在30℃下培养1～4天。将生长繁殖的株在含有15μg/mg的卡那霉素的LB液体培养基中在30℃下培养1～4天，利用离心分离回收菌体。将菌体悬浮于pH7.7的MOPS－K缓冲液中，使用悬0.1mm玻璃珠，用beads shocker（安井器械公司、MB5000）破碎。将离心上清液（13，000rpm、2min）制成变异体粗酶提取液，之后按照与实施例16同样的方法进行菌体的活性测定。将结果示于表17。
[表17]
株编号 质粒 活性（nmol/min/mg）
MT－9 pCASEL_mcl（Hme）_mtk（Gb） 5.5
MT－10 pCASEL_mcl（Hme）_mtk（Hme） 8.3
MT－11 pCASEL_mcl（Ne）_mtk（Ne） 11.0
MT－12 pCASEL_mcl（Mc）_mtk（Mc） 51.3
MT－13 pCASET_mcl（Mc）_mtk（Mc） 99.1
将pCASEL作为表达载体时，使来自荚膜甲基球菌的mtk表达的质粒显示最高的值。另外，与表9比较时，高活性的mtk与低活性的mtk的顺序的相关大致相同。然后，对导入至pCASEL和pCASET的来自荚膜甲基球菌的mtk的活性进行评价，结果显示导入至pCASET的株的活性高。
[实施例48]
＜棒状杆菌用mtk、mcl、gcl、及glxR表达质粒的构筑＞
从NBRC（独立行政法人产品评价技术基础机构生物技术本部生物遗传资源部门）购入红球菌jostii NBRC16295。用NBRC的培养基编号802培养NBRC16295，使用DNeasy Blood＆Tissue试剂盒（株式会社QIAGEN）得到基因组DNA。将该基因组DNA作为模板，以CGAGCTCAAGCTTACAAAAAGGATAAAACAATGAGCACCATTGCATTCATCGG（序列号155）CGGGATCCCTAGTCCAGCAGCATGAGAG（序列号156）为引物实施PCR，得到了红球菌属的glxR－gcl片段（序列号157）。将用SacI和BamHI切断而得到的片段、与用SacI和BamHI切断pCASET＿mcl（Mc）＿mtk（Mc）而得到的质粒连接。将该质粒命名为pCASET＿mcl（Mc）＿mtk（Mc）＿glxR（Rj）＿gcl（Rj）。
[实施例49]
＜谷氨酸棒杆菌中的谷氨酸生产及13C导入评价株的构筑＞
使用实施例43、45及48中构筑的质粒用电穿孔法转化谷氨酸棒杆菌DSM1412（以后有时称为“CG株”。）。将各株涂布于含有15μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基，将生长繁殖的株作为评价株。将这些株总结于表18。
Figure BDA0000461771840001181
[实施例50]
＜利用棒状杆菌株的13C标签化CO2向谷氨酸的导入验证＞
利用含有15μg/mL卡那霉素的2mL的LB液体培养基、在30℃且为280rpm的条件下，培养作为对象的微生物株，直至可见充分的生长繁殖。然后，在100mL的带搅拌叶片三角烧瓶中，配制含有20g/L的葡萄糖及15μg/mL卡那霉素的10ml的棒状杆菌用最小培养基｛30g/L（NH4）2SO4、3g/L Na2HPO4、6g/L KH2PO4、2g/L NaCl、84mg/L CaCl2、3.9mg/L FeCl3、0.9mg/L ZnSO4·7H2O、0.3mg/L CuCl2·H2O、5.56mg/L MnSO4·5H2O、0.1mg/L（NH4）6MO7O24·4H2O、0.3mg/L Na2B4O7·10H2O、0.4g/L MgSO4·7H2O、40mg/L FeSO4·7H2O、500μg/L维生素B1·HCl、0.1g/L EDTA、10μg/L生物素｝，添加1mL前述的基于LB液体培养基的培养液，培养1～4天直至可见充分的增殖，作为前培养液。利用离心分离（5000rpm、5分钟）从前培养液中回收菌体。
准备含有100mM的碳酸氢钠（13C标签化）、20g/L的葡萄糖、1.5%（w/v）的吐温60（Sigma·Aldrich公司制）、及15μg/mL卡那霉素的2mL的棒状杆菌用最小培养基（其中将生物素最终浓度改变为2μg/L），添加前培养菌体并将OD调节至1～5的范围内。盖严后，在30℃、150rpm下培养1～2天。对培养液进行定期采样，离心分离（MILLIPORE公司12，000rpm、3分钟）而除去菌体，用亲水性PTFE膜滤器（MILLIPORE公司、MSGVN2B50）过滤上清液，制成培养样品。培养样品的13C分析利用与实施例41同样的方法实施。即，将GC－MS分析时的MW432、433、434的峰面积分别作为[M]、[M＋1]、[M＋2]，横轴表示[M＋1]/[M]，纵轴表示[M＋2]/[M]。基线按照实施例41所记载的方法计算。
根据图5，mtk＋mcl＋gcl＋glxR导入株（CG/mtk＿mcl＿gcl＿glxR）表示基线上方的值，因此认为，固定的CO2经由乙酰CoA被导入至谷氨酸。另一方面，对照株（CG/vec）基本上绘点在基线上，未见经由乙酰CoA的13C导入。另外，在导入了mtk＋mcl的株（CG/mtk＿mcl）中，也基本上绘点在基线上，未见经由乙酰CoA的13C导入。谷氨酸棒杆菌不具有gcl、glxR，因此认为，与菠萝泛菌同样，仅通过mtk和mcl，反应不进行。
[实施例51]
＜利用棒状杆菌株进行的谷氨酸生产试验＞
测定实施例50的培养液中的、谷氨酸量及副产物的量。按照与实施例42同样的方法分析培养液中的谷氨酸、葡萄糖、其他有机化合物。将结果示于表19及表20。
[表19]
株表示名 相对于糖的收率（24h） 13C分析结果
CG/vec 2% －
CG/mtk_mcl 3% －
CG/mtk_mcl_gcl_glxR 6% +
[表20]
Figure BDA0000461771840001201
赋予了mtk＋mcl＋gcl＋glxR的株（CG/mtk＿mcl＿gcl＿glxR），与对照株（CG/vec）、仅导入mtk＋mcl的株（CG/mtk＿mcl）相比，显示高的相对于糖的收率。
关于副产物量，对mtk＋mcl＋gcl＋glxR导入株（CG/mtk＿mcl＿gcl＿glxR）株与对照株（CG/vec）进行比较，出乎意料地得知，乳酸主要减少，副产物的总量也减少。关于副产物量，仅mtk＋mcl的导入株（CG/mtk＿mcl）与对照株大致相等。
[实施例52]
＜由向来自扭脱甲基杆菌的苹果酸硫激酶基因导入变异而导致的活性提高＞
将pMWGKC＿mtk（Mex）＿mcl作为模板，使用表21记载的序列号的引物对进行PCR，用限制性酶DpnI处理而分解模板后，转化大肠杆菌DH5α株感受态细胞，得到了在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中在30℃下培养一夜。从一部分培养液中回收质粒，确认DNA序列，将目标变异被正确地导入的质粒作为变异体样品。将该样品在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中进行前培养，然后接种于3mL含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，在30℃、280rpm下培养一夜。对其中2mL进行10，000rpm、5分钟离心，除去上清液，然后添加2mL的10mM磷酸缓冲液（pH7.0）进行洗涤。进而再实施一次该洗涤操作，然后悬浮于500μL的pH7的10mM磷酸缓冲液（pH7.0）中。对于悬浮液，使用0.1mm玻璃珠，用beadsshocker（安井器械公司、MB5000）进行破碎。将离心上清液（13，000rpm、2min）作为变异体粗酶提取液。
针对各变异体粗酶提取液，基于[实施例16]的方法评价活性。将结果示于表21。其结果是，mtkB的Q244E变异及mtkB的L144I变异与变异导入前相比，可见活性值提高。另外，向mtkB的Q244位导入了其他氨基酸，结果在A、L、I、M、N、Y，K、R中，可见活性的提高。另外，向mtkB的L144位导入了变异，结果通过N、D、K、R、H、Q、P的变异，可见活性的提高。
[表21]
Figure BDA0000461771840001221
如上所述，通过本发明，可将CO2转化为乙酰CoA。另外，通过本发明，也可高效地生产来自乙酰CoA的物质，例如异丙醇、丙酮及谷氨酸。
将2011年7月29日申请的日本国申请号第2011－167808号的全部公开内容通过参照援引至本说明书中。
本说明书中记载的所有文献、专利申请、及技术标准通过参照被援引至本说明书中，各文献、专利申请、及技术标准通过参照被援引的程度与具体且分别地记载的情况的程度相同。
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Claims (16)

1.乙酰CoA生产微生物，具有乙酰CoA生产循环，所述乙酰CoA生产微生物是通过如下方式得到的：向不具有下述（a）、（b）、（c）、（d）及（e）中任一种的微生物中，不赋予（a）、（b）、（c）及（d）中任一种，或即使赋予也不发挥其功能，赋予选自苹果酸硫激酶、苹果酰CoA裂解酶、乙醛酸醛连接酶、2－羟基－3－氧代丙酸还原酶、及羟基丙酮酸还原酶中的至少一种酶活性；
（a）具有由丙二酸单酰CoA向丙二酸半醛或3－羟基丙酸的酶反应的二氧化碳固定循环，
（b）具有由乙酰CoA和CO2向丙酮酸的酶反应的二氧化碳固定循环，
（c）具有由巴豆酰CoA和CO2向乙基丙二酸单酰CoA或戊烯二酸单酰CoA的酶反应的二氧化碳固定循环，
（d）具有由CO2向甲酸的酶反应的二氧化碳固定循环，
（e）选自苹果酸硫激酶和苹果酰CoA裂解酶中的至少一种。
2.如权利要求1所述的乙酰CoA生产微生物，具有如下的乙酰CoA生产循环：磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸经由草酰乙酸、进而通过苹果酸硫激酶、苹果酰CoA裂解酶、乙醛酸醛连接酶而得到的2－羟基－3－氧代丙酸进一步经由2－磷酸甘油酸而再次转化为磷酸烯醇式丙酮酸。
3.如权利要求1或2所述的乙酰CoA生产微生物，具有乙酰CoA生产循环，所述乙酰CoA生产循环包括如下酶：
（f）选自丙酮酸激酶及丙酮酸羧化酶、或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、或磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶中的至少一种，
（g）苹果酸脱氢酶，
（h）苹果酸硫激酶，
（i）苹果酰CoA裂解酶，
（j）乙醛酸醛连接酶，
（k）选自2－羟基－3－氧代丙酸还原酶、或羟基丙酮酸异构酶及羟基丙酮酸还原酶中的至少一种，
（l）选自甘油酸2－激酶、或磷酸甘油酸变位酶及甘油酸3－激酶中的至少一种，和
（m）烯醇化酶。
4.如权利要求1～3中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为属于肠杆菌科的微生物或属于棒状细菌的微生物。
5.如权利要求1～4中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为属于肠杆菌科的微生物，为埃希氏菌属细菌或泛菌属细菌；或属于棒状细菌的微生物，为棒状杆菌属细菌。
6.如权利要求1～5中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为埃希氏菌属细菌，埃希氏菌属细菌具有的乳酸脱氢酶的活性被失活或降低。
7.如权利要求1～6中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为埃希氏菌属细菌，埃希氏菌属细菌具有的选自异柠檬酸裂解酶及苹果酸合酶中的至少一种酶的活性被失活或降低。
8.如权利要求1～7中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为埃希氏菌属细菌，埃希氏菌属细菌中硫解酶活性、CoA转移酶活性及乙酰乙酸脱羧酶活性被赋予或强化。
9.如权利要求1～8中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为埃希氏菌属细菌，埃希氏菌属细菌中硫解酶活性、CoA转移酶活性、乙酰乙酸脱羧酶活性及异丙醇脱氢酶活性被赋予或强化。
10.如权利要求1～5中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为泛菌属细菌，泛菌属细菌具有的富马酸水合酶A及富马酸水合酶C的活性被失活或降低。
11.如权利要求1～5及权利要求10中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其中，微生物为泛菌属细菌，泛菌属细菌具有的苹果酸合酶的活性被失活或降低。
12.如权利要求1～11中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，其特征在于，使用如下的苹果酸硫激酶，所述苹果酸硫激酶中，对应于来自扭脱甲基杆菌的mtkB的第144位的氨基酸的氨基酸为异亮氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酰胺或脯氨酸，及/或，第244位的氨基酸为谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、赖氨酸或精氨酸。
13.乙酰CoA生产方法，包括如下步骤：使用权利要求1～12中任一项所述的乙酰CoA生产微生物，由碳源材料生产乙酰CoA。
14.丙酮生产方法，包括如下步骤：使用权利要求9或12所述的乙酰CoA生产微生物，由碳源材料生产丙酮。
15.异丙醇生产方法，包括如下步骤：使用权利要求9或12所述的乙酰CoA生产微生物，由碳源材料生产异丙醇。
16.谷氨酸生产方法，包括如下步骤：使用权利要求5、10、11或12所述的乙酰CoA生产微生物，由碳源材料生产谷氨酸。
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