CN116925991A - 高产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株及构建方法与应用 - Google Patents

高产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株及构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了高产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株及构建方法与应用，其构建步骤为：1)构建CRISPRi弱化基因表达所需重组质粒pli‑1、pli‑2、pli‑3、pli‑4、pli‑5、pli‑6、pli‑7、pli‑8、pli‑9或pli‑10：2)将步骤1)构建得到的重组质粒分别转入大肠杆菌S17‑1，再通过接合转化方法导入生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌Halomonas sp.TDMVA‑02中，分别得到高产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株；本发明的菌株，在摇瓶发酵下较对照菌(空白载体表达菌株)的甲羟戊酸产量分别提高7.60％‑14.04％；显著提高甲羟戊酸的发酵产量。

Description

高产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株及构建方法与应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及高产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株及构建方法与应用。
背景技术
甲羟戊酸(mevalonic acid，MVA)，分子式为C6H12O4，是甲羟戊酸途径(MVApathway)的重要中间体，参与50,000种萜烯类化合物的合成，广泛应用于化工、制药、食品和化妆品等各个行业。甲羟戊酸可以通过化学法、酶催化法和微生物发酵法进行合成，其中，微生物发酵法因其较低的生产成本和环境友好性而受到广泛关注。据报道，酵母菌(如Endomycopsis fibuliger、Saccharomycopsis fibuligera和Saccharomyces cerevisiae)和细菌(如Staphylococcus aureus、Streptococcus pneumoniae、Lactobacillus casei、Enterococcus faecalis)等多种微生物具有天然产生甲羟戊酸的能力，但产量较低(摇瓶最高产量8.3g/L)Koike S,Murakawa S,Endo A.Fermentation of mevalonate bySaccharomycopsis fibuligera IFO 0107.Journal of Fermentation andBioengineering,1989,68，58-59)。随着代谢工程和合成生物学的发展，很多异源宿主包括Escherichia coli、Streptomyces lividans、Methylobacterium extorquens、Pseudomonas putida、Acinetobacter baylyi和Methylococcus capsulatus等也被改造用于合成甲羟戊酸。
盐单胞菌TD01(Halomonas sp.TD01)是一种中度嗜盐嗜碱微生物，能够在开放式、非灭菌条件下进行连续发酵培养。相较于普通模式微生物，以盐单胞菌Halomonas sp.TD01作为底盘细胞在工业应用中能够更加节约原材料、设备和人力资源投资成本，简化发酵工艺，并具有更高的经济性和价值性。但盐单胞菌TD01本身不具备甲羟戊酸合成能力。
本研究前期通过将来自粪肠球菌(E.faecalis)的3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶和HMG-CoA合酶及来自干酪乳杆菌(L.casei)的HMG-CoA还原酶和HMG-CoA合酶整合至盐单胞菌基因组中，构建了重组菌株Halomonas sp.TDMVA-02，该菌株以20g/L葡萄糖和5g/L乙酸为碳源，摇瓶发酵产生11.21g/L甲羟戊酸，底物转化率为45％。
CRISPR干扰(CRISPRi)系统作为一种简单高效的基因调控技术，是通过导入核酸内切酶活性缺失的dCas9蛋白和与靶序列互补配对的sgRNA，可以选择性地抑制基因转录。CRISPRi系统具有操作简便、适用于多种生物系统的优点，可以精确地弱化目标基因的表达，从而快速筛选到有利于增加目标产物产量的基因靶点。
经检索，目前未见有利用CRISPRi技术分别弱化盐单胞菌Halomonas sp.TDMVA-02中IldD、EGP18665、accA、glcB、rpoN、lpxK、lptB、lptD、kdsD和msbA的转录水平以提高甲羟戊酸合成的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供高产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株。
本发明的第二个目的是提供高产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株的构建方法。
本发明的第三个目的是提供高产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株发酵生产甲羟戊酸的应用。
本发明的技术方案概述如下：
高产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株的构建方法，包括如下步骤：
1)构建CRISPRi弱化基因表达所需重组质粒pli-1、pli-2、pli-3、pli-4、pli-5、pli-6、pli-7、pli-8、pli-9或pli-10：
合成特异性靶向基因IldD的gRNA-IldD，通过无缝克隆的方法连入质粒pli-dCas9-sgRNA中，获得重组质粒pli-1；
合成特异性靶向基因EGP18665的gRNA-EGP18665，通过无缝克隆的方法连入质粒pli-dCas9-sgRNA中，获得重组质粒pli-2；
合成特异性靶向基因accA的gRNA-accA，通过无缝克隆的方法连入质粒pli-dCas9-sgRNA中，获得重组质粒pli-3；
合成特异性靶向基因glcB的gRNA-glcB，通过无缝克隆的方法连入质粒pli-dCas9-sgRNA中，获得重组质粒pli-4；
合成特异性靶向基因rpoN的gRNA-rpoN，通过无缝克隆的方法连入质粒pli-dCas9-sgRNA中，获得重组质粒pli-5；
合成特异性靶向基因lpxK的gRNA-lpxK，通过无缝克隆的方法连入质粒pli-dCas9-sgRNA中，获得重组质粒pli-6；
合成特异性靶向基因lptB的gRNA-lptB，通过无缝克隆的方法连入质粒pli-dCas9-sgRNA中，获得重组质粒pli-7；
合成特异性靶向基因lptD的gRNA-lptD，通过无缝克隆的方法连入质粒pli-dCas9-sgRNA中，获得重组质粒pli-8；
合成特异性靶向基因kdsD的gRNA-kdsD，通过无缝克隆的方法连入质粒pli-dCas9-sgRNA中，获得重组质粒pli-9；
合成特异性靶向基因msbA的gRNA-msbA，通过无缝克隆的方法连入质粒pli-dCas9-sgRNA中，获得重组质粒pli-10；
基因IldD在Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)中的编号为EGP17955；
gRNA-IldD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
质粒pli-dCas9-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
基因EGP18665在Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)中的编号为EGP18665；
gRNA-EGP18665的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
基因accA在Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)中的编号为EGP18838；
gRNA-accA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
基因glcB在Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)中的编号为EGP19776；
gRNA-glcB的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
基因rpoN在Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)中的编号为EGP21034；
gRNA-rpoN的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
基因lpxK在Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)中的编号为EGP21093；
gRNA-lpxK的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
基因lptB在Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)中的编号为EGP21035；
gRNA-lptB的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
基因lptD在Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)中的编号为EGP21669；
gRNA-lptD的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
基因kdsD在Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)中的编号为EGP21040；
gRNA-kdsD的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
基因msbA在Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)中的编号为EGP21092；
gRNA-msbA的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
2)将步骤(1)构建得到的重组质粒pli-1、pli-2、pli-3、pli-4、pli-5、pli-6、pli-7、pli-8、pli-9或pli-10分别转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法导入生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌Halomonas sp.TDMVA-02中，分别得到高产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株Halomonas sp.TDMVA-02/pli-1，简称重组菌1；Halomonas sp.TDMVA-02/pli-2，简称重组菌2；Halomonas sp.TDMVA-02/pli-3，简称重组菌3；Halomonas sp.TDMVA-02/pli-4，简称重组菌4；Halomonas sp.TDMVA-02/pli-5，简称重组菌5；Halomonas sp.TDMVA-02/pli-6，简称重组菌6；Halomonas sp.TDMVA-02/pli-7，简称重组菌7；Halomonas sp.TDMVA-02/pli-8，简称重组菌8；Halomonas sp.TDMVA-02/pli-9，简称重组菌9或Halomonassp.TDMVA-02/pli-10，简称重组菌10。
上述构建方法构建的高产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株。
上述高产甲羟戊酸重组盐单胞菌菌株发酵生产甲羟戊酸的应用。
上述应用，包括如下步骤：
1)将活化后的重组菌1～重组菌10之一的单菌落接种于60LB液体培养基中，35～37℃、180～240rpm培养8～16h，按1％～2％接种量转接至新制备的60LB液体培养基中，35～37℃，180～240rpm培养8～20h，获得种子液；
2)将获得的种子液按1％～5％的接种量转接至装有20～100mL的发酵培养基的500mL锥形瓶中，32～42℃，180～240rpm培养，得到含有甲羟戊酸的发酵液。
本发明的优点：
本发明的高产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株，在摇瓶发酵下较对照菌(空白载体表达菌株)的甲羟戊酸产量分别提高10.28％、7.60％、8.50％、10.11％、14.04％、11.45％、11.81％、12.16％、12.25％和9.21％；通过本发明可显著提高甲羟戊酸的发酵产量。
附图说明
图1为本发明高产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株与对照菌株的甲羟戊酸发酵产量示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。
在生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌Halomonas sp.TDMVA-02基础上，利用CRISPRi技术分别弱化基因IldD、EGP18665、accA、glcB、rpoN、lpxK、lptB、lptD、kdsD或msbA的转录水平，构建得到高产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株，使甲羟戊酸的产量进一步得到提高。
本发明所用到的盐单胞菌Halomonas sp.TD01(保藏编号为CGMCC No.4353)，已申请发明专利且授权，一株盐单胞菌及其应用，CN201010578858.8。
大肠杆菌Escherichia coli S17-1，购自Biovector质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心，20191011，http://www.biovector.net/。
所用胶回收试剂盒、PCR产物纯化回收试剂盒从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)；高保真扩增聚合酶从南京诺唯赞生物科技有限公司购买(http://www.vazyme.com/)；细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司(https://www.solarbio.com/)；Seamless Cloning Kit(无缝克隆试剂盒，货号：D7010S)购自碧云天(https://www.beyotime.com/index.htm)。
所用PCR仪和电转仪购自Bio-Rad(http://www.bio-rad.com/)。
所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司(http://www.sangon.com/)购买。
60LB液体培养基包括胰蛋白胨(英国OXID公司，产品目录号LP0042)10g，酵母提取物(英国OXID公司，产品目录号LP0021)5g，氯化钠60g，加蒸馏水至1L，5M NaOH水溶液调pH至9.0。
发酵培养基包括葡萄糖20g，乙酸5g，氯化钠60g，酵母提取物1g，氯化铵1g，硫酸镁0.2g，十二水合磷酸氢二钠9.75g，磷酸二氢钾1.5g，10mL溶液I和1mL溶液II，加蒸馏水至1L；调节pH为9。
溶液I的组成为：柠檬酸铁铵5g，氯化钙2g，加1M HCl水溶液至1L；
溶液II的组成为：硫酸锌100mg，氯化锰30mg，硼酸300mg，氯化钴200mg，硫酸铜10mg，氯化镍20mg，钼酸钠30mg，加蒸馏水至1L。
高效液相色谱检测甲羟戊酸含量，采用安捷伦1100高效液相色谱仪，色谱柱为Aminex HPX-87H(300mm×7.8mm,9μm,Bio-Rad)，5mM H2SO4为流动相，流速0.4mL/min，进样量10μL，示差检测器，柱温设置为60℃。甲羟戊酸标准品购于Sigma-Aldrich(货号M4667)。
实施例1
高产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株的构建方法，具体包括以下步骤：
(1)首先在盐单胞菌Halomonas sp.TD01基因组上整合Mmp1 RNA聚合酶表达单元(SEQ ID No.12)(具体操作方法记载在如下文献中：Zhao H,Zhang H M,Chen X,Li T,WuQ,Ouyang Q,et al.(2016).Novel T7-like expression systems used forHalomonas.Metabolic Engineering,39,128-140)，再敲除3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶编码基因phaB(EGP18919)和PHA合成酶编码基因phaC(EGP20415)，最后分别在基因组的G4位点(TTCACCTAGCTAGATGAGAC)整合mvaESEfa表达单元(SEQ ID No.13)和G7位点(ACACCATTACGGGGGTGTCA)整合mvaESlca表达单元(SEQ ID No.14)。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行，具体方法在文献“Qin Q,Ling C,Zhao Y,Yang T,Yin J,Guo Y,et al.(2018).Crispr/cas9 editing genome of extremophile Halomonas spp.MetabolicEngineering,47,219-229”中有公开报道，所需工具质粒有pQ08(SEQ ID No.15)和pSEVA341-gRNA(SEQ ID No.16)，公众可按照文献说明进行操作。经过上述操作后获得菌株Halomonas sp.TDMVA-02(该菌株已于2022年12月09日申请了中国专利，专利申请号CN202211581639.4，一种生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌及构建方法与应用)。
(2)构建CRISPRi弱化基因表达所需重组质粒pli-1、pli-2、pli-3、pli-4、pli-5、pli-6、pli-7、pli-8、pli-9或pli-10：
使用引物对sgRNA-IldD-F/lacI-R(SEQ ID No.17和SEQ ID No.18)，以不含任何靶向基因gRNA的质粒pli-dCas9-sgRNA(SEQ ID No.2)作为模板，扩增获得含有靶向基因IldD(EGP17955)的gRNA-IldD片段(SEQ ID NO.1)；使用引物对pli-F/pli-R(SEQ ID No.19和SEQ ID No.20)，以质粒pli-dCas9-sgRNA作为模板，扩增获得质粒骨架片段(简称片段1)；将gRNA-IldD片段与片段1利用Seamless Cloning Kit试剂盒进行连接，得到重组质粒pli-1；
使用引物对sgRNA-EGP18665-F/lacI-R(SEQ ID No.21和SEQ ID No.18)，以质粒pli-dCas9-sgRNA作为模板，扩增获得含有靶向基因EGP18665(EGP18665)的gRNA-EGP18665片段(SEQ ID NO.3)；将gRNA-EGP18665片段与片段1利用Seamless Cloning Kit试剂盒进行连接，得到重组质粒pli-2；
使用引物对sgRNA-accA-F/lacI-R(SEQ ID No.22和SEQ ID No.18)，以质粒pli-dCas9-sgRNA作为模板，扩增获得含有靶向基因accA(EGP18838)的gRNA-accA片段(SEQ IDNO.4)；将gRNA-accA片段与片段1利用Seamless Cloning Kit试剂盒进行连接，得到重组质粒pli-3；
使用引物对sgRNA-glcB-F/lacI-R(SEQ ID No.23和SEQ ID No.18)，以质粒pli-dCas9-sgRNA作为模板，扩增获得含有靶向基因glcB(EGP19776)的gRNA-glcB片段(SEQ IDNO.5)；将gRNA-glcB片段与片段1利用Seamless Cloning Kit试剂盒进行连接，得到重组质粒pli-4；
使用引物对sgRNA-rpoN-F/lacI-R(SEQ ID No.24和SEQ ID No.18)，以质粒pli-dCas9-sgRNA作为模板，扩增获得含有靶向基因rpoN(EGP21034)的gRNA-rpoN片段(SEQ IDNO.6)；将gRNA-rpoN片段与片段1利用Seamless Cloning Kit试剂盒进行连接，得到重组质粒pli-5；
使用引物对sgRNA-lpxK-F/lacI-R(SEQ ID No.25和SEQ ID No.18)，以质粒pli-dCas9-sgRNA作为模板，扩增获得含有靶向基因lpxK(EGP21093)的gRNA-lpxK片段(SEQ IDNO.7)；将gRNA-lpxK片段与片段1利用Seamless Cloning Kit试剂盒进行连接，得到重组质粒pli-6；
使用引物对sgRNA-lptB-F/lacI-R(SEQ ID No.26和SEQ ID No.18)，以质粒pli-dCas9-sgRNA作为模板，扩增获得含有靶向基因lptB(EGP21035)的gRNA-lptB片段(SEQ IDNO.8)；将gRNA-lptB片段与片段1利用Seamless Cloning Kit试剂盒进行连接，得到重组质粒pli-7；
使用引物对sgRNA-lptD-F/lacI-R(SEQ ID No.27和SEQ ID No.18)，以质粒pli-dCas9-sgRNA作为模板，扩增获得含有靶向基因lptD(EGP21669)的gRNA-lptD片段(SEQ IDNO.9)；将gRNA-lptD片段与片段1利用Seamless Cloning Kit试剂盒进行连接，得到重组质粒pli-8；
使用引物对sgRNA-kdsD-F/lacI-R(SEQ ID No.28和SEQ ID No.18)，以质粒pli-dCas9-sgRNA作为模板，扩增获得含有靶向基因kdsD(EGP21040)的gRNA-kdsD片段(SEQ IDNO.10)；将gRNA-kdsD片段与片段1利用Seamless Cloning Kit试剂盒进行连接，得到重组质粒pli-9；
使用引物对sgRNA-msbA-F/lacI-R(SEQ ID No.29和SEQ ID No.18)，以质粒pli-dCas9-sgRNA作为模板，扩增获得含有靶向基因msbA(EGP21092)gRNA-msbA的片段(SEQ IDNO.11)；将gRNA-msbA片段与片段1利用Seamless Cloning Kit试剂盒进行连接，得到重组质粒pli-10；
(3)将步骤(2)构建得到的重组质粒pli-1、pli-2、pli-3、pli-4、pli-5、pli-6、pli-7、pli-8、pli-9或pli-10分别转入大肠杆菌S17-1(购买得到)，再通过接合转化(FuXZ，Tan D，Aibaidula G，Wu Q,Chen JC,Chen GQ(2014).Development of Halomonas TD01as a host for open production of chemicals.Metabolic Engineering,23，78-91)分别导入生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌Halomonas sp.TDMVA-02中，菌落PCR和测序验证筛选正确的接合子，从而分别得到基因IldD、EGP18665、accA、glcB、rpoN、lpxK、lptB、lptD、kdsD和msbA表达弱化的高产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株：Halomonas sp.TDMVA-02/pli-1，简称重组菌1；Halomonas sp.TDMVA-02/pli-2，简称重组菌2；Halomonas sp.TDMVA-02/pli-3，简称重组菌3；Halomonas sp.TDMVA-02/pli-4，简称重组菌4；Halomonas sp.TDMVA-02/pli-5，简称重组菌5；Halomonas sp.TDMVA-02/pli-6，简称重组菌6；Halomonas sp.TDMVA-02/pli-7，简称重组菌7；Halomonas sp.TDMVA-02/pli-8，简称重组菌8；Halomonassp.TDMVA-02/pli-9，简称重组菌9或Halomonas sp.TDMVA-02/pli-10，简称重组菌10。
将空白载体pli-dCas9-sgRNA接合至生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌Halomonassp.TDMVA-02中得到Halomonas sp.TDMVA-02/pli-dCas9-sgRNA作为对照菌株(简称对照菌)。
实施例2
高产甲羟戊酸重组盐单胞菌菌株(重组菌1)发酵生产甲羟戊酸的应用，包括如下述步骤：
1)将活化后的重组菌1单菌落接种于60LB液体培养基中，35℃、240rpm培养16h，按2％接种量转接至新制备的60LB液体培养基中，37℃，180rpm培养8h，获得种子液；
2)将获得的种子液按5％的接种量转至装有20mL的发酵培养基的500mL锥形瓶中，37℃，180rpm培养48h，得到含有甲羟戊酸的发酵液。甲羟戊酸产量达到12.33g/L，底物转化率为49％。
实施例3
高产甲羟戊酸重组盐单胞菌菌株(重组菌2)发酵生产甲羟戊酸的应用，包括如下述步骤：
1)将活化后的重组菌2单菌落接种于60LB液体培养基中，37℃、180rpm培养12h，按1％接种量转接至新制备的60LB液体培养基中，35℃，200rpm培养20h，获得种子液；
2)将获得的种子液按1％接种量转接至装有100mL的发酵培养基的500mL锥形瓶中，32℃，240rpm培养48h，得到含有甲羟戊酸的发酵液。甲羟戊酸产量达到12.03g/L，底物转化率为48％。
实施例4
高产甲羟戊酸重组盐单胞菌菌株(重组菌3)发酵生产甲羟戊酸的应用，包括如下述步骤：
1)将活化后的重组菌3单菌落接种于60LB液体培养基中，36℃、220rpm培养8h，按2％接种量转接至新制备的60LB液体培养基中，36℃，240rpm培养10h，获得种子液；
2)将获得的种子液按2％接种量转接至装有50mL的发酵培养基的500mL锥形瓶中，42℃，180rpm培养48h，得到含有甲羟戊酸的发酵液。甲羟戊酸产量达到12.13g/L，底物转化率为49％。
实施例5
高产甲羟戊酸重组盐单胞菌菌株(重组菌4)发酵生产甲羟戊酸的应用，包括如下述步骤：
1)将活化后的重组菌4单菌落接种于60LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12h，按1％接种量转接至新制备的60LB液体培养基中，37℃，200rpm培养14h，获得种子液；
2)将获得的种子液按5％接种量转接至装有30mL的发酵培养基的500mL锥形瓶中，38℃，180rpm培养48h，得到含有甲羟戊酸的发酵液。甲羟戊酸产量达到12.31g/L，底物转化率为49％。
实施例6
高产甲羟戊酸重组盐单胞菌菌株(重组菌5)发酵生产甲羟戊酸的应用，包括如下述步骤：
1)将活化后的重组菌5单菌落接种于60LB液体培养基中，37℃、180rpm培养14h，按1％接种量转接至新制备的60LB液体培养基中，37℃，210rpm培养9h，获得种子液；
2)将获得的种子液按5％接种量转接至装有40mL的发酵培养基的500mL锥形瓶中，38℃，180rpm培养48h，得到含有甲羟戊酸的发酵液。甲羟戊酸产量达到12.75g/L，底物转化率为51％。
实施例7
高产甲羟戊酸重组盐单胞菌菌株(重组菌6)发酵生产甲羟戊酸的应用，包括如下述步骤：
1)将活化后的重组菌6单菌落接种于60LB液体培养基中，37℃、220rpm培养12h，按1％接种量转接至新制备的60LB液体培养基中，37℃，180rpm培养18h，获得种子液；
2)将获得的种子液按5％接种量转接至装有60mL的发酵培养基的500mL锥形瓶中，37℃，200rpm培养48h，得到含有甲羟戊酸的发酵液。甲羟戊酸产量达到12.46g/L，底物转化率为50％。
实施例8
高产甲羟戊酸重组盐单胞菌菌株(重组菌7)发酵生产甲羟戊酸的应用，包括如下述步骤：
1)将活化后的重组菌7单菌落接种于60LB液体培养基中，37℃、200rpm培养14h，按2％接种量转接至新制备的60LB液体培养基中，36℃，210rpm培养15h，获得种子液；
2)将获得的种子液按照5％接种量转接至装有80mL的发酵培养基的500mL锥形瓶中，37℃，200rpm培养48h，得到含有甲羟戊酸的发酵液。甲羟戊酸产量达到12.50g/L，底物转化率为50％。
实施例9
高产甲羟戊酸重组盐单胞菌菌株(重组菌8)发酵生产甲羟戊酸的应用，包括如下述步骤：
1)将活化后的重组菌8单菌落接种于60LB液体培养基中，37℃、200rpm培养14h，按1％接种量转接至新制备的60LB液体培养基中，37℃，200rpm培养15h，获得种子液；
2)将获得的种子液按5％接种量转接至装有90mL的发酵培养基的500mL锥形瓶中，37℃，220rpm培养48h，得到含有甲羟戊酸的发酵液。甲羟戊酸产量达到12.54g/L，底物转化率为50％。
实施例10
高产甲羟戊酸重组盐单胞菌菌株(重组菌9)发酵生产甲羟戊酸的应用，包括如下述步骤：
1)将活化后的重组菌9单菌落接种于60LB液体培养基中，35℃、220rpm培养14h，按2％接种量转接至新制备的60LB液体培养基中，36℃，200rpm培养16h，获得种子液；
2)将获得的种子液按5％接种量转接至装有50mL的发酵培养基的500mL锥形瓶中，34℃，220rpm培养48h，得到含有甲羟戊酸的发酵液。甲羟戊酸产量达到12.55g/L，底物转化率为50％。
实施例11
高产甲羟戊酸重组盐单胞菌菌株(重组菌10)发酵生产甲羟戊酸的应用，包括如下述步骤：
1)将活化后的重组菌10单菌落接种于60LB液体培养基中，37℃、180rpm培养14h，按1％接种量转接至新制备的60LB液体培养基中，37℃，180rpm培养16h，获得种子液；
2)将获得的种子液按照5％接种量转接至装有100mL的发酵培养基的500mL锥形瓶中，37℃，240rpm培养48h，得到含有甲羟戊酸的发酵液。甲羟戊酸产量达到12.21g/L，底物转化率为49％。
实施例12
对照菌(实施例1公开了制备方法)发酵生产甲羟戊酸的应用，包括如下述步骤：
1)将活化后的对照菌单菌落接种于60LB液体培养基中，37℃、200rpm培养14h，按2％接种量转接至新制备的60LB液体培养基中，36℃，210rpm培养15h，获得种子液；
2)将获得的种子液按5％接种量转接至装有80mL的发酵培养基的500mL锥形瓶中，37℃，200rpm培养48h，得到含有甲羟戊酸的发酵液。甲羟戊酸产量达到11.18g/L，底物转化率为45％。
图1为10个重组菌与对照菌的甲羟戊酸产量示意图。结果表明，重组菌1、重组菌2、重组菌3、重组菌4、重组菌5、重组菌6、重组菌7、重组菌8、重组菌9和重组菌10的甲羟戊酸产量比对照菌分别提高10.28％、7.60％、8.50％、10.11％、14.04％、11.45％、11.81％、12.16％、12.25％和9.21％。

Claims (4)

1.高产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：
1)构建CRISPRi弱化基因表达所需重组质粒pli-1、pli-2、pli-3、pli-4、pli-5、pli-6、pli-7、pli-8、pli-9或pli-10：
合成特异性靶向基因IldD的gRNA-IldD，通过无缝克隆的方法连入质粒pli-dCas9-sgRNA中，获得重组质粒pli-1；
合成特异性靶向基因EGP18665的gRNA-EGP18665，通过无缝克隆的方法连入质粒pli-dCas9-sgRNA中，获得重组质粒pli-2；
合成特异性靶向基因accA的gRNA-accA，通过无缝克隆的方法连入质粒pli-dCas9-sgRNA中，获得重组质粒pli-3；
合成特异性靶向基因glcB的gRNA-glcB，通过无缝克隆的方法连入质粒pli-dCas9-sgRNA中，获得重组质粒pli-4；
合成特异性靶向基因rpoN的gRNA-rpoN，通过无缝克隆的方法连入质粒pli-dCas9-sgRNA中，获得重组质粒pli-5；
合成特异性靶向基因lpxK的gRNA-lpxK，通过无缝克隆的方法连入质粒pli-dCas9-sgRNA中，获得重组质粒pli-6；
合成特异性靶向基因lptB的gRNA-lptB，通过无缝克隆的方法连入质粒pli-dCas9-sgRNA中，获得重组质粒pli-7；
合成特异性靶向基因lptD的gRNA-lptD，通过无缝克隆的方法连入质粒pli-dCas9-sgRNA中，获得重组质粒pli-8；
合成特异性靶向基因kdsD的gRNA-kdsD，通过无缝克隆的方法连入质粒pli-dCas9-sgRNA中，获得重组质粒pli-9；
合成特异性靶向基因msbA的gRNA-msbA，通过无缝克隆的方法连入质粒pli-dCas9-sgRNA中，获得重组质粒pli-10；
所述gRNA-IldD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述质粒pli-dCas9-sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述gRNA-EGP18665的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述gRNA-accA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述gRNA-glcB的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述gRNA-rpoN的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述gRNA-lpxK的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述gRNA-lptB的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述gRNA-lptD的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述gRNA-kdsD的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
所述gRNA-msbA的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
2)将步骤1)构建得到的重组质粒pli-1、pli-2、pli-3、pli-4、pli-5、pli-6、pli-7、pli-8、pli-9或pli-10分别转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法导入生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌Halomonas sp.TDMVA-02中，分别得到高产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株Halomonas sp.TDMVA-02/pli-1，简称重组菌1；Halomonas sp.TDMVA-02/pli-2，简称重组菌2；Halomonassp.TDMVA-02/pli-3，简称重组菌3；Halomonas sp.TDMVA-02/pli-4，简称重组菌4；Halomonassp.TDMVA-02/pli-5，简称重组菌5；Halomonas sp.TDMVA-02/pli-6，简称重组菌6；Halomonassp.TDMVA-02/pli-7，简称重组菌7；Halomonas sp.TDMVA-02/pli-8，简称重组菌8；Halomonassp.TDMVA-02/pli-9，简称重组菌9或Halomonas sp.TDMVA-02/pli-10，简称重组菌10。
2.权利要求1的构建方法构建的高产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株。
3.权利要求2的高产甲羟戊酸重组盐单胞菌菌株发酵生产甲羟戊酸的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征是包括如下步骤：
1)将活化后的重组菌1～重组菌10之一的单菌落接种于60LB液体培养基中，35～37℃、180～240rpm培养8～16h，按1％～2％接种量转接至新制备的60LB液体培养基中，35～37℃，180～240rpm培养8～20h，获得种子液；
2)将获得的种子液按1％～5％的接种量转接至装有20～100mL的发酵培养基的500mL锥形瓶中，32～42℃，180～240rpm培养，得到含有甲羟戊酸的发酵液。
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